KR20180081605A - 개선된 단백질 분리를 위한 반대 pH-염 구배 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질의 관련된 전하 변이체 (예를 들어 산성 및 염기성 모노머), 당화 변이체, 및/또는 가용성 크기 변이체 (예를 들어 응집체, 모노머, 2/3 단편, ¾ 단편, 항원 결합 단편 (Fab) 및 결정화가능 단편 (Fc)) 로부터의, 단백질 특히 모노클로날 항체 (mAB) 의 개선된 분취용 분리 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 단백질 분리를 위한 반대 pH-염 구배
본 발명은 단백질의 관련된 전하 변이체 (예를 들어 산성 및 염기성 모노머), 당화 변이체, 및/또는 가용성 크기 변이체 (예를 들어 응집체, 모노머, 2/3 단편, 항원 결합 단편 (Fab) 및 결정화가능 단편 (Fc)) 로부터의 단백질, 특히 모노클로날 항체 (mAB) 의 개선된 분취용 분리 방법에 관한 것이다.
단백질 불균질성은 생체내에서의 번역후 변형의 결과로서 생산되거나, 또는 이것은 화학적 및 효소적 반응을 통해, 또는 기계적 스트레스, 고온, 또는 극단적인 pH 로 인해 발효 및 정제 공정 중의 부산물로서 인공적으로 유도된다 [1-4]. mAb 와 연관된 단백질 불균질성은, 비제한적으로, 전하 변이체, 예컨대 산성 및 염기성 변이체, 당화 변이체, 및 크기 변이체, 예컨대 응집체, 모노머, 단편, Fab, 및 Fc 잔기를 포함한다 [5-7]. 치료 mAb 에서, 이와 같은 생성물 변이체는 약물의 안정성, 효능, 및 효력에 영향을 줄, 다양한 약동학 및 약력학을 도출한다 [1]. 따라서, 이들은 최종 생성물 풀로부터 철저하게 프로파일링되고 제거되어야만 한다.
액체 크로마토그래피 (LC) 는 mAb 생산을 위한 표준 정제 도구로서 사용된다 [8]. mAb 에 대한 일반적인 다운스트림 방법 (DSP) 은 비제한적으로, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (AC), 이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 를 포함한다 [9]. IEC (이온 교환 크로마토그래피) 예컨대 강한 양이온 교환 크로마토그래피 (SCX), 약한 양이온 교환 크로마토그래피 (WCX), 및 약한 음이온 교환 크로마토그래피 (WAX) 는 매우 유사한 등전점 (pI) 을 갖는 mAb 전하 변이체 및, 비제한적으로, 크기 변이체, 당화 변이체, 시알릴화 변이체, 및 C-말단/N-말단 가공된 변이체를 포함하는 다른 단백질 변이체를 분리하기 위한 분석적 척도에서 널리 사용된다 [7, 10-14]. 고정된 pH 값을 가진 염화나트륨을 사용하는 얕은 염 구배 기울기가 mAb 변이체를 특징화하기 위해 사용될 수 있으나, 전하 변이체 분리 시 이의 적용은 단백질 특이적이고, 개별 mAb 에 대해 최적화되어야만 한다 [15]. 크로마토포커싱 (CF) 은 염 구배에 대한 대안이며, 이때 pH 구배는 양쪽성 고분자 전해질 (polyampholyte) 완충액을 사용하여 칼럼의 내부적으로 [16-21] 또는 칼럼 유입구에서, 후속적으로 칼럼을 통해 이동하는 상이한 pH 값을 갖는 2 가지 적절한 완충액을 혼합함으로써 외부적으로 생성된다 [22-26]. 각각의 pI 값에 따라, mAb 전하 변이체는 pH 구배 내 상이한 지점에 집중되고, 그러므로 고도로 분해된 피크를 산출한다 [27].
mAb 전하 변이체 분리를 위한 IEC 에서의 고-성능 CF 의 초기 적용은 7.3 내지 9.0 의 pI 범위를 가진 중성 및 염기성 mAb 에 제한되었다 [28-29]. 최근에, 상기 적용 스펙트럼이 pH 구배에서 이온 강도를 조절함으로써 산성 mAb (pI = 6.2) 까지 확장될 수 있다는 것이 발견되었다 [29]. 상승된 및 제어된 이온 강도에서의 pH 구배가 산성, 중성, 및 염기성 mAb 변이체에 대해 더 나은 분해된 피크를 도출했다는 것이 보고되었다 [29]. 상기 예는 분석적 척도에서 mAb 전하 변이체 분리에 대한 염 매개된 pH 구배의 성공을 도시하는 반면, Kaltenbrunner 등 [30] 은 훨씬 더 일찍 만니톨, 보레이트, 및 염화나트륨을 사용하는 그것의 pH-염 하이브리드 구배가 분취적 척도로 mAb 동형체를 분리할 수 있다는 것을 주장하였다. 이들은 8.15 내지 8.70 사이의 pI 를 가진 이소단백질 (isoprotein) 을 분리하기 위해 하강 염 구배와 조합된 pH 7.0 내지 9.1 의 상승 pH 구배를 사용하였다.
그러나, 여러 제한, 단점, 및 불일치가 그것의 접근법에서 발견된다. 예를 들어, 그들에 의해 제안된 방법은 여러 개의 탄수화물 측쇄가 상이한 당단백질 동형체의 분리에 대해서만 오직 적합하다 [29-30]. 이것은 이러한 구배 시스템의 사용을 당화 단백질에 대해서만 국한시키고, 따라서 이것을 다른 유형의 mAb 변이체, 예컨대 전하 또는 크기 동형체에 대해서는 비현실적으로 만든다. 피크 사이의 증가된 해상도가 pH-염 하이브리드 구배에 기인한다고 주장함에도 불구하고, 시스-디올 함유 올리고당과 완충액 성분 보레이트 사이의 비특이적 반응이 또한 개선된 분리에 대해 상당한 효과를 가지고 있는지의 여부는 불확실하게 남아있다 [29]. 더욱이, 이소단백질의 그것의 소위 "분취용" 분리는 오직 0.5 mg mAb /패킹된 수지 mL 였고 [30], 이것은 방법-척도 분리에 사용하기에는 여전히 매우 낮다.
현재까지, pH-염 하이브리드 구배 시스템을 사용하는 방법 척도 (≥ 30 mg/mL) mAb 전하 변이체 분리가 WCX - Fractogel® COO- (M) 에 대해 보고되었다 [31]. 그러나, 상승 염 구배 시스템을 동반하는 상승 pH 구배는 아세테이트 염을 사용하여 생성되고, 이것은 5 내지 6 의 오직 매우 좁은 pH 범위만을 포함하여, 이로써 이 방법을 용출 pH 대략 5.6 을 가진 mAb 에 대해 제한한다. 그것의 pH-염 하이브리드 구배에서 사용된 pH 범위가 카복실 작용기의 pKa 와 매우 유사하다는 것을 유의해야 한다 (pKa = 4.5). WCX 의 경우, 이동상에서 사용된 완충 종 이외에, 수지 골격 상의 작용기가 특히 카복실 기의 pKa 와 가까운 pH 에서 일시적 pH 변화를 또한 초래할 것이라는 것이 공지된다 [32-33]. 그들의 연구에서 사용된 pH 범위가 카복실 기의 pKa 와 매우 가깝기 때문에, 이동상에서 사용된 아세테이트 염 이외에, 수지 골격 상의 부분적으로 양성자화된 카복실 기가 또한 구배 시스템에 대한 특정한 완충 수용력을 발휘할 것이라는 것을 예상하는 것이 합리적이다. 더욱이, 하이브리드 pH-염 시스템 중의 pH 구배가 아세테이트 완충액 단독에 의해 생성되는 것인지 또는 이것이 카복실 기 및 아세테이트의 조합된 효과인 것인지가 불확실하다. 마찬가지로, 이 효과가 전하 변이체 분리에서 주요한 역할을 할 것인지도 또한 불확실하다. 또한, 이러한 유형의 수지에 대해 권고된 정상 작업 pH 범위는 카복실 기가 완전히 탈양성자화될 (즉 이온화될) 6 내지 8 이다. 이것이 6 미만의 pH 값에서 작업되는 경우, WCX 는 수용력의 손실을 겪을 것임이 가능하다. 패킹된 수지 L 당 38 내지 54 g 의 높은 결합능이 이들의 연구에서 보고되었지만 [31], 이 결과는 단백질 특이적인 것 같고, 이것은 그들의 연구에서 제시된 분리 효율이 그 특정한 항체에만 오로지 특이적이라는 문헌에서의 그들의 최종 메세지와 일치한다. 추가의 분리 예가 6 초과의 pH 에서는 제시되지 않고, 그들의 연구에서 사용된 다른 항체가 없다는 사실은 다른 mAb 의 분리에 대한 이 방법의 적용가능성을 의심스럽게 만든다.
