KR20180114770A - Biomarker for identification of genes related to inflammatory response after exposure to particulate matter 2.5 using human placenta cell line and the identification method using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(particulate matter 2.5, PM2.5) 특이적 노출 여부 확인용 염증성 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 태반 세포주에서 나타나는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an inflammatory biomarker for confirming specific exposure to particulate matter 2.5 (PM2.5) of less than 2.5 micrometer (㎛) and a method for identifying the same. More particularly, The present invention relates to a biomarker in which gene expression is specifically increased or decreased by exposure to fine dusts of less than a meter, and a method for identifying specific exposure of fine dusts of less than 2.5 micrometers using the biomarker.
입자의 크기가 10㎛(=0.001mm) 이하인 먼지를 미세먼지라고 부르며 대부분 연료 연소에 의해 인위적으로 발생되는 미세먼지는 직경이 10보다 작은 PM10과 직경이 2.5보다 작은 초미세먼지 PM2.5로 분류된다. 일반적으로 인체에 매우 심각한 영향을 끼칠 수 있는 PM2.5의 발생원은 대부분 연료 연소에 의해 발생되고 보일러, 자동차 및 발전시설 등의 배출물질이 주요 발생원이다. 그 외 공사장, 도로 등에서 비산되는 먼지도 많은 양을 차지한다.Dusts with a particle size of 10 μm (= 0.001 mm) or less are called fine dusts, and most of the fine dusts artificially generated by fuel combustion are classified as PM10 having a diameter smaller than 10 and PM2.5 having a diameter smaller than 2.5 do. Generally, the source of PM2.5, which can have a very serious effect on the human body, is mostly generated by fuel combustion and is a major source of emissions from boilers, automobiles and power generation facilities. In addition, dust scattering from construction sites and roads also occupies a large amount.
PM2.5는 크기가 작을수록 공기 중의 이동속도가 빠르며 약 1/3은 장거리 이동, 1/3은 지역에서의 직접적인 배출, 1/3은 공기 중 반응에 기인한다고 현재 추정되고 있다.It is estimated that PM2.5 is moving faster in the air as the size is smaller, about 1/3 is due to long-distance movement, 1/3 is direct discharge from the area, and 1/3 is due to air-borne reaction.
PM2.5는 직경이 2.5보다 작다는 특징을 가지므로 눈으로는 분간하기 어렵고, 나노크기의 초미세 입자를 포함하고 있어 폐포 깊숙이 침투할 뿐만 아니라 인체 조직을 통과해 다른 장기에 직·간접적으로 영향을 미칠 수 있는 가능성을 가지고 있다. PM2.5는 주로 호흡을 통해 인체에 유입되며 연료 연소에 의해 발생되기 때문에 공장이나 교통이 혼잡한 도로, 발전시설 등에서 과하게 노출될 수 있다.PM2.5 is characterized by its diameter smaller than 2.5, so it is difficult to distinguish it from the eyes. It contains nano-sized ultrafine particles, which not only penetrates deep into the alveoli but also penetrates through human tissues directly or indirectly to other organs Of the total number of deaths. PM2.5 is mainly infused into the human body through respiration and is generated by fuel combustion, so it can be overexposed to factories, traffic congested roads, and power generation facilities.
또한, PM2.5는 호흡기를 통해 폐질환을 일으키는 물질 중 하나이며, 장시간 노출될 경우 입자가 미세할수록 코 점막을 통해 걸러지지 않고 흡입 시 폐포까지 직접 침투하기에 천식, 아토피, 폐암 등의 질병들의 원인이 될 수 있으며 최근 연구에 따르면 뇌 조직에서 자철석 등 금속으로 구성된 초미세 입자가 발견되어 PM2.5가 혈관-조직 장벽을 투과하여 폐 이외에 다른 장기에도 영향을 줄 수 있음이 보고된 바 있다. 이러한 위해성 때문에 다중이용시설 등의 실내공기질 관리법에서는 신축 공동주택의 쾌적한 실내공기를 위하여 PM2.5의 대기환경기준은 연평균 25 μg/m3 이하, 하루 평균 50 μg/m3 이하로 두고 있다. 현재 PM2.5에 의해 건강에 미치는 영향이 더욱 크다는 보고가 증가하고 있으므로 환경부에서는 2015년부터 새로운 환경기준(연평균 μg/m3 이하)을 도입하여 시행하고 있다.In addition, PM2.5 is one of the substances that cause lung disease through the respiratory system. When it is exposed for a long time, the fine particles do not get caught through the nasal mucosa and penetrate directly into the alveoli when inhaled. Therefore, the diseases such as asthma, It has been reported that PM2.5 penetrates the blood-tissue barrier and can affect other organs besides the lungs, as recent research has found that ultrafine particles composed of metals such as magnetite in brain tissue. Because of this risk in the indoor air quality control laws, such as multi-use facilities for a comfortable indoor air of the new apartment house air quality standards of the PM2.5 are placed below the annual average of 25 μg / m 3 or less, per day, 50 μg / m 3. Since the increase in the impact on health by the current PM2.5 it reported more large in the Ministry of Environment has implemented the introduction of new environmental standards (annual μg / m 3 or less) since 2015.
국내 대기 중 PM2.5에 대한 오염도에 대한 자료는 공기 중에서 이동성이 크고 지역마다 분포농도, 조성 등의 차이가 커서 초미세먼지 물질의 특성상 이에 대한 조사 자료가 매우 부족하다. 이에 환경부는 효과적인 대책을 마련하기 위해 PM2.5의 장거리이동현황, 지역별 성분분석자료 수집에 기여하고 다량 배출사업장을 우선 대상으로 실태조사와 대책마련을 구상 중에 있다.The data on pollution degree of PM2.5 in domestic air are very mobility in the air and the distribution concentration and composition of each region are large, so that data on the characteristics of ultrafine dust are very insufficient. The Ministry of Environment, in order to provide effective measures, contributes to collecting data on the long-distance movement of PM2.5, regional analysis of each component,
또한, 황사, 미세먼지 PM10 등의 인체 독성 정도, 구성성분 분석 및 유전자 발현 변화에 대한 연구가 일부 보고되고 있지만, 초미세먼지 PM2.5 대한 연구는 구성성분 분석에 거의 국한되어 왔다.In addition, some studies on the degree of human toxicity, component analysis and gene expression changes of yellow dust, fine dust PM10, etc. have been reported, but studies on ultrafine dust PM2.5 have been limited to component analysis.
이외에도 여러 연구에 따르면 PM2.5와 같은 대기 오염의 증가는 임산부의 조산과 유산 및 태아의 발달저하 증가와 연관성이 있음이 보고되었다(Gavin Pereira, et al. Am J Epidemiol. 179(1):67-74;2014). 특히 임산부의 유산과 조산은 태반에서 발생되는 염증반응을 통해 그 가능성이 증가하는 만큼(Elovitz, Michal A., et al The American journal of pathology 163.5: 2103-2111; 2003.) PM2.5 노출로 인해 발생되는 태반의 염증반응관련 바이오 마커의 발굴이 PM2.5로 인해 임산부와 태아에서 나타날 수 있는 구체적인 유해영향과 위험성을 밝힐 수 있는 도구로 활용될 수 있을 것이라 판단된다.Other studies have also reported that increased air pollution, such as PM2.5, is associated with increased preterm labor and increased abortion and fetal development (Gavin Pereira, et al., Am J Epidemiol. 179 (1): 67 -74; 2014). In particular, miscarriage and prematurity of pregnant women are due to the increased possibility of placenta-induced inflammation (Elovitz, Michal A., et al., American Journal of pathology 163.5: 2103-2111; It is considered that the biomarkers related to the inflammatory response of the placenta can be used as a tool to reveal the specific harmful effects and risks that may occur in pregnant women and fetus due to PM2.5.
