KR20180093973A - 암 발생의 위험도를 평가하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개체에서 암 발생의 위험도를 평가하기 위한 방법을 제공한다.

Description

암 발생의 위험도를 평가하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 개체(individual)에서 암 발생의 위험도(risk)를 평가하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
암(cancer)은 세포의 한 집단이 통제되지 않은 성장(growth), 인접한 조직을 침범 및 파괴하는 침입(invasion), 및 때로는 전이(metastasis)를 나타내거나, 또는 림프(lymph) 또는 혈액(blood)을 통해 신체의 다른 위치로 퍼지는 것을 나타내는 다각적인(multi-faceted) 질환이다. 상기 암의 3가지 악성의(malignant) 특성은 침입하지 않거나 전이하지 않는 양성 종양(benign tumor)과 구별한다.
현재 수술(surgery), 방사선 치료(radiotherapy), 화학 요법(chemotherapy) 및 표적 치료(targeted therapy)를 포함하여, 각각의 유형의 암 치료에 사용되는 다수의 방법이 있다. 성공적인 암 치료는 임상적으로 명백하든지 또는 미시적이든지, 1차 종양 및 임의의 전이에 직접적으로 적용된다.
적절한 치료 방법의 선택은 환자에게 중요하다. 공격적인(aggressive) 암의 확장을 예방하기 위해 엄격하고 공격적인 치료 프로토콜(protocol)을 즉시 사용해야 하는 시기를 아는 것은 필수적이다. 대조적으로, 환자에 의해 진행된 종양으로 인해 필요하지 않은 경우 엄격하고 공격적인 치료를 수행하는 것은 또한 환자에게 불리하다. 실제로, 무겁고 공격적인 치료는 항상 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있는 유해한 독성(toxicity)을 유발한다. 예를 들어, 상기 치료의 대부분은 돌연변이 유발성이고 이에 따라 2차 종양을 유발하기 쉽다. 또한, 상기 엄격하고 공격적인 치료는 일반적으로 비용이 매우 많이 들고, 따라서 필요한 경우에만 수행되어야 한다.
현재, 고형 종양(solid tumor)에 대한 치료 방법의 선택은 종양 단계화(staging)를 기반으로 하며, 이는 일반적으로 미국암공동위원회(AJCC)로부터 종양/절/전이(TNM) 테스트를 사용하여 수행된다. TNM 시스템은 3개의 카테고리를 기반으로 한 번호를 할당한다. "T"는 종양 크기(tumor size)를 나타내고, "N"은 림프절(lymphatic node) 관련 정도를 나타내며 "M"은 전이(metastasis) 정도를 나타낸다. 암의 더 넓은 단계(stage)는 보통 예후(prognosis)에 의해 분류된 TNM 값에서 유래된 I, II, III, IV 숫자로 인용된다; 더 높은 숫자일수록 더욱 진행된 암을 나타내고 더욱 악화될 가능성을 나타낸다.
상기 테스트 및 단계화 시스템은 고형 암이 환자에게서 진단된 단계(stage)와 관련하여 유용한 정보를 제공하기도 하지만, 부정확하고 불충분하다고 일반적으로 인정된다. 특히 이는 고형 종양에 국한된다. 다른 한편으로 액상 종양(liquid tumor)은 주로 세포 유전학적 변화(alteration)의 동정으로 특징지어진다.
가장 중요한 것은, TNM 테스트가 종양 진행의 가장 초기의 단계를 확인하지 못한다는 것이다. 상기 초기 단계는 치료를 위한 가장 유망한 기회(window)를 제공한다. 암의 발달의 매우 초기에 암을 탐지하는 것은 부작용(side-effect)을 감소시키면서, 표적화되고, 효율적인 치료를 가능하게 한다. 따라서 전체 인구의 스크리닝(screening)의 일환으로 가능한 가장 초기의 단계에서 환자를 확인하는 것이 중요하다. 이에 따라 암은 조기에 지역 사회에서 확인될 수 있고, 조기 개입과 관리는 사망률을 감소시키며 상기 질환으로부터 고통 받는 것을 감소시키는 것을 가능하게 한다. 환자의 전반적인 생존률을 증진시킬 뿐만 아니라, 이들의 삶의 질도 향상시키며 실제로 공격적이고 고비용의 화학 요법으로 혜택을 볼 수 있는 환자를 위해 이들을 유지하기 위해서, 암 발생의 더욱 우수한 예후 테스트에 대한 절실한 필요성이 있다. 특히, 암을 발생(developing)하는 대상체(subject)의 위험도를 평가하는 검사에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체에서 암의 발생을 사전에 예측하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명의 발명자들은 대상체의 샘플에서의 프로가스트린(progastrin)의 존재가 상기 대상체가 암을 발생시키는지의 여부에 대한 적절하고 신뢰성있는 지표(indication)라는 것을 보여주고 있다. 상기 관계는 연령 또는 임의의 다른 매개변수에 영향을 받지 않는다. 따라서, 프로가스트린은 암을 발생하는 대상체의 위험도를 결정하기 위한 간단하고 효율적인 수단(tool)을 제공한다. 따라서, 프로가스트린은 암의 가장 초기 단계의 표지(marker)이다.
프로가스트린 수준(level)을 기반으로 한 예후 테스트는 이전에 기술되어 있다. 그러나, 이러한 테스트는 과형성의 용종(hyperplastic polyp)이 있는 환자가, 상기 과형성의 용종을 절제한 후 대장 종양(colonic neoplasia)을 발생할 위험도를 예측하는 것으로 제한되어 있다(WO　2012/164035; Do et al., Cancer Prev Res , 5(4): 675-684, 2012). 따라서 상기 테스트는 이미 존재하는 암을 예측하는 것으로 제한되기 때문에 제한적으로 사용된다. 상기 테스트는 상기 질환을 발생시키는 암의 임의의 징후가 없는 대상체의 위험도를 평가하기 위해서 사용될 수 없다.
제 1의 실시 양태에서, 본 발명은 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체에서 암 발생의 위험도를 평가하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기의 단계:
a) 상기 대상체의 샘플에서 프로가스트린의 수준을 결정하는 단계;
b) 상기 대상체가 단계 a)의 수준을 기반으로 하여 암을 발생할 위험도를 결정하는 단계를 포함한다.
임상 데이터에 대한 ROC(수신자 조작 특성) 분석은 프로가스트린의 존재가 매우 특이적이고 민감한 표지임을 나타낸다. 프로가스트린은 암을 발생시키지 않는 대상체의 샘플에서 본질적으로 검출할 수 없다. 반면에, 프로가스트린이 남성/여성의 샘플에서 검출할 수 있다면 암으로 진단된 적이 없는 대상체는 향후에 암을 발생시키는 데 무시할 수 없을 정도의 위험도를 지닌다.
본 발명의 방법은 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체가 암을 발생시킬 위험도를 쉽고 신뢰할 수 있게 평가하는 것을 가능하게 한다. 즉, 상기 방법은 또한 대상체가 현재 증상을 나타내지 않더라도, 암을 발생시킬 대상체의 식별을 가능하게 한다. 상기 환자는 이러한 증상을 전혀 인지하지 못하더라도, 이미 암을 지니고 있다.
"대상체 내에서 암 발생의 위험도의 평가"라는 표현은 제공된 대상체가 향후에 암의 증상을 나타낼 상대적인 확률(probability)을 결정하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르는 방법은 임상 시험, 생검(biopsy) 및 예를 들어, CA125 및/또는 OVA1와 같은, 암의 공지된 바이오마커(biomarker)의 수준을 결정하는 것과 같은 다른 방법 또는 지표의 조합으로, 상기 위험도의 평가에 있어서의 수단을 제시한다.
본원에서 기술된 방법론에 적용될 수 있는 "대상체"는 인간, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 멧돼지, 양 및 원숭이를 포함하는 임의의 포유동물일 수 있다. 인간 대상체는 "환자"로 알려져 있다. 바람직하게는, "대상체"는 암을 앓고 있지 않고 암을 앓고 있다고 의심되지 않으며 암으로 진단된 적이 없는 포유동물이다. 본원에서 사용된, "암을 앓고 있는 대상체"는 암을 앓고 있고 이의 증상을 나타내거나, 또는 암으로 진단된 포유동물을 말한다. 대상체는 의료종사자에 의해 수행된 메디컬 테스트가 암의 존재를 나타낸 경우 "암으로 진단"된다. 본원에서 사용된, "증상(symptom)"은 질환, 예를 들어, 암의 임의의 주관적인(subjective) 증거이다. "증상"은 비정상적인 상태 또는 질환, 예를 들어 암의 존재를 반영하여, 환자에 의해 인지되는 정상적인 기능 또는 감각으로부터 벗어난 것이다. 질환은 환자가 상기 질환에 대한 보균자(carrier)이지만 증상을 경험하지 못한 경우, 무증상으로(asymptomatic) 간주된다. 무증상 상태는 환자가 예를 들어 프로가스트린 수준을 측정하는 것과 같은 메디컬 테스트를 받을 때까지 발견되지 않을 수 있다.
본 방법은 또한 대상체가 전혀 암으로 진단된 적이 없는 경우 및/또는 이의 임의의 증상을 전혀 경험하지 않은 경우에도, 대상체에서 암을 확인할 수 있게 하기 때문에 특히 유용하다. 프로가스트린은 매우 특이적이고 민감한 암 표지이다. 대상체에서 프로가스트린의 검출은 상기 대상체가 암을 발생할 가능성이 높다는 것을 나타낸다. 따라서 프로가스트린은 상기 대상체가 아직 임의의 증상을 보이지 않더라도, 암을 발생할 대상체를 확인하는 데 특히 중요한 바이오마커이다. 본 발명은 건강해 보이는, 즉, 암으로 진단되지 않은 및/또는 이의 임의의 증상을 전혀 경험하지 않은 대상체의 집단을 스크리닝(screening)하고 암을 발생할 대상체를 식별할 수 있기 때문에 특히 유리하다. 본원에서 언급된 "스크리닝"은 징후(sign) 또는 증상(symptom)이 없는 개체에서 아직-진단되지 않은 질환의 존재 가능성을 집단 내에서 확인하는 데 사용되는 방법을 말한다. 상기 집단은 전-증상의 또는 인지할 수 없는 증상의 질환을 지닌 개체를 포함할 수 있다. 상기 스크리닝 테스트는 외견상 양호한 건강상태에 있는 사람에게 수행된다는 점에서 다소 독특하다는 것이 통상의 기술자에게는 명백할 것이다. 암 스크리닝의 가장 가까운 목표는 개체가 증상을 나타내기 전 및 치료가 완치될 가능성이 있을 경우 질병 궤도(trajectory)의 한 지점에서, 조기 단계의 암, 또는 전암성 병변(precancerous lesion)을 확인하는 것이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체에서 암을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계:
a) 상기 대상체의 샘플에서 프로가스트린의 수준을 결정하는 단계;
b) 단계 a)의 수준을 기반으로 하여 암을 예측하는 단계
를 포함한다.
본원에서 사용된 "예후(prognosis)"는 질환으로부터 회복의 가능성 또는 질환의 가능한 진행 또는 결과의 예측을 의미한다. 예를 들어, 대상체로부터의 샘플이 프로가스트린의 존재에 대해 음성(negative)이라면, 상기 대상체에 대한 "예후"는 상기 샘플이 프로가스트린에 대해 양성(positive)인 경우보다 더욱 좋다.
