KR101079714B1 - Specific biomarker for identification of genes after human exposure to toluene and the method of identification using thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 휘발성 유기 화합물류 중의 하나인 톨루엔(Toluene)의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 톨루엔의 노출 정도에 따라 특이적으로 유전자 발현이 변화하는 바이오 마커 및 이를 이용한 톨루엔에 대한 인체 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오 마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오 마커로 이용하여 환경 중 노출된 인체 시료에서 톨루엔의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 톨루엔에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.The present invention relates to a biomarker for confirming the expression of a specific gene causing expression change according to the degree of human exposure of toluene, which is one of volatile organic compounds, and more specifically, to a degree of exposure of toluene. The present invention relates to a biomarker with specific gene expression changes and a method for identifying human exposure to toluene using the same, and the biomarker according to the present invention uses a reaction gene selected through a DNA microarray chip as a biomarker. It can be usefully used to monitor and determine the contamination of toluene in human samples exposed to the environment, and can be used as a tool to identify the toxic effects caused by toluene.

Description

톨루엔의 인체 노출에 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법{Specific biomarker for identification of genes after human exposure to toluene and the method of identification using thereof}Specific biomarker for identification of genes after human exposure to toluene and the method of identification using knowledge}

본 발명은 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 톨루엔의 노출 정도에 따라 특이적으로 유전자 발현이 변화하는 바이오 마커 및 이를 이용한 톨루엔에 대한 인체 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a biomarker for confirming the expression of specific genes whose expression changes according to the degree of human exposure to toluene, and a method of identifying the same using the same. More specifically, the expression of genes specifically changes according to the degree of exposure of toluene. The present invention relates to a biomarker and a method for confirming human exposure to toluene using the same.

휘발성 유기 화합물류 중에서 톨루엔은 석유, 석탄 및 스틸렌 생산 공정에서 발생하는 부산물, 화학적 중간매체 및 담배연기 등에 포함되어 있다. Among volatile organic compounds, toluene is included in by-products, chemical intermediates, and tobacco smoke generated from petroleum, coal, and styrene production processes.

톨루엔은 휘발성이 있으며 토양에서의 휘발성이 다른 화합물에 비해 빠르다. 대기중 반감기가 빨라 넓은 지역으로의 이동이 용이하며 표면수에서 공기 중으로의 이동도 빠르다. 톨루엔은 무색투명한 가연성으로서 방향성 벤젠과 유사한 냄새가 나고 알코올, 클로로포름, 에테르, 성유에테르, 아세톤, 빙초산, 이황화탄소, 벤젠 및 아세트산 등과 혼합되나 물(0.067%)에는 녹지 않는다. 톨루엔은 주로 화학 합성 시 중간제, 화학용제 등으로 사용되며 인체 발암성 자료로서 역학 자료는 거의 없다. 자연발생적 오염원은 화산, 산불, 원유 등이며 인공적 오염원으로는 자동차 배기장치, 가솔린 저장탱크, 주유소, 소화기 등이 있다. 톨루엔을 처음에는 톨루발삼(tolu balsam)을 건류하여 얻었으며, 19세기 후반에는 석탄 건류(탄화)의 부산물을 이용하여 생산하였으며 2차 대전 후, 석유로부터 톨루엔 제조가 증가하였고 코크(coke)와 석탄타르는 감소하였다. 현재는 87%의 톨루엔은 정제분류의 촉매 개질(reforming)에 의해 생산되고 9%는 에틸렌과 프로필렌 제조 시 증기분해 반응탑에서 유도된 가솔린 열분해 과정에서 분리된다. 그 외 4%는 다른 과정의 부산물에서 생산되고 있다. 톨루엔은 일부 초목의 유형에서 자연적으로 발생하기도 하나(Toxicological Profile for Toluene, U.S.;2000), 주된 오염원으로는 석유 정제공정, 코크스 오븐공정, 페인트, 잉크, 신나, 접착제, 화장품의 성분 및 스티렌 등 다른 화학물질의 생산 등에 사용되며 이로 인하여 환경 중으로 배출된다(환경부, 1997).Toluene is volatile and fast in soil compared to other compounds. Its fast half-life in the atmosphere makes it easy to move to large areas, and it is also fast in surface water to air. Toluene is a colorless, transparent flammable, smells like aromatic benzene and is mixed with alcohol, chloroform, ether, petroleum ether, acetone, glacial acetic acid, carbon disulfide, benzene and acetic acid, but insoluble in water (0.067%). Toluene is mainly used as an intermediate and chemical solvent in chemical synthesis, and there are few epidemiological data as human carcinogenicity data. Natural sources of pollution include volcanoes, forest fires and crude oil. Artificial sources of pollution include automobile exhaust systems, gasoline storage tanks, gas stations and fire extinguishers. Toluene was first obtained by distilling tolu balsam. In the late 19th century, toluene was produced using by-products of coal drying (carbonization). After World War II, toluene production increased from petroleum, coke and coal. Tar was reduced. At present, 87% of toluene is produced by catalytic reforming of the refinery fraction and 9% is separated in gasoline pyrolysis process induced in the steam cracking reactor in the production of ethylene and propylene. The other 4% is produced by other processes. Toluene occurs naturally in some vegetation types (Toxicological Profile for Toluene, US; 2000), but the main contaminants include petroleum refining processes, coke oven processes, paints, inks, thinners, adhesives, cosmetic ingredients and styrene. It is used for the production of chemicals, etc., and is thus released into the environment (Ministry of Environment, 1997).

