KR20180093725A

KR20180093725A - 렌티난을 함유하는 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20180093725A
Application number: KR1020170020207A
Authority: KR
Inventors: 이근식
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2018-08-22

Abstract

본 발명은 패혈증을 치료 또는 개선하기 위한 약학적 조성물로서, 렌티난(lentinan) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에는 약제적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제가 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인플라마좀 발현 및 활성화를 통한 면역 조절에 의해 LPS-유발성 패혈증의 치료 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다.

Description

렌티난을 함유하는 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR IMPROVING SEPSIS CONTAINING LENTINAN}

본 발명은 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 렌티난(lentinan) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물에 관한 것이다.

그람 음성 미생물의 세포벽 구성성분인 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)는 혈중에 유입되면 내독소(endotoxin)로 작용하여 염증을 발생시킨다. 특히 이와 같은 미생물 감염으로 전신에 과도한 염증 반응이 일어날 경우 패혈증이 발생하여, 파종성 혈관내응고, 내독소 쇼크, 다장기장해(multi organ failure: MOF) 등을 초래한다. 패혈증은 그 치사율이 높게는 60%에 이르지만, 현재로서는 효과적인 치료제가 없어 패혈증이 발생한 장기에 맞는 항생제를 투여하는 치료방법을 활용하고 있다.

비특이성 면역조절자인 β-글루칸은 포도당 중합체들로 이루어진 이종 다당류이다. 다양한 β-글루칸들이 곡물, 효모, 박테리아 및 진균 등의 원천으로부터 분리되었으며, 그 중에서도 표고버섯(Lentinula edodes) 유래의 렌티난은 고분자량을 갖는 다당류로서 하기 화학식 1에서 나타낸 바와 같이 β(1→3) 결합 골격과 (5개 잔기마다) β(1→6) 측쇄를 갖는 것으로 알려져 있다.

렌티난은 생체의 면역기능을 높임으로써 항암 및 항염증성 활성을 갖는 물질로 알려져 있는데, 구체적으로 세포독성 활성 및 종양 괴사 인자 (TNF) 분비를 증가시키고, 전이성 종양에 대한 복막 대식세포에서의 세포 독성을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 렌티난은 T 세포 자극 효과를 가져서 암환자의 생존률을 증가시키므로, 위암 환자를 위한 보조제(adjuvant)로 승인되어 활용되고 있다.

염증 반응을 유발하는 세포내 감시자이며 다중-단백질 복합체인 인플라마좀은, 골수 세포에서 세포내 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP) 및/또는 위험-관련 분자 패턴 (DAMP)을 인지하여, 카스파제-1의 활성화, 및 이어서 전-염증성 사이토카인, 인터류킨(IL)-1β 및 IL-18의 성숙을 가져오는 것으로 알려져 있다. 인플라마좀은 감지 단백질들(sensing proteins), 에컨대 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인, 류이신-풍부 반복서열(NLR)과 피린(pyrin) 도메인-포함 단백질 3(NLRP3); NLR과 카스파제 활성화 및 보충(recruitment) 도메인(CARD) 도메인-함유 단백질 4(NLRC4); 및 AIM2로 이루어져 있다. 따라서, 인플라마좀은 점점더 암치료 및 염증성 질병들에 대한 치료 표적으로서 연구되고 있다.

기존에, 렌티난은 면역 활성을 통해 항암 물질로 알려져 있고, 다른 항암제와 함께 처리된 경우 NLRP3 인플라마좀에 대한 활성화에 대한 영향은 연구된 바 있으나, 렌티난 단독 처리시 인플라마좀 활성 조절에 의한 패혈증 치료 효과의 연구는 없었다.

대한민국 특허공개 제10-2007-0057803호 (2007.06.07)

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본 발명의 일 목적은 렌티난 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 패혈증은 LPS-유발성 패혈증인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 목적은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면은 렌티난 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

일 구현예에서, 상기 패혈증은 LPS-유발성 패혈증일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사의 제형으로 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 락토덱스트린 용액, 글리세롤 및 에탄올을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 렌티난을 유효 성분으로 함유하여, 인플라마좀 매개 질환인 LPS-유발성 패혈증을 렌티난 투여량 의존적으로 치료 또는 개선시킬 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 세포 독성이 없어, 이를 제형화하여 생체내에서 치료 또는 개선제로 사용할 수 있다.