몇몇 특허 [34-36] 는 mAb 변이체 분리를 위한 CEX 및 혼합-방식 크로마토그래피 (MMC) 의 용도를 청구하는데, 이것은 비제한적으로, mAb 로부터의 산성, 염기성, 탈아미드화된, 또는 글리콜-변이체의 소거를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 이들 청구항에서 [34-36] 모노 구배 용출 및 염 농도 또는 pH 값의 변화가 있는 단계 용출은, 한번에 한번씩 적용되었다. 게다가, 공급물은 비교적 "순수한", 단 하나의 유형의 전하 변이체 - 생성물 이외의 산성 변이체 - mAb [34-36] 를 포함하였다.
따라서 본 발명의 과제는 이온 교환 크로마토그래피 중의 단백질 분리를 위한 신규하고 개선된 방법을 제공하는 것이고, 이것은 이용가능한 수단으로 쉽게 수행될 수 있고, 추가의 분리 단계를 필요로 하지 않는다. 단백질 분리는 펩타이드의 분리를 포함한다.
본 발명은 하기 단계에 의한, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다:
a) 적어도 2 개의 상이한 단백질을 포함하는 샘플을 제공하는 단계
b) 상기 혼합물을 이온 교환 물질에 적용하는 단계
c) 단백질을 분리하기 위해 상승 pH 및 하강 염 농도에 의해 반대 pH-염 구배를 실행하는 단계, 또는 그 반대로
단백질을 분리하기 위해 하강 pH 및 상승 염 농도를 실행하는 단계
및 선택적으로
d) 단백질 분리를 위한 단계 용출 프로파일을 정의하기 위해 c) 로부터의 분리 데이터를 이용하는 단계.
따라서, 단백질은 구배 용출에서 분리될 수 있다.
유리하게는 본 발명에 따른 방법은 ≥5 mg/ml, 특히 ≥30 mg/ml, 특히 ≥60 mg/ml 의 높은 총 단백질 로드로 수행될 수 있다. 이를 위해, 단백질의 혼합물이 이온 교환 물질에 흡착되거나 결합되고 이로부터 용출된다. 이것은 단백질 혼합물이 적절한 조건에서 양이온 또는 음이온 또는 혼합 방식 이온 교환 물질 상에 로드되고 이로부터 용출될 수 있다는 것을 의미한다.
양호한 분리 결과는 c) 에서 pH 가 4.5 - 10.5 의 범위에서 변화되고, 염 농도가 0 - 1M 염의 범위에서 변화되는 경우에 발견된다. 분리 결과는 pH 구배가 pH 5 내지 9.5 로 조정된 완충 시스템을 적용함으로써 유도되는 경우, 및 염 구배가 0 - 0.25 M 의 농도 범위에서 유도되는 경우 특히 양호하다.
본 발명의 분리 방법은 적어도 2 가지의 완충 용액의 완충 시스템을 적용함으로써 pH 구배를 유도함으로써 프로세싱될 수 있고, 이로써 단백질의 필요한 흡착 또는 결합이 하나의 완충 용액의 존재 하에 일어나고, 용출이 증가하는 농도의 다른 완충 용액의 존재 하에 일어나는 한편, pH 는 상승하고 동시에 염 농도는 하강하거나, 또는 반대로 pH 는 하강하고 동시에 염 농도는 상승한다. pH 구배를 유도하기 위한 적합한 완충 시스템은 MES, MOPS, CHAPS 등 및 염화나트륨을 사용하는 전도도 변화 시스템을 사용한다.
바람직하게는 단백질의 분리 및 정제는 양이온 교환 물질 또는 혼합 방식 크로마토그래피 물질에 단백질의 혼합물을 흡착 또는 결합시킴으로써 첫번째로 수행된다. 그 다음, 단백질, 특히 모노클로날 항체 (mAB) 는, 그것의 관련된 전하 변이체, 당화 변이체, 및/또는 가용성 크기 변이체, 예컨대 그들의 응집체, 모노머, 2/3 단편, ¾ 단편, 일반적으로의 단편, 항원 결합 단편 (Fab) 및 결정화가능 단편 (Fc) 으로부터 분리 및 정제된다.
요약하면, 이것은 본 발명이 단백질, 예컨대 모노클로날 항체가, 이온 교환 크로마토그래피 중 반대 pH-염 구배를 사용하고 정제 계획, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 중의 단계 용출 정제를 이용함으로써 분리되는 방법을 말하는 것으로 의미한다. 정제 계획은 최상의 작동 조건을 확인하기 위해 반대 pH-염 구배를 이용하여 전개된다. 그 결과, 개선된 단백질 분리 효율이 가능하다.
발명의 상세한 설명
본원에 개시된 발명은 이온 교환 크로마토그래피 (IEC) 중의 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 그것의 관련된 전하 변이체 (예를 들어 산성 및 염기성 모노머), 당화 변이체, 및/또는 가용성 크기 변이체 (예를 들어 응집체, 모노머, 2/3-단편, 항원-결합 단편 (Fab), 및 결정화가능 단편 (Fc)) 로부터 모노클로날 항체 (mAb) 의 분취용 분리를 위한 하강 염 구배와 조합된 상승 pH 구배의 적용에 관한 것이다.
초반에 기재된 특허에 청구된 모노 구배 용출 및 염 또는 pH 변동을 사용하는 단계 용출과는 달리 [34-36], 본 발명에 따르면 하강 염 구배와 조합된 상승 pH 구배를 포함하는 반대 pH-염 하이브리드 구배는 mAb 변이체, 예컨대 전하 변이체, 당화 변이체, 및/또는 가용성 크기 변이체, 예컨대 그것의 응집체, 모노머, 2/3 단편, ¾ 단편, 일반적으로의 단편, 항원 결합 단편 (Fab) 및 결정화가능 단편 (Fc), 및 생성물로부터의 응집체의 분리를 위해, IEC, 바람직하게는 CEX, 및 가장 바람직하게는 SCX 에서 사용된다.
이들 특허에 개시된 비교적 "순수한" 공급물 (단 하나의 전하 변이체 유형) 의 사용과는 반대로 [34-36], 본 발명의 공급물은 1 개 초과의 전하 변이체 유형을 포함할 수 있다.
따라서, 단백질 성분을 포함하는 생물학적 용액은 (이것이 분리될 것임), 먼저 적절한 완충 용액과 혼합된다. 이후 수취된 혼합물은 이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 공급되고, 하전된 기 및 단백질, 이의 펩타이드 또는 단편, 응집체, 동형체 및 변이체가 강한 양이온 교환 (SCX) 고정상에 단단히 결합된다. 분석물을 회수하기 휘해, 그 다음 수지를 상기 이온성 상호작용을 중화하는 용매로 세정한다. 중화하는 세정 및 용출은 적합한 완충 용액의 혼합물로 수행된다. 가장 바람직한 적합한 생물학적 완충액은 4.5 내지 10.5 의 범위의 pH 를 제공하는 것들로부터 선택된다. 적합한 완충액은 상기 이미 언급된다. 수많은 적합한 완충액은 또한 인터넷 http://www.hsbt.com.tw/pdf/Biological%20Buffers.pdf 에서 발견될 수 있다. 적합한 완충액은 바람직하게는 MES, MOPS, CHAPS, HEPES 로서 공지된 완충액을 포함한다. 그러나 또한 사용될 수 있는 추가의 완충액 또는 완충 용액이 있는데, 단, 이들은 원하는 분리 생성물 또는 분리 물질과 간섭 반응 또는 상호작용을 나타내지 않는다.
높은 로딩에서의 pH 구배 분리는 낮은 출발 pH 값이, 특히 강한 양이온 교환수지 상에서의 높은 단백질 결합능을 허용하기 때문에 가능하다. MAb 는 변형, 예컨대 시알릴화, 탈아미드화 및 C-말단 라이신 절단 등으로 인해 고도로 불균질할 수 있다. 염 구배 양이온 교환 크로마토그래피는 mAb 전하 변이체를 특징화하는데 일부 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 개별 mAb 에 대한 염 구배 방법을 맞추기 위해 추가의 노력이 종종 요구된다. 빠른-진행의 약물 전개 환경에서, 좀더 일반적인 플랫폼 방법이 다수의 mAb 분석을 수용하기 위해 요구된다.