톨루엔은 유기용매로서 널리 이용되어 도료나 접착제 등에 사용되어 왔으며 체내에 과량 흡입될 경우 복통, 구토와 같은 위장관계의 기능장애를 초래할 뿐만 아니라 두통, 현훈 및 환각증세와 같은 신경장애를 일으킨다고 알려져 있다. 더욱이 근대산업이 발달함에 따라 산업체 근로자가 과량의 유기용매에 장기간 노출되는 경우가 날로 증가하고 있으며 근래 일부 청소년층에서 도취감을 얻기 위한 수단으로 접착제를 통한 톨루엔의 흡입이 유행되고 있어 이의 흡입이 생체기능, 특히 정신신경계에 미치는 효과 규명이 긴요한 과제로 대두하고 있다. 급성 또는 만성적인 톨루엔 흡입은 자율신경계를 포함한 중추신경계의 기능장애를 유발하며 EEG의 변화와 아세틸콜린(acetylcholine)을 포함한 신경 전도 물질의 분비 및 대사에 변화를 초래한다. 톨루엔은 벤젠 고리 중의 하나인 -H가 알킬기(-CH3)로 바뀐 것으로 가소제나 합성섬유 등의 합성원료로 사용이 되며 톨루엔은 벤젠보다 피부나 점막에 주는 자극이 강하며 증기흡입에 의한 중추신경에 주는 작용도 벤젠보다 강하다고 한다. 100 ~ 200 ppm의 증기를 8시간 흡입하면 피로, 구토, 감각저하, 운동불능, 무기력, 졸림 등의 증상을 보이며 600ppm 정도의 농도가 되면 단시간 노출만으로 심한 흥분, 강한 피로감, 구토, 두통을 일으킨다. Toluene has been widely used as an organic solvent and has been used in paints and adhesives. When it is inhaled in the body, it is known to cause gastrointestinal dysfunction such as abdominal pain and vomiting, as well as neurological disorders such as headache, dizziness and hallucinations. . Moreover, with the development of modern industries, industrial workers are increasingly exposed to excessive organic solvents for a long time, and in recent years, inhalation of toluene through adhesives has become popular as a means of obtaining euphoria in some youth groups. In particular, the identification of effects on the mental nervous system has emerged as an important task. Acute or chronic toluene inhalation causes dysfunction of the central nervous system, including the autonomic nervous system, and changes in EEG and the secretion and metabolism of neuroconductors, including acetylcholine. Toluene is one of the benzene rings, -H is converted into alkyl group (-CH3). It is used as a synthetic material for plasticizers and synthetic fibers. Toluene is more irritating to the skin and mucous membranes than benzene, Its action is also stronger than benzene. Inhalation of 100 ~ 200 ppm of steam for 8 hours may cause symptoms such as fatigue, vomiting, hypoesthesia, incompetence, lethargy, drowsiness, and concentrations of about 600ppm cause severe excitement, strong fatigue, vomiting and headaches with only a short exposure.

국내 식품 및 소비재 중 톨루엔에 대한 오염도 자료는 휘발성이 높은 톨루엔이라는 물질의 특성상 조사 자료의 미흡하다. 국내 톨루엔이 함유되어 있는 제품은 최근 유사휘발유로 제품화되어 나온 첨가제 등의 자동차원료, 폭약, 염료, 페인트, 잉크, 접착제, 인공 가죽 제조, 용매, 화장품, 의약품, 락카 희석제, 수지류, 세제 및 향료 등으로 다양하며(환경부, 1997 : 국립환경연구원, 환경자료집, 1999), 이들 제품 사용시 호흡기 및 피부접촉을 통해 인체 노출 가능성은 있으나 접착제(10% 미만)와 물휴지(불검출)에서만 톨루엔 농도를 규제하고 있다(식품의약품안전청 위해예방정책국).Pollution degree data on toluene in domestic food and consumer products is insufficient due to the characteristics of toluene, which is highly volatile. Domestic toluene-containing products include automotive raw materials, explosives, dyes, paints, inks, adhesives, artificial leather, solvents, cosmetics, pharmaceuticals, lacquer thinners, resins, detergents and fragrances. (Ministry of Environment, 1997: National Institute of Environmental Research, Environmental Data Collection, 1999) .The use of these products may expose humans through respiratory and skin contact, but toluene concentrations should be regulated only in adhesives (less than 10%) and in water (non-detection). (Hazard Prevention Policy Bureau, Korea Food and Drug Administration).