상기와 같이 인간에 대한 PM2.5의 잠재적 위해성에도 불구하고 PM2.5의 위해성 평가 데이터가 충분하지 않고, WHO에서 권고하는 PM2.5의 농도 수준이 대기 질 기준을 달성한다고 가정할 때 PM2.5의 농도 개선으로 기대되는 조기사망 감소의 건강 편익을 산출하는 분석방법의 불확실성과 제한점을 가지고 있다.Assuming that the PM2.5 risk assessment data are not sufficient and the WHO recommended concentration level of PM2.5 achieves the air quality standard despite the potential risks of PM2.5 to humans as described above, And the uncertainty and limitations of the analytical method that calculates the health benefits of expected early death reduction.
한편, 차세대염기서열분석법(NGS, Next generation sequencing)은 유전체를 무수히 많은 조각으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 유전체를 해독하는 분석방법으로, 2004년 인간게놈(genome)프로젝트 이후 Sanger 방법을 사용하여 처음으로 한 개인의 염기서열 정보가 해독 되었으며(Levy et al., Nature 456:2008) 뒤이어 2008년에는 기술의 발달로 인해 초기 염기 서열 정보 해독 기술의 1%의 비용으로 해독이 가능케 되었다(Wheeler DA et al., Nature 452:2008.) RNA-Seq은 NGS 기술로 transcriptome을 분석 할 수 있는 방법으로써, 특정 샘플에서 발현되는 RNA 서열을 시퀀싱하여, 어떤 exon들로 조합된 transcript가 발현이 되었는지, transcriptome에 대한 다양한 정보를 한 번에 알아낼 수 있는 방법이다. 유전자의 발현량을 비교하는 분석을 수행하거나, SNP, In/Del, alternative splicing과 같은 유전자 구조에 대한 분석도 및 통합적인 해석을 위해 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 시행한다.On the other hand, next generation sequencing (NGS) is a method of analyzing the genome by dividing the genome into a myriad of pieces and combining the nucleotide sequences of each. Using the Sanger method after the human genome project in 2004 (Levy et al., Nature 456: 2008) followed by the development of technology in 2008, which enabled decoding at a cost of 1% of the initial sequencing information decoding technology (Wheeler RNA-Seq is a method for analyzing transcriptomes using NGS technology, in which sequences of RNA expressed in a particular sample are sequenced to determine which exons have been transcribed, It is a way to get various information about transcriptome at once. RNA sequencing (RNA-seq) is performed for analysis of genetic structure such as SNP, In / Del, alternative splicing, and for integrated analysis.
최근 개발된 deep-sequencing 기술이 RNA-Seq에 사용되고 있다. 일반적으로 하나의 RNA 집단(전체 또는 Poly(A))은 하나 또는 양쪽 끝에 adaptor가 붙은 cDNA 조각들의 library로 전환이 된다. 증폭이 되었거나 그렇지 않은 각 분자들은 고 효율적인 방식으로 sequencing이 되어 한쪽 끝에서부터 짧은 서열을 얻거나(single-end sequencing) 또는 양쪽 끝에서 얻는다(paired-end sequencing). 획득된 서열들의 길이는 일반적으로 30-400bp이며, 사용된 시퀀싱 기술에 따라 달라진다. 현재 Illumina IG, Applied Biosystems SOLiD, Roche 454 Life Science systems 등의 기술이 RNA-seq에 적용 되고 있으며 시퀀싱 후에 결과로 나온 reads들은 표준 유전체 또는 표준 전사물에 정렬이 되며, 또는 유전체 서열이 없을 때 de novo로 assembly되어 전사적 구조와 각 유전자의 발현량을 구성으로 한 유전체 단위의 전사 지도를 생성한다. 최근 Microarray와 함께 RNA 시퀀싱 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다.Recently developed deep-sequencing technology is used in RNA-Seq. In general, one set of RNAs (whole or Poly (A)) is converted into a library of cDNA fragments with an adapter attached to one or both ends. Each molecule that is amplified or not is sequenced in a highly efficient manner to obtain a single sequence from one end (paired-end sequencing) or from both ends (paired-end sequencing). The length of the obtained sequences is generally 30-400 bp, depending on the sequencing technique used. Currently, techniques such as Illumina IG, Applied Biosystems SOLiD, and Roche 454 Life Science systems are being applied to RNA-seq, and the resulting reads after sequencing are aligned to standard or standard transcripts or de novo To generate a transcription map of the genome unit constituting the transcriptional structure and the expression amount of each gene. Recently, it has been combined with Microarray and Toxicogenomics research, which is an advanced technique using RNA sequencing technology. It can be applied to high-throughput drugs and candidate drugs, as well as representative environmental pollutants, And the quantitative analysis of the expression patterns of the genes expressed in the cells.
본 발명은 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지(PM2.5)의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, PM2.5에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 사용할 수 있는 태반 세포주를 이용한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지(PM2.5) 노출에 따른 염증반응 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 대한 전령 RNA 발현 여부 확인 방법을 제공하는 것이다.The present invention is useful for determining the monitoring and risk of micro-dust (PM 2.5) of less than 2.5 micrometers, and is useful as a tool to identify the toxic mechanism caused by PM 2.5, The present invention provides a kit for confirming the expression of an inflammatory response-related gene according to exposure to fine dust (PM2.5 or less), and a method for confirming the expression of messenger RNA in fine dusts of 2.5 micrometers or less using the kit.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 모든 전령 RNA(mRNA) 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된, 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(particulate matter 2.5, PM2.5) 노출 여부 확인용 염증반응 관련 마이크로어레이 칩이 제공된다.According to an aspect of the present invention, there is provided a method for detecting inflammation reaction for confirming exposure of particulate matter 2.5 (PM 2.5) below 2.5 micrometer (㎛) in which all messenger RNA (mRNA) A microarray chip is provided.
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유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000141655(TNFRSF11A, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator),A gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000141655 (TNFRSF11A, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000028137(TNFRSF1B, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000028137 (TNFRSF1B, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000163794(UCN, urocortin), 및The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000163794 (UCN, urocortin), and
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000143185(XCL2, chemokine (C motif) ligand 2).ENSG00000143185 (XCL2, chemokine (C motif) ligand 2).
그리고, 상기 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 수용성 추출액 또는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 유기성 추출액일 수 있다.The fine dust below 2.5 micrometer (mu m) may be an aqueous solution of fine dust less than 2.5 micrometer or a fine dust organic extract of less than 2.5 micrometer.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 마이크로어레이 칩을 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for confirming exposure of fine dusts of 2.5 micrometers (占 퐉) or less including a microarray chip.
