KR20180118482A - 생체적합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물, 그를 제조하는 방법 및 상기 조성물을 이용한 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법 - Google Patents

생체적합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물, 그를 제조하는 방법 및 상기 조성물을 이용한 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콜라겐 및 세포외 마트릭스를 포함한 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물, 그를 제조하는 방법 및 상기 조성물을 이용한 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물, 그를 제조하는 방법 및 상기 조성물을 이용한 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법{Composition for preparing a biocompatible tissue, method preparing the same and method treating a disease requiring a vascularization}
생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물, 그를 제조하는 방법 및 상기 조성물을 이용한 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
조직 재생 공학은 다양한 학문분야와 기술과 연계되어 있다. 조직공학에서 신생혈관이 내재되어 있으며 실제 혈관처럼 기능을 할 수 있는 삼차원 구조체를 만드는 것은 중요하다. 이러한 구조체는 인공조직 내 존재하는 세포들에게 필수적인 산소와 영양분 공급, 및 독성물질의 배출 등의 역할에 매우 중요하다. 혈관 조직 공학과 관련하여, 혈관세포, 생체적합성 3차원 스캐폴드, 혈관 성장 인자, 및 퍼퓨전가능한(perfusable) 미크로 유체 시스템과 같은 분야에서 많은 연구가 진행되고 있다.
콜라겐은 동물체의 결합조직에서 세포외 공간(extracellular space) 중의 주요 구조 단백질이다. 결합조직의 주요 성분으로서, 포유동물 중 가장 많은 단백질이다. 긴 피브릴(elongated fibril)의 형태인 콜라겐은 힘줄, 인대, 및 피부와 같은 섬유상 조직(fibrous tissue)에서 대부분 발견된다. 콜라겐는 타입 I, II, III, IV, 및 V로 구분된다.
세포외 기질 마트릭스(ECM)는 주위 세포에 구조적 생화학적 지지를 제공하기 위하여 세포에 의하여 분비된 세포외 분자(extracellular molecule)의 집합이다. 다양한 다중 세포 계열(multicellular lineage)에 독립적으로 발생된 다세포성(multicellularity)으로 인하여, ECM의 성분은 다세포 구조 사이에 다르다. 그러나, 세포 흡착, 세포-세포 연락(communication) 및 분화는 ECM의 공통 기능이다.
이러한 종래 기술에 의하더라도, 콜라겐, 및 세포외 마트릭스(extracellular matrix: ECM)를 포함하는, 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물이 요구되고 있다.
일 양상은 제1 콜라겐, 및 세포외 마트릭스(extracellular matrix: ECM)를 포함하는, 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물과 세포를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 배지 중에서 배양하여 세포를 성장시키는 단계;를 포함하는, 생체적합성 조직을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 제1 콜라겐, 및 세포외 마트릭스(extracellular matrix: ECM)를 포함하는, 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 제1 콜라겐은 생체 유래의 것일 수 있다. 상기 콜라겐 타입 I은 액체일 수 있다. 예를 들면, 0.02 N 아세트산에서 3-4 mg/mL 범위의 농도를 갖는 액체일 수 있다. 상기 콜라겐은 쥐(rat) 꼬리 힘줄(rat tail tendon) 유래의 것이다. 상기 콜라겐은 점성이 매우 높지 않고 유동성이 있는 상태일 수 있다. 제1 콜라겐은 타입 I 콜라겐일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 세포외 마트릭스는 세포를 탈세포화(decellularization)시켜 제조된 것일 수 있다. 상기 세포외 마트릭스는 섬유아세포 또는 섬유아세포 층으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포외 마트릭스는 제2 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, VEGF, bFGF, 안지오게닌, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 섬유아세포성장인자-산성(fibroblast growth factor-acidic:FGF-a), FGF-4, FGF-7, 간세포성장인자(hepatocyte growth factor:HGF), 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 메탈로프로테나제의 조직 저해제(tissue inhibitor of metalloproteinases:TIMP-1), 내피 플라스미노겐 활성자 저해제(endothelial plasminogen activator inhibitor:Serpin E1), 유로키나제 플라스미노겐 활성자(urokinase plasminogen activator:uPA), 악티빈 A, 암피레귤린(amphiregulin), 아르테민, 응고인자III(coagulation factor III), 엔도글린, IGFBP-3, IL-8, 및 트롬보스폰딘-1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 상기 세포외 마트릭스에 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 결합은 상기 세포외 마트릭스를 물 또는 배지와 같은 수성 용액으로 세척하더라도 상기 세포외 마트릭스로부터 떨어지지 않을 정도 이상의 강도를 갖는 것일 수 있다. 상기 단백질은 100 μg/ mL 내지 250 μg/ ml(hFDM 기준)의 범위로 포함될 수 있다. 상기 단백질은 VEGF, bFGF 또는 VEGF 및 bFGF일 수 있다. 상기 단백질 중 VEGF 및 bFGF는 100 μg/ mL 내지 250 μg/ml(hFDM 기준)의 농도로 포함된 것일 수 있다.