또한, 휘발성 유기 화합물류의 인체 독성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 휘발성 유기 화합물류로 알려진 포름알데하이드, 벤젠(Formaldehyde, Benzene)등에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 톨루엔의 인간에 대한 잠재적 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나, 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 더욱 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 백혈병과 같은 혈액관련 질병을 진단할 수 있는 유전자 발현여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 톨루엔의 인체 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
In addition, some studies on human toxicity and gene expression changes of volatile organic compounds have been reported, but are limited to studies on formaldehyde, benzene (Formaldehyde, Benzene), etc., which are known as representative volatile organic compounds. Despite the potential risks of toluene in humans, there are not enough risk assessment data in humans, and the method of exposure detection is also a classic such as Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS) or High Performance Liquid Chromatography (HPLC). It is limited to the traditional way. Quantification is possible by using GC-MS or HPLC method, but it is necessary to set proper conditions for analysis and expensive equipment is required. Therefore, faster and easier screening methods, such as real-time reverse transcript polymerase chain reaction (PCR) or DNA microarray chips using primers, can be used in humans through rapid risk assessment. It is an important task to discover and utilize molecular indicators that can detect the toxic effects of humans, especially the expression of genes to diagnose blood-related diseases such as leukemia, and to carry out appropriate measures and management of human exposure to toluene. would.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
Several genome sequencing projects, including six mammals and 292 microbes, have been completed and reported to the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Genome-wide expression studies are being conducted to study the function of genes based on the vast amount of data obtained. DNA microarray analysis is performed to analyze the expression of thousands of genes in one experiment (Schena, M., et al. , Proc . Natl. Acad . Sci . USA) . 93: 10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).
Microarrays integrate a set of oligonucleotides of cDNA (complementary DNA) or 20-25 base pairs in length on glass. cDNA microarrays are produced by labs in schools or by companies such as Agilent, Genomic Solutions, etc., by mechanically immobilizing cDNA collection on a chip or by using ink jetting (Sellheyer K. et. al., J. Am). . Acad Dermatol 51:.. 681-692 , 2004). Oligonucleotide microarrays are prepared by Affymetrix by direct synthesis on a chip using photolithography, and Agillent et al. Are produced by immobilizing synthesized oligonucleotides (Sellheyer, K.). et. al., J. Am . Acad . Dermatol . 51: 681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 한 개의 형광(예: Cy3)나 주로 두 개의 다른 형광(예: Cy3 및 Cy5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).To analyze gene expression, RNA is obtained from samples such as tissues and hybridized with oligonucleotides in DNA microarrays. The resulting RNA is labeled with fluorescence or isotope and converted to cDNA. The oligo microarray is labeled with a single fluorescence (e.g. Cy3) or mainly two different fluorescences (e.g. Cy3 and Cy5) to perform hybridization on the same chip at the same time by labeling the control and experimental groups, respectively. Get the strength of and analyze the result. Gene expression is determined according to the ratio of the two fluorescence intensities (Somasundaram, K. et al. , Genomics Proteomics I: 1-10, 2002).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 인체에서의 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.
In combination with recent research on toxic genomics (Toxicogenomics), an advanced technique using DNA macroarray technology, high-throughput expression in specific tissues or cell lines by all chemicals, including pharmaceuticals and new drug candidates, as well as representative environmental pollutants Analysis and quantitative analysis of expression patterns of genes are now possible. Accordingly, by analyzing the frequency of expression of specific genes in the human body, it is possible to discover genes related to the adverse effects of drugs and the harmful effects of environmental pollutants. The mechanism will be understood and further the search and identification of substances causing toxicity and side effects will be possible.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 톨루엔의 유전자 발현 프로파일을 실제 톨루엔에 노출된 작업장의 근로자로부터 혈액시료를 얻어 관찰 및 분석함으로써 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자를 발굴하고 톨루엔 인체 노출시 유전자 발현 여부를 검출할 수 있는 바이오 마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors observed and analyzed the gene expression profile of toluene by obtaining a blood sample from a worker in a workplace exposed to toluene using an oligomicroarray in which 44,000 human genes were accumulated and expressed according to the degree of human exposure of toluene. The present invention has been completed by discovering this changing specific gene and establishing a biomarker capable of detecting gene expression upon exposure of toluene to humans and a method for confirming exposure using the same.

본 발명의 목적은 톨루엔의 인체 노출에 의해 특이적으로 발현이 변화되는 바이오 마커 및 상기 바이오 마커를 이용한 톨루엔에 대한 인체 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a biomarker whose expression is specifically changed by human exposure of toluene and a method for identifying human exposure to toluene using the biomarker.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 톨루엔의 인체 노출 여부 확인용 바이오 마커를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker for confirming human exposure to toluene, characterized in that the expression changes specifically depending on the degree of human exposure to toluene.

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 톨루엔에 대한 인체 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.The present invention also provides a DNA microarray chip for identifying human exposure to toluene in which an oligonucleotide including the whole or part of the biomarker gene sequence or its complementary strand molecule is integrated.

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커를 이용한 톨루엔의 인체 노출에 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for confirming the expression of a gene specific for human exposure of toluene using the biomarker.

또한, 본 발명은 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a detection kit for confirming the expression of a specific gene whose expression changes according to the degree of human exposure of toluene.

아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 바이오 마커 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.
In addition, the present invention provides a kit for identifying specific genes whose expression changes depending on the degree of human exposure of toluene, including a primer set for amplifying the biomarker gene of the present invention.

본 발명의 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오 마커로 이용하여 톨루엔의 모니터링 및 인체 위해성을 판정하는데 유용하며, 톨루엔에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.
The biomarker for confirming the expression of a specific gene whose expression changes according to the degree of human exposure of toluene of the present invention, and the method of confirming the same using the DNA microarray chip as a biomarker for monitoring toluene and the human body It is useful for determining the risk and can be used as a tool to identify the mechanism of toxic action caused by toluene.

도 1은 마이크로어레이 칩을 이용한 톨루엔과 트리클로로에틸렌에 노출된 인간 혈액시료에서의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 트리클로로에틸렌과 비교 분석 시 톨루엔에서만 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
1 is a graph showing the results of analysis of gene expression patterns in human blood samples exposed to toluene and trichloroethylene using a microarray chip.
2 is a graph showing the results of analyzing gene expression showing a specific expression change only in toluene when compared with trichloroethylene.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 톨루엔의 인체 노출에 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커를 제공한다.The present invention provides a biomarker for confirming gene expression specific to human exposure to toluene, characterized in that the expression changes specifically depending on the degree of human exposure to toluene.

상기 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 일으키는 유전자는 유전자 등록번호(Genebank) NM_000532(PCCB, propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide)인 유전자인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.Genes that specifically change the expression according to the degree of human exposure to toluene is characterized in that the gene is a gene (Genebank) NM_000532 (PCCB, propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide), but is not limited thereto.

상기 바이오 마커는 p-value < 0.00001인 유전자들 중 1.3 fold change 이상으로 유의성 있게 발현을 보인 것을 특징으로 하는 바이오 마커이다.
The biomarker is a biomarker characterized by a significant expression of more than 1.3 fold change among genes having a p-value <0.00001.