도 1은 렌티난의 NLRP3 인플라마좀 활성화에 대한 영향을 분석한 결과이다. [A는 렌티난(LNT)의 화학적 구조이다. B는 지질다당류-처리된 골수 유래 대식세포(LPS-처리된 BMDM)에, 지정 농도의 LNT 또는 양성 대조군으로 ATP (2 mM)를 처리한 것이다. 활성형 IL-1β의 분비는 면역블로팅으로 분석하였다. C는 LPS-처리된 BMDM에는 니게리신(nigericin, NG, 40mM) 또는 요산 일나트륨 결정(monosodium urate crystal) (MSU, 800mg/㎖)을 포함하거나 포함하지 않은 지정 투여량의 LNT를 처리한 것이다. 카스파제-1 (Casp1)의 분비를 면역블로팅에 의해 분석하였고, IL-1β 또는 IL-18 분비는 ELISA로 측정하였다. 나타낸 모든 면역블로팅 데이터는 3개 이상의 독립적인 실험들을 나타낸 것이다. 막대 그래프는 평균±SD를 나타낸다].
도 2는 NLRC4 또는 AIM2 인플라마좀 활성화에 대한 렌티난의 영향을 분석한 결과이다. [LPS-처리된 BMDM에 플라젤린 (A) 또는 dsDNA (B)을 포함하거나 또는 포함하지 않은 지정 투여량의 렌티난 (LNT)을 처리하였다. 카스파제-1 (Casp1)의 분비는 면역블로팅으로 확인하였고, IL-1β 또는 IL-18 분비는 ELISA로 측정하였다. C는 IL-1β 분비는 면역블로팅으로 확인한 것이다. D는 세포 독성 측정을 위해 BMDM에 지정 투여량의 LNT를 처리하였고, 세포수는 자동 세포계수기로 측정한 것이다. Triton x-100 (1%, Triton) 처리로 세포 사멸을 유도하였다. 나타낸 모든 면역블로팅 데이터들은 3개 이상의 독립적인 실험들을 나타낸 것이다. 막대 그래프는 평균±SD를 나타낸다].
도 3은 사이토카인 및 인플라마좀 구성요소의 발현에 대한 렌티난의 영향을 분석한 결과이다. [A는 BMDM에 지정 투여량의 렌티난(LNT) 또는 LPS(10 ng/㎖)을 처리한 것이다. IL-1α, TNFα, IL-6, IL-1m, IL-10, 전-IL- 1β (pro-IL- 1β ), NLRP3, NLRC4 , AIM2, 및 전- Casp1 mRNA의 발현은 RT-PCR로 측정하였고, 우측 막대 그래프는 관련된 밴드의 밀도를 나타낸 것이다. B는 BMDM에 TLR4 저해제인 TAK-242가 포함되거나 또는 포함되지 않은 LPS(10 ng/㎖) 또는 LNT(1 mg/㎖)를 처리한 것이다. 지정된 유전자 발현 수준은 RT-PCR로 평가하였다. C는 BMDMs을 내독소 제거 수지에 의해 정제된 LNT, 또는 비정제(intact) LNT로 처리한 것이다. NLRP3 및 전-IL-1β 단백질은 면역블로팅으로 측정하였다. D는 LPS-처리된 BMDM에 dsDNA를 포함하거나 포함하지 않은 내독소-제거 LNT를 처리한 것이다. IL-1β의 분비는 ELISA로 측정하였다. 나타낸 모든 RT-PCR 데이터는 3개 이상의 독립적인 실험들을 나타내었다. 막대 그래프는 평균±SD를 나타낸다].
도 4는 보리(barley)로부터 추출한 β-D-글루칸의 사이토카인 생성 및 성숙에 대한 영향을 분석한 결과이다. [A는 보리로부터 추출한 β-D-글루칸(GB)의 화학적 구조이다. B는 LPS-처리된 BMDM에 지정 농도의 GB 또는 양성 대조군으로서 ATP (2mM)를 처리한 것이다. 활성형 IL-1β의 분비는 면역블로팅으로 평가하였다. C는 LPS-처리된 BMDM에 니게리신(NG), 플라젤린 또는 dsDNA이 포함되거나 포함되지 않은 지정 투여량의 GB를 처리한 것이다. IL-1β의 분비는 면역블로팅으로 분석한 것이다. D는 BMDM에 지정 투여량의 GB 또는 LPS (10 ng/㎖)를 처리한 것이다. 전-IL-1β 및 TNFα mRNA의 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 나타낸 모든 면역블로팅 및 RT-PCR 데이터는 3개 이상의 독립적인 실험을 나타낸 것이다].
도 5는 인플라마좀 -매개 질병 모델에 대한 렌티난의 영향을 분석한 결과이다. [A는 마우스 (1그룹당 10 개체)에 나타낸 바와 같이 LPS (25 mg/kg) 및/또는 렌티난 (LNT)을 복강 투입한 것이다. 생존률은 지정된 시간에 관찰하였다. B는 마우스 (1그룹당 8 개체)에는 LNT (10 mg/Kg)를 포함하거나 포함하지 않은 리스테리 아 모노시스토제네스(Listeria monocytogenes ) (200㎖의 생리식염수 중 1,000 cfu)를 복강 투입한 것이다. 복막분비세포들 (PEC)의 갯수를 계산하고, 복막 세척액 중의 IL-1β 및 IL-6 분비 수준을 측정하였다. 막대 그래프는 평균±SD를 나타낸다].