2009 년에, Farnan 및 Moreno 는 pH 구배 이온-교환 크로마토그래피를 사용하는 mAb 전하 변이체를 분리하기 위한 방법을 보고하였다. pH 구배를 생성하기 위해 이용되는 완충액은 5 내지 9.5 의 pH 범위를 포괄하는, 피페라진, 이미다졸, 및 Tris 로 이루어졌다. 양호한 분리가 관측된 반면, pH 증가 기울기는 시작지점에서는 얕고 끝으로 갈수록 가파르다 [15].
이제, 자체 실험을 통해, 단백질 A, mAb 및 상응하는 동형체의 개선된 정제가 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 염 구배 방법과 조합된 신규한 pH 구배 방법에서 가능하다는 것이 발견되었다. 여러 개의 완충액 종이 완충액 제형에 대해 선택되었고, 완충액의 pH 가 수산화나트륨으로 조정되었다. 상기 방법은 선형 구배가 낮은 pH 완충액 (약 5 의 pH) 의 100 % 용출에서 높은 pH 완충액 (약 9.5 내지 10.5 의 pH) 의 100 % 용출까지 실행되는 다중-성분 완충 시스템을 특징으로 한다. 각각의 완충액 종의 농도는 선형 상승 또는 하강 pH 용출 프로파일을 달성하기 위해 조정된다. 적합한 완충액 조성물은 하기 예시에 기재된다. 이에 더해, 제공된 예시는 또한 강한 양이온 교환 수지를 사용하는 더 나은 분리를 위해 어떻게 선형 상승 pH 구배 방법과 하강 선형 염 구배 방법을 조합하는지를 보여준다. 선형 pH 구배가 달성되는지를 확인하기 위해, 단순한 온라인 pH 측정기가 사용될 수 있다. 상이한 완충 용액은 상이한 용기 내에 제공되고 칼럼 내로 공급되어, 칼럼에서 원하는 pH 가 설정되도록 할 수 있다. 그러나 용기로부터 적절한 양의 상이한 완충 용액을 함께 혼합하고, 칼럼 내로의 분리 과정 동안 상승 pH 에서 혼합된 완충 용액을 도입하는 것이 또한 가능하다. 완충 용액의 상기 예비혼합은 pH 값이 분리 칼럼에서 조정되지 않아야 하고, 이온 교환기에 결합된 단백질 혼합물이 균일하게 변화하는 pH 에 적용된다는 장점을 갖는다.
일단 표적 mAb 의 대략적인 pH 용출 범위가 초기 실행에서 달성되면, 분리의 추가의 최적화는 더 좁은 pH 범위에서 더 얕은 pH 구배를 실행함으로써 다른 분리 물질 등을 사용하여 간단히 달성될 수 있다.
강한 양이온 교환 크로마토그래피 (SCX) 가 사용되므로, 고정상으로부터 완충 효과의 간섭이 없다. 강한 양이온 교환 (SCX) 고정상은 일반적으로 미립자 또는 일체식 (monolithic) 물질로 구성되며, 이것은 수용액 중에서 음으로 하전된 기를 함유한다. 이들 하전된 기 및 단백질, 이의 펩타이드 또는 단편, 응집체 또는 동형체 및 변이체 사이의 상호작용은 이들 염기성 분석물의 단단한 결합을 초래한다. 일반적으로 상기 SCX 물질은 설포프로필, 설포이소부틸, 설포에틸 또는 설포메틸 기를 소유한다. 이러한 고정상의 예는 교환체 물질, 예컨대 Eshmuno® CPS, Eshmuno® CPX, 또는 SP Fast Flow Sepharose®, Eshmuno® S Resin, Fractogel® SO3 (M), Fractogel® SO3 (S) Fractogel SE Hicap (M), SP Cellthru BigBead Plus®, Streamline® SP, Streamline® SP XL, SP Sepharose® Big Beads, Toyopearl® M-Cap II SP-550EC, SP Sephadex® A-25, Express-Ion® S, Toyopearl® SP-550C, Toyopearl® SP-650C, Source® 30S, POROS® 50 HS, POROS® 50 XS, SP Sepharose® Fast Flow, SP Sepharose® XL, Capto® S, Capto® SP ImRes, Capto® S ImpAct, Cellufine® MAX S-r, Cellufine® MAX S-h, Nuvia® S, Nuvia® HR-S, UNOsphere® S, UNOsphere® Rapid S, Toyopearl® Giga-Cap S-650 (M), S HyperCel Sorbent®, Toyopearl® SP-650M, Macro-Prep® High S, Macro-Prep® CM, S Ceramic HyperD® F, MacroCap® SP, Capto® SP ImpRes, Toyopearl® SP-650S, SP Sepharose® High Perform, Capto® MMC, Capto® MMC ImpRes, Eshmuno® HCX, Nuvia® c-Prime 또는 기타이다.
본 발명에 따른 분리 공정에 적합한 SCX 물질은 >25 ㎛, 바람직하게는 ≥40 ㎛, 특히 바람직하게는 50 - 100 ㎛ 의 범위의 평균 입자 직경을 갖는 미립자 물질이다.
적합한 양이온 교환 (SCX) 고정상 및 완충 시스템은 단백질의 pI 에 따라 선택되어야만 한다. 이것은 비-공유 이온성 상호작용을 통해 이온 교환 수지에 결합된 단백질을 용출하기 위해서는 이온성 상호작용이 경쟁 염과의 상호작용에 의해 또는 중화에 의해 약화되어야만 한다는 것을 의미한다.
대안적으로 및 작동 조건 및 단백질의 pI 에 따라, 또한 약한 양이온 교환 수지, 예컨대 Fractogel® EMD COO (M), CM Sepharose® HP, CM Sepharose® FF, Toyopearl® AF Carboxy 650-M, Macro-Prep® CM, Toyopearl® GigaCap CM, CM Ceramic Hyper® D, 또는 Bio-Rex® 70 이 사용될 수 있다.
단백질의 pI 에 따라, 음이온 교환 수지 (SAX) 가 사용될 수 있다. 강한 음이온 교환 수지에 대한 예는 Fractogel® EMD TMAE (M), Fractogel® EMD TMAE Medcap (M), Fractogel® EMD TMAE Hicap (M), Eshmuno® Q, Eshmuno® QPX, Eshmuno® QPX Hicap, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q Sepharose® FF, Q Sepharose® HP, Q Sepharose® XL, Source® 30Q, Capto® Adhere, Capto® Adhere ImpRes, POROS® 50 HQ, POROS® 50 XQ, POROS® 50 PI, Q HyperCel, Toyopearl® GigaCap Q 650-M, Toyopearl® GigaCap Q 650-S, Toyopearl® Super Q, YMC® BioPro Q, Macro-Prep® High Q, Nuvia® Q 또는 UNOsphere® Q 이다.
대안적으로 및 작동 조건 및 단백질의 pI 에 따라 또한 디메틸아미노에틸 (DMAE) 작용기의 디에틸아미노에틸 (DEAE) 을 가지고 있는 약한 음이온 교환 수지가 사용될 수 있다. 그 예는 Fractogel® EMD DEAE, Fractogel® EMD DMAE, Capto® DEAE 또는 DEAE Ceramic HyperD® F 이다.
이제, 이미 상기 언급된 바와 같이, 예상치 않게 생체액으로부터 단백질, 펩타이드 또는 단편, 응집체, 동형체 및 변이체의 포함하는 혼합물의 분리가 반대 pH-염 하이브리드 구배를 실행함으로써 우수한 결과로 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌고, 이것은 단백질을 분리하기 위해, 상승 pH 및 동시에 하강 염 농도, 또는 그 반대에 의한 것임을 의미한다. 구배 용출은, 여기서는 주로 높은 염에서 낮은 염 농도로의, 변화하는 pH 를 가진 용출 완충액 중의 염 농도의 순조로운 이행을 지칭한다. 상기 분리 공정을 위한 적절한 조건을 생성하기 위해 두 완충 용액은 적합한 염 농도로 혼합된다.
반대 pH-염 하이브리드 구배의 이들 조건은 복합적인 연속 분획을 개선된 해상도로 분리하고, 이들을 수집하면서 용출 조건, pH 및 염 농도를 선형 방식으로 조정하는 것을 가능하게 한다. 반대 pH-염 선형 구배는 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대한 최고 해상도를 제공하고, 다수의 연속적인 분획이 수집될 수 있다.
본 발명에 따른 분리를 실행하기 위해 높은 염 농도가 낮은 pH 를 갖는 완충 용액에 바람직하게는 첨가된다. 높은 pH 를 갖는 완충 용액은 바람직하게는 염의 첨가 없이 사용된다. 산출되는 2 가지 완충 용액을 함께 서서히 혼합하고 분리 칼럼 내로 혼합 후 서서히 직접 도입하는 경우, 용출 용액의 pH 는 시간이 지남에 따라 증가하면서 염 농도는 동시에 감소한다.