"프로가스트린(progastrin)"은, 본원에서 포유동물의 프로가스트린 펩타이드를 말한다. 프로가스트린은 가스트린 유전자의 1차 번역 산물인 101 아미노산 펩타이드(아미노산 서열 참조: AAB19304.1)인, 프리프로가스트린(preprogastrin)으로부터의 제 1의 21 아미노산(신호 펩타이드)의 절단에 의해 형성된다. 프로가스트린의 80 아미노산 사슬은 여러 개의 생물학적으로 활성화된 가스트린 호르몬 형태로 절단 및 변형 효소에 의해 처리된다: 가스트린 34(G34) 및 글리신-확장 가스트린 34(G34-Gly), 프로가스트린의 아미노산 38-71, 가스트린 17(G17) 및 글리신-확장 가스트린 17(G17-Gly)을 포함하고, 프로가스트린의 아미노산 55 내지 71을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 프로가스트린 펩타이드는 인간 프로가스트린이다. 보다 바람직하게는, "인간 프로가스트린"이란 표현은 서열번호 1의 서열을 갖는 인간 PG를 말한다. 인간 프로가스트린은 특히 상기 언급된 생물학적으로 활성화된 가스트린 호르몬 형태에 존재하지 않는 N-말단 및 C-말단 도메인(domain)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 N-말단 도메인의 서열은 서열번호 2에 의해 제시된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 C-말단 도메인의 서열은 서열번호 3에 의해 제시된다.
본 발명은 샘플, 특히 생물학적 유체 및 세포, 조직, 생검 샘플 및 장기 절편(organ section) 등과 같은 생물학적 샘플 내에서 프로가스트린의 검출 방법을 제공한다.
"생물학적 샘플"은 본원에서 대상체로부터 수득할 수 있는 임의의 샘플을 의미한다. 상기 샘플은 프로가스트린의 발현 수준의 결정을 허용하여야 한다. 프로가스트린은 분비된 단백질로 알려져 있다. 따라서 프로가스트린 단백질의 수준을 결정하기 위한 바람직한 생물학적 샘플은 생물학적 유체(biological fluid)를 포함한다. 본원에서 사용된 "생물학적 유체"는 생물학적 기원의 물질을 포함하는 임의의 유체를 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 생물학적 유체는 동물, 예를 들어 포유동물, 바람직하게는 인간 대상체의 체액(bodily fluid)을 포함한다. 상기 체액은 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 림프액(lymph), 뇌척수액(cerebrospinal fluid (CSF)), 타액(saliva), 땀 및 소변(urine)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 체액일 수 있다. 바람직하게는, 상기 바람직한 액상의 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플 또는 림프 샘플과 같은 샘플을 포함한다. 보다 바람직하게는, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 실제로, 상기 혈액 샘플은 환자로부터 완전히 무해한 혈액 수집에 의해 수득될 수 있으며 따라서 상기 대상체가 종양을 발생할 위험도에 대해 비-침습적인(non-invasive) 평가를 허용한다.
본원에서 사용된 "생물학적 샘플"은 또한 암이 고형암인 경우, 테스트된 환자의 고형암 샘플을 포함한다. 상기 고형암 샘플은 통상의 기술자가 본 발명의 바이오마커 수준의 임의의 유형의 측정을 수행하도록 허용한다. 일부 경우에, 본 발명에 따르는 방법은 환자로부터 고형암 샘플(solid cancer sample)을 수득하는 예비 단계를 추가로 포함할 수 있다. "고형암 샘플"은 종양 조직 샘플을 의미한다. 암 환자에게서 조차도, 종양의 부위인 조직은 여전히 종양이 아닌 건강한 조직을 포함한다. 따라서 "암 샘플"은 환자로부터 수득한 종양 조직으로 제한되어야 한다. 상기 "암 샘플"은 생검 샘플 또는 외과적 절제 요법으로부터 수득한 샘플일 수 있다.
일 양태에 따르면, 상기 환자로부터의 샘플은 암 세포 또는 암 조직이다.
상기 샘플은 수득될 수 있고 필요한 경우 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 특히, 상기 샘플은 공복 상태의 대상체로부터 수득되어야 한다는 것은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 암 세포 또는 암 조직은 특별히 제한되지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적인 조건을 지칭하거나 설명한다. 본원에서 사용된 용어 "암" 및 "암성의(cancerous)"는 질환의 모든 단계를 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 "암"은 바람직하지 않은 성장, 침입, 및 특정 조건 하에서 유기체(organism)에서 손상된 세포의 전이로부터 기인한 임의의 악성 신생물(malignant neoplasm)을 의미한다. 암을 유발하는 세포는 유전적으로 손상되고 일반적으로 세포 분열, 세포 이동 거동, 분화 상태 및/또는 세포 사멸 기구(machinery)를 제어하는 능력을 상실한다. 대부분의 암은 종양(tumor)을 형성하지만 백혈병(leukemia)과 같은, 일부 조혈암(hematopoietic cancer)은 그렇지 않다.
따라서, 본원에서 사용된 "암"은 양성(benign) 및 악성(malignant) 암 모두를 포함할 수 있다. 암의 예는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병(leukaemia) 또는 림프성 악성 종양(lymphoid malignancy)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따르는 암은 편평 상피함(squamous cell cancer)(예를 들어, 상피 편평 세포암(epithelial squamous cell cancer)), 소세포 폐암(small-cell lung cancer)을 포함하는 폐암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐의 선암(adenocarcinoma) 및 폐의 편평 세포 암종(squamous carcinoma), 구강인두암(oropharyngeal cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 후두암(laryngeal cancer), 복막암(cancer of the peritoneum), 식도암(oesophageal cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 위장암(gastrointestinal cancer) 및 위장관 기질 암(gastrointestinal stromal cancer)을 포함하는 위암(gastric or stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 악성 뇌교종(glioblastoma), 뇌암(brain cancer), 신경계암(nervous system cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 요로암(cancer of the urinary tract), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암종(endometrial or uterine carcinoma), 타액선암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney or renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 외음부암(vulval cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 카포시육종(Kaposi sarcoma), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 비-흑생종 피부암(non-melanoma skin cancer), 악성 흑생종(melanoma), 피부흑색종(skin melanoma), 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma), 악성흑색점흑색종(lentigo maligna melanoma), 말단흑자흑색종(acral lentiginous melanoma), 결정성 흑색종(nodular melanoma), 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 B-세포 림프종(B-cell lymphoma)(호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma); 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 예를 들어, 저등급/소포성 비-호지킨 림프종(low grade/follicular non-Hodgkin's lymphoma (NHL)); 소 림프성 NHL((small lymphocytic (SL) NHL); 중간 등급/소포성 NHL(intermediate grade/follicular NHL); 중간등급 확산 NHL(intermediate grade diffuse NHL); 고등급 면역모세포성 NHL(high grade immunoblastic NHL); 고등급 임파아구세포성 NHL(high grade lymphoblastic NHL); 고등급 소형 비-절단 세포( high grade small non-cleaved cell NHL); 부피가 큰 병 NHL(bulky disease NHL); 외투세포림프종(mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종(AIDS-related lymphoma); 및 왈덴스트룀마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia)을 포함함); 만성림프구백혈병(chronic lymphocytic leukaemia (CLL)); 급성림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukaemia (ALL)); 모발세포 백혈병(hairy cell leukaemia); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloblastic leukaemia (CML)); 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloblastic Leukaemia (AML)); 및 이식 후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD)) 뿐만 아니라 모반증(phakomatosis)과 관련된 비정상적인 혈관 증식(abnormal vascular proliferation), (뇌종양(brain tumor)과 관련된) 부종(oedema), 메이그 증후군(Meigs' syndrome), 뇌(brain)뿐만 아니라 입술(lip) 및 구강암(oral cavity cancer)을 포함한 두 경부암(head and neck cancer), 및 이와 관련된 전이를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 암은 폐암, 입술 및 구강암, 구강인두암, 비인두암, 후두암, 전립선암, 식도암, 담낭암, 간암, 간세포암, 위장암 및 위장관 기질 암을 포함하는 위암, 췌장암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, 카포시육종, 신장암, 방광암, 결장암(colon cancer), 직장암, 결장직장암(colorectal cancer), 간암, 간암종, 항문암, 갑상선암, 비-흑색종 피부암, 피부 흑색종, 뇌암, 신경계암, 고환암, 자궁경부암, 자궁암, 자궁내막암, 난소암, 또는 유방암이다.
보다 바람직한 구현 예에서, 상기 암은 식도암, 간암, 간세포암, 위장암 및 위장관 기질 암을 포함하는 위암, 췌장암, 호지킨 림프종, 결장암, 직장암, 결장직장암, 간암, 간암종, 항문암, 비-흑생종 피부암, 피부 흑색종, 자궁경부암, 자궁암, 자궁내막암, 난소암, 또는 유방암이다.
바람직하게는, 상기 대상체가 암을 발생할 위험도는 단계 b)에서 단계 a)의 수준을 기준 수준(reference level)과 비교함으로써 결정된다.
본원에서 사용된, 용어 "기준 수준"은 기준 샘플에서 고려 중인 암 마커, 즉 프로가스트린의 발현 수준을 말한다. 본원에서 사용된, "기준 샘플"은 질환이 없다고 알려진 대상체, 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 대상체 또는, 대안적으로, 일반적인 개체군으로부터 수득되는 샘플을 의미한다. 암 마커의 적절한 기준 발현 수준은 여러 개의 적합한 대상체에서 상기 암 마커의 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있으며, 상기 기준 수준은 특정 대상체 집단에 따라 조정될 수 있다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대 값(absolute value); 상대값(relative value); 상한 또는 하한을 갖는 값; 값의 범위; 평균값(average value); 중앙값(median value), 중간값(mean value) 또는 특정 조절 또는 기준선 값(baseline value)과 비교한 값이 될 수 있다. 기준 값은 예를 들어, 테스트가 진행된 대상체의 샘플로부터 수득된 값과 같은 각각의 샘플 값을 기초로 할 수 있지만, 보다 이른 시점에서 이루어질 수 있다. 기준 값은 다수의 샘플, 예를 들어 연대순의 연령(chronological age)이 일치된 군의 대상체 집단을 기초로 할 수 있고, 또는 테스트될 샘플을 포함하거나 또는 포함하지 않는 샘플의 풀(pool)을 기반으로 할 수 있다.
유리하게는, "기준 수준(reference level)"은 암과 관련하여 알려진 특정의 상태를 갖는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 수득된, 미리 결정된 프로가스트린 수준이다. 특정한 구현예에서, 단계 (b)에서 테스트한 샘플과의 비교를 위해 사용된 기준 수준은 건강한 대상체로부터의 생물학적 샘플, 또는 암을 앓고 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있고; 기준 발현 프로파일(reference expression profile)은 또한 건강한 대상체의 생물학적 샘플의 풀 또는 암을 갖는 대상체로부터의 샘플의 풀로부터 수득될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 발명자들은 공복(fasting) 시의 건강한 대상체에서 프로가스트린의 수준이 0 pM 임을 보여준다. 바람직한 구현예에서, 기준 수준은 0 pM 이다.
프로가스트린의 수준은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다.
바람직하게는, 샘플에서 프로가스트린의 수준을 결정하는 것은 상기 샘플을 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 것 및 프로가스트린에 상기 프로가스트린-결합 분자의 결합을 측정하는 것을 포함한다.