상기 미세먼지 노출 여부 확인용 키트는 인간 체세포를 추가로 포함할 수 있고, 상기 체세포는 인간 태반 세포일 수 있으며, 상기 인간 태반 세포는 JEG3 일 수 있다.The kit for confirming exposure of the fine dust may further comprise a human somatic cell, and the somatic cell may be a human placenta cell, and the human placental cell may be JEG3.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, According to another aspect of the present invention,
1)실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;1) separating the respective RNAs from somatic cells isolated from the test body of the experimental group and somatic cells isolated from the normal individuals as the control group;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;2) synthesizing the RNA of the experimental group and the control group of step 1), respectively, with cDNA;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 전령 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및 3) performing RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) using primers capable of amplifying the messenger RNA integrated in the microarray chip of the above item 1 with the cDNA of the test group and the control group of step 2); And
4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지에 대한 전령 RNA 발현 여부 확인 방법이 제공된다.4) A method for confirming the expression of messenger RNA in fine dusts of 2.5 micrometers (쨉 m) or less is provided, which includes a step of comparing the degree of expression of the amplification product of the experimental group of step 3) with that of the control group.
그리고, 상기 체세포는 인간 태반 세포일 수 있으며, 상기 인간 태반 세포는 JEG3 일 수 있다.The somatic cells may be human placental cells, and the human placental cells may be JEG3.
본 발명에 따른 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 대한 염증반응 관련 전령 RNA 발현 여부 확인 방법은, 포집 장소가 다른 두 종류의 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지(PM2.5) 노출에 의해 태반 세포주 모델에서 공통으로 발현이 변화하는 염증반응 관련 유전자를 바이오마커로 이용하여 PM2.5의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, PM2.5에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 사용할 수 있다.A kit for confirming the exposure of fine dusts of less than 2.5 micrometers according to the present invention and a method for confirming the expression of messenger RNA associated with an inflammation reaction on fine dusts of less than 2.5 micrometers using the same, It is useful for the monitoring and risk assessment of PM2.5 using biomarkers of inflammation related genes whose expression is changed in common in placental cell line model by dust (PM2.5) exposure. Toxicity caused by PM2.5 It can be used as a tool to identify mechanism of action.
도 1은, 유전자염기서열분석을 이용한 두 가지 종류의 PM2.5에 노출된 인간 태반세포 시료에서의 전체 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2는, 유전자염기서열분석을 이용한 두 가지 종류의 PM2.5에 인간 태반세포 시료에서의 유전자 발현 양상을 분석한 결과에서 1.5배 이상 공통적으로 발현이 변화하는 염증성 유전자 45종의 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 이미지이다.1 is an image showing the result of analysis of the overall gene expression pattern in human placental cell samples exposed to two kinds of PM2.5 using gene sequencing.
FIG. 2 is a graph showing the expression patterns of 45 kinds of inflammatory genes whose expression is changed more than 1.5 times in the result of analysis of gene expression patterns in human placental cell samples by two kinds of PM2.5 using gene sequencing analysis This is an image showing a result.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The present invention is capable of various modifications and various embodiments, and specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. It is to be understood, however, that the invention is not to be limited to the specific embodiments, but includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the invention. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 대한 염증반응 관련 전령 RNA 발현 여부 확인 방법에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, a kit for confirming exposure of micro-dusts of less than 2.5 micrometers according to a specific embodiment of the present invention, and a method for confirming the expression of messenger RNA associated with an inflammatory reaction on micro-dusts of less than 2.5 micrometer using the same will be described in detail.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기의 모든 전령 RNA(mRNA) 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된, 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(particulate matter 2.5, PM2.5) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩이 제공된다.According to an aspect of the present invention, there is provided a microarray chip for confirming whether or not particulate matter 2.5 (PM2.5) is exposed with less than 2.5 micrometer (mu m) in which all the following messenger RNA (mRNA) / RTI >
본 발명의 다른 측면에 따르면, 마이크로어레이 칩을 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for confirming exposure of fine dusts of 2.5 micrometers (占 퐉) or less including a microarray chip.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, According to another aspect of the present invention,
1)실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;1) separating the respective RNAs from somatic cells isolated from the test body of the experimental group and somatic cells isolated from the normal individuals as the control group;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;2) synthesizing the RNA of the experimental group and the control group of step 1), respectively, with cDNA;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제1항의 마이크로어레이 칩에 3) The cDNA of the experimental group and the control group of step 2) were respectively added to the microarray chip
집적된 전령 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및 Performing RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) using a primer capable of amplifying integrated messenger RNA; And
4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지에 대한 전령 RNA 발현 여부 확인 방법이 제공된다.4) A method for confirming the expression of messenger RNA in fine dusts of 2.5 micrometers (쨉 m) or less is provided, which includes a step of comparing the degree of expression of the amplification product of the experimental group of step 3) with that of the control group.
본 발명자들은 HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA)을 이용하여 JEG3 인간 태반 세포주에서 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 유전자 발현 프로파일을 확보하고 분석하여 태반 세포주 모델에서 PM2.5 노출에 의해 공통으로 발현이 변화하는 염증반응 관련 유전자를 발굴하고 PM2.5 노출 시 유전자 발현 여부를 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors obtained and analyzed gene expression profiles of micro-dusts of 2.5 micrometer or less in JEG3 human placental cell line using HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA) and found that expression in the placental cell line model by PM2.5 The present inventors completed the present invention by establishing a biomarker capable of detecting the expression of a gene upon exposure to PM2.5 and a method of confirming exposure using the same.
본 발명은 세포주 모델에서의 포집장소가 다른 두 종류(실외 대기, 지하주차장)의 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(particulate matter 2.5, PM2.5) 노출에 의해 공통적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 염증반응 관련 바이오 마커를 제공한다.The present invention is characterized in that the expression of the cells is commonly caused by exposure to particulate matter 2.5 (PM 2.5) of 2.5 micrometer (㎛) or less in two different types of collection sites (outdoor air, underground parking lot) To provide a biomarker related to inflammation reaction for confirming exposure of fine dust less than 2.5 micrometers.
상기 바이오마커는 1.5배 이상 발현이 증가 또는 감소한 유전자로써, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 특이적으로 발현이 변화하는 45종의 유전자로 구성되어 있다.The biomarker is a gene having an expression increase or decrease of 1.5 times or more, and is composed of 45 kinds of genes whose expression changes specifically in fine dusts of 2.5 micrometers or less.
상기 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 나타내는 바이오마커는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.Preferably, the biomarker exhibiting a specific expression change according to the micro-dust exposure level of less than 2.5 micrometers is selected from the group consisting of the following, but is not limited thereto.