상기 탈세포화는 세포로부터 조직의 원래(original) ECM을 분리하는 과정을 나타낸다. 상기 탈세포화는 ECM 성분을 손상시키기 않고 조직 내의 세포를 파쇄(lyse) 및 죽이고(kill), 자연적 조직의 동일한 물리적 및 생화학적 기능을 갖는 자연적 ECM 스캐폴드를 얻는 것일 수 있다. 상기 탈세포화는 물리적, 화학적, 및 효소적 처리와 같은 탈세포화-유도 처리(decellularization-inducing treatment)에 의하여 이루어질 수 있으며, 이때 ECM이 원래 조직의 구조적 화학적 견고성을 유지하는지 모니터링할 수 있다. 탈세포화 처리의 예는 세포를 세포 용해 용매, 저장액, 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 비이온성 계면활성제, RNase A, 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 용액과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 탈세포화 용매는 PBS 중 0.25% Triton X-100과 50 mM 수산화암모늄(NH4OH)의 혼합물일 수 있다. 탈세포화된 인간 섬유아세포는 추가적으로 RNase A와 DNase I의 혼합물과 접촉시킬 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 단백질은 세포외 마트릭스에 결합되어 있고 세포외 마트릭스의 기원과 동일한 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질은 동일한 세포로부터 생산되어 ECM에 결합되어 있었고 탈세포화 과정에서도 떨어지지 않고 계속 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 제1 콜라겐 및 세포외 마트릭스의 함량은 무게 기준으로 1.0: 0.04 내지 0.2, 예를 들면, 1.0: 0.04 내지 0.15, 1.0: 0.04 내지 0.1, 또는 1.0: 0.1 내지 0.2의 비일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 세포외 기질 마트릭스가 수성 용액 또는 현탁액에 포함되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 수성용액 또는 현탁액과 같은 액체 제형일 수 있다. 제1 콜라겐 및 세포외 기질 마트릭스는 수성 용액에 중에 혼합된 것, 예를 들면 균질하게 혼합된 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 동물에서 이식체가 이식되어질 부위, 예를 들면 혈관 형성이 필요한 부위에 이식할 수 있는 적당한 형태일 수 있다. 상기 조성물은 적절하게 수분은 포함하고 있으나 흐름성은 없어서 다루기가 용이한 형태일 수 있다. 상기 조성물은 히드로겔일 수 있다. 상기 히드로겔 적절한 수분을 함유하고 있으나 흐름성은 없는 팽창된 형태의 히드로겔일 수 있다. 상기 조성물은 또한 고체 상일 수 있다. 상기 조성물은 이식되어질 부위의 크기에 맞게 적절한 크기로 된 것일 수 있다. 상기 조성물은 가로, 세포 및 높이를 갖는 3차원 형태의 구조체일 수 있다. 상기 조성물은 또한 겔 형태일 수 있다. 즉, 상기 제1 콜라겐 및 세포외 마트릭스는 조성물 중에서 겔 형태로 존재할 수 있다.
상기 조성물은 성장인자를 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 혈관 성장 인자일 수 있다. 상기 성장인자는 VEGF, bFGF, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 및 기질유래 인자(stromal derived factor:SDF)-α1로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 성장인자는 VEGF; bFGF; SDF-α1; VEGF 및 bFGF; VEGF 및 SDF-α1; 또는 VEGF 및 bFGF 및 SDF-α1일 수 있다. 상기 성장인자는 상기 ECM에 결합되어 있는 것일 아닐 수 있다. 상기 결합은 물 또는 수성용액으로 세척하는 경우 떨어질 수 있는 정도 이하의 강도로 부착될 것일 수 있다. 상기 성장인자는 세포외 마트릭스의 기원과는 다른 기원으로부터 얻어진 것일 수 있다. 즉, 탈세포화 과정에 의하여 얻어진 ECM에 결합되어 있지 않은 것으로서, 별도로 상기 조성물 중에 포함시킨 것일 수 있다.
상기 조성물은 세포를 더 포함할 수 있다. 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 상기 세포는 사람 세포일 수 있다. 상기 사람 세포는 혈관 형성에 기여할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포, 지방유래 줄기세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 신경줄기세포, 태반유래 줄기세포, 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 세포는 연골세포, 내피세포, 평활근세포, 골아 세포, 간세포, 신경세포, 심장세포, 또는 추간판 세포일 수 있다. 상기 세포는 인간탯줄정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)일 수 있다. 상기 세포는 상기 조성물 중에서 배양되어 증식된 것일 수 있다. 상기 세포는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic) 세포일 수 있다.
상기 조직은 혈관 형성과 관련되거나 혈관 형성이 필요한 조직일 수 있다. 상기 조직은 예를 들면, 상처 또는 질병으로 인하여 혈관이 결손된 부위에 있는 것일 수 있다. 상기 조직은 혈관일 수 있다. 상기 질병은 심부 궤양(deep ulcers), 당뇨성 궤양, 심근경색, 뇌졸증, 및 만성 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 조성물은 조직을 포함할 수 있다. 상기 조직은 세포를 상기 조성물에서 배양하여 형성된 조직일 수 있다. 상기 조직은 상기 혈관 형성에 기여할 수 있는 세포를 상기 조성물에서 배양하여 형성 혈관, 예를 들면, 예비적으로 형성된(prevasculated) 혈관일 수 있다. 상기 조직은 혈관 특이적 튜브 구조를 포함하는 것일 수 있다. 상기 혈관 특이적 튜브 구조는 상기 조성물을 체외배양하는 동안 안정적인 혈관 구조를 유지하는 것일 수 있다. 즉, 세포를 포함하는 상기 조성물을 배양하여 형성된 혈관은 배양 중에 파괴 또는 튜브 구조가 감소되는 비율이 상대적으로 낮은 것일 수 있다. 이러한 효과는 제1 콜라겐, 세포외 마트릭스, 및 성장인자 중 어느 하나 이상과 세포와의 상호 작용에 의하여 야기되는 것으로 보이나, 청구된 발명이 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 안정적인 혈관 구조는 세포외 마트릭스를 포함하지 않는 조성물에 비하여 더 큰 견고성을 갖는 것일 수 있다. 상기 배양은 온도 34 내지 40℃에서, pH 6.5 내지 pH 7.5에서 산소가 공급되는 상태에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 배양은 5 rpm 내지 20 rpm으로 교반하는 것일 수 있다. 상기 배양은 온도 34 내지 40℃에서, pH 6.5 내지 pH 7.5에서 70 내지 100% 포화 공기와 접촉된 상태에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 질병은 상처, 심부 궤양(deep ulcers), 당뇨성 궤양, 심근경색, 뇌졸증, 및 만성 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 이식체일 수 있다. 상기 상처는 피부 예를 들면, 공기에 직접적으로 노출되는 외부 피부일 수 있다.