발현 수준이 단백질 수준에서 측정되는 경우, 예를 들어, 항체와 같은, 특이적인 프로가스트린-결합 분자를 사용하여 명확히 실행될 수 있고, 특히 바이오티닐화(biotinylation)를 사용한 세포막 염색법과 같이 잘 알려진 기술 또는 특이적인 항체를 이용한 면역침전법(immunoprecipitation), 웨스턴 블롯, ELISA 또는 ELISPOT, 효소-연결된 면역흡수성 분석법(enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)), 방사면역측정법(radioimmunoassay (RIA)), 면역조직화학법(immunohistochemistry (IHC)), 면역형광법(immunofluorescence (IF)), 항체 마이크로어레이(antibodies microarray), 또는 면역조직화학(immunohistochemistry)과 연결된 조직 마이크로어레이에 의해 수행되는 다른 등가의 기술을 사용하여 실행될 수 있다. 다른 적합한 기술은 FRET 또는 BRET, 단일 또는 다중 여기 파장(excitation wavelength)의 사용 및 임의의 적응성 있는 광학 방법, 예를 들어 전기화학적 방법(전압전류법(voltametry) 및 전류법(amperometry) 기술), 원자력 현미경(atomic force microscopy), 및 무선주파수 방법(radio frequency method), 예를 들어 다극 공명 분광법(multipolar resonance spectroscopy), 공초점(confocal) 및 비-공초점, 형광 탐지, 발광(luminescence), 화학 발광(chemiluminescence), 흡광도(absorbance), 반사율(reflectance), 투과율(transmittance), 및 복굴절율(birefringence) 또는 굴절율의 검출(refractive index) (예를 들어, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 타원 편광법(ellipsometry), 공명 거울 방법(resonant mirror method), 격자 커플러 도파관 방법(grating coupler waveguide method) 또는 간섭계법(interferometry)), 세포 ELISA, 유세포 분석(flow cytometry), 방사성 동위원소(radioisotopic), 자기공명 화상법(magnetic resonance imaging), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE); HPLC-질량 분석법(HPLC-Mass Spectroscopy); 액체 크로마토그래피//질량 분석법//질량 분석법(LC-MS/MS)에 의한 분석을 적용하는 단일 세포 현미경 또는 조직화학 방법을 포함한다. 상기 모든 기술은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 본원에서 추가로 상세하게 설명될 필요가 없다. 이러한 상이한 기술은 프로가스트린 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 프로가스트린-결합 분자, 특히 항-프로가스트린 항체는, 면역 측정법(immunoassay)에서 특히 유용하다. 면역측정법은 효소면역정량법(immunosorbent assay (ELISA)), 방사면역측정법(RIA), 면역확산측정법(immunodiffusion assay), 또는 표면 플라스몬 저항법(surface Plasmon resistance assay)(예: Biacore® 분석)과 같은 면역-검출검정법(immune-detection assay), ELISPOT, 슬롯-블롯(slot-blot), 또는 웨스턴 블롯(western blot)일 수 있다. 상기 기술에 대한 일반적인 지침으로서, 예를 들어, "분자 생물학에서 통용되는 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology)" John Wiley and Sons, 뉴욕, N.Y 의 Ausubel 외. (편집자들) (1987) 을 참조한다.
항체는 의학, 수의학 및 기타 면역 검출 분야에서 사용되는 수많은 분석 기술에서 중요한 시약이다. 상기 테스트는 예를 들어, 효소-연결된 ELISA, RIA, IHC, 및 IF 분석법과 같은, 일상적으로 사용되는 많은 면역 측정 기술을 포함한다. 프로가스트린의 수준은 상기 단백질에 대하여 직접 유도된 항체를 사용하여 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 우선적으로 분석된다. 바람직하게는, 프로가스트린의 수준은 면역효소검정법(immunoenzymatic assay), 바람직하게는 RIA 및 ELISA 사이에서 선택된 기술에 기초하여, 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자를 사용하여 결정된다. 가장 바람직하게는, 상기 수준은 ELISA에 의해 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자로 결정된다. 보다 바람직하게는, 프로가스트린의 수준은 면역효소검정법, 가장 바람직하게는 ELISA 검정법을 사용하여 하나의 프로가스트린-결합 분자로 측정된다.
특히 유용한 구현예에서, 본 발명에 따르는 암 발생의 위험도를 평가하는 방법은 면역효소검정법, 바람직하게는 RIA 및 ELISA 사이에서 선택된 기술에 기초하여, 프로가스트린-결합 분자를 사용하여 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 프로가스트린의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
상기 기술은 통상의 기술자가 간단하고, 재현성있고 신뢰할 수 있는 테스트에 의해 프로가스트린의 존재를 분석하도록 허용하는 데 있어, 특히 유용하다. 선행 기술의 방법은 반-정량적인(semi-quantitative) 검사, 즉, 전체 용종(polyp)의 상피세포의 IHC 염색에 의존하였다. 상기 방법은 다소 신뢰할 수 없다. 특히, 분석과 관련된 주관성(subjectivity)의 정도 때문에, 다른 병리학자에 의해 얻어진 결과를 비교하는 것은 어렵다. 대조적으로, 본 발명의 방법은 완전히 정량적이며, 객관적이고 고도로 민감성이다.
또 다른 특히 유용한 구현예에서, 본 발명에 따르는 방법은 면역효소검정법, 바람직하게는 RIA 및 ELISA 사이에서 선택된 기술에 기초하여, 프로가스트린-결합 분자를 사용하여 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 프로가스트린의 수준을 결정하는 것을 포함한다.
따라서 프로가스트린의 수준은 프로가스트린-결합 분자에 의해, 바람직하게는 프로가스트린을 인식하는 항체에 의해 결합된 프로가스트린의 양을 결정함으로써 본 방법의 단계 a)에서 결정된다.
"프로가스트린-결합 분자(progastrin-binding molecule)"는, 프로가스트린에 결합하지만 가스트린-17(G17), 가스트린-34(G34), 글리신-확장 가스트린-17(G17-Gly), 또는 글리신-확장 가스트린-34(G34-Gly)에 결합하지 않는 임의의 분자를 의미한다. 본 발명의 프로가스트린-결합 분자는 임의의 프로가스트린-결합 분자, 예를 들어, 항체 분자 또는 수용체 분자일 수 있다. 바람직하게는, 프로가스트린-결합 분자는 항-프로가스트린 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
"결합하는(binding)", "결합하다(bind)", 또는 그 외에 유사한 것은, 본원에서 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 생리적인 조건 하에서, 상대적으로 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 두 개의 분자가 서로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 평형 투석(equilibrium dialysis), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 등을 포함한다. 특정한 구현예에서, 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, BSA 또는 카제인(casein)과 같은 비특이적 분자에 결합하는 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 프로가스트린에 결합한다. 보다 더 특정한 구현예에서, 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은, 프로가스트린에만 결합한다.
특정한 구현예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 프로가스트린에 결합하는 적어도 하나의 분자와 접촉되고, 상기 프로가스트린에 대한 약제(agent)의 친화도는 적어도 100 nM, 적어도 90 nM, 적어도 80 nM, 적어도 70 nM, 적어도 60 nM, 적어도 50 nM, 적어도 40 nM, 적어도 30 nM, 적어도 20 nM, 적어도 10 nM, 적어도 5 nM, 적어도 1 nM, 적어도 100 pM, 적어도 10 pM, 또는 적어도 1 pM 로, 상기 기술된 바와 같은 방법으로 결정된다.
특정한 구현예에서, 본 발명은 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체에서 암 발생의 위험도를 평가하는 방법에 관한 것으로, 암으로 진단되지 않은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 프로가스트린의 농도를 검출하는 것을 포함하며, 상기 생물학적 샘플은 항-hPG 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉된다.
특정한 구현예에서, 본 발명은 암으로 진단되지 않은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 프로가스트린의 농도를 검출하는 것을 포함하는, 암의 예후를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 생물학적 샘플은 항-hPG 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉된다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 다클론성(polyclonal) 및 단일클론성(monoclonal) 항체를 포함하는 것으로 해석된다. 항체(또는 "면역 글로불린(immunoglobulin)")는 이황화결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중사슬(heavy(H) chain) 및 2개의 경사슬(light(L) chain)을 포함하는 당단백질(glycoprotein)로 이루어진다. 각각의 중사슬은 중사슬 가변 영역(또는 도메인)(본원에서는 HCVR 또는 VH 로 약칭함) 및 중사슬 불변 영역을 포함한다. 상기 중사슬 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경사슬은 경사슬 가변 영역(본원에서는 LCVR 또는 VL 로 약칭함) 및 경사슬 불변 영역을 포함한다. 경사슬 불변 영역은 1개의 도메인, CL 을 포함한다. VH 및 VL 영역은 항원의 에피토프(epitope)에 주로 결합하고, 프레임워크 영역(framework region (FR))으로 지칭되는, 더욱 보존된 영역에 배치되는 "상보성 결정 영역(complementarity determining region (CDR)" 또는 "과가변 영역(hypervariable region)"으로 지칭되는 과가변성의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL 은 하기의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단에 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR 로 구성된다. 중사슬 및 경사슬의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 효과기 세포(effector cell)) 및 종래의 보체 시스템(classical complement system)의 제 1 성분(Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자(factor)에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 다른 아이소타입(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 일 수 있다.
보다 특정한 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉되며, 다클론성 항체, 단일클론성 항체, 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 단일 사슬 항체, 낙타화 항체(camelized antibody), IgA1 항체, IgA2 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체 및 IgM 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 항체 생성의 기술분야에서 통상의 기술자는 주어진 항원에 대한 다클론성 및/또는 단일클론성 항체를 생성하는 방법을 용이하게 선택 및 실행할 수 있다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 항체의 경사슬 및 중사슬 내의 CDR을 결정하는 방법을 알고 있다.
"다클론성 항체"는 하나 또는 그 이상의 다른, 비-동일 항체의 존재 또는 존재 하에서 생성된 항체이다. 일반적으로, 다클론성 항체는 비-동일 항체를 생성하는 여러 개의 다른 B-림프구(B-lymphocyte)의 존재 하에서 B-림프구로부터 생산된다. 일반적으로, 다클론성 항체는 면역접종된 동물로부터 직접 수득된다.
용어 "단일클론성 항체"는 거의 균질한(homogeneous) 항체 집단으로부터 발생하는 항체를 지칭하며, 상기 집단은 최소한의 비율로 발견될 수 있는 몇 가지의 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외한 동일한 항체를 포함한다. 단일클론성 항체는 하이브리도마(hybridoma)와 같은, 단세포 클론의 성장으로부터 유래되며, 한 종류(class) 및 하위 종류(subclass)의 중사슬, 및 한 유형(type)의 경사슬에 의해 특징지어진다. 항-인간 프로가스트린(항-hPG) 단일클론성 항체 및 진단 또는 치료를 위한 상기 항체의 용도는 이미 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 결장직장암에 대한 WO 2011/083 088, 유방암에 대한 WO 2011/083 090, 췌장암(pancreatic cancer)에 대한 WO 2011/083 091, 대장암 및 위장암(gastrointestinal cancer)에 대한 WO 2011/116 954, 간 병리(liver pathology)에 대해서는 WO 2012/013 609 및 WO 2011/083089 를 참조한다.
항체의 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"이라는 표현은, 상기 항체의 표적 (또한 일반적으로 항원으로도 지칭됨), 일반적으로 동일한 에피토프와 결합하는 능력을 보유하고, 항체의 아미노산 서열의, 적어도 5개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 10개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 20개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 40개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 50개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 60개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 70개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 80개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 90개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 100개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 125개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 150개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 175개의 연속적인 아미노산 잔기, 적어도 200개의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 나타내고자 한다.
특정한 구현예에서, 상기 항원-결합 단편은 상기 단편이 유래된 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 여전히 바람직한 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 2, 3, 4 또는 5개의 CDR, 보다 바람직하게는 상기 단편이 유래된 항체의 6개의 CDR을 포함한다.
"항원-결합 단편"은 Fv, scFv(단일 사슬에 대한 sc), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아바디(diabody), 또는 XTEN(확장된 재조합 폴리펩타이드) 또는 PAS 모티프와 같은 무질서화된 펩타이드를 갖는 융합단백질, 또는 화학적 변형, 예를 들어 폴리(에틸렌) 글리콜과 같은 폴리(알킬렌) 글리콜의 첨가("페길레이션(PEGylation)")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG로 일컬어지는 PEG화 단편)(폴리(에틸린) 글리콜에 대한 "PEG")와 같은 화학적 변형, 또는 리포좀(liposome) 내에 혼입(incorporation)시킴으로써 반감기 시간(half-life time)이 증가될 수 있는 임의의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이에 제한되지 않고, 상기 단편은 본 발명에 따르는 항체의 적어도 하나의 특징적인 CDR 을 갖는다. 바람직하게는, 상기 "항원-결합 단편"은 상기 단편이 유래된 항체의 중사슬 또는 경사슬 가변 서열의 부분 서열로 구성되거나 또는 이를 포함할 것이며, 상기 부분 서열은 상기 서열이 유래된 항체와 동일한 결합 특이성을 보유하기에 충분하고 충분한 친화성, 바람직하게는 적어도 1/100과 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 1/10로, 표적에 대하여, 상기 유래된 항체와의 친화성이 존재한다.