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000128271(ADORA2A, adenosine A2a receptor), Ensembl ID ENSG00000128271 (ADORA2A, adenosine A2a receptor),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000135046(ANXA1, annexin A1), Ensemble ID ENSG00000135046 (ANXA1, annexin A1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000131471(AOC3, amine oxidase, copper containing 3), Ensemble ID ENSG00000131471 (AOC3, amine oxidase, copper containing 3),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000158874(APOA2, apolipoprotein A-II), 유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000130707(ASS1, argininosuccinate synthase 1),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000158874 (APOA2, apolipoprotein A-II), the gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000130707 (ASS1, argininosuccinate synthase 1)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000095585(BLNK, B-cell linker),Ensemble ID ENSG00000095585 (BLNK, B-cell linker),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000183049 (CAMK1D, calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000183049 (CAMK1D, calcium / calmodulin-dependent protein kinase ID)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000102962(CCL22, chemokine (C-C motif) ligand 22),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000102962 (CCL22, chemokine (C-C motif) ligand 22),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000131142(CCL25, chemokine (C-C motif) ligand 25),Ensemble ID ENSG00000131142 (CCL25, chemokine (C-C motif) ligand 25),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000205021(CCL3L1, chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000205021 (CCL3L1, C-C motif) ligand 3-like 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000205020(CCL4L1, chemokine (C-C motif) ligand 4-like 1),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000205020 (CCL4L1, chemokine (C-C motif) ligand 4-like 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000139610(CELA1, chymotrypsin-like elastase family, member 1),Ensemble ID ENSG00000139610 (CELA1, chymotrypsin-like elastase family, member 1)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000140835(CHST4, carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000140835 (CHST4, carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000172243(CLEC7A, C-type lectin domain family 7, member A),Ensemble ID ENSG00000172243 (CLEC7A, C-type lectin domain family 7, member A)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000184371(CSF1, colony stimulating factor 1),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000184371 (CSF1, colony stimulating factor 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000165457(FOLR2, folate receptor 2),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000165457 (FOLR2, folate receptor 2),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000048052(HDAC9, histone deacetylase 9),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000048052 (HDAC9, histone deacetylase 9)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000100292(HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1),Ensemble ID ENSG00000100292 (HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000196639(HRH1, histamine receptor H1), 유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000131203(IDO1, indoleamine 2,3-ENSG00000196639 (HRH1, histamine receptor H1), Ensembl ID ENSG00000131203 (IDO1, indoleamine 2,3-
dioxygenase 1),dioxygenase 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000110944(IL23A, interleukin 23, alpha subunit p19),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000110944 (IL23A, interleukin 23, alpha subunit p19)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000164509(IL31RA, interleukin 31 receptor A),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000164509 (IL31RA, interleukin 31 receptor A),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000160712(IL6R, interleukin 6 receptor), 유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000139187(KLRG1, killer cell lectin-like (EN6), the gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000160712 (IL6R, interleukin 6 receptor), the ENT ID number ENSG00000139187 (KLRG1, killer cell lectin-
receptor subfamily G, member 1),receptor subfamily G, member 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000168961(LGALS9, lectin, galactoside-binding, soluble, 9),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000168961 (LGALS9, lectin, galactoside-binding, soluble, 9)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000213906(LTB4R2, leukotriene B4 receptor 2),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000213906 (LTB4R2, leukotriene B4 receptor 2),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000140795(MYLK3, myosin light chain kinase 3),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000140795 (MYLK3, myosin light chain kinase 3),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000100968(NFATC4, nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 4),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000100968 (NFATC4, nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 4)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000091592(NLRP1, NLR family, pyrin domain containing 1),Ensemble ID ENSG00000091592 (NLRP1, NLR family, pyrin domain containing 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000086991(NOX4, NADPH oxidase 4),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000086991 (NOX4, NADPH oxidase 4),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000176046(NUPR1, nuclear protein, transcriptional regulator, 1),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000176046 (NUPR1, nuclear protein, transcriptional regulator, 1)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000109205(ODAM, odontogenic, ameloblast asssociated),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000109205 (ODAM, odontogenic, ameloblast asssociated),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000065675(PRKCQ, protein kinase C, theta),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000065675 (PRKCQ, protein kinase C, theta)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000184304(PRKD1, protein kinase D1),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000184304 (PRKD1, protein kinase D1)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000050628(PTGER3, prostaglandin E receptor 3 (subtype EP3)),Ensembl ID ENSG00000050628 (PTGER3, prostaglandin E receptor 3 (subtype EP3)),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000104856(RELB, v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000104856 (RELB, v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000115884(SDC1, syndecan 1),Ensemble ID ENSG00000115884 (SDC1, syndecan 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000130768(SMPDL3B, sphingomyelin phosphodiesterase, acid-like 3B),Ensemble ID ENSG00000130768 (SMPDL3B, sphingomyelin phosphodiesterase, acid-like 3B),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000176170(SPHK1, sphingosine kinase),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000176170 (SPHK1, sphingosine kinase),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000174123(TLR10, toll-like receptor 10),Ensembl ID ENSG00000174123 (TLR10, toll-like receptor 10),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000232810(TNF, tumor necrosis factor),Ensembl ID ENSG00000232810 (TNF, tumor necrosis factor)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000141655(TNFRSF11A, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator),A gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000141655 (TNFRSF11A, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000028137(TNFRSF1B, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B),The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000028137 (TNFRSF1B, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000163794(UCN, urocortin), 및The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000163794 (UCN, urocortin), and
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000143185(XCL2, chemokine (C motif) ligand 2).ENSG00000143185 (XCL2, chemokine (C motif) ligand 2).
상기 미세먼지 추출액은 하기 단계들을 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:The fine dust extract is preferably, but not limited to, prepared by a manufacturing method comprising the following steps:
1) 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지를 포집하는 단계;1) collecting fine dust less than 2.5 micrometers;
2) 단계 1)의 포집한 미세먼지를 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 및2) extracting the collected fine dust in step 1) by adding an extraction solvent; And
3) 단계 2)의 추출물을 여과하는 단계. 3) filtering the extract of step 2).
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 추출용매는 물, 알코올, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기의 물로는 정제 또는 증류한 것이 바람직하며, 3차 증류수 이용하는 것이 더욱 바람직하다. In this method, the extraction solvent of step 2) is preferably water, alcohol, dichloromethane or a mixture thereof. The above-mentioned water is preferably purified or distilled, and it is more preferable to use tertiary distilled water.
상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 초음파 분쇄기 및 하이 볼륨 에어 샘플러를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 초음파 분쇄기 시간은 20 내지 60 분인 것이 바람직하고, 30 분이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.As the alcohol, C1 to C2 lower alcohol is preferably used, and as the lower alcohol, ethanol or methanol is preferably used. As the extraction method, it is preferable to use an ultrasonic pulverizer and a high volume air sampler, but it is not limited thereto. In addition, the ultrasonic pulverizer time is preferably 20 to 60 minutes, more preferably 30 minutes, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 특이적 노출 여부 확인용 염증성 바이오마커를 발굴하기 위하여, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 수용성 추출액, 유기성 추출액을 1개의 Quartz Filter를 24시간 ± 30분 동안 포집을 하였다. 포집된 10개의 필터는 각각 절반의 크기로 나누어져서 수용성 추출액과 유기성 추출액으로 나누어서 각각 150ml 증류수와 디클로로메탄(dichloromethane)을 이용하여 30분간 초음파 분쇄기에 넣어서 추출공정을 수행하였다. 상기 실험을 3회 실시(30개의 필터)하여 각각의 수용성 추출액과 유기성 추출액을 하나의 수용성 추출액, 유기성 추출액을 제작하였다.In an embodiment of the present invention, in order to find an inflammatory biomarker for confirming whether or not specific microparticles have been exposed to less than 2.5 micrometers, a microparticle aqueous extract solution of 2.5 micrometers or less, a quartz filter of 24 hours Collected for ± 30 minutes. The 10 filters were divided into half size and separated into aqueous extract and organic extract, respectively, and the extraction process was performed by adding 150 ml of distilled water and dichloromethane to the ultrasonic mill for 30 minutes. The above experiment was carried out three times (30 filters), and each of the water-soluble extract and the organic extract was used as a water-soluble extract and an organic extract.