다른 양상은 상기 조성물과 세포를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 배지 중에서 배양하여 세포를 성장시키는 단계;를 포함하는, 생체적합성 조직을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 조성물에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 상기 세포는 사람 세포일 수 있다. 상기 사람 세포는 혈관 형성에 기여할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포일 수 있다. 상기 세포는 인간탯줄정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)일 수 있다. 상기 세포는 상기 조성물 중에서 배양되어 증식된 것일 수 있다.
상기 혼합은 액체 매질 중에서 이루어질 수 있다. 상기 액체 매질은 물 또는 배지와 같은 수성 용액일 수 있다. 상기 혼합은 교반 하에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 배양은 세포를 성장시키기에 적당한 조건일 수 있다. 상기 조건은 선택되는 세포에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 배양은 온도 34 내지 40℃에서, pH 6.5 내지 pH 7.5에서 산소가 공급되는 상태에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 배양은 5 내지 20 rpm(hFDM 기준)으로 교반하는 것일 수 있다. 상기 배양은 온도 34 내지 40℃에서, pH 6.5 내지 pH 7.5에서 70 내지 100% 포화 공기와 접촉된 상태에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 세포는 인간탯줄정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)이고, 상기 성장시키는 단계에서, 세포 성장에 의하여 3차원 혈관 구조가 형성되는 것일 수 있다. 상기 조직은 혈관일 수 있다.
다른 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 투여는 상기 조성물을 개체의 혈관 형성이 필요한 부위에 이식하는 것일 수 있다. 상기 이식은 상기 부위에 상기 조성물을 제공하고 부착시켜 이탈하지 않도록 하는 것일 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람일 수 있다. 상기 질병은 상처, 심부 궤양(deep ulcers), 당뇨성 궤양, 심근경색, 뇌졸증, 및 만성 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 이식체일 수 있다. 상기 상처는 피부 예를 들면, 공기에 직접적으로 노출되는 외부 피부일 수 있다. 상기 조성물은 세포를 포함하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물에 따르면, 혈관 형성이 필요한 질병과 같은 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 조성물을 혈관 내피세포와 같은 세포의 성장을 유지 또는 촉진할 수 있다. 또한, 혈관 내피세포를 성장시켜 신생 혈관을 형성하고 유지할 수 있다.
다른 양상에 따른 생체적합성 조직을 제조하는 방법에 의하면, 생체적합성 조직을 효율적으로 제조할 수 있다.
다른 양상에 따른 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법에 의하면, 혈관 형성이 필요한 질병을 효율적으로 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물을 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2A는 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스의 주요 단백질 성분인 피브로넥틴(Fn), 콜라겐(ColI), 및 라미닌(Ln)에 대한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 2B는 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스 내 단백질 총량을 나타낸다. 도 2C는 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스 내 bFGF(C) 및 VEGF(D)의 양을 나타낸다.
도 2C 및 2D는 마트릭스의 단위면적(cm2) 당 bFGF 및 VEGF의 양을 ELISA 분석을 통하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스에 포함된 혈관 생성 인자를 포함하는 다양한 생리활성인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 HUVEC 접종 농도에 따른 콜라겐 히드로겔에 형성된 모세관-유사 구조의 양을 나타낸 도면이다.
도 5는 hFDM 및 콜라겐을 포함하는 3차원 복합체를 나타낸 도면이다.
도 6은 hFDM 함량이 HUVEC의 신생 혈관 형성에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 7A는 배양 3 일 및 7 일에 피브로넥틴(녹색), F-액틴(붉은색), 및 DAPI(파란색)에 대해 면역형광 염색을 실시한 결과이다.
도 7B는 배양 3 일 및 7 일에서 형성된 모세혈관 세그멘트 수를 나타낸 도면이다.
도 7C는 배양 3 일 및 7 일에서 형성된 모세혈관의 총 길이를 나타낸 도면이다.
도 8A, 8B 및 8C는 도 7에 나타낸 혈관의 고배율 이미지로부터 시간에 따른 신생 혈관 내경의 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 9A, 9B 및 9C는 혈관형성 구조체를 생쥐의 피부 상처에 이식한 후 14 일 동안 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10A는 혈관내피세포 지표 CD31과 혈관 외부세포 지표 α-SMA에 대한 면역형광 염색 결과를 나타낸다.
도 10B는 신생 혈관 생성에 따른 면적당 혈관 밀도를 나타내고, 도 10C는 신생 혈관이 차지한 지역을 퍼센트로 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물을 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
실시예 1: 인간 섬유아세포 유래 마트릭스(human fibroblast derived matrix: hFDM )의 제조
본 실시예에서는 인간 폐 섬유아세포를 배양하고 그로부터 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스(이하 'hFDM)'라고도 한다.)를 제조하였다.