일반적으로, NaCl 은 상이한 단백질 분획의 결합 및 용출 방법을 수행하기에 유용한 염인데, 변화하는 NaCl 농도가 변화하는 전도도와 조합되고, 이것이 이온 교환기에 결합된 단백질의 하전된 기의 결합 강도에 영향을 주기 때문이다.
일단 단백질성 혼합물의 분리를 위한 반대 pH-염 하이브리드 구배의 적절한 조건이 확립된 경우, 상이한 단백질 분획의 개별 피크가 혼합물로부터 분리가 일어나는 최적의 조건에 배정될 수 있다. 이들 조건이 각각의 원하는 단백질 분획의 단계적인 용출에 대해 사용될 수 있다. 예시에서, 상기 원리의 적용이 제시된다.
이하, 적어도 3 개의 생성물 전하 변이체 및 적어도 3 개의 생성물 크기 변이체의 분리가 수행되는 실험이 예시된다. 이전에 열거된 바와 같은 이들 변이체는 단일 크로마토그래피 실행에서 본 발명에 따라 성공적으로 분리되었다는 것이 발견되었다.
상기 놀라운 분리 결과는 단순한 완충 시스템이 4.5 내지 10.5 의 넓은 pH 범위, 특히 5 내지 9.5 의 pH 범위를 포괄하기 위해 양쪽성 고분자 전해질 완충액 대신에 사용되는 경우, 및 염 구배를 유도하기 위해 염화나트륨이 사용되는 경우 달성될 수 있다. 상이한 pH 값 및 염화나트륨 농도를 가진 2 개의 완충액 (즉 A 및 B) (즉 낮은 pH 및 높은 염 농도를 가진 A; 높은 pH 및 낮은 염 농도를 가진 B) 을 칼럼 유입구에서 외부에서 혼합함으로써 반대 pH-염 하이브리드 구배가 생성되고, 이후 이것은 칼럼을 통과하여 이동한다.
실험은 낮은 로드 및 매우 높은 로딩 모두에서 양호한 분리가, 방법이 그에 따라 제어되는 경우 다양한 단백질로 달성될 수 있다는 것을 보여주었다.
예시적인 복합생성물 (multiproduct) 분리 예가 낮은 로딩 (
Figure pct00001
1 mg/패킹된 수지 mL), 더 높은 로딩 (≥ 30 mg/mL), 및 매우 높은 로딩 (≥ 60 mg/mL) 에서 다양한 mAb 이소단백질을 함유하는 3 가지 상이한 공급물에 대해 제시된다. 분리를 위해 염 구배, pH 구배, 유사 pH-염 하이브리드 구배, 및 반대 pH-염 하이브리드 구배와 같은 상이한 구배 유형을 시험하였다. 낮은 로딩에서의 결과는 염 구배가 크기 변이체 분리의 분리에 대해 (즉, 응집체 및 모노머에 대해) 적합한 반면, pH 구배는 전하 변이체 분리에 대해 (즉, 산성, 중성, 및 염기성 모노머에 대해) 적합하다는 것을 보여주었다. 놀랍게도 크기 및 전하 변이체 모두에 대한 최상의 분리가, 반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템에서 달성된다.
수많은 실험 결과는 상승 pH 구배와 하강 염 구배의 사용이, 단백질 변이체가 선형 pH 구배에 집중시키는 효과 뿐 아니라, 부수적으로 또한 염 농도 감소로 인한 단백질 이동 속도의 지연을 경험하도록 하여 이로써 개선된 분해를 산출한다는 것을 시사한다. 또한 Zhou 등 [31] 은 아세트산나트륨을 유일한 완충 성분으로서 이용하였고, 동시에 이들은 상승 전도도 구배를 발생시키기 위해 상승된 농도에서 동일한 염을 사용하였다. 따라서, 이들은 유사한 증가하는 pH 및 전도도 구배를 부수적으로 발생시키기 위해 유일한 하나의 염 유형을 사용하였다. 아세테이트의 pKa 덕에, 이러한 유형의 완충 시스템을 사용하여 생성된 pH 구배는 오로지 4.8 내지 6.2 의 pH 에만 제한된다 [29,31]. 이와 반대로, 본 실험은 이동상이 MES, MOPS, CHAPS 등을 사용하는 완충 시스템 및 염화나트륨을 사용하는 전도도 변화 시스템으로 구성되는 경우 유리한 결과가 달성된다는 것을 제시하였다. 그러므로, 본 발명의 기반은 Zhou 등에 의해 제안된 것과 동일한 것이 아니다 [31]. 또한 Zhou 등의 하이브리드 구배 시스템과 비교하여 [31], 본 발명은 4.5 내지 10.5 의 넓은 pH 범위를 포괄하는 공통의 완충 시스템을 이용한다. 이것은 산성, 중성, 또는 염기성 pI 값을 가진 넓은 범위의 mAb 의 분리를 위한 이점을 제공한다. SCX 가 사용되므로, 5 내지 9.5 의 pH 범위에서 카복실 리간드를 가진 WCX 와 비교하여 고정상으로부터 완충 효과의 간섭이 없었다. Kaltenbrunner 등에 의해 기재된 pH-염 하이브리드 시스템과 비교하여 [30], 그것의 완충 시스템은 이동상에서 산성 pH 를 달성하기 위한 만니톨 및 보레이트로부터의 시스-디올의 반응으로부터 방출된 하이드록실 이온을 이용하며, 이것은 본원에 기재된 간단한 완충 시스템과는 근본적으로 상이하다. 본 발명의 이점은 이동상 중의 완충액 성분과 단백질, 예컨대 이 경우에는 보레이트 완충액과의 비특이적 결합이 없다는 것이다. DSP 에서 높은 동적 결합능이 항상 바람직하다. 그 동안에, 낮은 전도도를 가진 생성물 풀이 또한 바람직하여, 용출물은, 필요한 경우 다음 IEC 상에 직접적으로 로딩될 수 있고, 이것은 중간 희석 또는 탈염 단계에 대한 필요성을 없앨 수 있다. 본원에 개시된 하이브리드 pH-염 구배 시스템은 이들 목적을 매우 잘 제공하는데, 동적 결합능 (DBC) 은 개시 완충액 내의 일부 염의 첨가로 증가되고, 낮은 전도도를 가진 용출액이 감소하는 염 구배로 가능하다는 것이 관찰되었기 때문이다; 그러나 단백질 변이체 사이의 양호한 분리가 상승 pH 구배의 크로마토포커싱 효과를 통해 용이하다. 마지막으로 그러나 중요하게도, 본원에 기재된 방법은 분리 효율의 손실을 겪지 않으면서 단백질 로드 ≥ 30 mg/mL 를 가진 mAb 변이체 분리의 분취용 규모에 적합하다. 이에 더해, 구배 용출을 사용하는 분리 공정은 유사한 완충 시스템을 사용하는 단계 용출 내로 직접적으로 전달될 수 있다. 더욱이, 높은 단백질 로드는 본 발명의 유용성을 추가로 강화시킨다.
다양한 실험이 수행되었고, 이로부터 예시의 선택이 하기에 기재된다. 이들 예는 어떻게 다양화된 청구된 방법이 수행될 수 있는지를 보여준다. 공정 파라미터의 단순한 조정을 통해, 상이한 단백질 분획을 분리 및 정제하는 것이 가능하며, 이의 분리는 일반적으로 어렵다. 따라서, pH 구배를 덜 변화사시키거나 또는 염 농도를 오직 수 밀리몰만 변화시키는 것이 가능하다. 또 다른 변이체는 크로마토그래피 물질을 선택하는 것으로 이루어진다. 일반적으로, 양이온 교환 물질이 (예컨대 Eshmuno CPX) 적합하나, 원하는 분리에 따라 또한 혼합 방식 크로마토그래피 물질 (MMC) 을 사용하는 것도 가능하다. 혼합 방식 크로마토그래피 물질은 이온성 상호작용, 수소 결합, 및/또는 소수성 상호작용의 조합에 의한 단백질 흡착을 가능하게 하는 멀티모달 기능성의 리간드를 함유한다. 그러므로, 또한 상이한 이온 교환 물질의 사용은 상이한 단백질 분획의 특징적인 분리를 초래한다.
본 발명의 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 완전히 적용시킬 수 있도록 한다. 추가의 코멘트가 없더라도, 당업자는 상기 상세한 설명을 가장 넓은 범위로 사용할 수 있을 것으로 추정된다.
숙련자는, 일상적인 실험 작업에서, 본원의 교시를 사용하여, 최적의 작동 조건을 확인하기 위해 반대 pH-염 구배를 이용하여 진전된 정제 계획을 이용하는 신규 방법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피의 단계 용출 정제에서 효율적으로 상기 정의된 바와 같이 단백질을 분리할 수 있을 것이다.