또 다른 특정한 구현예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 프로가스트린에 결합하는 적어도 하나의 항체와 접촉되고, 상기 항체는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 면역접종 방법에 의해 수득되며, 상기 면역원으로서 사용한 펩타이드는 아미노산 서열이 프로가스트린의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 포함한다. 상기 항체는 다클론성 또는 단일클론성일 수 있다. 하나 이상(예를 들어, 2개)의 항체가 사용되는 경우, 본 발명의 방법은 동일한 유형의 유일한 항체(예를 들어, 2개의 단일클론 항체) 또는 상이한 유형에 속하는 항체(예를 들어, 1개의 단일클론성 및 1개의 다클론성)로 수행될 수 있다.
또 다른 특정한 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 하나의 상기 항체와 접촉된다. 보다 구체적으로, 상기 면역원은
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Figure pct00001
아미노산 서열이 전장 프로가스트린의 아미노산 서열, 및 특히 서열번호 1의 전장 인간 프로가스트린을 포함하거나, 또는 이로 이루어진, 펩타이드,
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Figure pct00002
아미노산 서열이 프로가스트린의 아미노산 서열, 및 특히 서열번호 1의 전장 인간 프로가스트린의 일부에 대응하는 펩타이드,
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Figure pct00003
아미노산 서열이 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열의 일부 또는 전체에 대응하는 펩타이드, 및 특히 아미노산 서열: SWKPRSQQPDAPLG (서열번호 2)을 포함하거나, 또는 이로 이루어진, 펩타이드, 및
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Figure pct00004
아미노산 서열이 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열의 일부 또는 전체에 대응하는 펩타이드, 및 특히 아미노산 서열: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (서열번호 3)을 포함하거나, 또는 이로 이루어진, 펩타이드,
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Figure pct00005
아미노산 서열이 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열의 일부에 대응하는 펩타이드, 및 특히 프로가스트린의 아미노산 71-80 에 대응하는 아미노산 서열 FGRRSAEDEN (서열번호 40)을 포함하는 펩타이드 중에서 선택된 펩타이드를 포함한다.
통상의 기술자는 상기 면역접종이 원하는, 다클론성 또는 단일클론성 항체를 생성하는데 사용될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 상기 유형의 항체 각각을 수득하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
인간 프로가스트린(N-말단)의 아미노산 서열 1-14에 대응하는 아미노산 서열 "SWKPRSQQPDAPLG"을 포함하는 면역원성을 사용하여 생성된 단일클론성 항체의 예는 하기 표 1 내지 표 4에 기술된 바와 같이, 단일클론성 항체: mAb3, mAb4, mAb16, 및 mAb19 및 mAb20 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체가 실제로 프로가스트린에 결합하는지 여부는 분명하지 않지만, 다른 단일클론성 항체가 기술되어 있다(WO 2006/032980). 에피토프 맵핑(epitope mapping)의 실험 결과는 mAb3, mAb4, mAb16, 및 mAb19 및 mAb20이 상기 hPG N-말단 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적으로 결합함을 나타낸다. 서열번호 2 로 표시되는 프로가스트린의 N-말단 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는 다클론성 항체는, 당해 기술분야에 기술되어 있다(예를 들면, WO 2011/083088 참조).
하이브리도마 기탁 단일클론항체
(mAb)		 아미노산 서열 서열번호
6B5B11C10 mAb3 VH CDR 1 GYIFTSYW 서열번호 4
VH CDR 2 FYPGNSDS 서열번호 5
VH CDR 3 TRRDSPQY 서열번호 6
VL CDR 1 QSIVHSNGNTY 서열번호 7
VL CDR 2 KVS 서열번호 8
VL CDR 3 FQGSHVPFT 서열번호 9
하이브리도마 기탁 단일클론항체
(mAb)		 아미노산 서열 서열번호
20D2C3G2 mAb4 VH CDR 1 GYTFSSW 서열번호 10
VH CDR 2 FLPGSGST 서열번호 11
VH CDR 3 ATDGNYDWFAY 서열번호 12
VL CDR 1 QSLVHSSGVTY 서열번호 13
VL CDR 2 KVS 서열번호 14
VL CDR 3 SQSTHVPPT 서열번호 15
하이브리도마 기탁 단일클론항체
(mAb)		 아미노산 서열 서열번호
1E9D9B6 mAb16 VH CDR 1 GYTFTSYY 서열번호 16
VH CDR 2 INPSNGGT 서열번호 17
VH CDR 3 TRGGYYPFDY 서열번호 18
VL CDR 1 QSLLDSDGKTY 서열번호 19
VL CDR 2 LVS 서열번호 20
VL CDR 3 WQGTHSPYT 서열번호 21
하이브리도마 기탁 단일클론항체
(mAb)		 아미노산 서열 서열번호
1B3B4F11 mAb19 VH CDR 1 GYSITSDYA 서열번호 22
VH CDR 2 ISFSGYT 서열번호 23
VH CDR 3 AREVNYGDSYHFDY 서열번호 24
VL CDR 1 SQHRTYT 서열번호 25
VL CDR 2 VKKDGSH 서열번호 26
VL CDR 3 GVGDAIKGQSVFV 서열번호 27
인간 프로가스트린의 아미노산 서열 55-80 에 대응하는 아미노산 서열 "QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN", (프로가스트린의 C-말단 부분)을 포함하는 면역원성을 이용하여 생성될 수 있는 단일클론성 항체의 예로는, 하기 표 5 및 6 에서 mAb8 및 mAb13 로 명시되지만 이에 제한되지 않는다. 에피토프 맵핑의 실험 결과는 mAb13 가 상기 hPG C-말단 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다.
하이브리도마 기탁 단일클론항체
(mAb)		 아미노산 서열 서열번호
1C10D3B9 mAb8 VH CDR 1 GFTFTTYA 서열번호 28
VH CDR 2 ISSGGTYT 서열번호 29
VH CDR 3 ATQGNYSLDF 서열번호 30
VL CDR 1 KSLRHTKGITF 서열번호 31
VL CDR 2 QMS 서열번호 32
VL CDR 3 AQNLELPLT 서열번호 33
하이브리도마 기탁 단일클론항체
(mAb)		 아미노산 서열 서열번호
2C6C3C7 mAb13 VH CDR 1 GFIFSSYG 서열번호 34
VH CDR 2 INTFGDRT 서열번호 35
VH CDR 3 ARGTGTY 서열번호 36
VL CDR 1 QSLLDSDGKTY 서열번호 37
VL CDR 2 LVS 서열번호 38
VL CDR 3 WQGTHFPQT 서열번호 39
다른 예는 서열번호 40 의 아미노산 서열을 포함하는 면역원을 사용하여 생성된 항-hPG 단일클론성 및/또는 다클론성 항체를 포함한다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명에 따르는 방법에서 상기 생물학적 샘플은 적어도 하나의 항-hPG 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 하나의 항-hPG 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 접촉되며, 상기 항-hPG 항체는 N-말단 항-hPG 항체 및 C-말단 항-hPG 항체 중에서 선택된다.
용어 "N-말단 항-hPG 항체(N-terminal anti-hPG antibody)" 및 "C-말단 항-hPG 항체(C-terminal anti-hPG antibody)"는 각각, hPG의 N-말단 부분에 위치한 아미노산을 포함하는 에피토프 또는 hPG의 C-말단 부분에 위치한 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 나타낸다. 바람직하게는, 용어 "N-말단 항-hPG 항체"는 서열이 서열번호 2 로 표시되는 프로가스트린의 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 용어 "C-말단 항-hPG 항체"는 서열이 서열번호 3 로 표시되는 프로가스트린의 도메인에 위치한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다.
용어 "에피토프(epitope)"는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 부분 집합(subset)이며 상호 작용의 친화도에 직접 기여하는 아미노산을 갖는다. 에피토프는 또한 구조적일수 있다. 특정한 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당측쇄(sugar side chain), 포스포릴기(phosphoryl group), 또는 설포닐기(sulfonyl group)와 같은 분자의 화학적 활성인 표면 그룹인 결정인자(determinant)를 포함할 수 있으며, 특정 구현예에서, 특정의 3-차원 구조적 특성, 및/또는 특정의 전하 특성을 가질 수 있다. 항체에 의해 결합된 에피토프의 결정은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된, 임의의 에피토프 맵핑 기술에 의해 수행될 수 있다. 에피토프는 단백질의 아미노산 서열 내에 순차적으로 위치하는 상이한 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 또한 단백질의 아미노산 서열 내에 순차적으로 위치하지 않는 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정한 구현예에서, 상기 항체는 하기로 이루어진 군에서 선택된 단일클론성 항체이다:
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Figure pct00006
서열번호 4, 5, 및 6 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 서열번호 4, 5 및 6 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 중사슬, 및 서열번호 7, 8 및 9 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 서열번호 7, 8 및 9 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체,
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Figure pct00007
서열번호 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 서열번호 10, 11 및 12 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중사슬, 및 서열번호 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 서열번호 13, 14 및 15 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체,
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Figure pct00008
서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 서열번호 16, 17 및 18 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중사슬, 및 서열번호 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 서열번호 19, 20 및 21 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체,
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Figure pct00009
서열번호 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 서열번호 22, 23 및 24 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중사슬, 및 서열번호 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 서열번호 25, 26 및 27 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체,
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Figure pct00010
서열번호 28, 29 및 30 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 서열번호 28, 29 및 30 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중사슬, 및 서열번호 31, 32 및 33 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 서열번호 31, 32 및 33 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체,
Figure pct00011
서열번호 34, 35 및 36 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 또는 서열번호 34, 35 및 36 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중사슬, 및 서열번호 37, 38 및 39 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 또는 서열번호 37, 38 및 39 각각의 서열과의 최적의 정렬 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체, 및
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Figure pct00012
참조번호 I-5158로, 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재(25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, France)의 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur)의 CNCM에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론성 항체.
본원에서 사용된, 핵산 또는 아미노산의 2개의 서열 사이의 "퍼센트 동일성" 또는 "% 동일성"은 최적의 정렬 후에 수득된, 비교될 2개의 서열 간의 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 말하며, 상기 백분율은 순전히 통계적이며 2개의 서열 간의 차이는 길이에 따라 무작위로 분포된다. 2개의 핵산 또는 아미노산 서열의 비교는 전통적으로 서열을 최적으로 정렬시킨 후 상기 서열을 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 분절(segment) 또는 "정렬 창(alignment window)"을 사용하여 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 당해 기술분야의 통상의 기술자자에게 공지된 방법에 의해 손으로 비교하는 것에 추가로 수행될 수 있다.
기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 바람직한 예는 기준 서열, 특정 변형, 특히 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환, 절단 또는 연장을 함유하는 아미노산을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산의 치환의 경우, 치환된 아미노산이 "동등한(equivalent)" 아미노산으로 대체되는 치환이 바람직하다. 여기서, "동등한 아미노산"이라는 표현은 해당 항체 및 하기에서 정의된 특정 예의 생물학적 활성을 변형시키지 않고 구조적 아미노산의 하나를 치환할 수 있는 임의의 아미노산을 나타내는 것을 의미한다.
동등한 아미노산은 이들이 치환된 아미노산과의 구조상 상동성(homology) 또는 생성될 다양한 항체 사이의 생물학적 활성의 비교 테스트 결과에서 결정될 수 있다.
또 다른 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 인간화 항체이다.
본원에서 사용된, "인간화 항체"는 비인간 기원의 항체로부터 유래된 CDR 영역을 포함하는 항체를 말하며, 항체 분자의 다른 부분은 하나 또는 여러 개의 인간 항체로부터 유도된다. 또한, 골격 분절 잔기(skeleton segment residue)(프레임워크에 대해 FR로 불림)의 일부가 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986 참조)을 사용하여, 결합 친화력을 보존하기 위해 필요한 경우 변형될 수 있다. 인간화(humanisation)의 목표는 항체의 완전한 항원 결합 친화도 및 특이성을 유지하면서, 인간에게 도입하기 위한, 쥐(murine) 항체와 같은 이종(xenogenic) 항체의 면역원성의 감소이다.