1. 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스 ( hFDM ) 제조 및 분석
(1) 인간 폐 섬유아세포 배양
19 내지 21 계대(passage)의 인간 폐 섬유아세포(WI-38 cell line; ATCC®-CCL-75TM, Manassas, VA)를 100 mm 지름의 테트리디쉬(petri-dish) 위에 1x104 cells/cm2의 밀도로 접종하였다. 상기 세포는 10 % 소태아혈청 (FBS), 1% 페니실린-스트렙토미신, 및 50 μg/mL 아스코르베이트-2-포스페이트(AAP)가 보충된 DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)(D-글루코스, L-글루타민, 소듐 피루베이트) 중에서 37 ℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 7-10일 동안 배양하였으며, 2-3일 마다 배지를 새로운 배지로 교환하였다.
(2) 인간 폐 섬유아세포의 탈세포화
7-10일 배양 후, 세포를 인산 완충 염수(phosphate buffered saline: PBS)로 2 회 세척하였다. 그 후, 탈세포화 용액(0.25% Triton X-100 및 50 mM NH4OH) 2 mL를 상기 디쉬에 첨가하고 상온에서 2 분 동안 방치하였다. 위상차 현미경을 통하여, 세포가 파괴되는 것을 확인하였다. 다음으로, 흡입장치를 이용하여 상기 디쉬로부터 상기 탈세포화 용액을 제거한 후 PBS로 두 번 세척하였다. 다음으로, 50 U/mL DNases와 2.5 ㎕/mL RNases를 함유한 PBS 용액 2 ml를 상기 디쉬에 첨가하고 37 ℃에서 2 내지 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 상기 디쉬를 PBS로 3회 세척하여 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스(hFDM)를 얻었다.
(3) hFDM 에 포함되어 있는 단백질의 분석
얻어진 hFDM에 대하여 면역형광염색, BCA 어세이 및 ELISA를 통하여 단백질을 분석하였다.
먼저, hFDM을 커버슬립 위에 부착시킨 후 세척하였다. hFDM이 부착된 커버슬립을 30 분 동안 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 중에서 고정시켰다. 다음으로, 상기 hFDM 시료를 0.2% Triton X-100을 함유한 PBS로 3회 세척하고, 3 % BSA 함유 PBS 중에 첨가하고 1 시간 동안 방치하였다. 다음으로, 상기 시료를 토끼 폴리클론 항-타입 I 콜라겐 항체(ab34710, Abcam)(1:300 희석), 생쥐 항-피브로넥틴 항체(SC-8422; Santa Cruz Biotechnology)(1:200 희석), 및 염소 항-라미닌 항체(SC-16590)(1:100 희석)를 각각 함유하는 1 % BSA 중에서 4 ℃에서 하룻밤 동안 각각 인큐베이션시켜 상기 항체가 상기 hFDM 중에 포함되어 있는 항원에 결합하도록 하였다. 그 후, 시료를 PBS로 3회 세척하고, 염소 항-생쥐 IgG의 Alexa Fluor® 488 F(ab') 단편(A-11017), 토끼 IgG-H&L에 대한 염소 폴리클론 항체의 Dylight 488(ab96899), Alexa Fluor® 594-접합된 당나귀 항-염소 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), 생쥐 IgG-H&L에 대한 Alexa Fluor® 647-접합된 염소 폴리클론 항체 (ab150115)와 같은 형광 표지된 이차 항체(1:1000 희석)와 함께 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 다음으로, DAPI를 포함한 탑재(mounting) 용액을 현미경 슬라이드 글라스에 한 방울 올리고 상기 커버슬립 자체를 올려 고정시켰다. 고정된 시료를 공촛점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과는, 도 2A에 나타내었다.
도 2A는 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스의 주요 단백질 성분인 피브로넥틴(Fn), 콜라겐(ColI), 및 라미닌(Ln)에 대한 면역형광 염색 결과를 나타낸 도면이다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, hFDM 내 주요 ECM 성분인 피브로넥틴(Fn), 콜라겐(ColI), 및 라미닌(Ln)이 관찰되고, DAPI 염색에서 알 수 있는 바와 같이 세포 핵은 거의 관찰되지 않았다. 상기 세포 핵은 탈세포화 과정에 의하여 파괴된 것으로 보인다.
또한, 상기 탈세포화 전과 후의 시료에 대하여 BCA 어세이를 통해 단백질의 양을 측정하였다. 탈세포화 후의 시료는 25 ul 액상 hFDM을 사용하였다. 또한 hFDM에 포함된 성장 인자를 정량적으로 분석하기 위해, 플레이트에서 배양된 인간 폐 섬유아세포의 탈세포화 전후 시료를 각각 PBS로 세척한 후 EDTA-없는 프로테아제 저해제 칵테일(cocktail)(78415 및 1862495; Thermo Scientific)을 포함하는 RIPA 세포 용해 완충액(R0278; Sigma)을 상기 디쉬에 넣고 1.7 mL 원심분리튜브로 모았다. 시료를 위아래로 피펫팅하여 현탁화하고 30 분 동안 2-8 ℃에서 부드럽게 흔들어 준 뒤, 14,000g에서 5 분 동안 원심분리 후 상층액을 깨끗한 시험관으로 옮겼다. 각 시료를 즉시 분석하거나 -70℃ 이하에서 냉동 보관하였다. 성장인자 VEGF와 bFGF 농도는 ELISA kit를 사용하여 각각 정량하였다.