추출된 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 추출액은 포집 당시 대기 중 미세먼지 구성비에 맞춰 혼합한 뒤 JEG3 인간 태반 세포주에 처리하였다. 상기 물질을 처리한 JEG3 태반 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성한 뒤 HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA)을 이용해 해당 유전자들의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석을 통해 mRNA의 유전자 및 발현 정도를 확인 하였으며, 실험군 및 대조군의 신호 강도 비율이 1.5 배 이상 차이나는 경우만 PM2.5 노출에 의해 발현이 변화한 유전자로 분류하였다. 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 수용성 추출액 및 유기성 추출액에 의하여 공통적으로 발현이 변화한 염증반응과 연관이 있는 상술한 바 있는 유전자 45종을 선발하였다.Extracted micro-dust extracts below 2.5 micrometer were mixed with airborne micro dust composition ratio at the time of collection and then treated with JEG3 human placental cell line. MRNA was isolated from the JEG3 placental cell line treated with the above material, and the cDNAs were synthesized, and the nucleotide sequences of the genes were analyzed using HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA). The mRNA gene and expression level were confirmed by base sequence analysis and classified as genes whose expression was changed by PM2.5 exposure only when the signal intensity ratio of the experimental group and the control group was 1.5 times or more different. A total of 45 genes were identified that were associated with inflammatory responses that were commonly expressed by aqueous extracts of microdispersions below 2.5 micrometers and organic extracts.
따라서, 본 발명에 따른 바이오 마커는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 특이적으로 발현되는 염증성 유전자를 확인함으로써, 이는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부를 확인, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 모니터링, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 위해성 판정, 및 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 의해 야기되는 독성 작용 기작 규명하는 도구로 유용하게 사용할 수 있다.Therefore, the biomarker according to the present invention identifies an inflammatory gene specifically expressed in fine dusts of less than 2.5 micrometers, thereby confirming whether or not fine dusts of less than 2.5 micrometers are present, monitoring fine dusts of less than 2.5 micrometers, It can be usefully used as a tool to determine the risk of sub-meter fine dust, and the mechanism of toxic action caused by fine dust less than 2.5 micrometers.
또한, 본 발명은 상기 유전자염기서열분석을 이용한 PM2.5 노출에 대한 유전자 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for confirming gene expression for PM2.5 exposure using the above gene sequence analysis.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, According to another aspect of the present invention,
1) 실험군인 피검체로부터 분리된 체세포 및 대조군인 정상개체로부터 분리된 체세포에서 각각의 RNA를 분리하는 단계;1) separating the respective RNAs from somatic cells isolated from the test body of the experimental group and somatic cells isolated from the normal individuals as the control group;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;2) synthesizing the RNA of the experimental group and the control group of step 1), respectively, with cDNA;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 전령 RNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및 3) performing RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) using primers capable of amplifying the messenger RNA integrated in the microarray chip of the above item 1 with the cDNA of the test group and the control group of step 2); And
4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지에 대한 전령 RNA 발현 여부 확인 방법이 제공된다. 4) A method for confirming the expression of messenger RNA in fine dusts of 2.5 micrometers (쨉 m) or less is provided, which includes a step of comparing the degree of expression of the amplification product of the experimental group of step 3) with that of the control group.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포 시료는 구체적으로 PM2.5에 노출되거나 노출되지 않은 인간의 태반 세포인 것이나 이에 한정되지 않고, 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.In the above method, the somatic cell sample of step 1) is specifically a human placental cell that is neither exposed nor exposed to PM2.5, but any cell derived from a tissue can be used.
또한, 상기 방법에 있어서, 인간 태반 세포는 구체적으로 JEG3인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In addition, in the above method, the human placental cell is preferably JEG3, but is not limited thereto.
상기 단계 2)에서는 RNA로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하며, 상기 RNA로부터 분리된 mRNA 정제 방법은 oligo dT를 포함하는 magnetic beads를 이용한 immunoprecipitation 방법이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 mRNA 정제 및 분리방법 모두 사용 가능하다.In the above step 2), cDNA is synthesized from mRNA isolated from RNA, and mRNA purification method separated from the RNA is preferably an immunoprecipitation method using magnetic beads including oligo dT, but it is not limited thereto, and mRNA purified And separation methods are all usable.
상기 방법에 있어서, 염기서열 분석 도구는 HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA)를 이용한 paired-end 100 sequencing 방법이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.In this method, the base sequence analysis tool is preferably a paired-end 100 sequencing method using HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA), but is not limited thereto.
또한, 단계 4)의 분석 방법은 진스프링(GeneSpring) GX 12.6.1 소프트웨어(Agilent, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.Also, the analysis method of step 4) is preferably to use GeneSpring GX 12.6.1 software (Agilent, USA), but it is not limited thereto, and analysis software known to those skilled in the art may be used.
본 발명은 유전자 염기서열 방법을 포함하는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for confirming exposure of fine dusts of 2.5 micrometers or less including a gene sequencing method.
상기 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트는 인간 태반 세포를 추가로 포함한다.The kit for confirming exposure of fine dust below 2.5 micrometers further includes human placental cells.
상기 인간 태반 세포 시료는 PM2.5에 노출되거나 노출되지 않은 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. It is preferred that the human placental cell sample is obtained from a group that is exposed to PM2.5 or not.
상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, total RNA로부터 mRNA를 분리 하기 위한 oligo dT beads, cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, dNTP 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 연결효소(ligase), 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 RNA-seq을 위한 mRNA 혼성화 및 cDNA합성과 증폭 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.The reaction reagent may further comprise a buffer solution used for hybridization, oligo dT beads for separating mRNA from total RNA, reverse transcriptase for synthesizing cDNA, dNTP and rNTP But the present invention is not limited thereto. For example, mRNA hybridization for RNA-seq known to those skilled in the art, and reaction reagents necessary for cDNA synthesis and amplification reactions can be included. have.
따라서, 본 발명에 따른 키트는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 특이적으로 발현이 변화되는 염증성 유전자임을 확인함으로써, 이는 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부를 확인, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 모니터링, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 위해성 판정, 및 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 의해 야기되는 독성 작용 기작 규명하는 도구로 유용하게 사용할 수 있다.Therefore, it is confirmed that the kit according to the present invention is an inflammatory gene whose expression is specifically changed in fine dusts of 2.5 micrometers or less. Thus, it is possible to confirm whether the micro dust is exposed to 2.5 micrometer or less, It can be usefully used as a tool for determining the risk of micro-dust below micrometer, and a toxic action mechanism caused by micro-dust below 2.5 micrometer.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. It should be understood, however, that these examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the present invention.