여전히 불분명한 점이 존재하는 경우, 인용된 출판물 및 특허 문헌을 검색해야 함을 이해한다. 이에 따라, 이러한 문헌은 본 발명의 상세한 설명의 개시물 내용의 일부로서 간주된다.
보다 나은 이해 및 본 발명의 예시를 위해, 본 발명의 보호 범위 내에 속하는 실시예가 하기 제시된다. 이러한 실시예는 또한 가능한 변형을 예시하는 역할을 한다. 그러나, 기재된 본 발명의 원리의 일반적 타당성 때문에, 실시예는 본 출원의 보호 범위를 이들 단독으로 축소시키기에 부적합하다.
추가로, 제시된 실시예 및 또한 상세한 설명의 나머지 모두에서, 조성물에 존재하는 성분의 양은 항상 전체 조성물을 기준으로 총합하여 100 중량% 또는 mol% 이고, 제시된 백분율 범위에서 보다 높은 값이 발생할 수 있다 하더라도, 이를 초과할 수 없다는 것은 당업자에게 자명하다. 달리 제시되지 않는 한, % 데이터는 중량% 또는 mol% 인데, 예를 들어 제조에 있어서 특정 부피 비의 용매가 혼합물로 사용되는 용출액과 같이 부피 데이터로 나타나는 비는 예외이다.
실시예 및 상세한 설명뿐 아니라 청구범위에 제시된 온도는 항상 ℃ 이다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예
실시예 1
IEC 를 사용하는 mAb A 전하 변이체의 분취 분리
분취 크로마토그래피 실행을 하기와 같이 수행한다:
장치:
Figure pct00006
KTApurifier 100
칼럼: Eshmuno® CPX, Merck Millipore, 평균 입자 크기 50 ㎛, 이온 수용력 60 μmol/mL, 칼럼 치수 8 i.d. x 50 mm (2.5 mL)
공급물: MAb A 포스트 단백질 A 풀
이동상:
(A) 선형 염 구배의 완충액은 10 mM MES 로 이루어진다. NaCl 미포함 완충액 A. 1 M NaCl 포함 완충액 B. 두 완충액의 pH 는 NaOH 에 의해 모두 pH 6.5 로 조정되었다.
(B) 선형 pH 구배의 완충액은 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 6 mM MOPS, 4 mM HEPES, 8 mM TAPS, 8 mM CHES, 11 mM CAPS, 53 mM NaOH 로 이루어진다. 도면의 설명에 언급되지 않는 한, 완충액 A 및 B 에 NaCl 은 첨가되지 않는다. 완충액 A 를 HCl 에 의해 pH 5 로 조정한다. 완충액 B (pH = 10.5) 에 대해서는 pH 조정이 요구되지 않았다.
(C) 하강 pH 및 상승 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배의 완충액은 12 mM 아세트산, 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 6 mM MOPS, 4 mM HEPES 로 이루어진다. NaCl 미포함 및 NaOH 에 의해 pH 가 8 로 조정된 완충액 A. 200 mM NaCl 포함 및 NaOH 에 의해 pH 가 5 로 조정된 완충액 B.
(D) 상승 pH 및 하강 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배의 완충액은 12 mM 아세트산, 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 6 mM MOPS, 4 mM HEPES, 8 mM TAPS, 8 mM CHES, 11 mM CAPS 로 이루어진다. 150 mM NaCl 포함 및 NaOH 에 의해 pH 가 5 로 조정된 완충액 A. NaCl 미포함 및 NaOH 에 의해 pH 가 10.5 로 조정된 완충액 B.
(E) 상승 pH 및 상승 염 구배의 유사 pH-염 하이브리드 구배 완충액은 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 6 mM MOPS, 4 mM HEPES 로 이루어진다. NaCl 미포함 및 NaOH 에 의해 pH 가 5 로 조정된 완충액 A. 200 mM NaCl 포함 및 NaOH 에 의해 pH 가 8 로 조정된 완충액 B.
선형 구배 용출:
구배 기울기: 60 CV (2.5 mL/CV), 그렇지 않으면 도면의 설명에 언급될 것임
유량: 1 mL/min (= 119 cm/h)
단백질 로드: 1 mg/mL, 그렇지 않으면 도면의 설명에 언급될 것임
제자리 세정 (Cleaning-In-Place) (CIP): 0.5 M NaOH (3 - 5 CV)
단계 용출:
유량: 1 mL/min (= 119 cm/h) 을 사용하여 단백질을 결합시켰고; 3 mL/min (= 358 cm/h) 을 사용하여 단백질을 용출하였음
단백질 로드: 30 mg/mL
제자리 세정 (CIP): 0.5 M NaOH (3 - 5 CV)
(D) 에 언급된 완충액 A 및 B (이동상 참조) 를 사용한다. 0% 완충액 B 를 단백질 결합에 사용한다. 단백질 용출에 있어서, 상이한 농도의 완충액 A 및 B 의 혼합에 의해 하기와 같은 상이한 단계가 생성된다:
Figure pct00007
하기와 같이 분석을 수행한다:
장치:
Figure pct00008
KTAmicro
크기-배제 고압 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 를 BioSep™-SEC-s3000, Phenomenex, 칼럼 치수 7.8 i.d. x 300 mm, 입자 크기 5 ㎛ 를 사용하여 수행한다. 사용된 완충액은 50 mM NaH2PO4 및 300 mM NaCl, pH 7 로 이루어진다. 1 mL/min 의 유량으로 등용매 용출을 사용한다. 주입 부피는 40 ㎕ 내지 100 ㎕ 에서 가변적이다.
양이온 교환 고압 액체 크로마토그래피 (CEX-HPLC) 를 YMC BioPro Sp-F, YMC Co. Ltd., 칼럼 치수 4.6 i.d. x 50 mm, 입자 크기 5 ㎛ 를 사용하여 수행한다. (B) 에서 이전 기재된 바와 같은 완충액을 사용한다. 0.7 mL/min 의 유량으로 8.75 CV 구배 길이에서 50% 내지 85% 완충액 B 로부터의 구배 용출을 사용하였다. 주입 부피는 40 ㎕ 내지 100 ㎕ 에서 가변적이다.
결과:
하기 데이터를 수집하여, CEX 를 사용하는 mAb A 전하 변이체의 분리에서의 상이한 구배 유형의 효율을 비교한다.
도면 1 (도. 1) 에서, mAb A 전하 변이체의 분리에서의 상이한 구배 용출 유형의 스크리닝을 나타낸다. Eshmuno® CPX 에서의 (A) 선형 염 구배 용출: 0 - 1 M NaCl, pH 6.5, (B) 선형 pH 구배 용출: pH 5 - 10.5, 0.053 M Na+, (C) 하강 pH 및 상승 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출 : pH 8 - 5, 0 - 1 M NaCl, (D) 상승 pH 및 하강 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출 : pH 5 - 10.5, 0.15 - 0 M NaCl, (E) 상승 pH 및 상승 염 구배의 유사 pH-염 하이브리드 구배 용출 : pH 5 - 8, 0 - 0.2 M NaCl. 수산화나트륨 (완충액의 pH 조정을 위해 사용됨) 으로부터 유래된 반대이온을 Na+ 로 나타낸 반면, 염화나트륨으로부터 유래된 것은 NaCl 로 나타낸다.
도면 1 에 나타난 모든 구배 용출 실행 중에서, (D) 의 반대 pH-염 하이브리드 구배는 가장 많은 수의 분해 피크 - 6 를 보인 반면, 다른 두 하이브리드 구배 (C) 및 (E) 는 적당히 분해된 피크 (피크 개수 - 3) 을 보인다. 선형 pH 구배 (B) 와 같은 전형적인 용출 방법은 말단에 숄더 (shoulder) 를 갖는 3 개의 매우 분해된 피크를 보인 반면, 선형 염 구배는 단지 2 개의 피크만을 보인다.
하기 데이터는 도면 1 의 구배 유형 (A), (B) 및 (D) 에서 풀링된 분획의 자세한 HPLC 분석을 나타낸다.
도면 2 (도. 2) 에서, 왼쪽 칼럼은 도면 1 에서 나타나고 설명된 (A), (B) 및 (D) (위에서 아래) 각각의 분취 크로마토그래피 실행 (파선: 전도도 (cond.), 점선: pH) 을 나타낸다. 중앙 및 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 HPLC 분석이다. Mono.- 단량체, Ag 1, 2, 및 3- 응집 변이체 1, 2, 및 3, AV- 산성 전하 변이체, MP- 메인 피크, BV- 염기성 전하 변이체. 수산화나트륨 (완충액의 pH 조정을 위해 사용됨) 으로부터 유래된 반대이온을 Na+ 로 나타낸 반면, 염화나트륨으로부터 유래된 것은 NaCl 로 나타낸다.