본 발명자들은 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커를 발굴하기 위하여, 인천지역 소재의 톨루엔을 취급하는 U 사업장의 근로자들을 대상으로, 사업장의 작업환경을 측정한 결과(N=3) 톨루엔에 노출되는 것으로 추정되었다(표 1 참조). 본래 생물학적 모니터링 대상자를 선정하기 위해서는 사업장 전체 근로자의 개인 노출 농도가 바람직하나 본 연구에서는 09년 노동부 작업환경측정 정도 관리 규정에 의하여 시행한 결과를 토대로 사업장별로 3개 지점의 측정치를 이용하였다.
The present inventors measure the working environment of the workplace, targeting workers in the U workplace dealing with toluene in Incheon, in order to discover a biomarker for confirming the expression of specific genes whose expression changes according to the degree of human exposure of toluene. One result (N = 3) was estimated to be toluene (see Table 1). Originally, it is desirable to select individual subjects for biological monitoring. However, in this study, three sites were used for each workplace based on the results of the Ministry of Labor's Work Environment Measurement Quality Control Regulations in 2009.

물질별 공기 중 노출농도(작업환경측정 결과)Airborne concentration by substance (work environment measurement results) 사업장명Business name 물질명Material name 작업환경측정 결과(ppm)Work environment measurement result (ppm) 노출기준(ppm)
Impression criterion (ppm)
1 지점1 point 2 지점2 points 3 지점3 branch U 사업장U workplace 톨루엔toluene 13.3813.38 5.835.83 6.336.33 5050

이후 상기 농도의 톨루엔에 노출된 근로자의 혈액시료와 톨루엔에 노출되지 않은 근로자의 혈액시료로부터 mRNA를 분리하여 증폭시킨 후 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광표지된 aRNA(amplified RNA)를 44 k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome microarray(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 1 참조). 분석 시 비노출군에 비해 유의하게 발현 변이를 나타낸 유전자들을 Parametric test use all available estimates, Multiple Testing Correction - Benjamini and Hochberg False Discovery Rate를 통해서 p-value < 0.00001인 유전자들 중 1.3 fold change 이상 증가 혹은 감소하는 유전자들로 선별하였다. 이때, 다른 대표적인 휘발성 유기 화합물류 중 하나인 트리클로로에틸렌에 의한 유전자 발현 프로파일과 비교분석 시 두 물질 모두에서 공통으로 발현된 유전자 40종을 제외한 톨루엔에서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자를 선별한 결과 증가한 유전자가 77종, 감소한 유전자가 256종으로 총 333종이었다. 이 중 톨루엔의 혈중 농도에 따라 그 발현이 감소한 유전자 1종을 선정하였다. 상기 유전자는 다른 화학물질에 의해서 급성 또는 만성적으로 톨루엔을 흡입했을 경우 나타나는 증상인 자율신경계를 포함한 중추신경계의 기능장애나 백혈병 등에 관여한다고 보고되었으나, 표 2의 톨루엔을 처리했을 때, 실제 인체에서 같은 증상을 나타낸다는 보고는 없다.
Thereafter, mRNA was isolated and amplified from the blood sample of the worker exposed to the toluene and the blood sample of the worker not exposed to toluene, and then labeled with fluorescent material (Cy3). The fluorescently labeled aRNA was hybridized with a 44 k oligomicroarray chip Human whole genome microarray (Agilent, USA), and the fluorescent image was scanned to analyze the difference in gene expression patterns (see FIG. 1). Genes showing significant expression variation compared to non-exposed group were increased or decreased more than 1.3 fold change among p-value <0.00001 through Parametric test use all available estimates, Multiple Testing Correction-Benjamini and Hochberg False Discovery Rate. The genes were selected. At this time, the gene expression profile by trichloroethylene, one of the other representative volatile organic compounds, and the result of screening for genes whose expression changed specifically in toluene except for 40 genes commonly expressed in both substances 77 genes increased and 256 genes decreased, totaling 333. Among them, one kind of gene whose expression was reduced according to the blood concentration of toluene was selected. The gene has been reported to be involved in dysfunction or leukemia of the central nervous system including the autonomic nervous system, which is a symptom of acute or chronic inhalation of toluene by other chemicals. There are no reports of symptoms.

PCCB 발현과 관련 질병PCCB Expression and Related Diseases 등록번호Registration Number 유전자약어Gene abbreviation 유전자명Gene name 관련 질병Related disease NM_000532NM_000532 PCCBPCCB propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide (PCCB), mRNA [NM_000532]
propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide (PCCB), mRNA [NM_000532]
Anxiety Disorders (불안장애)Anxiety Disorders
Autistic Disorder (자폐증)Autistic Disorder Dystonia (긴장이상)Dystonia Seizures (발작)Seizures (Seizures) 급성 골수성 백혈병
(Leukemia, Myeloid, Acute)
Acute myeloid leukemia
(Leukemia, Myeloid, Acute)
림프종(Lymphoma)Lymphoma

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된 톨루엔에 특이적인 인체 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.The present invention also provides a DNA microarray chip for identifying human exposure specific to toluene in which an oligonucleotide or a complementary strand molecule thereof including all or part of the biomarker gene sequence is integrated.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오 마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다. The oligonucleotide or its complementary strand molecule comprises 18 to 30 nucleic acids of the biomarker gene, preferably 20 to 25 nucleic acids.

본 발명의 톨루엔 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
The DNA microarray chip for toluene retrieval of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art. The method of manufacturing the microarray chip is as follows. In order to immobilize the searched biomarker as a probe DNA molecule on a substrate of a DNA chip, a micropipetting method or a pin-shaped spotter using a piezoelectric method is used. It is preferable to use the method, but the present invention is not limited thereto. In a preferred embodiment of the present invention, a microarray, which is a pin-shaped spotter, is used. The substrate of the DNA microarray chip is preferably coated with one active group selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine, and aldehyde. It is not limited. In addition, the substrate may be selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon membrane, and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto, and in the preferred embodiment of the present invention, amino-silane may be used. Coated slide glass was used.