항체는 CDR-이식(EP 0 239 400; WO 91/09967; 미국 특허 제 5,530,101호; 및 제 5,585,089호), 축성(veneering) 또는 표면 치환(resurfacing)(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991 , Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 91:969-973) 및 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제 5,565,332호)을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 인간 항체는 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 미국 특허 제 4,444,887호, 4,716,111호, 5,545,806호, 및 5,814,318호; 및 국제특허출원 공보번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 를 참조한다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 하기로 이루어진 군:
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Figure pct00013
서열번호 4, 5 및 6 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 5 및 6 각각의 서열과 최적의(optimal) 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 7, 8 및 9 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 8 및 9 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 인간화 항체,
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Figure pct00014
서열번호 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 11 및 12 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 14 및 15 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 인간화 항체,
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Figure pct00015
서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16, 17 및 18 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19, 20 및 21 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 인간화 항체,
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Figure pct00016
서열번호 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22, 23 및 24 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 25, 26 및 27 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 인간화 항체,
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Figure pct00017
서열번호 28, 29 및 30 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 28, 29 및 30 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 31, 32 및 33 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 31, 32 및 33 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 인간화 항체, 및
·
Figure pct00018
서열번호 34, 35 및 36 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 34, 35 및 36 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 37, 38 및 39 각각의 아미노산 서열, 또는 서열번호 37, 38 및 39 각각의 서열과 최적의 정렬을 한 후 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 지닌 서열 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 인간화 항체에서 선택된 인간화 항체이고, 상기 항체는 또한 인간 항체로부터 유래된 경-사슬 및 중-사슬의 불변 영역을 포함한다.
제 1의 구현예에서, 본 발명에 따르는 방법은 생물학적 샘플을 hPG의 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항-hPG 항체, 바람직하게는 hPG의 에피토프에 결합하는 하나의 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 에피토프는 hPG의 C-말단 부분 내에 위치한다. 선택적으로, 본 발명에 따르는 방법은 생물학적 샘플을 hPG의 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항-hPG 항체, 바람직하게는 hPG의 에피토프에 결합하는 하나의 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 에피토프는 hPG의 N-말단 부분 내에 위치한다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명에 따르는 방법은 생물학적 샘플을 hPG의 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항-hPG 항체, 바람직하게는 hPG의 에피토프에 결합하는 하나의 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 에피토프는 hPG의 아미노산 10 내지 14, hPG의 아미노산 9 내지 14, hPG의 아미노산 4 내지 10, hPG의 아미노산 2 내지 10 및 hPG의 아미노산 2 내지 14 에 대응하는 아미노산 서열 중에서 선택된 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 hPG의 아미노산 서열은 서열번호 1이다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명에 따르는 방법은 생물학적 샘플을 hPG의 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항-hPG 항체, 바람직하게는 hPG의 에피토프를 결합하는 하나의 항-hPG 항체와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 에피토프는 hPG의 아미노산 71 내지 74, hPG의 아미노산 69 내지 73, hPG의 아미노산 71 내지 80(서열번호 40), hPG의 아미노산 76 내지 80, 및 hPG의 아미노산 67 내지 74에 대응하는 아미노산 서열 중에서 선택된, 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 hPG의 아미노산 서열은 서열번호 1이다.
본 발명의 방법의 특정한 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플을 프로가스트린의 제 1의 부분에 결합하는 제 1의 약제(agent) 및 프로가스트린의 제 2의 부분에 결합하는 제 2의 약제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 보다 특정한 구현예에서, 상기 프로가스트린-결합 분자는 항체이며, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 프로가스트린의 제 1의 에피토프에 결합하는 항체 및 프로가스트린의 제 2의 에피토프에 결합하는 제 2의 항체와 접촉된다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1 항체는 불용성 또는 부분 용해성 담체에 결합된다. 상기 제1 항체에 의한 프로가스트린의 결합은 상기 생물학적 샘플로부터의 프로가스트린의 포획(capture)을 초래한다. 바람직하게는, 상기 제1 항체는 hPG의 에피토프에 결합하는 항체이고, 상기 에피토프는 상기 기술된, 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 제1 항체는 WO 2011/083088 에 기술된 하이브리도마 2H9F4B7 에 의해 생산된 단일클론성 항체 Mab14 이다. 하이브리도마 2H9F4B7은 참조번호 I-5158로2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 부다페스트 조약(Budapest Treaty) 하에 기탁되었다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2 항체는 하기에 기술된, 검출가능한 모이어티(moiety)로 표지된다. 제2항체에 의한 프로가스트린의 결합은 생물학적 샘플에 존재하는 프로가스트린 분자의 검출을 가능하게 한다. 추가로, 제2항체에 의한 프로가스트린의 결합은 생물학적 샘플에 존재하는 프로가스트린 분자의 정량화를 가능하게 한다. 바람직하게는, 상기 제2항체는 hPG의 에피토프에 결합하는 항체이고, 상기 에피토프는 상기 기술된, 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 N-말단 항체는 상기 기술된, 다클론성 항체이다. 선택적으로, 프로가스트린의 N-말단 내에서 에피토프에 결합하는 단일클론성 항체, 예를 들어 상기 기술된 N-말단 단일클론성 항체, 특히 서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 19, 20 및 21의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체를 사용하는 것 또한 가능하다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 항체는 불용성 또는 부분 용해성 담체에 결합되고, 제2 항체는 검출 가능한 부분으로 표지된다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 방법은 이전에 암으로 진단되지 않은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 프로가스트린의 농도를 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법은 이전에 암으로 진단된 적이 없는 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 프로가스트린의 농도를 결정하는 것을 포함하며, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택된다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 대상체로부터의 혈장 샘플을 적어도 하나의 항-hPG 항체, 특히 하나의 항-hPG 항체와 접촉시키는 것, 및 상기 샘플에서 프로가스트린의 농도를 결정하는 것을 포함하며, 상기 혈장에서 10pM보다 높은 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 암을 발생할 위험을 나타낸다. 즉, 상기 혈장에서 10pM보다 높은 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 나쁜 예후를 나타낸다.
여전히 보다 바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 대상체로부터의 혈장 샘플을 적어도 하나의 항-hPG 항체, 특히 하나의 항-hPG 항체와 접촉시키는 것, 및 상기 샘플에서 프로가스트린의 농도를 결정하는 것을 포함하며, 상기 혈장 샘플에서 10pM, 바람직하게는 20pM, 보다 바람직하게는 30pM, 여전히 보다 바람직하게는 40pM, 보다 더 바람직하게는 50pM 보다 높은 프로가스트린의 농도는 상기 대상체에서 암을 발생할 위험을 나타낸다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 암으로 진단되지 않았던 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 상기 기술된 임의의 방법에 의해 암을 발생할 상기 환자의 위험도를 평가하는 단계; 및
b) 단계 a)에 따라 위험이 있는 경우 상기 암을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은, 암이 매우 초기 단계에서 동정될 수 있기 때문에 특히 유리하다. 당해 기술분야에서는 암의 동정이 빠를수록 완화(remission)될 가능성이 높다는 것이 알려져 있다. 또한, 환자는 너무 공격적이지 않은 항암제로 치료될 수 있고, 이로써 치료 효과를 유지함과 동시에 부작용의 가능성을 줄인다.
특정한 구현예에서, 본 발명에 따르는 방법은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 프로가스트린의 농도를 상기 샘플내에서 프로가스트린의 농도의 미리 결정된 값과 비교하는 것을 포함하며, 보다 특정한 구현예에서, 상기 미리 결정된 값은 평균값, 또는 상기 평균값을 기반으로 한 샘플 값의 평균값, 또는 암이 없는 개체군에서 결정된 값의 평균값, 환자가 암이 없는 것으로 알려진 경우 수득된 프로가스트린 농도값 중에서 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 또한 상기 기술된 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 이러한 실시 양태에 따르면, 조성물은 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체에서 암 발생의 위험도를 평가하기 위한 것이고, 상기 조성물은 적어도 하나의 프로가스트린-결합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
제 1의 구현예에서, 본 발명에 따르는 조성물은 프로가스트린의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 항체를 포함한다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명에 따르는 조성물은 프로가스트린의 에피토프를 인식하는 항체를 포함하고 상기 에피토프는 프로가스트린의 N-말단 부분의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 hPG의 잔기 10 내지 14, hPG의 잔기 9 내지 14, hPG의 잔기 4 내지 10, hPG의 잔기 2 내지 10 또는 hPG의 잔기 2 내지 14를 포함할 수 있고, 상기 hPG의 아미노산 서열은 서열번호 1 이다.
보다 특정한 구현예에서, 본 발명에 따르는 조성물은 프로가스트린의 에피토프를 인식하는 항체를 포함하고 상기 에피토프는 프로가스트린의 C-말단 부분의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 hPG의 잔기 71 내지 74, hPG의 잔기 69 내지 73, hPG의 잔기 71 내지 80 (서열번호 40), hPG의 잔기 76 내지 80 또는 hPG의 잔기 67 내지 74를 포함할 수 있고, 상기 hPG의 아미노산 서열은 서열번호 1 이다.
여전히 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 유용한 키트(kit)를 제공하며, 상기 키트는 본 발명의 임의의 항체를 포함한다. 상기 기술된 방법을 수행하기 위한 지침서에 따르는 미리 결정된 양의 시약(reagent)의 조합물을 포함하는 포장된 물질, 예를 들어 키트는, 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 본 발명의 적어도 하나의 항체, 보다 바람직하게는 2개를 포함한다.
예를 들어, 제 1의 구현예에서, 상기 키트는 불용성 또는 부분 용해성 담체에 결합된 제1항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제1항체는 hPG의 에피토프에 결합하는 항체이고 상기 에피토프는 상기 기술된, 프로가스트린의 C-말단 부분 내의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 제1항체는 WO 2011/083088에 기술된, 하이브리도마 2H9F4B7에 의해 생산된 단일클론성 항체 Mab14 이다. 하이브리도마 2H9F4B7은 참조번호 I-5158로, 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 부다페스트 조약 하에 기탁되었다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된, 다클론성 또는 단일클론성 항체, 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체는 검출 가능한 부분으로 표지되어 제공되며, 이들은 프로가스트린에 대한 수용체에 결합 또는 분비 전에, 상기 항원을 갖는 세포를 동정하기 위해 예를 들어, 키트 내에 포장되고 사용될 수 있다. 이러한 표지의 비-제한적인 예는 플루오레세인 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate)과 같은 형광단(fluorophore); 발색단(chromophore), 방사성핵종(radionuclide), 비오틴(biotin) 또는 효소를 포함한다. 상기 표지된 항체 또는 결합 단편은 항원의 조직학적 국소화, ELISA, 세포 선별(cell sorting) 뿐만 아니라 예를 들어, 프로가스트린, 및 상기 항원을 보유하는 세포를 검출 또는 정량화하기 위한 다른 면역학적 기술에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지된 항체는 hPG의 에피토프를 결합하는 항체이고, 상기 에피토프는 상기 기술된, 프로가스트린의 N-말단 부분 내의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 N-말단 항체는 상기 기술된, 다클론성 항체이다. 선택적으로, 프로가스트린의 N-말단 내에서 에피토프에 결합하는 단일클론성 항체, 예를 들어 상기 기술된 N-말단 단일클론성 항체, 특히 서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 19, 20 및 21의 아미노산 서열 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체를 사용하는 것 또한 가능하다.
따라서 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는
-제 1의 항-프로가스트린 항체, 상기 항체는 참조번호 I-5158로, 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론성 항체인 상기 제1의 항-프로가스트린 항체; 및
-제 2의 항-프로가스트린 항체, 상기 제2의 항-프로가스트린 항체는 프로가스트린의 N-말단 내에서 에피토프에 결합하는 다클론성 항체 또는 하기의 3개의 CDR, 서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 하기 3개의 CDR, 서열번호 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체를 포함한다.
본 발명은 상기 항체, 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체가 표지된 키트를 포함한다.