도 2B는 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스 내 단백질 총량을 나타낸다. 도 2C는 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스 내 bFGF(C) 및 VEGF(D)의 양을 나타낸다. 도 2B는 마트릭스의 단위면적(cm2) 당 단백질 양을 BCA 분석을 통하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2B에서, before 및 after는 탈세포화 전과 후의 단백질의 양을 각각 나타낸다. 도 2C 및 2D는 마트릭스의 단위면적(cm2) 당 bFGF 및 VEGF의 양을 ELISA 분석을 통하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2C 및 2D에서, before 및 after는 탈세포화 전과 후 bFGF 및 VEGF의 양을 각각 나타낸다.
(4) hFDM 에 포함되어 있는 혈관 생성인자 ( angiogenic growth factor) 분석
(3)에서 hFDM을 RIPA 세포 용해 완충액으로 처리한 후 얻어진 상층액에서, 혈광생성인자를 포함하는 생리활성인자들의 양을 측정하였다. 측정은 'Proteome ProfilerTM Human Angiogenesis Array Kit'(ARY007, R&D system)의 매뉴얼에 기재된 지시에 따라 수행하였다. 구체적으로, 각각 항체가 코팅된 막을 이미 제공된 차단 버퍼(block buffer)에 담그고 세척하였다. 다음으로, 상기 차단된 막, 요구되는 양만큼의 검출 항체 및 300 ug hFDM 시료를 어레이 버퍼(array buffer) 1.5 ml 중에 첨가하고 락킹 진탕기(rocking shaker)에서 2-8 ℃에서 하룻밤 동안 유지하였다. 그 후, 세척 버퍼로 상기 막을 매회 10 분씩 세척버퍼(wash buffer concentrate: 895003)로 3회 세척한 뒤, 실온에서 30 분 동안 희석된 스트렙타빈-HRP를 첨가하고 인큐베이션시켰다. 그 후, 매회 10 분씩 세척버퍼(wash buffer concentrate: 895003)로 3회 세척한 후, 막은 4 분 동안 1 mL Chemi Reagent 혼합체와 반응시킨 후 LAS 3000 imaging system으로 스캔하여 유효 반응 여부를 확인하였다. 양성 반응으로 나타난 점들(dots)은 Multi gauge v3.0 software(FujiFilm)를 사용하여 상대적인 양을 도출하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 인간 폐 섬유아세포 유래 마트릭스에 포함된 혈관 생성 인자를 포함하는 생리활성인자들의 양을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에서, 세로 축은 표준화된 화학발광 강도를 나타내고, 가로축은 항원 단백질 종류를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, hFDM에는 다양한 혈관 성장 인자들뿐만 아니라 혈관 리모델링 관련 단백질을 포함하는 기타 성분들도 포함하고 있다.
실시예 2: hFDM 을 포함하는 3차원 복합체 제조
1. hFDM 을 포함하는 3차원 복합체 제조 및 평가
(1) 3차원 복합체 내 세포밀도 결정
본 절에서는 콜라겐 히드로겔에 HUVEC을 농도에 따라 접종하고 혈관형성에 적합한 세포 접종 농도를 결정하였다. 세포는 HUVEC(Lonza, CC-2517)을 사용하였다. 상기 콜라겐 히드로겔은 상업적으로 구입가능한 랫트 꼬리(rat tail) 콜라겐 타입 I 히드로겔(354236; Corning®)을 사용하였다.
구체적으로, 상기 콜라겐 히드로겔에 HUVEC을 0.25, 0.5, 1, 및 2×106 cells/mL 농도로 각각 접종하고, HUVEC이 접종된 콜라겐 히드로겔 30 ul(콜라겐은 겔화되기 전의 용액 상태)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 접종하고 37 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션시킨 후 배양액(EGM-2)을 80 ul씩 첨가하였다. 24 시간 경과 후 모세관-유사 구조(capillary-like structure: CLS)를 광학현미경 또는 톨루이딘 블루 O 염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 나타내었다.
도 4는 HUVEC 접종 농도에 따른 콜라겐 히드로겔에 형성된 모세관-유사 구조의 양을 나타낸 도면이다. 도 4에서, A는 광학현미경 이미지이고, B는 톨루이딘 블루 O에 의하여 염색된 것을 나타내는 이미지이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 접종 농도가 높은 수록 모세관-유사 구조가 많은 것을 확인하였다. 그에 따라, 이하 실험에서 HUVEC 세포 접종은 2x106 cells/mL로 사용하였다.
(2) 콜라겐의 농도와 크기 결정
상기 콜라겐 타입 I은 0.02 N 아세트산에서 3-4 mg/mL 범위의 농도의 액체이다. 본 연구에서는 1xM199 배지(Phenol Red, L-글루타민)에서 최종 농도 2.5 mg/mL 콜라겐(Corning®) 농도로서 1N NaOH을 사용하여 콜라겐의 pH 7.4를 확인하고 사용하였다. 상기 콜라겐은 쥐(rat) 꼬리 힘줄(rat tail tendon) 유래의 것이다. 상기 콜라겐은 점성이 매우 높지 않고 유동성이 있는 상태로서 얼음 위에서 상기 콜라겐에 HUVEC을 균일하게 섞어주었다. 상기 HUVEC 함유 콜라겐 중 최종 세포 밀도는 2x106 cells/mL이며 96-웰 반-웰 플레이트(half-well plate)의 각 웰 당 60 ㎕를 포함하도록 하였다. 상기 HUVEC 함유 콜라겐이 담긴 96-웰 반-웰 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 30 분 동안 인큐베이션시켜 콜라겐을 젤화(gelation)시켰다. 다음으로, 80 ㎕ EGM-2 배지(endothelial cell growth medium; BulletKit, CC-3162)(FBS, 히드로코르티손, hFGF, VEGF, IGF, 아스코르빈산, hEGF, GA-1000, 및 헤파린 함유)를 상기 플레이트의 각 웰에 첨가하고 동일한 조건에서 지정된 기간 동안 배양하였다.