실시예Example 1 : 2.51: 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 Submicrometer fine dust 포집Capture 및 추출 And extraction
1-1. 1-1. 포집Capture 장소 선정 Place selection
PM2.5 노출에 대한 염증반응 관련 유전자 발현 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 상당한 교통량을 가지고 있는 도로로 보고된 성북구 월곡역 부근의 내부 순환로와 인접하고 있는 서울시 성북구 하월곡동에 위치하고 있는 한국과학기술연구원 체육관 옥상과 함께 일 최대 161대가 수용 가능한 한국 과학기술연구원 내 지하주차장을 시료 포집 장소로 선정하여 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지를 포집하였다. 하이 볼륨 에어 샘플러를 선택하여 실험을 진행하였으며, 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 전용 Inlet(Tisch Instrument Company)은 유체역학적 크기(Aerodynamic Size)가 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지보다 그 이상의 것은 그 무게의 관성을 이기지 못하고 유막(oil)에 부딪혀 정지하고, 이 과정을 거친 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지는 Quartz Filter를 이용하여 포집된다.In order to identify biomarkers for the detection of inflammatory response-related gene expression in PM2.5 exposure, the Korea Science and Technology Research Institute, located in Haewok-dong, Seongbuk-gu, Seoul, We picked fine dust below 2.5 micrometer (㎛) by selecting the underground parking lot of Korea Institute of Science and Technology (KIST) which can accommodate up to 161 days together with the gym roof. Experiments were conducted by selecting a high-volume air sampler. Inlet (Tisch Instrument Company) of less than 2.5 micrometers had an aerodynamic size of less than 2.5 micrometers, After stopping the process, the fine dusts of 2.5 micrometer or less through the process are collected by using a Quartz filter.
1-2. 1-2. 포집Capture 방법 Way
하이 볼륨 에어 샘플러 사용 시, 2.5 마이크로미터 이하 입자를 추출하기 위한 Quartz Microfiber Filter를 사용하였으며, 추출 용매로는 정제수(distilled water, 18.2 ㏁)와 디클로로메탄(dichloromethane)을 이용하였다. 포집된 시료는 질소가스를 이용 용매 완전히 제거한 후, 0.1 mg 까지 측정할 수 있는 초정밀저울계(Mettler Toledo Company)를 이용하여 시료의 총 무게를 칭량하였다. 표집 후 필터의 안쪽 면을 서로 만나게 접은 이후, 암실 및 밀폐효과가 있는 지퍼 백(Zipper bag)에 넣어서 시료를 사용하기 전까지 -80에서 보관하고, 포집 장소까지 이동시에는 아이스박스(Ice box)를 이용하여 이동하였다. 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 포집을 위해서는 적정유량속도(1.13 ㎥/min ± 10%)를 유지하였다. When using high volume air sampler, Quartz Microfiber Filter was used to extract particles less than 2.5 micrometers. Distilled water (18.2 MΩ) and dichloromethane were used as extraction solvent. The collected sample was completely removed by using a nitrogen gas, and then the total weight of the sample was weighed using an ultra-fine scale system (Mettler Toledo Company) capable of measuring up to 0.1 mg. After the sampling, fold the inner side of the filter together and put it in a dark room and a zipper bag with airtight effect. Store it at -80 until the sample is used. When moving to the collection place, use an ice box Respectively. The appropriate flow rate (1.13 m3 / min ± 10%) was maintained for fine dust collection of less than 2.5 micrometers.
1-3. 1-3. 포집시료Collection sample 추출 extraction
포집한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지의 성분분석을 위하여 한 장의 필터를 1/2로 나누어 사용하였고, 추출 용매로는 수용성(water soluble) 성분 추출을 위한 초순수 정제수(증류수)와 유기성(organic soluble) 성분 추출을 위한 디클로로메탄을 이용하였다. 추출공정 경로에 따라 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 수용성 및 유기성 추출액을 확보하였으며, 사용시에는 대기 중 미세먼지 구성비와 혼합하여 사용하였다.For the analysis of the components of fine dust less than 2.5 micrometers, one filter was divided into two, and the extraction solvent was purified water (distilled water) and organic soluble component Dichloromethane was used for extraction. According to the extraction process route, micro-dust water-soluble and organic extracts of less than 2.5 micrometers were obtained, and they were mixed with the composition ratio of fine dust in the air during use.
실시예Example 2 : 2.52: 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출에 따른 세포 독성 확인 Cytotoxicity following micrometer exposure to fine dust
2-1. 세포배양2-1. Cell culture
인간 태반 세포주인 JEG3 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibco, 미국)를 이용하여 100 밀리미터(mm) 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다.JEG3 cells (Korean Cell Line Bank), a human placenta cell line, were cultured in a 100 mm dish using DMEM medium (Gibco, USA) supplemented with 10% FBS until it grew to about 80%.
2-2. 세포독성 실험(2-2. Cytotoxicity experiment ( MTTMTT assay) 및 화학 물질 처리 assay) and chemical treatment
JEG3 인간 태반 세포주를 이용한 MTT 실험은 24웰 플레이트에 5 × 105/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibco, 미국)에서 24시간 배양한 뒤 수용성과 유기성 PM2.5 시료가 농도별로 혼합된 배지를 처리하고 48시간 배양한 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 용액 5 ㎎/㎖을 혼합하여 5% CO2, 37에서 1 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 각 웰에서 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 0.5㎖에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.MTT experiments using JEG3 human placental cell line were performed in DMEM medium (Gibco, USA) for 24 hours at a density of 5 × 10 5 cells / well in a 24-well plate, and then treated with a mixture of water-soluble and organic PM2.5 And cultured for 48 hours. Then, 5 mg / ml of MTT (3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) solution was mixed and cultured for 1 hour at 37 ° C in 5% CO 2 . The medium was then removed and the formazan crystals formed in each well were dissolved in 0.5 ml of DMSO. The plate was transferred to a 96-well plate and aliquoted and the OD value measured at 540 nm absorbance.
그 결과, JEG3 세포주에서 실외 대기 PM2.5와 지하 주차장 PM2.5 노출로 인해 나타나는 세포독성에서 80%의 생존율을 보이는 농도(IC20)는 실외 대기 시료의 경우 51.30 ug/ml, 지하 주차장의 경우 118.42 ug/ml 이었으며, 상기 결과를 바탕으로 유전자 염기서열 분석 실험을 수행하였다.As a result, the survival rate (IC 20 ) of 80% in the cytotoxicity due to outdoor air PM 2.5 and PM 2.5 exposure in the JEG 3 cell line was 51.30 ug / ml for outdoor air samples, 118.42 ug / ml. Based on the above results, a gene sequencing analysis experiment was performed.