선택된 3 개의 모든 구배 용출 유형에 있어서, 단량체로부터 응집체가 분해될 수 있다는 것이 관찰된다 (도면 2 의 SE-HPLC 참조). 도면 2 의 분취 크로마토그램에 있어서, 선형 염 구배 용출은 단량체 피크 (피크 넘버 1) 로부터 약간 더 양호하게 분해된 응집체 피크 (피크 넘버 2) 를 제공한다. 그러나, 염기성 전하 변이체를 제외하고 전하 변이체의 분리는 전혀 존재하지 않는다 (도면 2 의 CEX-HPLC 참조). 선형 pH 구배 및 상승 pH 및 하강 염 구배의 반대 (Opp.) pH-염 하이브리드 구배는 메인 피크 (MP) 로부터 매우 분해된 산성 전하 변이체 (AV) 및 염기성 전하 변이체 (BV) 피크를 나타낸다. 전하 변이체 분리 이외에, 반대 pH-염 하이브리드 구배는 또한 이러한 유형의 하이브리드 구배의 이점을 입증하는 3 개의 분리 응집체 피크를 나타낸다.
하기 데이터는 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출 및 선형 pH 구배의 상응하는 이소단백질 분리 효율뿐 아니라 수용력을 비교한다.
도면 3a-3d (도. 3a-3d): 왼쪽 칼럼은, 상이한 표적 로드를 사용하는, Eshmuno® CPX 에서의 반대 pH-염 하이브리드 구배 pH 5 - 10.5, 0.15 - 0 M NaCl (A, C, F, G), 선형 pH 구배 pH 5 - 10.5, 0.053 mM Na+ (B, D), 및 염 pH 5 - 10.5, 0.15 M NaCl (E) 의 선형 pH 구배의 각각의 분취 크로마토그래피 실행을 나타낸다. (A) - (F) 에 있어서, 구배 기울기는 60 CV 였고, (G) 에서는 276 CV 이다. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 중앙 및 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 HPLC 분석이다. Mono.- 단량체, Ag 1, 2, 및 3- 응집 변이체 1, 2, 및 3, AV- 산성 전하 변이체, MP- 메인 피크, BV- 염기성 전하 변이체. 수산화나트륨 (완충액의 pH 조정을 위해 사용됨) 으로부터 유래된 반대이온을 Na+ 로 나타낸 반면, 염화나트륨으로부터 유래된 것은 NaCl 로 나타낸다. 매 실행에서 단백질 회수율은 > 90% 이다.
30 mg/패킹된 수지 mL 의 표적 로드가 사용된 경우, 단백질의 파과 (breakthrough) 는 선형 pH 구배 시스템에서 관찰되는 반면 (도면 3 의 (B) 참조), 반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템에서는 관찰되지 않는다 (도면 3 의 (A) 참조). 표적 로드가 60 mg/패킹된 수지 mL 로 증가된 경우, 단백질의 파과는 선형 pH 구배 시스템에서 약 80% (공급물에 대한 100% UV 신호
Figure pct00009
1560 mAU) 로 증가한다 (도면 3 의 (D) 참조). 60 mg/패킹된 수지 mL 의 동일한 표적 로드에서, 반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템에서는 단백질의 파과가 관찰되지 않는다는 것을 유의해야 한다. VR ~ 40 내지 50 mL 사이의 피크 (도 3 의 (C) 참조) 는 샘플 주입이 완료된 경우 (즉, 칼럼이 결합 완충액으로 세척된 경우) 발생한다. 동적 결합능 (DBC) 이 상승된 염 농도에 따라 증가할 수 있다는 것을 확인하기 위하여, pH 구배 용출 실험을 완충액 A 및 B 모두에 0.15 M 염화나트륨을 첨가함으로써 반복하고, (E) 에서의 결과는 60 mg/패킹된 수지 mL 의 표적 로드가 칼럼을 통한 임의의 단백질 흐름 없이 달성된다는 것을 보여준다. 그러나, 분리 효율에 관해서는, 60 mg/mL 로드에서의 반대 pH-염 하이브리드 구배에서 풀링된 분획 (도면 3 의 (C) 의 CEX-HPLC 참조) 이 0.15 M NaCl 의 pH 구배 (도면 3 의 (E) 의 CEX-HPLC 참조) 에 비해 개개의 변이체 종의 보다 높은 순도를 보인다. 또한, 메인 피크 2 및 염기성 전하 변이체 피크 3 은 상승된 염 농도에서의 pH 구배보다 반대 pH-염 하이브리드 구배에서 보다 양호하게 분해된다 (도면 3 의 분취 크로마토그램 (C) 및 (E) 비교).
반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템에 있어서, 5% 파과시 동적 결합능 (DBC5%) 은 대략 98 mg/패킹된 수지 mL 인 것으로 확인된다 (도면 3 의 (F) 참조). 상이한 구배 기울기 간의 분리 효율을 연구하기 위하여, 동일한 DBC5% 실험을 매우 얕은 구배 - 276 CV 를 사용하여 반복하였다 (도면 3 의 (G) 참조). 보다 가파른 기울기에 비교시, 얕은 구배에서 개개의 피크 사이의 보다 높은 분해능 이외에 각각의 풀의 순도의 유의한 개선은 관찰되지 않는다 (도면 3 의 (F) 및 (G) 의 CEX-HPLC 비교). 결합능의 유의한 증가 이외에, 반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템은 또한 메인 피크로부터 산성 및 염기성 전하 변이체의 높은 분해능 분리를 제공한다. 전형적인 pH 구배 용출에 비해, 반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템은 하기 이점을 제공한다: 보다 높은 결합능 (적어도 2 내지 3 배), 보다 양호하지는 않더라도 유사한 생성물 관련 전하 변이체 간의 분리, 및 유의하게 개선된 생성물 관련 응집체 종 간의 분리.
150 mM 의 반대 pH-염의 초기 염 농도가 분취 CEX 수지에 대해 비교적 높다는 것을 유의해야 한다. 보다 낮은 염 농도 (예를 들어, 50 mM 또는 100 mM) 를 사용하는 경우, 보다 높은 결합능과 피크 간의 개선된 분해능이 획득될 수 있다는 것을 예상하는 것은 타당하다.
하기는 동일한 완충 시스템을 사용하는 하이브리드 pH-염 구배 용출에서 일련의 단계식 용출로의 분리 방법의 전환을 나타낸다.
도면 4: (도. 4) 왼쪽 칼럼은 Eshmuno® CPX 에서의, 단계 용출을 사용하는 다중생성물 분리를 나타낸다. 피크 1 및 2 는 제 1 단계에서 용출되고 (46% 완충액 B), 피크 3 은 제 2 단계에서 용출되고 (55% 완충액 B), 피크 4 는 제 3 단계에서 용출되고 (70% 완충액 B), 피크 5 는 제 4 단계에서 용출되고 (81% 완충액 B), 피크 6 은 제 5 단계에서 용출되고 (89% 완충액 B), 피크 7 은 제 6 단계에서 용출된다 (93% 완충액 B). 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 중앙 및 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 HPLC 분석이다. Mono.- 단량체, Ag 1, 2, 및 3- 응집 변이체 1, 2, 및 3, AV- 산성 전하 변이체, MP- 메인 피크, BV- 염기성 전하 변이체.
도면 3 의 (A) 에서의 용출 프로파일을 기준으로, 각각의 변이체 종이 용출되는 지점에서의 각각의 농도의 완충액 B 는 동일한 완충 시스템을 사용하는 일련의 단계식 용출로 전환된다. 도면 4 에서 나타난 바와 같이, 개개의 생성물 변이체는 단계 용출을 통해 서로 매우 잘 분리된다. 양호한 분리뿐 아니라, 해당 단량체성 종 (즉, AV, MP, 및 BV) 의 80% 초과의 수율 (도면 4 의 CEX-HPLC 의 피크 하 면적에 따름) 이 피크 1, 2, 및 3 에서 달성된다.
구배 용출로부터 단계 용출로의 분리 방법의 전환의 용이성은 최소한의 경험적 노력을 사용하여 최단 시간 내 다중생성물 분리의 방법 진전을 위한 반대 pH-염 하이브리드 구배의 이점을 강화시킨다.