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커를 이용한 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for confirming the expression of a specific gene whose expression changes depending on the degree of human exposure of toluene using the biomarker.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다: The present invention provides a method for identifying the expression of specific genes whose expression changes according to the degree of human exposure of toluene, including the following process:

1) 톨루엔이 노출된 인체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및 톨루엔이 노출되지 않은 인체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;1) separating RNA from experimental blood samples obtained from humans exposed to toluene and control blood obtained from humans not exposed toluene;

2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;2) amplifying RNA of the experimental group and the control group of step 1) and labeling the experimental group and the control group with fluorescent materials;

3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;3) hybridizing the aRNA (amplified RNA) labeled with the fluorescent material of step 2) with the DNA microarray chip of claim 1;

4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및4) analyzing the reacted DNA microarray chip of step 3); And

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.5) Checking the expression level of the gene integrated in the DNA microarray chip of claim 1 in the analyzed data of step 4) compared to the control.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 혈액시료는 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. In the method for confirming the exposure, it is preferable to use the blood sample obtained in the group of workers exposed or not exposed to toluene in step 1).

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.In the method for confirming the exposure, the fluorescent material of step 3) is selected from the group consisting of Cy3, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), and rhodamine (rhodamine) Preferably, but not limited to, all fluorescent materials known to those skilled in the art can be used.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Microarray(operon, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 유전자(표 8 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GeneSpring GX 7.3.1(Agilent Technology, USA) software를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
In the method of confirming the exposure, the DNA microarray chip of step 5) preferably uses Whole Human Genome Microarray (operon, USA) and the like, but is not limited thereto. It can be used if the microarray chip (see Table 8) is mounted, and it is most preferable to use the DNA microarray chip produced by the present inventor. In addition, the analysis method of step 5) preferably uses GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent Technology, USA) software, but is not limited thereto. Analysis software known to those skilled in the art may be used.

또한, 본 발명은 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for identifying specific genes whose expression changes depending on the degree of human exposure of toluene.

본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다. The present invention provides a kit for identifying specific genes whose expression changes depending on the degree of human exposure of toluene, including the DNA microarray chip prepared in the present invention.

아울러, 본 발명은 상기 본 발명의 바이오 마커 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for identifying specific genes whose expression changes depending on the degree of human exposure of toluene, including a primer set for amplifying the biomarker gene of the present invention.

상기 확인용 키트에 추가적으로 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 혈액시료는 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. In addition to the identification kit, the present invention provides a kit for identifying specific genes whose expression changes depending on the degree of human exposure of toluene, including a human blood sample of a negative control and a positive control. Preferably, the human blood sample is obtained from a group of workers who are exposed or not exposed to toluene.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다. The kit may further include a fluorescent material, wherein the fluorescent material is selected from the group consisting of a strepavidin-like phosphatease conjugate, a chemiflurorensce and a chemiluminescent material. Preferably, but not limited thereto, Cy3 was used in the preferred embodiment of the present invention.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.
The kit may additionally include a reaction reagent, which is a buffer used for hybridization, reverse transcriptase for synthesizing cDNA from RNA, cNTPs and rNTP (premixed or separated feed), chemical inducer of fluorescent dyes It may be composed of a labeling reagent, such as a washing buffer, but is not limited thereto, and may include all reaction reagents required for hybridization of DNA microarray chips known to those skilled in the art.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1> 연구모집단 및 혈액시료 수득 1> Research group and blood sample obtained

<1-1> 연구모집단<1-1> Research Group

노출군과 비노출군 근로자들은 연세대학교 의과대학 산업보건연구소 연구원들에 의해 모집되었다. 본 연구의 모집단은 U업체의 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 근로자들(N=30)로 구성되었다(표 3 참조). 마이크로어레이를 위한 시료(N=22)는 성별, 연령분포, 근무경력, 흡연이나 음주 등의 생활습관, 평균 근무시간 등의 요인들과 무관하게 선정하였으며 약물 복용자는 제외하였다. 실험에 앞서 본 연구방법은 IRB 위원회로부터 평가되고 인증받았으며(승인번호 4-2009-0275) 실험에 앞서 모든 참가자는 동의서를 읽고 서명하였다.
The exposed and non-exposed workers were recruited by researchers at the Institute for Occupational Health, Yonsei University College of Medicine. The population of this study consisted of workers exposed or unexposed to toluene from U firms (N = 30) (see Table 3). The sample for microarray (N = 22) was selected irrespective of factors such as gender, age distribution, work experience, lifestyles such as smoking or drinking, and average working hours. Prior to the experiment, the method was evaluated and certified by the IRB Committee (Approval No. 4-2009-0275) and all participants had read and signed the consent form prior to the experiment.

톨루엔 노출군Toluene exposure group 톨루엔 비노출군Toluene non-exposure group 1One 1-11-1 22 2-22-2 3(약물복용)3 (drug use) 3-3(약물복용)3-3 (drug use) 44 4-44-4 55 5-55-5 66 6-66-6 77 7-77-7 88 8-88-8 9(약물복용)9 (drug use) 9-9(약물복용)9-9 (drug use) 10(약물복용)10 (drug use) 10-10(약물복용)10-10 (drug use) 1111 11-1111-11 1212 12-1212-12 13-13 번13-13 times 14-14 번14-14 times 15-15 번15-15 times 16-16 번(약물 복용)16-16 times (take medication) 17-17 번17-17 times 18-18 번18-18 times

<1-2> 연구모집단의 피검화합물 <1-2> Test Compounds of Research Population 노출여부Exposure 확인 Confirm