실시예Example 3 : 유전자 염기서열 분석 실험 3: Gene sequencing analysis experiment
3-1. 표적 RNA의 분리 3-1. Isolation of target RNA
PM2.5 노출군과 비노출군 체세포시료로부터의 total RNA 추출은 트리졸을 이용한 RNA 추출기법을 사용하여 추출하였고, 키아젠(Qiagen)사의 RNeasy 미니키트(RNeasy Mini kit)(Cat NO.74106)을 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-결핍 DNase 세트(RNase-free DNase set)(Qiagen, USA)를 사용하여 제거한다. 각 전체 RNA 시료의 농도는 분광광도계인 나노드롭(NanoDrop) ND 2000 분광강도계(spectrophotometer)(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 측정하며 RNA의 질적상태는 에질런트 2100 생물 분석기(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용하여 측정한다. 추출된 total RNA로부터 염기서열 분석에 필요한 mRNA의 분리는 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria)를 이용 제조사의 실험조건에 맞추어 mRNA만 선택적으로 분리하였다.Total RNA extraction from PM2.5 exposed and unexposed somatic cell samples was extracted using RNA extraction using a triazole and the RNeasy Mini kit (Cat NO.74106) from Qiagen ≪ / RTI > Genomic DNA is removed during RNA purification using an RNase-free DNase set (Qiagen, USA). The concentration of each total RNA sample was measured using a spectrophotometer NanoDrop ND 2000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies Inc., USA) and the qualitative state of the RNA was measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer ). To isolate mRNA from the extracted total RNA, mRNA was selectively isolated using the SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria) according to the manufacturer's experimental conditions.
3-2. cDNA 제조 3-2. cDNA production
유전자 염기서열 분석을 위하여 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 추출액 처리군의 분리된 mRNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 mRNA로부터 cDNA의 합성은 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria)를 이용 제조사의 실험조건에 맞추어 진행하였다. mRNA 10 ㎕과 비선택적 프라이머(Starter/Stopper heterodimer) 2 ㎕ 그리고 역전사효소 및 연결효소 혼합액 15 ㎕을 혼합하고 thermoMixer에서 25 5분, 37에서 1시간 차례로 반응시키며 어닐링(annealing)시켰으며, 상기 합성된 cDNA는 결합된 oligo dT magnetic beads를 분리하는 과정을 통해 정제 하였다.For gene sequencing, cDNAs were prepared using the separated mRNAs of the micro-dust extract-treated group of <2.5 μm obtained in Example <1-3> above. Synthesis of cDNA from the mRNA thus obtained was carried out using the SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria) according to the manufacturer's experimental conditions. 10 μl of mRNA, 2 μl of a non-selective primer (Starter / Stopper heterodimer) and 15 μl of a reverse transcription enzyme and a conjugated enzyme mixture were mixed and annealed by reacting in a thermo-mixer for 255 minutes at 37 ° C for 1 hour, The cDNA was purified by sequencing the bound oligo dT magnetic beads.
3-3. cDNA증폭3-3. cDNA amplification
유전자 증폭 및 정제과정은 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria)를 이용 제조사의 실험조건에 맞추어 진행하였다. 구체적으로, 하기 [표 1]와 같은 혼합액들을 차례로 준비된 cDNA시료 17㎕ 에 넣어 만들어 넣고 잘 섞은 후 98 30초 변성 시킨 뒤 98 10초, 65 에서 20초 72에서 30초씩을 11 ~ 25회 진행 마지막으로 72 1분 Extension하는 PCR 과정을 거쳐 cDNA를 증폭시켰다.Gene amplification and purification were performed using the SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc., Austria) according to the manufacturer's experimental conditions. Concretely, the mixed solutions as shown in [Table 1] were put into 17 μl of the prepared cDNA samples, mixed well, and denatured for 98 seconds, and then subjected to 11 to 25 times for 98 seconds, 65 to 20 seconds and 72 to 30 seconds And amplified by PCR for 72 1 min extension.
3-4. 염기서열 분석3-4. Sequencing
증폭된 cDNA는 HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA)을 이용 as paired-end 100 sequencing방법을 통해 유전자 염기서열을 분석하였으며, 이를 바탕으로 공개 소프트웨어 BIOCONDUCTOR(version 3.0) 을 이용해 해당 유전자들의 발현 양상을 확인 하였다. 추출된 데이터는 에질런트 진스프링 GX 12.6.1(Agilent GeneSpring GX 12.6.1)(Agilent technologies)를 이용하여 정상화(normalization)을 거쳐 각 유전자의 발현양상을 분석하였다.The amplified cDNA was analyzed by as paired-end 100 sequencing method using HiSeq 2000 (Illumina, Inc., USA). Based on this analysis, expression patterns of the genes were analyzed using open software BIOCONDUCTOR (version 3.0) Respectively. The extracted data were normalized using Agilent GX 12.6.1 (Agilent Technologies GX 12.6.1) (Agilent technologies) to analyze the expression pattern of each gene.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 유전자 염기서열 분석결과 발현이 변화하는 유전자를 진스프링(GeneSpring) GX 12.6.1 소프트웨어를 사용하여 노출군과 비노출군의 유전자 발현 양상을 확보하였다(도 1). 분석 결과, 발현이 1.5배 이상 발현된 유전자가 45종이 측정되었다(표 2, 도 2). 상기 유전자가 태반 세포주 모델에서의 PM2.5 노출 시 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.As a result, as shown in FIG. 2, the genes whose expression was changed as a result of gene sequence analysis were analyzed using GeneSpring GX 12.6.1 software to ensure gene expression patterns in exposed and unexposed groups (FIG. 1). As a result of analysis, 45 genes expressing expression 1.5 times or more were measured (Table 2, Fig. 2). There is no report that the gene is associated with toxicity at PM2.5 exposure in a placental cell line model.