시약은 용해(dissolution)시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제(excipient)를 포함하여, 건조된 분말, 일반적으로 동결 건조된 것으로 제공될 수 있다.
키트는 시험관 내(in vitro), 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯(Western blot)에서 프로가스트린의 검출 및 정량을 위한 항체를 함유한다. 본 발명의 항체는 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 프로가스트린의 검출 및 정량화를 위한 키트로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질(substrate) 및 보조 인자(cofactor)(예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정화제(stabilizer), 완충액(buffer)(예를 들어, 블록(block) 완충액 또는 용해(lysis) 완충액) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 상기 키트는 바이알(vial), 튜브 등과 같은 하나 또는 그 이상의 용기(container)를 수용하기 위해 구획화된 리셉터클(receptacle)을 포함할 수 있으며, 상기 용기는 본 발명의 개별 요소를 보유한다. 예를 들어, 하나의 용기는 불용성 또는 부분 용해성 담체에 결합된 제1항체를 함유할 수 있다. 제2용기는 가용성의, 검출 가능하게-표지된 제2항체를 동결 건조된 형태 또는 용액으로 함유할 수 있다. 상기 리셉터클은 또한 검출 가능하게 표지된 제3항체를 동결 건조된 형태 또는 용액으로 보유하는 제3용기를 함유할 수 있다. 이러한 성질의 키트는 본 발명의 샌드위치 분석(sandwich assay)에 사용될 수 있다. 라벨(label) 또는 패키지 삽입물(package insert)은 의도된 시험관 내 또는 진단 용도에 대한 지침뿐만 아니라 조성물에 대한 설명을 제공할 수 있다.
키트는 또한 세포로부터 프로가스트린의 정제(purification) 또는 면역침전(immunoprecipitation)에 대한 양성 대조군(positive control)으로서 사용하기 위해 제공된다. 프로가스트린의 분리(isolation) 및 정제를 위해, 키트는 비드(bead) (예를 들어, 세파로즈(sepharose) 비드)에 연결된, 본원에 기술된 항체, 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체를 함유할 수 있다. 키트는 시험관 내 또는 생체 외(ex vivo)에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 프로가스트린의 검출 및 정량화를 위해 항체를 함유하는 것으로 제공될 수 있다. 상기 키트는 용기 및 용기에 있거나 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 상기 용기는 본 발명의 적어도 하나의 항체, 또는 결합 단편 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 보유한다. 추가의 용기는 예를 들어, 희석제(diluent) 및 완충액, 대조군 항체를 함유하는 것을 포함할 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 의도된 시험관 내 또는 진단 용도에 대한 지침뿐만 아니라 조성물에 대한 설명을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법의 실행(implementation)에 특유한 일련의 지시사항을 포함하는 제품/컴퓨터 프로그램에 관한 것이다.
본 발명은 또한 계산 유닛(computation unit) 및 입력 인터페이스(input interface)를 포함하는 처리(processing) 시스템에 관한 것으로, 상기 시스템은 본원에 개시된 암을 발생시키는 위험도를 결정하기 위한 방법을 실행하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 13을 참조하면, 본 발명의 특정한 구현예에 따르는 장치(1)는 컴퓨터의 지시사항을 따르고 데이터를 처리할 수 있는 계산 유닛(10)을 포함한다. 상기 하나의 계산 유닛은 바람직하게는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 유형일 수 있는, 마이크로프로세서(110)를 포함한다. 계산 유닛(10)은 또한 방법의 실행에 특유한 일련의 지시사항을 포함하는 컴퓨터 프로그램을 수신할 수 있고, 데이터를 저장할 수 있는 저장 유닛(100)을 갖는다.
상기 장치(1)는 또한 장치(1)의 작동자(O)가 처리될 데이터를 입력할 수 있게 하는 계산 유닛(10)에 연결된 입력 인터페이스(12)를 포함한다. 상기 하나의 입력 인터페이스(12)는 포인팅 장치 요소(pointing device element)와 선택적으로 관련되는 키보드(keyboard) 요소와 같은 계산 유닛(10)에 예정된 상기 데이터의 입력을 가능하게 하는 임의의 요소를 포함한다.
바람직하게는, 계산 유닛은 한편으로는 사용자가 입력된 데이터의 완전성(integrity)을 검증할 수 있게 하지만 다른 한편으로는 계산 유닛(10)이 작동자(O)와 상호작용할 수 있게 하는 스크린과 같은 출력(output) 인터페이스(14)를 추가로 포함한다.
장치(1)는 컴퓨터, 스마트폰 또는 본 발명의 방법의 실행을 가능하게 하는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 다른 시스템과 같이 단일 시스템에 통합될 수 있다. 작동자(O)는 임의의 기술 수준을 가질 수 있으므로 의료 자격을 가지고 있거나 또는 가지고 있지 않을 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에 따르면 작동자(O)에 의해 입력된 데이터는 네트워크(예를 들어, 인터넷)를 통해 바람직하게는 보안 방식으로 본 발명의 방법을 실행할 수 있고 따라서 서버에 의해 수신된 데이터를 처리할 수 있는 계산 유닛을 포함하는 원격 서버로 전송된다는 것에 특히 주목된다. 선택적으로, 상기 처리 후에, 상기 서버는 분석 결과를 사용자에게 동일한 네트워크 또는 다른 네트워크를 통해 돌아간다. 선택적으로, 상기 서버는 데이터 및/또는 기록 수단에서의 분석 결과를 기록한다. 분명히, 공여자(donor)와 수용자(recipient)의 생리학적/임상적 특성의 익명성을 보장할 수 있는 수단이 고려될 수 있다.
따라서, 상기 하나의 장치(1)는 본 발명의 방법의 실행을 가능하게 하며, 즉, 하기의 단계들의 실행을 가능하게 한다:
- 입력 인터페이스(12)를 사용하여 생리학적/임상적인 특성을 계산 유닛(10)에 입력하는 단계(단계 22)로서, 상기 특성은 샘플(10)에서 프로가스트린의 수준을 포함하는 단계(단계 23),
- 선택적으로 계산 유닛(10)에 의한 데이터 처리를 통해 상기 프로가스트린의 수준을 표준화하는 단계(단계 24), 및
- 암의 발생 위험도를 결정하기 위해 상기 위험 점수를 분석하는 단계(단계 25).
따라서, 본 발명의 방법은 임상 또는 병원 직원뿐만 아니라 임상 연구에 포함된 모든 사람들(제약 산업, 과학자, 의사 등) 또는 일반 대중에 의해서도 실행될 수 있다.
하기의 실시예는 단지 본 발명의 범주 및 본 개시 내용의 예시이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 하기 열거된 실시예들에 대해 다수의 수정(modification)을 고안하고 구성할 수 있다.
도 1: 결장직장암(colorectal cancer)에 대한 수용자 조작 특성(ROC) 곡선(상단 패널)과 ROC곡선 아래 면적 및 통계 분석(하단 패널).
도 2: N-말단 다클론성 항체 및 C-말단 다클론성 항체의 조합을 사용한 결장직장암 환자(n=148) 및 대조군 환자(n=103)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트(Mann Whitney test) 양측(two-tailed), *** p<0.0001.
도 3: 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)에 대한 수용자 조작 특성(ROC) 곡선(상단 패널)과 ROC 곡선 아래 영역 및 통계 분석(하단 패널).
도 4: N-말단 다클론성 항체 및 C-말단 다클론성 항체의 조합을 사용한 간세포 암종 환자(n=47) 및 대조군 환자(n=103)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트 양측, *** p<0.0001.
도 5: 식도암(oesophagic cancer)에 대한 수용자 조작 특성(ROC) 곡선(상단 패널)과 ROC 곡선 아래 영역 및 통계 분석(하단 패널).
도 6: N-말단 다클론성 항체 및 C-말단 다클론성 항체의 조합을 사용한 식도암 환자(n=12) 및 대조군 환자(n=103)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트 양측, *** p<0.0001.
도 7: 위암(gastric cancer)에 대한 수용자 조작 특성(ROC) 곡선(상단 패널)과 ROC 곡선 아래 영역 및 통계 분석(하단 패널).
도 8: N-말단 다클론성 항체 및 C-말단 다클론성 항체의 조합을 사용한 위암 환자(n=15) 및 대조군 환자(n=103)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트 양측, *** p<0.0001.
도 9: 췌장암(pancreatic cancer)에 대한 수용자 조작 특성(ROC) 곡선(상단 패널)과 ROC 곡선 아래 영역 및 통계 분석(하단 패널).
도 10: N-말단 다클론성 항체 및 C-말단 다클론성 항체의 조합을 사용한 췌장암 환자(n=44) 및 대조군 환자(n=103)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트 양측, *** p<0.0001.
도 11: 난소암(ovarian cancer)에 대한 수용자 조작 특성(ROC) 곡선(상단 패널)과 ROC 곡선 아래 영역 및 통계 분석(하단 패널).
도 12: N-말단 다클론성 항체 및 C-말단 다클론성 항체의 조합을 사용한 난소암 환자(n=8) 및 대조군 환자(n=103)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트 양측, *** p<0.0001.
도 13: 본 발명의 특정한 구현예에 따르는 처리 시스템의 도식도.
도 14: 본 발명의 특정한 구현예에 따르는 방법을 나타내는 기능적인 도표.
도 15: 다클론성 항체 및 단일클론성 항체의 조합을 사용하여 다양한 암 유형 환자(n=231), 및 대조군 환자(n=322)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값.
도 16: 다클론성 항체 및 단일클론성 항체(mAb-pAb) 또는 단일클론성 항체의 조합(mAb-mAb)을 사용한, 다양한 암 유형 환자(n=10)에서 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값 - 맨 휘트니 테스트 양측, *** p<0.0001.
실시예 1: 다클론성 항체를 사용한 혈장 프로가스트린 농도의 검출
혈장 프로가스트린의 수준은 2개의 특이적 항-프로가스트린 항체의 사용을 통해 ELISA에 의해 정량화되었다: 포획(capture) 항체는 플레이트(plate)의 웰(well) 상에 코팅되지만, 반면에 개시(revelation) 항체는 프로가스트린을 검출하기 위해 사용되고 신호의 개시를 매개한다.
본 실시예에서, 정량화는 반응이 빛을 방출하는 기질(substrate)의 사용을 통해, 포획 항체에 의해 보유된 항원에 결합된 항체의 발광 양에 비례하는 값을 할당하는 것을 허용하는 ELISA 방법에 기초한다.
재료
시약 및 장치(apparatus)는 표 7에 나열되어 있다:
명칭 제공기관 참조 번호
MaxiSORP 흰색 누크 플레이트, 96 웰(Plates MaxiSORP white Nunc, 96 wells) 뒤셀(Dutscher) # 055221
탄산나트륨/중탄산염(Sodium Carbonate / Bicarbonate) 시그마(Sigma) # 21851
DPBS 1X 론자(Lonza) # P04-36500
트윈-20(Tween-20) 바이오솔브(Biosolve) # 20452335
BSA 유로메덱스(Euromedex) # 04-100-810-C
스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP) 피어스(서모)Pierce (Thermo) # 21130
수퍼시그널 ELISA 펨토 최대 감도 기질 (SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate) 피어스(서모)Pierce (Thermo) # 37074
항-프로가스트린 다클론성 항체(Anti-ProGastrin Polyclonal Antibody) 유로젠텍(Eurogentec) /
다클론성 항체는 N-말단 프로가스트린(서열번호 2) 또는 hPG의 아미노산 71 내지 80에 대응하고 표준 프로토콜에 따라, 서열 FGRRSAEDEN(서열번호 40)을 갖는C-말단 프로가스트린을 토끼(rabbit)에게 면역접종함으로써 수득된다.
상기 분석에서 사용된 프로가스트린에 대한 다클론성 항체의 결합 특성은 하기와 같다: G34-Gly, G34, G17-Gly, G17에의 결합의 부재, 전장 프로가스트린에 대한 결합.