(3) hFDM 을 포함하는 3차원 혈관 모델 제조
(3.1) hFDM -콜라겐 복합체 제조
실시예1에서 제조된 탈세포화를 통해 얻어진 hFDM과 상기 콜라겐 히드로겔을 혼합하여 복합체를 형성시켰다. 구체적으로, 실시예1에 나타낸 과정에 따라 탈세포화 후 직경 100 mm의 배양 플레이트에 부착된 hFDM을 스크레이퍼로 긁어 모은 후 이를 15 mL 코니컬 튜브로 옮기고 증류수 5 mL를 넣고 원심분리기에서 3000 rpm에서 3 분간 돌렸다. hFDM이 바닥에 가라앉은 것을 확인한 뒤 상층액을 제거하고 증류수 5 mL를 넣어 다시 한 번 동일한 조건에서 원심분리기를 돌렸다. 그 결과, 히드로겔 처럼 팽창된(swelling)된 형태의 hFDM이 형성되면, 원심분리를 통하여 상층액을 제거하였다. 이렇게 얻어진 hFDM은 지정된 특정 농도에서 (2)에서 제조된 1xM199 배지 중 2.5 mg/mL 콜라겐(pH 7.4)으로서 HUVEC 포함하고 있지 않은 것과 혼합하고 피펫팅하여 균질하게 섞어주었다. 그 결과 얻어진 높은 점성의 졸 형태 제제는 37 ℃ 인큐베이터에서 30 분 동안 인큐베이션시켜 젤화시켰다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 상기 지정된 hFDM의 단백질 농도(hFDM 중 총 단백질의 농도)는 100, 250, 및 500 μg/mL이며, 이때 mL은 2.5 mg/mL 콜라겐 용액의 부피를 의미한다. 한편 hFDM의 단백질 함량은 BCA 어세이에 의해 측정하였다.
도 5는 hFDM 및 콜라겐을 포함하는 3차원 복합체를 나타낸 도면이다. 도 5에서, 좌측은 HUVEC/콜라겐 복합체이고, 우측은 HUVEC/콜라겐/hFDM 복합체를 나타낸다.
(3.2) hFDM -콜라겐- HUVEC 복합체 제조
얻어진 hFDM-콜라겐 복합체에 HUVEC을 넣어 혼합하여, HUVEC 세포가 hFDM-콜라겐 복합체에 결합된 hFDM-콜라겐-HUVEC 복합체를 얻었다. 다음으로, hFDM-콜라겐-HUVEC 복합체 용액을 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7 일 동안 배양하고 배양 중 배지 교환은 매 2 일마다 하였다. 배양 완료 후, 배양물 중에서 신생 혈관 형성 정도를 평가하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 신생 혈관 형성 정도는 시료 중 F-액틴의 형태를 통하여 결정하였다. F-액틴과 핵은 HUVEC의 염색, 피브로넥틴은 hFDM의 염색을 위해 사용되었으며, F-액틴 염색을 통해 혈관 모양을 확인하였다.
도 6은 hFDM 함량이 HUVEC의 신생 혈관 형성에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 6은 공초점 현미경에 의하여 촬영된 hFDM-콜라겐-HUVEC 복합체의 배양물을 찍은 사진이다. HUVEC은 F-액틴(붉은색)과 DAPI(핵, 바란색) 염색으로, hFDM 내 존재하는 피브로넥틴은 형광 염색(녹색)을 통해 구분하였다. hFDM은 각각 0, 100, 250, 및 500 μg/mL 농도로 사용되었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, hFDM 농도가 증가함에 따라 혈관 형성이 증가하였다.
(4) hFDM 과 혈관성장인자( angiogenic growth factor)를 포함하는 3차원 혈관 모델 제조
본 절에서는 (3)에서 언급된 hFDM-콜라겐-HUVEC 복합체에 혈관 성장인자인 VEGF, bFGF, 및 SDF-1α 첨가가 혈관 형성에 미치는 영향을 확인하였다.
상기 혈관 성장인자는 각각 200 ng/mL 농도로 사용하였다. 시험군은 1) 콜라겐(Col), 2) 혈관 성장인자 포함 콜라겐 (Col/GFs), 3) hFDM 포함 콜라겐(Col/hFDM), 4) 혈관 성장인자와 hFDM 포함 콜라겐 (Col/hFDM/GFs) 그룹으로 나누어 평가하고 HUVEC은 2x106 cells/mL를 사용하였다. 여기서, 그룹 1의 콜라겐은 (2)에서 제조된 1xM199 배지 중 2.5 mg/mL 콜라겐에 HUVEC을 접종한 것을 나타낸다. 그룹 2는 (2)에서 제조된 1xM199 배지 중 2.5 mg/mL 콜라겐과 상기 성장인자를 혼합하고 여기에 HUVEC을 접종한 것을 나타낸다. 그룹 3은 (3)에서 설명한 바와 같이 hFDM-콜라겐을 포함하는 3차원 제형에 HUVEC을 접종한 것을 나타낸다. 그룹 4는 (3)에서 설명한 바와 같이 hFDM-콜라겐의 삼차원 제형에 성장인자를 첨가하여 혼합하고 여기에 HUVEC을 접종한 것을 나타낸다.