산업안전보건법 제43조[건강진단], 동법 시행규칙 제99조 3항[특수건강 진단실시]에 적용되는 검사항목 중 유해물질의 생체지표물질 분석방법과 톨루엔의 생체지표물질 분석지침(KOSHA code H-10-2007)에 의거하여 요중 마뇨산 분석을 실시하였다. 또한 근로자 특수건강진단 실무지침에 의거하여 노출군 및 비노출군 근로자의 작업 전 소변과 주말작업 종료시 소변으로 2회에 걸쳐 채취하여 작업 전, 후의 톨루엔 개인 노출량에 차이가 있는지를 검정하였으며, 노출군과 비 노출군의 농도 평균을 비교하였다(표 4). 요중 마뇨산 분석을 위하여 채취된 소변은 적합한 시료의 선택을 위하여 요중 크레아티닌을 분석하여 다음과 수학식 1과 같이 보정하였다.
Method of analysis of biomarkers of hazardous substances and instructions for analyzing biomarkers of toluene among the inspection items applicable to Article 43 [Health Diagnosis] of the Industrial Safety and Health Act, Article 99, Paragraph 3 [Special Health Diagnosis] of the Enforcement Rule of the Act (KOSHA code U-10 manic acid analysis was performed according to H-10-2007). In addition, in accordance with the Worker's Special Health Check-up Guidelines, exposed and non-exposed group workers were collected twice before the urine and at the end of the weekend to test whether there was a difference in the individual toluene exposure before and after the operation. The mean concentrations of the non-exposed groups were compared (Table 4). Urine collected for uric acid manic acid analysis was corrected as shown in Equation 1 by analyzing urinary creatinine to select an appropriate sample.

Figure 112010018953427-pat00001
Figure 112010018953427-pat00001

요중 마뇨산 분석 결과Urinary manure acid analysis result
노출군

Exposure
요중 마뇨산
(g/g creatinine)
Uric acid
(g / g creatinine)

비노출군

Unexposed
요중 마뇨산
(g/g creatinine)
Uric acid
(g / g creatinine)
작업전before work 작업후After work 작업전before work 작업후After work 1One 0.8530.853 1.0481.048 1-11-1 0.1540.154 0.1010.101 22 0.5540.554 0.4670.467 2-22-2 0.2610.261 0.2000.200 33 0.1740.174 0.0830.083 3-33-3 0.1430.143 0.0650.065 44 0.3760.376 0.4470.447 4-44-4 0.0780.078 0.0630.063 55 0.3220.322 0.7650.765 5-55-5 0.1770.177 0.0750.075 66 0.4350.435 0.3290.329 6-66-6 0.0450.045 0.0430.043 77 0.3240.324 0.8600.860 7-77-7 0.3550.355 0.1990.199 88 0.8880.888 0.9600.960 8-88-8 0.2090.209 0.0530.053 99 0.1600.160 0.5080.508 9-99-9 0.1280.128 0.0270.027 1010 0.1120.112 0.2410.241 10-1010-10 0.1390.139 0.1650.165 1111 0.6290.629 1.3561.356 11-1111-11 0.1730.173 0.1270.127 1212 0.1790.179 0.4800.480 12-1212-12 0.3470.347 0.1290.129 Median
(min-max)
Median
(min-max)
0.350
(0.112-0.888)
0.350
(0.112-0.888)
0.494
(0.083-1.356)
0.494
(0.083-1.356)
Median
(min-max)
Median
(min-max)
0.163
(0.045-0.355)
0.163
(0.045-0.355)
0.088
(0.027-0.200)
0.088
(0.027-0.200)
P-value* P-value * 0.0340.034 P-value* P-value * 0.0050.005 P-value** P-value ** 0.0000.000

우리나라의 근로자 특수건강진단 실무지침에는 톨루엔의 생물학적 노출 지표로서 요중 마뇨산 항목이 선정되어 있으나 요중 마뇨산은 안식향산 나트륨이 함유되어 있는 음식물을 섭취할 경우 다소 노출과의 상관성이 낮아질 수 있다는 단점이 있다. 따라서 미국산업위생 전문가협의회의 노출기준과 생물학적 노출지표(ACGIH TLVs and BEIs)에서 권고하고 있는 혈중 톨루엔 지표를 추가로 분석하여 노출군과 비 노출군과의 작업 전, 후 차이를 비교하였다. ACGIH TLVs 및 BEIs에 따라 작업 종료시 혈액 시료 채취하여 NIOSH method No. 8002와 톨루엔의 생체지표 물질 분석지침(KOSHA code H-10-2007)를 바탕으로 SPME(solid phase microextraction) G/C법을 활용하여 분석하였다(표 5).
Although the urinary manic acid item is selected as an indicator of biological exposure of toluene, the urinary manure acid may have a low correlation with exposure when ingesting foods containing sodium benzoate. Therefore, we further analyzed the blood toluene index recommended by the American Association of Occupational Health Professionals' Exposure Standards and Biological Exposure Indicators (ACGIH TLVs and BEIs) to compare the difference between before and after exposure between exposed and non-exposed groups. At the end of the work according to ACGIH TLVs and BEIs, blood samples were taken and NIOSH method No. Based on 8002 and biomarker analysis guideline of toluene (KOSHA code H-10-2007), the analysis was performed using the solid phase microextraction (SPME) G / C method (Table 5).

혈중 톨루엔 분석 결과Blood Toluene Assay 노출군Exposure 혈중톨루엔
(㎍ℓ)
Blood toluene
(Μl)
비노출군Unexposed 혈중톨루엔
(㎍ℓ)
Blood toluene
(Μl)
P-value** P-value **
1One 1.1261.126 1-11-1 0.0020.002 0.000










0.000










22 0.8570.857 2-22-2 0.0020.002 33 0.2660.266 3-33-3 0.0020.002 44 0.6270.627 4-44-4 0.0180.018 55 0.480.48 5-55-5 0.0020.002 66 0.3590.359 6-66-6 0.0130.013 77 0.7780.778 7-77-7 0.0160.016 88 0.4270.427 8-88-8 0.0190.019 99 0.6170.617 9-99-9 0.0150.015 1010 0.3040.304 10-1010-10 0.0020.002 1111 0.8820.882 11-1111-11 0.0110.011 1212 0.9840.984 12-1212-12 0.0020.002 Median
(min-max)
Median
(min-max)
0.622
(0.266-1.126)
0.622
(0.266-1.126)
Median
(min-max)
Median
(min-max)
0.006
0.002-0.019
0.006
0.002-0.019

<1-3> 혈액시료<1-3> blood sample

동의서를 받은 후, 혈액시료는 연구 간호사에 의해 PAXgene Blood RNA tube를 사용하여 수득하였으며 -20℃에서 24시간 보관 후 -80℃에서 보관하였다. After receiving informed consent, blood samples were obtained using a PAXgene Blood RNA tube by a study nurse and stored at -80 ° C after 24 hours storage at -20 ° C.