일 구현예에서, 상기 패혈증은 LPS-유발성(내독소 혈증성) 패혈증일 수 있다. 상기 패혈증의 치료 또는 개선 효과는 인플라마좀의 발현 및 활성의 조절에 의한 것일 수 있다. 상기 패혈증의 치료 또는 개선 효과는 렌티난의 NLRP3을 포함하는 전-염증성 사이토카인의 발현 자극에 의한 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 패혈증의 치료 또는 개선 효과는 렌티난의 투여량 의존적 방식으로 이루어질 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여 방법은 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강내 투여, 경 기관지 투여 또는 근육내 투여 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 렌티난의 투여량은 피험체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 렌티난은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 1번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 렌티날을 0.001 내지 90% 중량백분율로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여 대상은 비인간-영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 및 소를 포함하는 비-인간 포유류인 것이 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 락토덱스트린 용액, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

시험예

재료 및 방법

골수-유래 대식세포 (BMDM)의 준비

BMDM는 L929 세포로부터 분비된 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF)의 존재 하에 C57BL/6 마우스(6주령 내지 12주령; Narabio Co., 서울, 한국)의 정강이뼈 및 대퇴골로부터 얻은 골수 전구체를 분화시켜 수득하였다. 골수 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS, GenDEPOT Inc., Barker, TX, USA), L929 세포 유래의 50% M-CSF 함유 배지, 100 U/㎖의 페니실린, 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 상기 세포를 비-조직배양-처리된 페트리 디쉬(SPL Life Science Co., 포천시, 경기도, 한국) 내에서 플레이트 배양하고, 37℃의 5% CO₂분위기 중에서 7일 동안 배양하였다.

세포 처리

인플라마좀 활성화를 위해, 10% FBS 및 항생제를 함유하는 RPMI 1640 중의 BMDM를 12-웰 조직 배양 플레이트 (SPL Life Science Co.) 내에 접종하고(1 웰당 1.0×10⁶세포), 지질다당류(LPS, 1㎍/㎖; #L4130, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 처리하였다(primed). 3시간 후, LPS-처리된 BMDM에 1시간 동안 아데노신 트리포스페이트 (2 mM, ATP; #tlrl-atp, InvivoGen, San Diego, CA, USA)의 존재 하에, 또는 1시간 동안 니게리신 (40μM, NG; #4312 Tocris Bioscience, Bristol, UK)의 존재 하에, 또는 1시간 동안 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000, 10㎕/㎖, Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 및 플라젤린 (0.5㎍/㎖; #tlrl-stfla, InvivoGen)의 존재 하에, 또는 1시간 동안 jetPRIME^TM (2㎕/㎖, Polyplus-transfection Inc., Illkirch, France) 및 이중 가닥 DNA(1㎍/㎖, dsDNA)의 존재 하에, 또는 6시간 동안 렌티난(LNT, #FL33321, Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) 또는 보리에서 유래된 β-D-글루칸(GB, #G6513, Sigma-Aldrich Co.)을 포함하거나 포함하지 않는 요산 일나트륨 결정(800㎍/㎖, MSU, Sigma-Aldrich Co.)의 존재 하에, FBS 또는 항생제가 포함되지 않는 신선한 배지 (RPMI 1640, 12-웰 플레이트 내 250㎖/웰)를 첨가하였다. LNT(lentinan)는 제조자의 프로토콜에 따라 Pierce^TM 고용량 내독소 제거 수지(#88270, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 정제하였다.

유전자 발현을 위하여, BMDM를 6-웰 플레이트(SPL Life Science Co.)에 플레이트 배양하고(1 웰당 2.0×10⁶세포), LNT, GB 또는 TAK-242 (5mM, #CLI-095, InvivoGen)을 포함하거나 또는 포함하지 않는 LPS(10ng/㎖, Sigma-Aldrich Co.)로 3시간 동안 처리하였다.