96 웰 플레이트는 100 ml 의 MilliQ 물에 1개의 캡슐의 내용물을 용해시켜 탄산염-중탄산 나트륨, 50 mM pH 9.6 의 용액을 제조함으로써 코팅된다. 프로가스트린 FGRRSAEDEN (서열번호 40)의 C-말단을 사용하여 수득된 다클론성 항체에 대응하는 포획 항체(3 μg/ml)의 용액은, 탄산염 완충액에서 제조된다. 100 마이크로리터의 항체 용액은 각 웰에 첨가되고 4 °C 에서 16 시간(1 밤) 동안 배양된다. 플레이트는 이후에 항체 용액을 제거하고 300μl 1X PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척한 후, 웰 당 차단 완충액(1X PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA) 200μl을 첨가하여 차단되고, 22 °C 에서 2 시간 동안 배양된다. 이후에 차단 완충액은 제거되고, 웰은 300 μl 1X PBS / 0.1 % 트윈-20으로 3 회 세척된다.
혈장 희석은 하기와 같이 수행된다: 혈장은 1/2, 1/5 및 1/10 로 희석된 순수한 상태로 사용된다. 희석은 1X PBS / 0.1% 트윈 20 / 0.1% BSA 속의 순수한 혈장으로부터 준비된다.
대조군 테스트, 프로가스트린의 공지된 농도의 존재 하의 ELISA에 있어서, 프로가스트린 희석은 하기와 같이 준비된다: 스톡(stock) 재조합 PG (대장균에서 생산된 전장 인간 프로가스트린 및 프랑스 파리에 소재한 파스퇴르 연구소부터의, 글루타티온 아가로스/태그 제거(Tev)/IMAC 카운터 정제/투석으로 정제된 친화도)은 0.45 mg/ml (45 microM)의 농도로, 3회 제조된다. 프로가스트린 농도의 범위는 하기와 같이 제조되었다.
· 용액 A: 1/10로 사전-희석(pre-dilution), 2 μl의 스톡 + 18 μl의 완충액
· 용액 B: 1/100로 사전-희석, 10 μl의 A + 90 μl의 완충액
· 용액 C: 1/1000로 사전-희석, 10 μl의 B + 90 μl의 완충액
· 용액 D: 500 pM, 5,55 μl의 C + 494.5 μl의 희석액
· 용액 E: 250 pM, 250 μl의 D + 250 μl의 희석액
· 용액 F: 100 pM, 200 μl의 E + 300 μl의 희석액
· 용액 G: 50 pM, 250 μl의 F + 250 μl의 희석액
· 용액 H: 25 pM, 200 μl의 G + 200 μl의 희석액
· 용액 I: 10 pM, 100 μl의 H + 150 μl의 희석액
재조합 PG의 범위는 선형이고 그 결과 사용된 항체에 따라 다소 광범위할 수 있다.
테스트 샘플의 제조를 위해, 각 샘플의 약 500 μl 는 따로 보관되고 결과의 분석(및 필요한 경우 확인)때까지 보관된다. 범위 및/또는 혈장의 각 지점의 100 μl 는 순수하게 분석되고, 1/2, 1/5 및 1/10로 희석되며, 플레이트 상에 22 °C 에서 2시간 동안 배양된다.
테스트의 개시를 위해, 플레이트는 300 μl 1X PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척된다. 다클론성 토끼 항-프로가스트린 항체의 용액은, 상기 항체가 0.5 μg/ml로 바이오틴에 연결된 면역원으로서 프로가스트린의 N-말단 부분을 사용하여 수득되며, 1X PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA 내에서 희석함으로 제조된다. 상기 용액의 100 μl 은 각 웰에 첨가된다. 배양은 22 °C 에서 1시간 동안 수행한다. 스트렙타비딘-HRP를 사용한 개시는 검출 항체를 제거함으로써 수행되고 300 μl 1X PBS / 0.1% 트윈-20으로 3회 세척한 후, 1X PBS / 0.1% 트윈-20 / 0.1% BSA 속에서 희석된 20 ng / ml의 스트렙타비딘-HRP 용액을 제조하며, 22 °C 에서 1시간 배양 전에, 상기 용액의 100 μl에 100 (100 Add 100 μl)이 각 웰에 첨가된다.
검출은 스트렙타비딘-HRP를 제거하고 300 μl 1X PBS / 0.1% 트윈-20 으로 3회 세척한 후, 웰 당 100 μl의 화학 발광 기질 용액을 첨가하는 것으로 이루어진다. 기질 용액은 사용하기 30분 전에 동일한 양의 수퍼시그널(Super Signal) ELISA 펨토 키트 2개의 용액을, 20 ml + 20 ml의 동일한 부피로 혼합하여 제조되고 암실에서 실온에 보관된다. 발광(luminescence)은 암실에서 실온에 5분 배양 후 판독된다.
각각의 조건에 대해, 테스트는 3회 수행되고 범위의 결과는 프로가스트린 농도에 따른 발광의 변화를 나타내는 그래프로서 제시될 것이다. 각각의 혈장 희석의 경우, 프로가스트린의 농도는 대응하는 범위 (1 / 10로 희석된 샘플의 경우 1 / 10의 범위)의 선형 회귀 직선의 방정식(linear regression line)을 사용하여 결정된다.
방법 및 결과
프로가스트린 수치는 이후에 암이 발생된 것으로 알려진 대상체로부터의 혈장 샘플에서 결정되었다. 프로가스트린은 C-말단에 특이적인 다클론성 항체로 포획되었다. 검출은 N-말단에 특이적인 표지된 다클론성 항체로 수행되었다.
중요하게도, 샘플 수집 시점에서, 상기 대상체는 암으로 진단되지 않았고 암과 관련된 임의의 증상도 나타내지 않았다. 대조군은 일반 개체군으로부터의 혈장 샘플로 구성되었다.
상기 결과는 도 1 내지 12 에 나타낸다. 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값은 이후에 결장직장암이 발생된 환자(n=148)에서는 17pM 이었고, 간세포 암종이 발생된 환자(n=47)에서는 100pM, 식도암이 발생된 환자(n=12)에서는 42.3pM, 위암이 발생된 환자(n=15)에서는 17.90pM, 췌장암이 발생된 환자(n=44)에서는 16.6pM, 및 난소암이 발생된 환자(n=8)에서는 8.45 이었다. 대조적으로, 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값은 대조군 개체(n=103)에서 0pM 이다.
상기 데이터는 암을 발생시킬 환자는 혈장에서 프로가스트린의 검출가능한 수준을 보이지만 건강한 대조군 개체에서는 보이지 않음을 입증한다. 프로가스트린은 임의의 암이 진단되기 전에도 검출될 수 있고, 암 발병에 대해 유용한 바이오마커가 된다. ROC 분석은 상기 나열된 암의 각각에 대해 프로가스트린의 예측적 성질을 확인하였다.
상기 데이터는 암 발생 위험이 있는 환자가 건강한 대조군 개체에 비해 혈장 내 프로가스트린 농도가 더 높다는 것을 입증한다.
실시예 2: 다클론성 항체 및 단일클론성 항체의 조합을 사용한 혈장 프로가스트린 농도의 검출.
본 실시예에서, 혈장 프로가스트린 수준은 96-웰 플레이트 상에 사전-코팅된 인간 프로가스트린(hPG)에 특이적인 항체의 사용을 통해 ELISA에 의해 정량화되었다. 표준 및 샘플은 웰에 첨가되고, 존재하는 임의의 hPG는 고정된 포획 항체에 결합한다. 웰은 세척되고 항-hPG 검출 항체인 겨자무과산화효소(horseradish peroxidise(HRP)) 접합체는 첨가되어, 항체-항원-항체의 "샌드위치"를 생성한다. 2차 세척 후, TMB 기질 용액이 첨가되고, 상기 용액은 초기 샘플에 존재하는 hPG의 양에 정비례하여 청색을 생성한다. 정지 용액(stop solution)은 색상을 청색에서 황색으로 변경하고, 상기 웰은 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 450nm에서 판독된다.
다클론성 항체는 표준 프로토콜에 따라, N-말단 프로가스트린(서열번호 2) 또는 hPG의 아미노산 71 내지 80에 상응하는 서열 FGRRSAEDEN (서열번호 40)을 갖는 C-말단의 프로가스트린으로 토끼에 면역접종하여 수득된다.
단일클론성 항체는 표준 프로토콜에 따라, N-말단 프로가스트린 (서열번호 2) 또는 hPG의 아미노산 71 내지 80 에 상응하는 서열 FGRRSAEDEN (서열번호 40)을 갖는 C-말단의 프로가스트린에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 사용하여 수득된다.
상기 분석에서 사용된 프로가스트린에 대한 다클론성 및 단일클론성 항체의 결합 특성은 하기와 같다: G34-Gly, G34, G17-Gly, G17에의 결합의 부재, 전장 프로가스트린에 대한 결합.
대조군 테스트, 프로가스트린의 공지된 농도의 존재 하의 ELISA에 있어서, 프로가스트린의 희석은 하기와 같이 제조된다: 재조합 PG 스톡(대장균에서 생성된 전장 인간 프로가스트린 및 프랑스 파리에 소재한 파스퇴르 연구소부터의, 글루타티온 아가로스/태그 제거(Tev)/IMAC 카운터 정제/투석으로 정제된 친화도)은 0.45 mg/ml (45 microM) 의 농도로 3회 제조된다. 프로가스트린의 농도의 범위는 하기와 같이 제조되었다:
· 용액 A: 1/10로 사전-희석(pre-dilution), 2 μl의 스톡 + 18 μl의 완충액
· 용액 B: 1/100로 사전-희석, 10 μl의 A + 90 μl의 완충액
· 용액 C: 1/1000로 사전-희석, 10 μl의 B + 90 μl의 완충액
· 용액 D: 500 pM, 5,55 μl의 C + 494.5 μl의 희석액
· 용액 E: 250 pM, 250 μl의 D + 250 μl의 희석액
· 용액 F: 100 pM, 200 μl의 E + 300 μl의 희석액
· 용액 G: 50 pM, 250 μl의 F + 250 μl의 희석액
· 용액 H: 25 pM, 200 μl의 G + 200 μl의 희석액
· 용액 I: 10 pM, 100 μl의 H + 150 μl의 희석액
재조합 PG 의 범위는 선형이고 그 결과 사용된 항체에 따라 다소 광범위할 수 있다.
방법 및 결과
프로가스트린 수준은 이후에 암이 발생된 것으로 알려진 대상체로부터의 혈장 샘플에서 결정되었다. 프로가스트린은 WO 2011/083088 에 기술된 하이브리도마 2H9F4B7 에 의해 생성된 C-말단 단일클론성 항체 14 로 포획되었다(하이브리도마 2H9F4B7 은 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 부다페스트 조약하에 참조번호 I-5158로 기탁됨). 검출은 N-말단에 특이적으로 표지된 다클론성 항체로 수행되었다.
중요하게도, 샘플 수집 시점에서, 상기 대상체는 암으로 진단되지 않았고 암과 관련된 임의의 증상을 전혀 나타내지 않았다. 대조군은 일반 개체군으로부터의 혈장 샘플로 구성되었다.
상기 결과는 도 15 에서 나타낸다. 프로가스트린의 혈장 농도의 중앙값은 암의 유형에 따르는 환자(n=231)에서 2.750 과 21.5 pM 사이에 나열되었다. 대조적으로, 프로가스트린의 평균 혈장 농도는 대조군 개체(n=322)에서 0 pM 이다.
상기 데이터는 암을 발생시킬 환자는 혈장에서 프로가스트린의 검출 가능한 수준을 보이지만 건강한 대조군 개체는 보이지 않는 것을 입증한다. 프로가스트린은 임의의 암이 진단되기 전에도 검출될 수 있고, 암 발병에 대해 유용한 바이오마커가 된다.
상기 데이터는 암 발병 위험이 있는 환자가 건강한 대조군 개체에 비해 혈장 내 프로가스트린의 농도가 더 높다는 것을 입증한다.