<실시예 2> 마이크로어레이 실험Example 2 Microarray Experiment

<2-1> 표적 RNA의 분리<2-1> Isolation of Target RNA

톨루엔의 노출군과 비노출군 혈액시료로 부터의 RNA 추출은 Human blood RNA kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 Nanodrop(NanoDrop Technologies Inc, USA)을 이용하여 측정하였고, 농도는 Experion(Automated Electrophoresis station, Bio-Rad)으로 확인하였다.
RNA extraction from toluene-exposed and non-exposed blood samples was purified using the Human blood RNA kit (Qiagen, USA). Genomic DNA was removed using RNase-free DNase set (Qiagen, USA) during RNA purification. The amount of each total RNA sample was measured using Nanodrop (NanoDrop Technologies Inc, USA), the concentration was confirmed by Experion (Automated Electrophoresis station, Bio-Rad).

<2-2> RNA 증폭<2-2> RNA amplification

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 <2-1>에서 수득한 톨루엔 처리군의 전체 RNA가 다소 적은 양이므로 RNA 증폭 과정을 Kreatech의 RNA ampULSe kit(GEA-002)의 증폭 프로토콜에 따라 진행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 1 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 1 ㎍/㎕과 혼합하고 70℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 반응 혼합물에 2 ㎕ 10× first strand 버퍼, 4 ㎕ dNTPs 혼합물, 최종적으로 200U의 SuperScriptTMII(Invitrogen,CA)RNaseH Reverse Transcriptase를 혼합한 후 42℃에서 2시간 동안 반응을 하였다. 이후 second strand cDNA를 합성하기 위해 표 6과 같이 시약을 혼합하여 16℃에서 2시간 반응을 진행하였다.
Since the total RNA of the toluene treated group obtained in Example <2-1> was slightly smaller for oligo microarray analysis, the RNA amplification process was performed according to the amplification protocol of Kreatech's RNA ampULSe kit (GEA-002). 1 μg of the obtained total RNA and 1 μg / μl of oligo (dT) primer were mixed and reacted at 70 ° C. for 10 minutes, followed by annealing. 2 μl 10 × first strand buffer, 4 μl dNTPs mixture, and finally 200 U of SuperScript TM II (Invitrogen, CA) RNaseH in the reaction mixture for Reverse Transcript reaction of the annealed RNA. The reverse transcriptase was mixed and then reacted at 42 ° C. for 2 hours. Then, to synthesize the second strand cDNA, the reagents were mixed as shown in Table 6, and the reaction was performed at 16 ° C. for 2 hours.

구성Configuration 부피(㎕)Volume (μl) 10×second strand buffer10 × second strand buffer 1010 dNTPsdNTPs 44 DNA polymeraseDNA polymerase 22 RNase HRNase H 1One

cDNA 합성 반응이 끝난 후 합성된 cDNA에서 in vitro transcription을 통해서 aRNA를 합성하기 위해 표 7과 같이 시약을 혼합하였다.
After the cDNA synthesis reaction, the reagents were mixed as shown in Table 7 to synthesize aRNA through in vitro transcription from the synthesized cDNA.

구성Configuration 부피(㎕)Volume (μl) T7 rNTP mixtureT7 rNTP mixture 1616 T7 10×reaction bufferT7 10 × reaction buffer 44 T7 enzyme mixT7 enzyme mix 44

증폭된 aRNA는 농축을 거쳐 완전히 건조시킨 후 획득하였으며 획득된 aRNA 2 ㎍에 Cy3-ULS와 10X labeling solution을 첨가하고 표지화하였다. 이때 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다. 발광 표지된 aRNA의 양은 Nanodrop을 이용하여 측정하였고, 농도는 Experion으로 확인하였다.
The amplified aRNA was obtained by concentrating and drying completely, and adding and labeling Cy3-ULS and 10X labeling solution to 2 μg of the obtained aRNA. At this time, the samples were mixed and purified using a Microcon YM-30 column (Millipore, USA). The amount of light-labeled aRNA was measured using Nanodrop, the concentration was confirmed by Experion.

<2-3> <2-3> 혼성화Hybridization 반응 reaction

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 44 k Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(5분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 5분간 1× SSC, 10분간 0.2× SSC에 세척)후 슬라이드는 20초간 3,000 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
Hybridization and washing procedures were carried out according to the instructions of Genome Co., Ltd .. Hybridization was performed in a 62 ° C. oven for 12 hours. 44 k Whole Human Genome Oligo Microarray (Agilent, USA) was used as the DNA microarray chip. After washing (washing in 2 × SSC / 0.1% SDS for 5 minutes, washing in 1 × SSC for 5 minutes, 0.2 × SSC for 10 minutes), the slides were dried by centrifugation at 3,000 rpm for 20 seconds.

<2-4> 형광 이미지 획득<2-4> Fluorescence Image Acquisition

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent scanner(Agilent technologies, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 Feature Extraction v10.7 software(Agilent technologies, USA)로 분석하였다(도 1). 이렇게 하여 얻어진 데이터를 톨루엔의 데이터와 비교분석 후 이로부터 톨루엔에 대한 특이적인 마커 유전자를 선별하였다(도 2). Hybridization images on the slides were scanned with an Agilent scanner (Agilent technologies, USA). Chips washed with unbound genes were obtained with a fluorescence image using a laser fluorescence scanner. Scanned images were analyzed with Feature Extraction v10.7 software (Agilent technologies, USA) to obtain gene expression rates (FIG. 1). The data obtained in this way were compared with the data of toluene, and then the marker genes specific for toluene were selected therefrom (FIG. 2).