실시예 2
IEC 를 사용하는 mAb B 전하 변이체의 분취 분리
분취 크로마토그래피 실행을 하기와 같이 수행한다:
장치:
Figure pct00010
KTApurifier 100
칼럼: Eshmuno® CPX, Merck Millipore, 평균 입자 크기 50 ㎛, 이온 수용력 60 μmol/mL, 칼럼 치수 8 i.d. x 20 mm (1 mL)
공급물: MAb B 단량체 포스트 단백질 A 풀
이동상:
(A) 선형 염 구배에 있어서, 완충액 A 및 B 는 20 mM 아세트산으로 이루어진다. 완충액 B 에 250 mM 염화나트륨이 첨가되는 반면 완충액 A 에는 아무것도 첨가되지 않는다. 두 완충액은 모두 NaOH 에 의해 pH 5 로 조정되었다.
(B) 선형 pH 구배에 있어서, 완충액 A 는 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 및 10 mM MOPS 로 이루어진 반면 완충액 B 는 6 mM MOPS, 6 mM HEPES, 10 mM TAPS, 및 9 mM CHES 로 이루어진다. 완충액 A 및 B 는 각각 NaOH 에 의해 pH 5 및 9.5 로 조정된다.
(C) 상승 pH 및 하강 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배에 있어서, (A) 에서와 동일한 완충 성분이 사용되지만, 특정 양의 염화나트륨 (50 mM 또는 100 mM) 이 완충액 A 에 첨가되는 반면 완충액 B 에는 아무것도 첨가되지 않는다. 두 완충액은 모두 NaOH 에 의해 각각 pH 5 및 9.5 로 조정되었다.
구배 기울기: 60 CV (1 mL/CV), 그렇지 않으면 도면의 설명에 언급될 것임
유량: 1 mL/min (= 119 cm/h)
단백질 로드: 1 mg/mL, 그렇지 않으면 도면의 설명에 언급될 것임
CIP: 0.5 M NaOH (3 - 5 CV)
분석을 하기와 같이 수행한다:
장치:
Figure pct00011
KTAmicro
CEX-HPLC 를 YMC BioPro Sp-F, YMC Co. Ltd., 칼럼 치수 4.6 i.d. x 50 mm, 입자 크기 5 ㎛ 를 사용하여 수행한다. 완충액은 10 mM MES, 6 mM MOPS, 4 mM HEPES, 8 mM TAPS, 8 mM CHES, 및 31.8 mM NaOH 를 포함한다. 완충액 A 는 HCl 에 의해 pH 6 으로 조정된다. 완충액 B (pH = 9.5) 에 대해서는 pH 조정이 요구되지 않는다. 0.7 mL/min 의 유량으로 15.76 CV 구배 길이에서 25% 내지 60% 완충액 B 로부터의 구배 용출을 사용한다. 주입 부피는 40 ㎕ 내지 100 ㎕ 에서 가변적이다.
결과:
하기 데이터는 다음 3 개의 상이한 구배 용출 시스템의 이소단백질 분리 효율을 비교한다: CEX 에서의 선형 염 구배 용출, 선형 pH 구배 용출, 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출.
도면 5: (도. 5) 왼쪽 칼럼은 Eshmuno® CPX 에서의 3 개의 선형 구배 용출 유형의 각각의 분취 크로마토그래피 실행을 나타낸다. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 CEX-HPLC 분석이다. CEX-HPLC 분석의 A - H 는 상이한 단량체성 전하 변이체를 나타낸다.
도면 5 의 3 개의 상이한 구배 유형의 비교를 통해, 선형 염 구배 용출은 단지 하나의 용출된 피크를 나타내는 반면, 다른 둘은 메인 피크와 숄더를 나타낸다. 이는 본원에서 시험된 세 방법 중에서 염 구배가 가장 효율적이지 않은 시스템임을 의미한다. pH 구배 및 하이브리드 구배 용출에 있어서, 두 셋업 모두에서 특정 전하 변이체의 제거가 달성될 수 있지만, 하이브리드 구배 용출은 보다 양호하게 분해된 숄더를 나타낸다 (이는 염기성 전하 변이체를 함유함). 또한, CEX-HPLC 분석으로부터, 하이브리드 구배의 숄더 피크 3 이 pH 구배 (F, G, 및 H) 와 비교시 2 개의 염기성 전하 변이체 (G 및 H) 를 함유하는 것이 확인되며 이는 종래의 pH 구배 용출 시스템에 비해 하이브리드 구배를 사용하는 경우 이소단백질의 분리가 보다 양호한 것을 의미한다.
하기 데이터는 선형 pH 구배 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출의 상응하는 전하 변이체 분리 효율뿐 아니라 수용력을 비교한다.
도면 6: (도. 6) 왼쪽 칼럼은 5% 파과 (DBC5%) 를 사용하는 Eshmuno® CPX 에서의 선형 염 구배 용출 0 - 0.25 M NaCl, pH 5, 선형 pH 구배 용출 pH 5 - 9.5, 0 M NaCl, 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 pH 5 - 9.5, 0.05 - 0 M NaCl 의 각각의 분취 크로마토그래피 실행을 나타낸다. 구배 기울기- 690 CV. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 CEX-HPLC 분석을 나타낸다. CEX-HPLC 분석의 A - H 는 상이한 단량체성 전하 변이체를 나타낸다. 매 실행에서 단백질 회수율은 > 90% 이다.
도면 7a - 7c: (도. 7a - 7c) 도면 6 에 나타난 각각의 구배 유형의 용출 피크에서의 개개의 전하 변이체의 총합 백분율. A - H 는 구배에 따른 도면 6 의 CEX-HPLC 에 나타난 개개의 전하 변이체의 최대치를 나타낸다. 숫자 (1 - 7) 표시된 직선은 도면 6 의 분획 풀이 취해진 위치를 나타낸다.
전형적인 선형 염 및 선형 pH 구배 용출의 DBC (DBC5%
Figure pct00012
53 - 55 mg/패킹된 수지 mL) 에 비해, 증가하는 pH 및 하강 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배가 사용되는 경우, mAb B 의 DBC 는 유의하게 더 높다 (DBC5%
Figure pct00013
71 mg/패킹된 수지 mL) (도면 6 참조). 용출 구배에 따른 전하 변이체의 변화에 있어서 (도면 7 참조), 선형 염 구배에서, 산성 전하 변이체 (A, B, C, D) 및 염기성 전하 변이체 (G, H) 가 각각 구배의 시작점 및 구배의 종료점에서 하나로 통합되어 전하 변이체의 비효율적인 분리를 유발한다는 것이 관찰된다. 이와 반대로, 이러한 전하 변이체는 각각 pH 구배 및 하이브리드 구배에 따라서 균일하게 분포한다. DBC5% 가 도달되기 전 보다 적은 단백질이 pH 구배 완충을 사용하는 칼럼 상에 로딩될 수 있었기 때문에, 하이브리드 구배에 비해 pH 구배에 따른 전하 변이체 분포가 약간 더 양호한 것을 주목해야 한다. 실시예 1 에 나타난 것과 같이 (도 3a - 3d (C) 및 (E) 참조), 하이브리드 구배에서 사용된 것과 유사한 양의 단백질 (즉, 패킹된 수지 1 mL 당 ~71 mg) 이 상승된 염 농도에서 pH 구배 완충을 사용하는 칼럼 상에 로딩되는 경우, 전하 변이체의 분리는 하이브리드 구배보다 더 악화될 것이다. 따라서, 하이브리드 구배가, 전형적인 pH 구배 방법에 비해 이소단백질 분리 효율을 감소시키지 않으면서 단백질의 DBC 를 개선한다는 결론은 타당하다.
실험은, 전하 변이체 분리가 상기 종을 더 적게 함유하는 혼합물을 사용하는 경우 개선될 수 있다는 것을 보여준다. 이에 따라, 도면 6 에서 반대 pH-염 하이브리드 구배의 숄더 피크 5 - 7 은 풀링되고 조합되어 더 적은 전하 변이체 (E, F, G, 및 H) 를 갖는 공급물을 형성하고, 이는 유사한 실험 셋업을 사용하여 재크로마토그래피된다.
하기 데이터는 E, F, G 및 H 전하 변이체를 함유하는 공급물의 재크로마토그래피 결과를 나타낸다.
도면 8: (도. 8) 도면 6 의 반대 pH-염 하이브리드 구배의 숄더 피크 5 - 7 로부터 풀링된 전하 변이체 E, F, G, 및 H 를 함유하는 공급물의 재크로마토그래피. 왼쪽 칼럼은 Eshmuno® CPX 에서의 선형 pH 구배 용출 pH 5 - 9.5, 0 M NaCl 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 pH 5 - 9.5, 0.05 - 0 M NaCl / 0.10 - 0 M NaCl 의 각각의 분취 크로마토그래피 실행 (위에서 아래로) 을 나타낸다. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 CEX-HPLC 분석을 나타낸다. CEX-HPLC 분석의 E - H 는 상이한 단량체성 전하 변이체를 나타낸다.