웨스턴 블롯 분석

인플라마좀 활성화의 분석을 위하여, 세포 상등액(supernatant, Sup)을 수득하고, 잔여 세포를 프로티나아제 저해제 칵테일 (proteinase inhibitor cocktail, #M250-1, AMRESCO LLC, Solon, OH, USA)을 함유하는 용해 버퍼(lysis buffer)로 용해시켰다. 세포 잔여물을 제거하기 위해서 15,000 rcf으로 5분 동안 원심 분리한 후, 용해액(lysate, Lys)을 추가로 수득하였다. 달리 기재된 바가 없는 경우, 웨스턴 블롯 분석을 위한 모든 재료들은 BIO-RAD (Hercules, CA, USA)에서 구입하였다. 전개 버퍼를 사용하여 SDS-PAGE (10% 또는 16%)에 의해 Sup와 Lys를 분리하고, 이를 트랜스퍼 버퍼를 사용하는 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 (PVDF; #10849A, Pall Co., Port Washington, NY, USA)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 3% 탈지유(skim milk)로 블로킹하고, 4℃에서 항-마우스 IL-1β 항체 (#AF-401-NA, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 항-카스파제-1 항체 (#AG-20B-0042, AdipoGen Co., San Diego, CA, USA), 항-NLRP3 항체 (#AG-20B-0014-C100, AddipoGen Co.), 또는 항-액틴 항체 (#sc-1615, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 밤새 프로브 결합(probing)하였다. 멤브레인은 추가로 HRP-접합된 2차항-혈청(#sc-2020 또는 #sc-2004, SantaCruz Biotechnology)으로 프로브 결합하였고, Power-Opti ECL^TM solution (BioNote Co., 화성시, 경기도, 한국) 및 냉각시킨 CCD 카메라 시스템 (#AE-9105, EZ-Capture^TMII, ATTO Technology, Tokyo, Japan)으로 시각화하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)

총 RNA는 NucleoZOL (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Postfach, Duren, Germany)를 사용하여 추출하였고, M-MLV cDNA 합성 키트(Enzynomics, Daejeon, 한국)을 사용하여 첫번째 가닥 상보 DNA (cDNA)로 역전사시켰다. 전사는 Simpli Amp^TM열순환기 (Thermo Fisher Scientific Inc. Grand Island, NY, USA)와 nTaq 중합효소(Enzynomics)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 산물은 아가로스 젤 전기영동, 에티디움 브로마이드 염색, 및 EZ-Capture^TM Ⅱ(ATTO Technology)에 의해 시각화하였다. 밴드 강도(Band intensity)는 CS 분석기 버전 3.00 (ATTO Technology)를 이용해 측정하였다. 유전자-특이적 프라이머들은 이하와 같다:

전-IL-1β (Il1b; Genebank ID: NM_008361) 프라이머 5'-CCC AAG CAA TAC CCA AAG AA-3' 및 5'-GCT TGT GCT CTG CTT GTG AG-3'; TNFα (Tnfa; NM_013693) 5'-ACG GCA TGG ATC TCA AAG AC-3' 및 5'-GTG GGT GAG GAG CAC GTA GT-3'; IL-1α (Il1a; NM_010554) 5'-CCG ACC TCA TTT TCT TCT GG-3' 및 5'-GTG CAC CCG ACT TTG TTC TT-3'; NLRP3 (Nlrp3; NM_145827) 5'-CAG GCG AGA CCT CTG GGA AA-3' 및 5'-CCC AGC AAA CCC ATC CAC TC-3'; NLRC4 (Nlrc4; NM_001033367) 5'-ATC GTC ATC ACC GTG TGG AG-3' 및 5'-CTT CAG CAG CAG AGC CTT GA-3'; AIM2 (Aim2; NM_001013779) 5'-AGT GGC CAC GGA GAC AGA TT-3' 및 5'-GGG AGT TTC CCT GGC TCT CT-3'; 프로카스파제-1 (Casp1; NM_009807) 5'-CTG GGA CCC TCA AGT TTT GC-3' 및 5'-GGC AGG CAG CAA ATT CTT TC-3'; GAPDH (Gapdh; NM_001289726) 5'-AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG-3' 및 5'-ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA-3'.

박테리아 생장

한국 미생물 보존센터(KCCM; 서울, 한국)로부터 입수한 리스테리아 모노사이 토제너스를 뇌심장침출액 (Brain Heart Infusion; BHI, Laboratories Conda, Madrid, Spain) 배지 중에 37℃에서 18시간 동안 진탕배양하거나, 또는 BHI 플레이트 상에서 배양하여 콜로니-형성 단위(cfu)를 산정하였다.

동물 실험

수컷 C57BL/6 마우스(8주령 내지 10주령)를 Narabio Co. (서울, 한국)으로부터 구입하였다. 모든 마우스는 24℃에서 12 시간 명암 주기 하에 보관하였다. 동물들을 1주 동안 환경 적응시킨 후, 표준의 멸균된 먹이와 물을 임의로(ad libitum) 공급하였다. 마우스(1 그룹당 10 개체)에 LPS (25 mg/kg, Sigma-Aldrich Co.) 또는 생리식염수 (200㎖)를 1 시간 복강 처리한 후에 렌티난 (2 또는 10 mg/kg, Carbosynth)을 복강 주입하였다. 마우스 치사률을 4일 동안 매 8시간마다 관찰하였다. 마우스(1 그룹당 8 개체)에, 리스테리아 모노사이토제너스(마우스 1마리당 1,000 cfu)을 1시간 복강 처리한 후에, 렌티난 (10 mg/kg)을 복강 주입하였디. 5시간 후에, 마우스를 CO₂흡입으로죽였다. 복강을 5㎖의 PBS로 세척하고, 복막분비세포(PEC)를 세포계수기(MoxiZ^TM, ORFLO Technologies, Ketchum, ID, USA)로 분석하였다. 추가 분석을 위해, 세척액을 수집하였다. 동물 실험은 실험동물의 보호와 사용을 위한 국립보건원 지침(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)을 따라 실시되었고, 강원대학교의 동물실험운영위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인되었다(IACUC; 승인번호 KW-160114-1).