그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 톨루엔에 의해 비노출군에 비해 유의하게 발현 변이를 나타낸 유전자들을 Parametric test use all available estimates, Multiple Testing Correction - Benjamini and Hochberg False Discovery Rate를 통해서 p-value < 0.00001인 유전자들 중 1.3 fold change 이상 증가 혹은 감소하는 유전자들로 선별하였다. 이때, 다른 대표적인 휘발성 유기 화합물류 중 하나인 트리클로로에틸렌에 의한 유전자 발현 프로파일과 비교분석 시 두 물질 모두에서 공통으로 발현된 유전자 40종을 제외한 톨루엔에서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자를 선별한 결과 증가한 유전자가 77종, 감소한 유전자가 256종으로 총 333종이었다. 이 중 톨루엔의 혈중 농도에 따라 그 발현이 감소한 유전자 1종을 선정하였다. 상기 유전자는 다른 화학물질에 의해서 급성 또는 만성적으로 톨루엔을 흡입했을 경우 나타나는 증상인 자율신경계를 포함한 중추신경계의 기능장애나 백혈병 등에 관여한다고 보고되었으나, 표 2의 톨루엔을 처리했을 때, 실제 인체에서 같은 증상을 나타낸다는 보고는 없다.
As a result, among the approximately 44,000 genes present on the oligo chip, genes showing significant expression variation compared to the non-exposed group by toluene were compared with Parametric test use all available estimates, Multiple Testing Correction-Benjamini and Hochberg False Discovery Rate. Through the p-value <0.00001 genes were selected to increase or decrease more than 1.3 fold change. At this time, the gene expression profile by trichloroethylene, one of the other representative volatile organic compounds, and the result of screening for genes whose expression changed specifically in toluene except for 40 genes commonly expressed in both substances 77 genes increased and 256 genes decreased, totaling 333. Among them, one kind of gene whose expression was reduced according to the blood concentration of toluene was selected. The gene has been reported to be involved in dysfunction or leukemia of the central nervous system including the autonomic nervous system, which is a symptom of acute or chronic inhalation of toluene by other chemicals. There are no reports of symptoms.

톨루엔의 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 유전자Gene whose expression changes depending on the exposure of toluene 시료 수sample water T1T1 T12T12 T11T11 T2T2 T7T7 T4T4 T5T5 T8T8 T6T6 혈중톨루엔분석결과(㎍/ℓ)Blood toluene analysis result (㎍ / ℓ) 1.11.1 1One 0.880.88 0.860.86 0.80.8 0.630.63 0.480.48 0.430.43 0.360.36 등록번호Registration Number 유전자 약어Gene abbreviation 중간값의 비 Ratio of medians NM_000532NM_000532 PCCBPCCB 0.620.62 0.630.63 0.630.63 0.710.71 0.720.72 0.740.74 0.750.75 0.770.77 0.830.83

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 톨루엔(Toluene)의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현을 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 바이오 마커로 선별하여, 이들을 이용한 확인 키트 및 마이크로칩을 개발하여 환경 중 노출된 인체 시료에서 톨루엔의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
As described above, the present invention is to select specific gene expression causing a change in expression according to the degree of human exposure to toluene (Toluene) as a biomarker through a DNA microarray chip, to develop a verification kit and microchip using these It can be usefully used to monitor and determine the contamination of toluene in human samples exposed to the environment.

Claims (7)

유전자 등록번호(Genebank) NM_000532(PCCB, propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide)인 유전자의 핵산 서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩.
An oligonucleotide or a complementary strand molecule thereof, which is composed of all or 18 to 30 nucleic acid sequences of the nucleic acid sequence of the gene of Genebank NM_000532 (PCCB, propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide) DNA microarray chip for checking the expression of specific genes whose expression changes depending on the degree of exposure of toluene to the human body.
1) 톨루엔이 노출된 인체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및 톨루엔이 노출되지 않은 인체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법.
1) separating RNA from experimental blood samples obtained from humans exposed to toluene and control blood obtained from humans not exposed toluene;
2) amplifying RNA of the experimental group and the control group of step 1) and labeling the experimental group and the control group with fluorescent materials;
3) hybridizing the aRNA (amplified RNA) labeled with the fluorescent material of step 2) with the DNA microarray chip of claim 1;
4) analyzing the reacted DNA microarray chip of step 3); And
5) Specific gene expression whose expression varies depending on the degree of human exposure of toluene, comprising confirming the expression level of the gene integrated in the DNA microarray chip of claim 1 in the analyzed data of step 4) compared with the control group. How to find out.
제 2항에 있어서, 단계 1)의 혈액시료는 톨루엔에 노출되거나 노출되지 않은 인체로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법.
The method of claim 2, wherein the blood sample of step 1) is obtained from a human body that is exposed or not exposed to toluene.
제 2항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법.
The method of claim 2, wherein the fluorescent material of step 3) is selected from the group consisting of Cy3, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), and rhodamine (rhodamine). Method for confirming the expression of specific genes whose expression changes according to the degree of human exposure to toluene.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트.
The kit for confirming the expression of a specific gene whose expression changes according to the degree of human exposure of toluene, including the DNA microarray chip of claim 1.
제 5항에 있어서, 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트.
6. The kit according to claim 5, further comprising a human blood sample of a negative control and a positive control, the expression of which changes in expression according to the degree of human exposure to toluene.
유전자 등록번호(Genebank) NM_000532(PCCB, propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide)인 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 톨루엔의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트.Genebank (Genebank) NM_000532 (PCCB, propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide) comprising a set of primers to amplify a gene for a specific gene expression check whether the expression changes according to the degree of human exposure to toluene.
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