등록번호
(Ensembl ID ID)
Registration Number
(Ensembl ID ID)
유전자명
Gene name
본 발명에 따른 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 키트, 및 이를 이용한 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지에 대한 전령 RNA 발현 여부 확인 방법은 포집 장소가 다른 두 종류의 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지(PM2.5) 노출에 의해 공통으로 발현이 변화하는 염증반응 관련 유전자를 바이오마커로 이용하여 PM2.5의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, PM2.5에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.The kit for confirming exposure of fine dusts of less than 2.5 micrometer according to the present invention and the method for confirming the expression of messenger RNA in fine dusts of less than 2.5 micrometers using two kinds of micro dusts of less than 2.5 micrometer (PM2. 5) It is useful for monitoring PM2.5 and determining the risk of PM2.5 by using inflammation related genes whose expression is changed by exposure as a biomarker. It is useful as a tool to identify the toxic mechanism caused by PM2.5 It can be used.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
Claims (9)
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000128271(ADORA2A, adenosine A2a receptor),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000135046(ANXA1, annexin A1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000131471(AOC3, amine oxidase, copper containing 3),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000158874(APOA2, apolipoprotein A-II), 유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000130707(ASS1, argininosuccinate synthase 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000095585(BLNK, B-cell linker),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000183049 (CAMK1D, calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000102962(CCL22, chemokine (C-C motif) ligand 22),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000131142(CCL25, chemokine (C-C motif) ligand 25),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000205021(CCL3L1, chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000205020(CCL4L1, chemokine (C-C motif) ligand 4-like 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000139610(CELA1, chymotrypsin-like elastase family, member 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000140835(CHST4, carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000172243(CLEC7A, C-type lectin domain family 7, member A),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000184371(CSF1, colony stimulating factor 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000165457(FOLR2, folate receptor 2),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000048052(HDAC9, histone deacetylase 9),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000100292(HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000196639(HRH1, histamine receptor H1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000131203(IDO1, indoleamine 2,3-dioxygenase 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000110944(IL23A, interleukin 23, alpha subunit p19),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000164509(IL31RA, interleukin 31 receptor A),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000160712(IL6R, interleukin 6 receptor),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000139187(KLRG1, killer cell lectin-like receptor subfamily G, member 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000168961(LGALS9, lectin, galactoside-binding, soluble, 9),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000213906(LTB4R2, leukotriene B4 receptor 2),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000140795(MYLK3, myosin light chain kinase 3),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000100968(NFATC4, nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 4),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000091592(NLRP1, NLR family, pyrin domain containing 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000086991(NOX4, NADPH oxidase 4),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000176046(NUPR1, nuclear protein, transcriptional regulator, 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000109205(ODAM, odontogenic, ameloblast asssociated),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000065675(PRKCQ, protein kinase C, theta),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000184304(PRKD1, protein kinase D1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000050628(PTGER3, prostaglandin E receptor 3 (subtype EP3)),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000104856(RELB, v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000115884(SDC1, syndecan 1),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000130768(SMPDL3B, sphingomyelin phosphodiesterase, acid-like 3B),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000176170(SPHK1, sphingosine kinase),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000174123(TLR10, toll-like receptor 10),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000232810(TNF, tumor necrosis factor),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000141655(TNFRSF11A, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000028137(TNFRSF1B, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B),
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000163794(UCN, urocortin), 및
유전자 등록ID(Ensembl ID) ENSG00000143185(XCL2, chemokine (C motif) ligand 2).
A microarray chip for confirming exposure of particulate matter 2.5 (PM2.5) of 2.5 micrometer (㎛) or less in which all the following messenger RNA (mRNA) or complementary strand molecules thereof are integrated:
Ensembl ID ENSG00000128271 (ADORA2A, adenosine A2a receptor),
Ensemble ID ENSG00000135046 (ANXA1, annexin A1),
Ensemble ID ENSG00000131471 (AOC3, amine oxidase, copper containing 3),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000158874 (APOA2, apolipoprotein A-II), the gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000130707 (ASS1, argininosuccinate synthase 1)
Ensemble ID ENSG00000095585 (BLNK, B-cell linker),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000183049 (CAMK1D, calcium / calmodulin-dependent protein kinase ID)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000102962 (CCL22, chemokine (CC motif) ligand 22),
Ensemble ID ENSG00000131142 (CCL25, chemokine (CC motif) ligand 25),
Ensemble ID ENSG00000205021 (CCL3L1, chemokine (CC motif) ligand 3-like 1),
Ensemble ID ENSG00000205020 (CCL4L1, chemokine (CC motif) ligand 4-like 1),
Ensemble ID ENSG00000139610 (CELA1, chymotrypsin-like elastase family, member 1)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000140835 (CHST4, carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 4)
Ensemble ID ENSG00000172243 (CLEC7A, C-type lectin domain family 7, member A)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000184371 (CSF1, colony stimulating factor 1),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000165457 (FOLR2, folate receptor 2),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000048052 (HDAC9, histone deacetylase 9)
Ensemble ID ENSG00000100292 (HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000196639 (HRH1, histamine receptor H1)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000131203 (IDO1, indoleamine 2,3-dioxygenase 1),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000110944 (IL23A, interleukin 23, alpha subunit p19)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000164509 (IL31RA, interleukin 31 receptor A),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000160712 (IL6R, interleukin 6 receptor)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000139187 (KLRG1, killer cell lectin-like receptor subfamily G, member 1)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000168961 (LGALS9, lectin, galactoside-binding, soluble, 9)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000213906 (LTB4R2, leukotriene B4 receptor 2),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000140795 (MYLK3, myosin light chain kinase 3),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000100968 (NFATC4, nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 4)
Ensemble ID ENSG00000091592 (NLRP1, NLR family, pyrin domain containing 1),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000086991 (NOX4, NADPH oxidase 4),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000176046 (NUPR1, nuclear protein, transcriptional regulator, 1)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000109205 (ODAM, odontogenic, ameloblast asssociated),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000065675 (PRKCQ, protein kinase C, theta)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000184304 (PRKD1, protein kinase D1)
Ensembl ID ENSG00000050628 (PTGER3, prostaglandin E receptor 3 (subtype EP3)),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000104856 (RELB, v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B)
Ensemble ID ENSG00000115884 (SDC1, syndecan 1),
Ensemble ID ENSG00000130768 (SMPDL3B, sphingomyelin phosphodiesterase, acid-like 3B),
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000176170 (SPHK1, sphingosine kinase),
Ensembl ID ENSG00000174123 (TLR10, toll-like receptor 10),
Ensembl ID ENSG00000232810 (TNF, tumor necrosis factor)
A gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000141655 (TNFRSF11A, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, NFKB activator)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000028137 (TNFRSF1B, tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B)
The gene registration ID (Ensembl ID) ENSG00000163794 (UCN, urocortin), and
ENSG00000143185 (XCL2, chemokine (C motif) ligand 2).
[3] The micro-dust according to claim 1, wherein the fine dust less than 2.5 micrometer (micrometer) is a micro-dust water-soluble extract of less than 2.5 micrometer or a fine dust organic extract of less than 2.5 micrometer. Array chip.
A kit for confirming exposure of fine dust below 2.5 micrometer (占 퐉) comprising the microarray chip of claim 1.
4. The kit according to claim 3, further comprising a human somatic cell.
5. The kit according to claim 4, wherein the somatic cells are human placental cells.
6. The kit according to claim 5, wherein the human placental cell is JEG3.
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 각각 cDNA로 합성하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 cDNA를 각각 제1항의 마이크로어레이 칩에 집적된 전령 RNA(mRNA)를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 RT-PCR(Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 실험군의 증폭산물의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지에 대한 전령 RNA(mRNA) 발현 여부 확인 방법.
1) separating the respective RNAs from somatic cells isolated from the test body of the experimental group and somatic cells isolated from the normal individuals as the control group;
2) synthesizing the RNA of the experimental group and the control group of step 1), respectively, with cDNA;
3) Performing RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) using the primers capable of amplifying the messenger RNA (mRNA) integrated in the microarray chip of the above item 1 with the cDNAs of the experimental group and the control group of step 2) ; And
4) A method for confirming the expression of messenger RNA (mRNA) for fine dusts of 2.5 micrometers (쨉 m) or less including the step of comparing the expression level of the amplification product of the experimental group of step 3) with that of the control group.
[8] The method according to claim 7, wherein the somatic cell is a human placental cell.
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| KR20150008252A (en) * | 2013-07-11 | 2015-01-22 | 한국과학기술연구원 | microRNAs for identification of exposure to particulate matter 2.5 and the method of identification using thereof |
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