ELISA를 사용한 IL-1β 및 IL-18의 탐지

분비된 IL-1β 또는 IL-18를 정량화하기 위하여, BMDM의 세포 배양 상등액 또는 복막 세척액을 마우스 IL-1βeta/IL-1F2 Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems) 또는 마우스 IL-18 백금 ELISA (eBioscience, San Diego, CA, USA)로 측정하였다. ELISA 플레이트는 Epoch^TM 마이크로플레이트 스펙트로포토미터 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 판독하였다.

세포 독성 에세이

BMDM를 6-웰 플레이트(SPL Life Science Co.)에 플레이트 배양하고(1 웰당 5x10⁵ 세포), 0, 0.3 또는 1.0mg/㎖의 렌티난을 처리하였다. 3시간 후, 세포들을 차가운 PBS 중에서 긁어내어, 자동 세포계수기(MOXZI Z Mini^TM)에 넣었다.

통계 분석

통계 분석은 2개 그룹에 대해서는 t-검증법 (Mann-Whitney test)을 사용하였고, 복수의 그룹에 대해서는 일원배치분산분석(one-way ANOVA)(Turkey's multiple comparisons test)을 사용하며, 치사율 측정을 위해서 GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하는 log-rank (Mantel-Cox) 시험법을 사용하여 실시하였다.

결론

렌티난은 NLRP3 인플라마좀 활성화를 변화시키지 않는다

고분자량 다당류인 렌티난은 대식세포에서 염증성 사이토카인, 예컨대 IL-1β를 유도한다고 보고되고 있다(도 1A). 렌티난이 단독으로 인플라마좀을 활성화하여 IL-1β 성숙 및 분비를 유발하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 LPS-처리된 BMDM에 렌티난 또는 ATP을 그 투여량을 증가시키면서 처리하였고, BMDM에 NLRP3 인플라마좀 유발자를 처리한 것을 양성 대조군으로 하였다. 렌티난은 단독으로 IL-1β 분비를 변화시키지 않으나, ATP는 IL-1β 분비를 변화시켰다(도 1B). 또한 본 발명자들은 NLRP3 인플라마좀 활성화에 대한 렌티난의 영향을 결정하였다. 렌티난은 NG-매개 또는 MSU-매개 IL-1β, IL-18를 변화시키지 않았고, 카스파제-1 분비를 변화시키지도 않았다(도 1C). 따라서, 렌티난은 인플라마좀 활성화를 매개할 수도 없고, 또한 NLRP3 인플라마좀을 저해할 수도 없다는 사실을 확인할 수 있었다.

렌티난은 선택적으로 AIM2 인플라마좀 활성화를 저해한다.

다른 인플라마좀들, 예컨대 NLRC4 또는 AIM2에 대한 렌티난의 저해 효과를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 LPS-처리된 BMDM에 플라젤린 및 dsDNA를 형질감염시켰다. NLRP3 인플라마좀의 경우와 유사하게, 렌티난은 플라젤린-매개 NLRC4 인플라마좀 활성화에 의해 유도된 IL-1β 또는 카스파제-1 분비는 조절할 수 없었다(도 2A). 이어서, 본 발명자들은 AIM2 인플라마좀 활성화를 위하여 dsDNA-형질감염된 BMDM에 렌티난을 처리하였다. 그 결과, 렌티난은 투여량-의존적으로 카스파제-1, IL-1β, 및 IL-18 분비를 저해하였다(도 2B). IL-1β 분비의 감소는 추가로 면역블로팅 에세이에 의해서도 확인되었다(도 2C). 또한, 본 발명자들은 이와 같은 렌티난의 농도(current lentinan concentration)가 BMDM에서 세포독성을 나타내지 않는다는 것도 확인할 수 있었다.(도 2D). 종합하면, 렌티난은 선별적으로 AIM2 인플라마좀 활성화를 방해한다는 사실을 확인할 수 있었다.

렌티난은 톨-유사 수용체(toll-like receptor) 4 신호경로를 통해 전-염증성 사이토카인 및 인플라마좀 구성요소의 발현을 상향 조절한다.