신생 혈관 생성 정도는 모세관-유사 구조 형성 정도를 측정하여 확인하였다. 모세관-유사 구조는 배양 3 일과 7 일차에 피브로넥틴, 로다민-팔로이딘(rhodomine-phalloidin), 및 DAPI 염색을 각각 진행하고 이를 공초점 현미경으로 관찰하여 확인하였다. 구체적으로, 고정된 시료들(n=4, 각 군)은 30 분 동안 0.2 % Triton-X 100에서 투과성으로 만들고, 2 시간 동안 3 % BSA 용액에 담근 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 토끼 항-피브로넥틴 일차 항체(SC-9068; Santa Cruz Biotechnology)(1:200 희석) 존재 하에서 인큐베이션하였다. 그 후, 시료를 매회 10 분 동안 5 회 PBS로 세척하고, 2 시간 동안 이차 항체인 염소 항-생쥐 IgG의 Alexa Fluor® 488 F(ab') 단편(A-11017), 토끼 IgG-H&L에 대한 염소 폴리클론 항체의 Dylight 488(ab96899), Alexa Fluor®594-접합된 당나귀 항-염소 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)와 더불어 Alexa Fluor-647이 접합된 로다민 레드-팔로이딘(rhodamine red-phalloidin) 중에서 배양하였다. DAPI는 세포 핵을 표지하기 위해 탑재(mounting) 과정에서 시료들에 처리하였다. 모든 과정 후, 시료들을 완전히 세척하고 공초점 현미경으로 찍은 관련 이미지(100x)는 신생 혈관 형성 정도를 정량적인 지표 즉, 혈관 세그먼트 수 및 전체 모세혈관 길이로 분석하기 위해 활용하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7A는 배양 3 일 및 7 일에 피브로넥틴(녹색), F-액틴(붉은색), 및 DAPI(파란색)에 대해 면역형광 염색을 실시한 결과이다. 도 7B는 배양 3 일 및 7 일에서 형성된 모세혈관 세그멘트 수를 나타낸 도면이다. 도 7C는 배양 3 일 및 7 일에서 형성된 모세혈관의 총 길이를 나타낸 도면이다. 도 7A-7C에 나타낸 바와 같이, hFDM 및 혈관 성장인자는 시간에 따라 혈관 형성을 촉진하였다.
또한, 도 7의 결과에 대하여, 신생 혈관 구조를 더 면밀히 분석하기 위해 좀 더 고배율(100)에서 관련 이미지를 확보하였고 신생 혈관의 내부(lumen) 직경을 수치화하여 3 일과 7 일차에서 비교하였다. 혈관 내부 구조를 식별하고 모세혈관 두께를 결정하기 위해, 연속적인 z-stack 이미지 즉, 1 μm 간격 두께를 가진 20-80 반복(iterations)을 공초점 현미경에서 확보하고 이를 Imaris software를 이용해서 3차원 형태로 재구성하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 도 7에 나타낸 혈관의 고배율 이미지로부터 시간에 따른 신생 혈관 내경의 변화를 정량적으로 분석한 결과이다. 도 8A는 피브로넥틴(녹색), F-액틴 (붉은색), 및 DAPI(파란색)에 대한 면역형광 염색 결과를 나타낸다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 3 일차와 7 일차에서 혈관-유사구조가 관찰되었다. 도 8B와 도 8C는 각각 3 일차 및 7 일차의 혈관의 루멘 지름을 나타낸 도면이다.
상기 4개 시험군에서 사용된 콜라겐 함유 구조체는 혈관형성 구조체(vasculogenic construct) 또는 혈관형성 촉진 구조체(vasculature formation stimulating construct)로서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 구조체는 예비적으로 혈관형성이 되어 있는 구조체로서, 이식물(implant)로서 상처 부위와 같은 혈관형성이 요구되는 부위에 이식하는데 사용될 수 있다.
실시예 3: 콜라겐 함유 혈관형성 구조체의 인 비보 상처 치료 효능의 확인
본 실시예에서는 실시예 2의 (4)절에 기재된 4개 시험군에 사용된 콜라겐 함유 혈관형성 구조체를 피부 결손 동물 모델에 이식하고, 상처 치료에 미치는 영향을 확인하였다.
1. 피부 결손 모델 제작 및 콜라겐 함유 혈관형성 구조체 이식
동물은 BALB/C 백서(수컷, 8주령)를 사용하였다. 동물은 일정한 온도 및 습도에서 사육하고 사료와 물은 자유롭게 섭취하며 사육실 환경에 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 모든 동물은 실험 전 졸레틸 0.6 ml/kg과 2 % 럼푼(0.4 ml/kg)의 혼합 주사제 1 ml/kg을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 다음으로, 등 부위의 피부를 70 % 에탄올로 소독하고, 생검 펀치(33-35, Integra)를 이용하여 직경 5 mm 크기로 진피층을 포함한 전층 결손 상처(full-thickness excisional wound)를 유발하였다.
실험군은 실시예 2의 (4)절에 기재된 4개 시험군 즉, 공통적으로 HUVEC을 포함하고, 1) 콜라겐(Col), 2) 콜라겐/성장인자(Col/GFs), 3) 콜라겐/hFDM (Col/hFDM), 및 4) 콜라겐/hFDM/성장인자(Col/hFDM/GFs)로 구성된 구조체를 사용하였다. 또한 모든 상처 부위에 직경 5 mm의 실리콘을 이식하여 구조체 고정 및 피부조직의 자가치유 가능성을 최소화하였다. 실험은 상기 실험군의 혈관형성 구조체(직경 11 mmm)를 상처 부위에 이식한 후 실리콘으로 덮은 뒤 그대로 유지하고, Tegaderm (3M Healthcare, St Paul, MN)을 이용하여 드레싱하고, 2-3일 마다 새 드레싱으로 교체하였다.