실시예 3: 단일클론성 항체의 조합을 사용한 혈장의 프로가스트린 농도의 검출
본 실시예에서, 혈장 프로가스트린 수준은 96-웰 플레이트 상에 사전-코팅된 인간 프로가스트린(hPG)에 특이적인 항체의 사용을 통해 ELISA에 의해 정량화되었다. 표준 및 샘플은 웰에 첨가되고, 존재하는 임의의 hPG는 고정된 포획 항체에 결합한다. 웰은 세척되고 항-hPG 검출 항체인 겨자무과산화효소(HRP) 접합체는 첨가되어, 항체-항원-항체의 "샌드위치"를 생성한다. 2차 세척 후, TMB 기질 용액이 첨가되고, 상기 용액은 초기 샘플에 존재하는 hPG의 양에 정비례하여 청색을 생성한다. 정지 용액은 색상을 청색에서 황색으로 변경하고, 상기 웰은 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 판독된다.
다클론성 항체는 표준 프로토콜에 따라, N-말단 프로가스트린(서열번호 2) 또는 hPG의 아미노산 71 내지 80에 상응하는 서열 FGRRSAEDEN (서열번호 40)을 갖는 C-말단의 프로가스트린으로 토끼에 면역접종하여 수득된다.
단일클론성 항체는 표준 프로토콜에 따라, N-말단 프로가스트린 (서열번호 2) 또는 hPG의 아미노산 71 내지 80에 상응하는 서열 FGRRSAEDEN (서열번호 40)을 갖는 C-말단의 프로가스트린에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 사용하여 수득된다.
상기 분석에서 사용된 프로가스트린에 대한 다클론성 및 단일클론성 항체의 결합 특성은 하기와 같다: G34-Gly, G34, G17-Gly, G17에의 결합의 부재, 전장 프로가스트린에 대한 결합.
대조군 테스트, 프로가스트린의 공지된 농도의 존재 하의 ELISA에 있어서, 프로가스트린의 희석은 하기와 같이 제조된다: 재조합 PG 스톡(대장균에서 생성된 전장 인간 프로가스트린 및 프랑스 파리에 소재한 파스퇴르 연구소부터의, 글루타티온 아가로스/태그 제거(Tev)/IMAC 카운터 정제/투석으로 정제된 친화도)은 0.45 mg/ml (45 microM)의 농도로 3회 제조된다. 프로가스트린의 농도의 범위는 하기와 같이 제조되었다:
· 용액 A: 1/10로 사전-희석(pre-dilution), 2 μl의 스톡 + 18 μl의 완충액· 용액 B: 1/100로 사전-희석, 10 μl의 A + 90 μl의 완충액
· 용액 C: 1/1000로 사전-희석, 10 μl의 B + 90 μl의 완충액
· 용액 D: 500 pM, 5,55 μl의 C + 494.5 μl의 희석액
· 용액 E: 250 pM, 250 μl의 D + 250 μl의 희석액
· 용액 F: 100 pM, 200 μl의 E + 300 μl의 희석액
· 용액 G: 50 pM, 250 μl의 F + 250 μl의 희석액
· 용액 H: 25 pM, 200 μl의 G + 200 μl의 희석액
· 용액 I: 10 pM, 100 μl의 H + 150 μl의 희석액
재조합 PG의 범위는 선형이고 그 결과 사용된 항체에 따라 다소 광범위할 수 있다.
방법 및 결과
프로가스트린 수준은 이후에 암이 발생된 것으로 알려진 대상체로부터의 혈장 샘플에서 결정되었다. 프로가스트린은 WO 2011/083088 에 기술된 하이브리도마 2H9F4B7 에 의해 생성된 C-말단 단일클론성 항체 14로 포획되었다(하이브리도마 2H9F4B7 은 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 부다페스트 조약하에 참조번호 I-5158로 기탁됨). 검출은 N-말단에 특이적인 WO 2011/083088 에 기술된 표지된 단일클론성 항체 16으로 수행되었다.
중요하게도, 샘플 수집 시점에서, 상기 대상체는 암으로 진단되지 않았고 암과 관련된 임의의 증상을 전혀 나타내지 않았다. 대조군은 일반 인구 집단으로부터의 혈장 샘플로 구성되었다.
상기 결과는 도 16에서 나타낸다. mAb-pAb 및 mAb-mAb를 사용한 프로가스트린의 혈장 농도 중앙값은 각각의 중앙값(각각 8.2 대 6.6 pM) 및 평균값(18.99 대 16.79 pM)에 유사하였다(n=10).
상기 데이터는 mAb-pAb 및 mAb-mAb ELISA 샌드위치 테스트가 환자의 혈장에서 프로가스트린 2개 모두를 검출하는 것을 입증한다. 중요하게도, 2개의 테스트 사이의 유의적인 차이는 확인될 수 있었다. 특히, mAb-pAb 및 mAb-mAb 샌드위치의 민감도는 매우 유사하였다. 따라서 mAb-mAb ELISA 샌드위치는 임의의 암이 진단 가능하기 전에도 환자의 혈장에서 프로가스트린을 확실하게 검출하는 데 사용될 수 있고, 프로가스트린은 암 발병에 대해 유용한 바이오마커가 된다.
상기 데이터는 암 발병 위험이 있는 환자가 건강한 대조군 개체에 비해 혈장 내 프로가스트린의 농도가 더 높다는 것을 입증한다.
Collection nationale de cultures de micro-organismes(CNCM) CNCMI-5158 20161227
SEQUENCE LISTING <110> Syncerus S.a r.l. <120> Compositions and methods for assessing the risk of cancer occurrence <130> IPA180651-FR <140> PCT EP2017/050034 <141> 2017-01-02 <150> EP15307190.7 <151> 2015-12-31 <150> EP16305133.7 <151> 2016-02-05 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(80) <223> Human progastrin <400> 1 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly 1 5 10 15 Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gln Gln Gly Pro Ala 20 25 30 Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val 35 40 45 Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 65 70 75 80 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acids 1-14, N-terminal extremity of human progastrin <400> 2 Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acids 1-14, N-terminal extremity of human progastrin <400> 3 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 1 5 10 15 Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn 20 25 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B5B11C10 CDR-H1 <400> 4 Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B5B11C10 CDR-H2 <400> 5 Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B5B11C10 CDR-H3 <400> 6 Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B5B11C10 CDR-L1 <400> 7 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B5B11C10 CDR-L2 <400> 8 Lys Val Ser 1 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6B5B11C10 CDR-L3 <400> 9 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D2C3G2 CDR-H1 <400> 10 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Trp 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D2C3G2 CDR-H2 <400> 11 Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D2C3G2 CDR-H3 <400> 12 Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D2C3G2 CDR-L1 <400> 13 Gln Ser Leu Val His Ser Ser Gly Val Thr Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D2C3G2 CDR-L2 <400> 14 Lys Val Ser 1 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20D2C3G2 CDR-L3 <400> 15 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E9D9B6 CDR-H1 <400> 16 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E9D9B6 CDR-H2 <400> 17 Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E9D9B6 CDR-H3 <400> 18 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E9D9B6 CDR-L1 <400> 19 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E9D9B6 CDR-L2 <400> 20 Leu Val Ser 1 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E9D9B6 CDR-L3 <400> 21 Trp Gln Gly Thr His Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B3B4F11 CDR-H1 <400> 22 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B3B4F11 CDR-H2 <400> 23 Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr 1 5 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B3B4F11 CDR-H3 <400> 24 Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B3B4F11 CDR-L1 <400> 25 Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B3B4F11 CDR-L2 <400> 26 Val Lys Lys Asp Gly Ser His 1 5 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B3B4F11 CDR-L3 <400> 27 Gly Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val 1 5 10 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1C10D3B9 CDR-H1 <400> 28 Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Ala 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1C10D3B9 CDR-H2 <400> 29 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr 1 5 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1C10D3B9 CDR-H3 <400> 30 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1C10D3B9 CDR-L1 <400> 31 Lys Ser Leu Arg His Thr Lys Gly Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1C10D3B9 CDR-L2 <400> 32 Gln Met Ser 1 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1C10D3B9 CDR-L3 <400> 33 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C6C3C7 CDR-H1 <400> 34 Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C6C3C7 CDR-H2 <400> 35 Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C6C3C7 CDR-H3 <400> 36 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C6C3C7 CDR-L1 <400> 37 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C6C3C7 CDR-L2 <400> 38 Leu Val Ser 1 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2C6C3C7 CDR-L3 <400> 39 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5

Claims (17)

  1. 이전에 암으로 진단되지 않은 대상체(subject)에서 암 발생 위험도(risk)를 평가하는 방법으로서,
    a) 상기 대상체의 샘플에서 프로가스트린(progastrin)의 수준(level)을 결정(determining)하는 단계;
    b) 상기 단계a)의 수준을 기반으로 하여, 암을 발병할 위험도를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계a)의 결정은 상기 샘플을 적어도 하나의 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 단계 및 프로가스트린-결합 분자의 프로가스트린에 대한 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 프로가스트린에 결합하는 상기 약제(agent)가 항-프로가스트린 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체가 단일클론성(monoclonal) 항체 또는 다클론성(polyclonal) 항체인, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체가 N-말단 항-프로가스트린 항체 및 C-말단 항-프로가스트린 항체 중에서 선택되는, 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는
    - 서열번호 4, 5 및 6 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬(heavy chain), 및 서열번호 7, 8 및 9 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬(light chain)을 포함하는 단일클론성의 항체,
    - 서열번호 10, 11 및 12 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 13, 14 및 15 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성의 항체,
    - 서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성의 항체,
    - 서열번호 22, 23 및 24 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 25, 26 및 27 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성의 항체,
    - 서열번호 28, 29 및 30 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 31, 32 및 33 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성의 항체,
    - 서열번호 34, 35 및 36 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 서열번호 37, 38 및 39 각각의 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 3개의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성의 항체, 및
    - 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM 에 참조번호 I-5158로 기탁된 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산된 단일클론성 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 단일클론성 항체인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)의 결정은,
    (i) 상기 샘플을 프로가스트린의 제1의 부분에 결합하는 제1의 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 단계, 및
    (ii) 상기 샘플을 프로가스트린의 제2의 부분에 결합하는 제2의 프로가스트린-결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1의 프로가스트린-결합 분자는 프로가스트린의 C-말단 내의 에피토프(epitope)를 결합하는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 프로가스트린-결합 분자는 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 참조번호 I-5158로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론성 항체인, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2의 프로가스트린-결합 분자는 프로가스트린의 N-말단 내의 에피토프를 결합하는, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2의 프로가스트린-결합 분자는 프로가스트린의 N-말단 내의 에피토프를 결합하는 다클론성 항체 또는 하기의 3개의 CDR, 서열번호 16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 하기의 3개의 CDR, 서열번호 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬을 포함하는 단일클론성 항체인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로가스트린의 수준이 ELISA로 단계 a)에서 결정되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는, 방법.
  14. 이전에 암으로 진단된 적이 없는 대상체에서 암 발생 위험도를 평가하기 위한, 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 항-프로가스트린의 항체를 포함하는 키트(kit).
  15. 제14항에 있어서,
    제1의 항-프로가스트린 항체, 상기 항체는 2016년 12월 27일에, 프랑스 75724 파리 세덱스 15, 25-28 뤼 두 독퇴르 로욱스 소재의 파스퇴르 연구소의 CNCM에 참조번호 I-5158로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론성 항체인 상기 제1의 항-프로가스트린 항체; 및
    제2의 항-프로가스트린 항체, 상기 제2의 항-프로가스트린 항체는 프로가스트린의 N-말단에 결합하는 다클론성 항체 또는 하기의 3개의 CDR, 서열번호16, 17 및 18 각각의 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중사슬, 및 하기 3개의 CDR, 서열번호 19, 20 및 21 각각의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경사슬(light chain)을 포함하는 단일클론성 항체
    를 포함하는, 키트.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법의 실행에 특유한 일련의 지시사항(instruction)을 포함하는 제품/컴퓨터 프로그램.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법을 실행하기 위한 수단을 포함하는, 계산 유닛(computation unit) 및 입력 인터페이스(input interface)를 포함하는 프로세싱 시스템.

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