이전에, 렌티난은 전-염증성 사이토카인의 유도자(inducer)로서 입증되었다. 렌티난의 전-염증성 사이토카인 발현에 대한 영향을 결정하기 위하여, 쥐과의 대식세포에 렌티난 또는 LPS을 투여량을 점차 증가시켜 처리하고, 양성 대조군으로 대식세포에 톨-유사 수용체 4 (TLR4) 리간드를 처리하였다. 그 결과, 렌티난의 단독 처리는 염증성 사이토카인, 예컨대 IL- 1α, TNFα, IL-6, IL- 1rn, IL-10, 및 전-IL-1β의 mRNA 전사를 유도하였다(도 3A). 나아가, 렌티난 처리에 반응하는 인플라마좀 관련 유전자들을 정량화시켰다. 렌티난은 전-IL- 1β (Pro-IL- 1β ), NLRP3, 및 전-Casp1(Pro-Casp1)의 전사를 증가시키나, NLRC4 및 AIM2에 대한 영향은 없었다(도 3A). 다음으로, 본 발명자들은 렌티난-유발 유전자 발현을 유도하는 경로(pathway)를 결정하였다. 렌티난이 TLR 2 및 4 발현을 상향 조절한다는 이전의 보고에 기초하여, TLR4 신호경로 저해제인 TAK-242를 처리하면 이것이 렌티난과 반응하여 사이토카인 생성 및 NLRP3 mRNA 발현이 감소하였다(도 3B). 또한, 본 발명자들은 LNT를 내독소 제거 수지로 정제하고, 정제된 LNT와 비정제 LNT 사이에서 NLRP3 및 전-IL-1β 단백질의 발현 수준을 비교하였다(도 3C). 그 결과, 정제된 LNT는, 비정제 LNT과 유사하게, NLRP3 및 전-IL-1β 발현을 유도하였다. 나아가, 정제된 LNT는 유사한 항-AIM2 인플라마좀 특성을 나타내었다(도 3D). 종합하면, 렌티난은 TLR4 신호경로를 통한 전-IL-1β 및 NLRP3의 생성은 자극하나, AIM2 인플라마좀 활성화에 의해 유도되는 IL-1β의 성숙은 저해한다는 사실을 확인할 수 있었다.

보리로부터 추출한 β-D-글루칸은 사이토카인 생성 및 성숙을 조절하지 않는다.

본 발명자들은 다음으로 상이한 원천에서 유래하는 β-글루칸들이 인플라마좀 활성화 및 유전자 발현을 조절할 수 있는지를 연구하였다. 보리에서 추출한 β-D-글루칸(GB)은 β-(1,3)-포도당 단위로 이루어진 구조를 갖는다(도 4A). 렌티난과 유사하게, GB 단독으로는 LPS-처리된 BMDM에서 IL-1β 분비를 유도하지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다(도 4B). 다음으로, 본 발명자들은 LPS-처리된 대식세포에, NLRP3 인플라마좀의 활성화를 위해 NG의 존재 하에 GB를 처리하거나, NLRC4 인플라마좀의 활성화를 위해 플라젤린을 처리하거나, 또는 AIM2 인플라마좀의 활성화를 위해 dsDNA를 처리하였다. 그 결과, 인플라마좀 활성화는 GB 공처리(co-treatment)에 의해 저해되지 않았다(도 4C). 또한, 쥐과의 대식세포는 GB 처리에 반응하여 전-염증성 사이토카인 생성을 유도하지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다(도 4D). 따라서, β-글루칸의 인플라마좀-조절 특성은 원천에 따라 달리 나타난다.

렌티난은 인플라마좀 -매개 질병 마우스 모델의 감수성을 감소시킨다.

본 연구에서, 렌티난은 염증성 반응에 대해 모순되는 영향들을 보였다. 렌티난은 전-염증성 사이토카인은 상향 조절하나, AIM2 인플라마좀 활성화에 의해 매개되는 IL-1β 분비는 방해하였다. 렌티난의 인플라마좀 활성화에 대한 역할을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 2가지 동물 모델 (LPS-유발성 패혈증 쇼크 및 리스 테리아 모노사이토제너스-유도 복막염)을 고안하였다. LPS-유발성 패혈증 쇼크 모델은 NLRP3 인플라마좀-매개 질병의 잘 특성화된 모델이고, 세포내 LPS는 비-표준 인플라마좀 활성화를 유발한다고 알려져있다. 비록 본 발명자들이 NLRP3 및 비-표준(no-canonical) 인플라마좀 활성화에 대한 LPS의 정확한 역할을 규명하지는 못했지만, LPS가 단독 투입된 마우스는 50% 치사률을 나타내었으나, 렌티난이 단독 투입된 마우스의 경우에는 치사률을 나타나지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다 (도 5A). 특히, LPS-처리된 마우스에 렌티난을 투입한 경우에는, 투여량-의존적 방식으로 치사률이 상당히 감소되었다. 다음으로, 본 발명자들은 렌티난의 항-AIM2 인플라마좀 특성에 주목하였다. 리스테리아 모노사이토제너스는 NLRP3 인플라마좀도 활성화시키기는 하지만, AIM 인플라마좀 유발자로 밝혀졌다. 리스테리아 모노사이토제너스가 주입된 마우스에서는 복막분비세포(PEC)의 갯수 뿐만 아니라 복막 IL-1β 및 IL-6 분비도 증가하였다(도 5B). 렌티난 처리는 리스테리아 모노사이토제너 스-유발 IL-1β 분비를 상당히 감소시키지만, PEC 또는 IL-6 분비는 감소시키지 않았다. 이들 데이터는 렌티난이 항-AIM2 인플라마좀 특성을 갖는다는 사실을 시사하였다.