2. 육안적 상처 변화의 관찰 및 조직학적 검사
1에 기재한 바와 같이 혈관형성 구조체를 이식한 후, 일정 시점에 상처 부위를 촬영하였고 관련 이미지를 ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD)를 이용하여 상처 부위 면적을 시간대 별로 계산하였다. 또한, 14 일째 동물 모델을 희생시킨 후 창상 주위의 조직을 채취하여 조직학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 해당 조직 시료를 파라핀으로 포매한 후, 6 μm 두께로 조직의 절편을 제작하여 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin and eosin) (H&E) 염색과 마손 트리콤(Masson's trichrome) 염색을 각각 진행하고 광학현미경(Zeiss Axio Vert.A1, Germany)으로 검사하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 혈관형성 구조체를 생쥐의 피부 상처에 이식한 후 14 일 동안 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 도 9에서, A는 피부 상처 부위를 시간을 달리하여 찍은 도면이다. A에 나타낸 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 상처 부위가 작아져 상처가 치유됨을 알 수 있다. B는 시간에 따라 상처 크기를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸다. C는 이식 14일 후 상처 부위 조직을 헤마톡실린&에오신 염색한 결과를 나타낸다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 피부 재생은 4개 실험군 중 실험군 4 즉, Col/hFDM/GF 그룹이 가장 효과적이었다.
또한, 상처 조직의 일부 시료는 OCT(Optimal cutting temperature compound, Tissue-TekTM, 4583) 화합물을 사용하여 얼리고 냉절단(cryosection) 후, CD31과 α-SMA 특이적 면역형광 염색을 각각 실시하여 피부재생 관련 혈관 형성 인자를 표지하고, 이를 공초점 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 혈관생성 구조체가 이식된 상처 부위를 조직에 대하여 혈관 형성 인자에 대하여 면역형광 염색한 결과를 나타낸 도면이다. 상기 혈관 형성 관련 마커는 CD31 및 α-SMA이다. 도 10A는 혈관내피세포 지표 CD31과 혈관 외부세포 지표 α-SMA에 대한 면역형광 염색 결과를 나타내고, 도 10B는 신생 혈관 생성에 따른 면적당 혈관 밀도를 나타내고, 도 10C는 신생 혈관이 차지한 지역을 퍼센트로 보여준다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 피부 재생 또는 혈관 생성은 4개 실험군 중 실험군 4 즉, Col/hFDM/GF 그룹이 가장 효과적이었다.
3. 통계적 분석 (Statistical analysis)
상기에서 각 분석으로부터 얻어진 데이터는 평균±SD로 표현하였다. 각 실험 그룹들 간의 통계학적 유의성을 확인하기 위해 Student' t-test를 사용하였으며, p<0.05인 경우를 통계적 유의성이 있다고 판단하였다.

Claims (20)

  1. 제1 콜라겐, 및 세포외 마트릭스(extracellular matrix: ECM)를 포함하는, 생체접합성 조직을 제조하는데 사용하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 제1 콜라겐은 타입 I 콜라겐인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외 마트릭스는 세포를 탈세포화(decellularization)시켜 제조된 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외 마트릭스는 제2 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, VEGF, bFGF, 안지오게닌, 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 섬유아세포성장인자-산성(fibroblast growth factor-acidic:FGF-a), FGF-4, FGF-7, 간세포성장인자(hepatocyte growth factor:HGF), 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 메탈로프로테나제의 조직 저해제(tissue inhibitor of metalloproteinases:TIMP-1), 내피 플라스미노겐 활성자 저해제(endothelial plasminogen activator inhibitor:Serpin E1), 유로키나제 플라스미노겐 활성자(urokinase plasminogen activator:uPA), 악티빈 A, 암피레귤린(amphiregulin), 아르테민, 응고인자III(coagulation factor III), 엔도글린, IGFBP-3, IL-8, 및 트롬보스폰딘-1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 단백질은 세포외 마트릭스에 결합되어 있고 세포외 마트릭스의 기원과 동일한 세포로부터 유래된 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 제1 콜라겐 및 세포외 마트릭스의 함량은 무게 기준으로1.0: 0.04 내지 0.2의 비로 포함되어 있는 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 겔 형태인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 성장인자 및 세포 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 성장인자는 VEGF, bFGF, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 및 기질유래 인자(stromal derived factor:SDF)-α1로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 성장인자는 세포외 마트릭스의 기원과는 다른 기원으로부터 얻어진 것인 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 세포는 상기 조성물 중에서 배양되어 증식된 것인 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 세포는 인간탯줄정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)인 것인 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 조직은 혈관인 것인 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 혈관 특이적 튜브 구조를 포함하는 것인 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 혈관은 배양하는 동안 혈관 구조를 유지하는 것이고, 상기 배양은 온도 34 내지 40℃에서, pH 6.5 내지 pH 7.5에서 산소가 공급되는 상태에서 수행되는 것인 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서, 상처, 심부 궤양(deep ulcers), 당뇨성 궤양, 심근경색, 뇌졸증, 및 만성 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인 조성물.
  17. 청구항 1 내지 10, 및 청구항 13 내지 16 중 어느 한 항의 조성물과 세포를 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합물을 배지 중에서 배양하여 세포를 성장시키는 단계;를 포함하는, 생체적합성 조직을 제조하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 세포는 인간탯줄정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)이고, 상기 성장시키는 단계에서, 세포 성장에 의하여 3차원 혈관 구조가 형성되는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 조직은 혈관인 것인 방법.
  20. 청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관 형성이 필요한 질병을 치료하는 방법.
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