논의

본 연구에서, 발명자들은 표고버섯 유래의 β-글루칸인 렌티난의 인플라마좀 활성화 및 사이토카인 성숙에 대한 영향을 확인하였다. 그 결과, 렌티난은 쥐과의 대식세포에서 AIM2 인플라마좀 활성화에 반응하여 IL-1β 성숙을 선택적으로 저해하였으나, 반면 NLRP3 및 NLRC4 인플라마좀은 렌티난 처리에 의해 활성화되지 않았다. 기대한 바와 같이, 렌티난은 전-염증성 사이토카인을 상향-조절하고, TLR4 신호경로를 자극하여, 인플라마좀 구성요소 NLRP3 및 전-IL-1β을 발현시킨다. 렌티난과 다르게, 보리에서 추출한 β-D-글루칸(GB)은 대식 세포에서 사이토카인의 성숙도 변화시키지 않고, 발현도 변화시키지 않는다. 또한, 렌티난은 투여량-의존적 방식으로 LPS-유발성 치사률을 감소시키고, 리스테리아 모노사이토제너스-매개 AIM2 인플라마좀 활성화에 반응하여 IL-1β 분비를 선택적으로 감소시켰다. 종합하면, 렌티난은 NLRP3을 포함하는 전-염증성 사이토카인들의 발현을 자극하는 반면, AIM2 인플라마좀 활성화에 반응한 사이토카인의 성숙은 선택적으로 감소시켰다.

β-글루칸의 인플라머좀 활성화에 대한 영향은 이전부터 연구되어왔다. 알칼 리제네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis ) 유래의 β-글루칸인 커들란(Curdlan)은, 덱틴-1(dectin-1)과의 상호작용을 통해 전-IL- 1β mRNA 발현을 상향 조절할 뿐만 아니라, 덱틴-1/Syk 신호경로를 통한 NLRP3 인플라마좀 활성화로부터 발생하는 NLRP3 인플라마좀매개 IL-1β 분비를 유도한다. 그러나, 다른 β-글루칸들, 예컨대 GB, 파라마일론(paramylon) 및 자이모산(zymosan)은 IL-1β 분비를 조절하지 않는다. 본 연구에서, 렌티난은 사이토카인 생성 및 성숙을 조절하나 GB는 그러하지 않다는 사실을 확인할 수 있었고, 이러한 사실은 β-글루칸이 원천 또는 화학적 구조에 따라 인플라마좀 활성화에 대해 다양한 효과들을 갖는다는 것을 암시하였다. 렌티난의 NLRP3 인플라마좀 활성화에 대한 영향은 이전에 연구되었으나, 이전의 연구는 대식 세포 또는 수지상 세포 대신에 인간 폐암 세포주 A549를 사용하였다. A549 세포에 항암성 약물인 팍리탁셀(paclitaxel)을 렌티난과 함께 처리하면 반응성 산소종(ROS) 생성 및 티오레독신-상호작용 단백질(thioredoxin-interacting protein, TXNIP) 발현을 유도하며, 이는 NLRP3 인플라마좀 활성화와 밀접하게 연관된다. 또한, 팍리탁셀와 함께 렌티난을 처리하면, TXNIP-NLRP3 상호작용을 자극하여, IL-1β 및 Casp1 성숙을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 본 발명자들은 렌티난을 단독으로 반응시켰을 때 LPS-처리된 BMDM로부터 IL-1β 분비를 관찰하지 못했다(도 1B). 따라서, 렌티난의 인플라마좀-조절 특성은 세포 종류 또는 화학적 결합에 따라 다양할 것으로 예측되었다.

강한 활성을 갖는 거대분자로서 렌티난은 인간 면역계에서 숙주-매개성 항암 활성을 강화시키는 것으로 알려져있다. 예를 들면, 렌티난을 투여한 암 환자들은 종양 세포에 대한 항체- 및 보체-의존성 세포 독성이 강화되므로 생존률이 높아진다. 또한, 렌티난 투여는 세포독성 T 세포 및 NK 세포의 생성을 유도하여, 이들의 항암 활성을 자극하는 것으로 나타났다. 나아가, 렌티난은 마우스 연구에서 전이성 종양에 대한 대식 세포의 세포 독성을 자극하는 것으로 나타났다. 따라서, 렌티난-자극성 면역은 이들의 항암 특성의 원인이 되는 주요 메커니즘이다. 본 연구에서, 발명자들은 렌티난이 대식세포에서 사이토카인 및 NLRP3 발현은 유도하나, AIM2 인플라마좀 활성화는 저해하는 것을 관찰하였다. 인플라마좀은 암유발 및 항암성 면역 반응에 관여한다. 염증성 세포에서의 카스파제-1 활성화는 무감염성 염증 및 암발생을 야기하는 반면, 항원-제시 세포에서의 인플라마좀의 저해 또는 IL-1β 및 IL-18의 중화는 암 유발 및 종양 진행을 유발하는 것으로 나타났다. 몇몇 연구들은 유전자-제거 마우스를 사용하여 종양 발생에 대한 인플라마좀의 역할을 밝혀내었다. Casp1^-/-, Asc^-/-, Nlrp3^-/-, 및 Nlrp12^-/- 마우스에서는 대장염-관련 암(CAC) 모델에서 종양 생성이 증가하였으나, Nlrc4^-/-마우스에서는 그러하지 않은 것으로 나타났다.또한, Il1r1^-/- 및 Casp1^-/- 마우스는 암을 별로 발달시키지 않고, 화학물질-유발 피부암 모델에서 종양 발생(tumor incidence)을 지연시키나, Asc^-/- 마우스는 야행형 동물에 비해 표현형에 차이가 없다. 최근, Kolb 등은 비만-매개성 NLRC4 인플라마좀 활성화가 유방암의 발달을 촉진시킨다는 것을 밝혔다. 또한, AIM2의 결실은 암 성장을 발생시키는 것으로 나타나나, AIM2의 변이는 인체의 다양한 암 발생과 관련된다. 나아가, AIM2^-/-마우스는 CAC 모델에서 대장 종양의 크기 및 개수를 증가시키는 것으로 나타났고, 이는 AIM2이 종양 발달을 조절하고 대장암을 예방하는 것을 암시한다. 문헌에 기초하여, 본 발명자들은 렌티난이 AIM2의 mRNA 발현도 변화시키지 않고 NLRP3 및 NLRC4 인플라마좀의 활성화도 변화시키지 않기 때문에, 렌티난의 항암 특성이 인플라마좀에 의해 매개되지 않는다는 결론을 내렸다.

AIM2는 pyrin 도메인을 포함하는데, 이는 ASC 뿐만 아니라, 세포질 dsDNA을 감지하는 조혈 인터페론-유도성 핵 단백질 (HIN)-200 도메인과도 반응한다. 이들 도메인은 유발자의 제거 이전에는 자동-저해성 형태를 형성하나, 자동-저해는 세포질 dsDNA에 의해 약화되어, 카스파제-1-의존성 세포사멸(pyroptosis) 및 IL-1β과 IL-18의 유리(release)를 발생시킨다. AIM2 인플라마좀 활성화는 세포질 내에서 복제하는 DNA 바이러스 및 박테리아에 대한 숙주의 방어에 매우 중요하다. 예를 들면, 리스테리아 모노사이토제너스는 몇몇 인플라마좀들 중에서 AIM2 인플라마좀을 우선적으로 활성화시킨다. 또한, 리스테리아 모노사이토제너스-유발성 세포사멸 및 사이토카인 분비는 AIM2^-/-대식세포에서는 감소하는 것으로 나타났다. 야토병 (tularemia)을 일으키는 프란시셀라 튜베렌시스(Francisella tularensis )는 AIM2 인플라마좀의 활성화를 유발하여, 감염된 대식세포에서 IL-1β 및 18을 생성시킨다. AIM2 인플라마좀은 또한 장의 항상성에도 매우 중요하다. AIM2^-/-마우스에서, 장 상피세포(IEC)는 정상 상태 동안 IEC 증식 및 조직 재생에 요구되는 IL-18 분비가 감소된 것으로 나타난다. 이와 반대로, 만성 인플라마좀 활성화에 의해 유발되는 사이토카인의 과다생성은 조직 손상 및 대장염-관련 대장암을 발생시킨다. 이전에, 렌티난의 경구 투여는 덱스트란 설페이트 소듐(DSS)-유발 대장염에 대한 감수성을 감소시키고, 장염증을 완화시키는 것으로 나타났다. 본 발명자들이 잘 특성화된 인플라마좀-매개 질병인 DSS-유도 대장염에서 렌티난의 영향을 확인하지는 않았지만, 렌티난은 대장염 모델에서 IL-1β 및 IL-18 분비를 방해할 수 있다. 따라서, 렌티난을 특히 AIM2 인플라마좀에 대한 항-인플라마좀 제제로서 제안한다.

Claims

렌티난 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 패혈증의 치료 또는 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 패혈증은 LPS-유발성 패혈증인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.