숄더 피크 1 및 메인 피크 2 간의 최적의 분해능은 0.05 M NaCl 의 반대 pH-염 하이브리드 구배가 사용되는 경우 (도면 8 의 중간 열) 달성된다. 그러나, CEX-HPLC 결과는 0.10 M NaCl 의 하이브리드 구배의 메인 피크 2 가 단 하나의 주요 전하 변이체 H 를 함유한다는 것을 나타내며, 이는 이러한 시스템이 가장 효율적인 전하 변이체 분리를 갖는다는 것을 의미한다. 세 시스템 중에서, 하이브리드 구배 시스템이 선형 pH 구배 시스템보다 분해능 및 전하 변이체 제거 효율의 관점에서 탁월하다.
실시예 3
IEC 를 사용하는 mAb B Fc, Fab, 2/3 단편, 및 단량체성 종의 분취 분리
분취 크로마토그래피 실행을 하기와 같이 수행하였다:
장치:
Figure pct00014
KTApurifier 100
칼럼: Eshmuno® CPX, Merck Millipore, 평균 입자 크기 50 ㎛, 이온 수용력 60 μmol/mL, 칼럼 치수 8 i.d. x 20 mm (1 mL)
공급물: Fc/Fab, 및 2/3 단편과 MAb B 천연 단량체 스파이크 (spike)
이동상:
(A) 선형 pH 구배에 있어서, 완충액 A 는 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 및10 mM MOPS 로 이루어진 반면, 완충액 B 는 6 mM MOPS, 6 mM HEPES, 10 mM TAPS, 및 9 mM CHES 로 이루어진다. 완충액 A 및 B 는 NaOH 에 의해 각각 pH 5 및 9.5 로 조정되었다.
(B) 상승 pH 및 하강 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배에 있어서, (A) 에서와 동일한 완충 성분이 사용되지만, 특정 양의 염화나트륨 (50 mM 또는 100 mM) 이 완충액 A 에 첨가되는 반면 완충액 B 에는 아무것도 첨가되지 않는다. 두 완충액은 모두 NaOH 에 의해 각각 pH 5 및 9.5 로 조정된다.
구배 기울기: 60 CV (1 mL/CV)
유량: 1 mL/min (= 119 cm/h)
단백질 로드: 1 mg/mL, 그렇지 않으면 도면의 설명에 언급될 것임
CIP: 0.5 M NaOH (3 - 5 CV)
단계 용출:
유량: 1 mL/min (= 119 cm/h) 을 사용하여 단백질을 결합시켰고; 3 mL/min (= 358 cm/h) 을 사용하여 단백질을 용출하였음
단백질 로드: 30 mg/mL
제자리 세정 (CIP): 0.5 M NaOH (3 - 5 CV)
(B) 에 언급된 완충액 A 및 B (이동상 참조) 를 사용한다. 0% 완충액 B 를 단백질 결합에 사용한다. 단백질 용출에 있어서, 하기와 같은 상이한 농도의 완충액 A 및 B 의 혼합에 의해 상이한 단계가 생성된다:
Figure pct00015
하기와 같이 분석을 수행하였다:
장치:
Figure pct00016
KTAmicro
SE-HPLC 를 Superdex™ 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare, 칼럼 치수 10 i.d. x 300 mm, 평균 입자 크기 8.6 ㎛ 를 사용하여 수행하였다. 사용된 완충액은 50 mM NaH2PO4 및 300 mM NaCl, pH 7 로 이루어진다. 0.5 mL/min 의 유량으로 등용매 용출을 사용한다. 주입 부피는 40 ㎕ 내지 100 ㎕ 에서 가변적이다.
결과:
하기 데이터는, 본 발명의 방법이 CEX 를 사용하여 2/3 단편, Fc 및 Fab 와 같은 기타 가용성 크기 변이체로부터 천연 mAb 를 분리하기 위한, pH 구배를 사용하는 방법에 대한 특정한 이점을 갖는다는 것을 보여준다.
도면 9: (도. 9) 왼쪽 칼럼은 Eshmuno® CPX 에서의 선형 pH 구배 용출 pH 5 - 9.5, 0 M NaCl 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 pH 5 - 9.5, 0.05 - 0 M NaCl 의 각각의 분취 크로마토그래피 실행을 나타낸다. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 SE-HPLC 분석을 나타낸다. MAb- 천연 단량체성 mAb B, 2/3 Fg.- 2/3 단편, Fc- 결정성 단편, Fab- 항원-결합 단편.
분리 결과가 설득력이 있다 하더라도, 도면 9 의 SE-HPLC 결과의 Fc 및 Fab 피크를 설명하는 경우에는 숙련된 전문가가 필요하다. Fc (VR
Figure pct00017
15 mL) 는 Fab (VR
Figure pct00018
15.5 mL) 전에 숄더로서 나타난다. 선형 pH 구배 용출을 사용하는 크로마토그래피 실행의 SE-HPLC 분석에 있어서, 분획 풀 1 및 2 는 단지 Fc 만을 함유하는 반면 Fab 는 분획 풀 4 및 5 에서 발견된다. 마찬가지로, 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출을 사용하는 크로마토그래피 실행에 있어서, 상응하는 SE-HPLC 결과는 분획 풀 1 이 주로 Fab 를 함유하는 반면 분획 풀 2 는 Fc 및 Fab 둘의 혼합물이라는 것을 나타낸다.
도면 9 의 왼쪽의 두 크로마토그래피 실행의 비교를 통해, 선형 pH 구배 용출을 사용하는 경우 더 많은 수의 분해 피크가 수득되지만, 생성물 피크 (즉, 왼쪽 상부의 크로마토그램의 피크 6) 는 Fab 피크 (즉, 동일한 크로마토그램의 피크 5) 와 오버랩된다. 반대로, 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출에서 더 적은 피크가 분해되지만, 생성물 피크 (즉, 왼쪽 하부의 크로마토그램의 피크 4) 는 다른 불순물 피크로부터 매우 잘 컷 오프 (cut off) 되어, 단계 용출을 사용하는 생성물의 용출에 보다 넓은 윈도우를 제공할 수 있다. 여기서, 또한 분명한 것은 상승 pH 구배에서 하강 염 구배를 이용함으로써, Fab 및 고정상 사이의 상호작용을 강하게 억제시켜 생성물 피크로부터의 이 피크의 완전한 배제가 유도된다는 것이다. pH 구배 용출에서 (도면 9 의 왼쪽 상부), Fab 종은 Fc 및 2/3 단편 이후 용출된다. 그러나, 하이브리드 구배 용출에서 (도면 9 의 왼쪽 하부), Fab 종은 Fc 및 2/3 단편 이전 용출된다.
이러한 연구에서 사용된 천연 단량체성 mAb 가 실시예 2 에서 사용된 것과 동일하기 때문에, 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출 (도면 9 의 왼쪽 하부) 의 피크 4 및 5 는 도면 5 의 용출된 피크 (왼쪽 하부) 와 유사하고, 도면 5 에서 전하 변이체가 분리되는 것은 이전에 제시되었다. 따라서, 실시예 2 및 3 의 결과를 조합함으로써, 반대 pH-염 하이브리드 구배가 전하 및 크기 변이체를 동시에 분리시키는데 사용될 수 있다는 것이 입증되고, 이는 실시예 1 에 나타난 결과를 다시 한 번 확증한다.
하기 데이터는 보다 높은 로딩에서의 선형 pH 구배 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 용출의 상응하는 전하 변이체 분리 효율을 비교한다.
도면 10: (도. 10) 왼쪽 칼럼은 30 mg/패킹된 수지 mL 의 로드를 사용하는 Eshmuno® CPX 에서의 선형 pH 구배 용출 pH 5 - 9.5, 0 M NaCl 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 pH 5 - 9.5, 0.05 - 0 M NaCl 의 각각의 분취 크로마토그래피 실행을 나타낸다. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 SE-HPLC 분석을 나타낸다. MAb- 천연 단량체성 mAb B, 2/3 Fg.- 2/3 단편, Fc- 결정성 단편, Fab- 항원-결합 단편.
도면 10 에서, 다중생성물 분리 효율이 높은 로딩 (= 30 mg/패킹된 수지 mL) 에서 시험된다. 도면 9 에 나타난 동일한 분리 결과가 재현된다. 여기서, 이 실험에서 사용된 공급물이 도면 9 에서 사용된 공급물에 비해 약간 더 높은 백분율의 Fc 및 Fab 를 함유한다는 것이 주목된다. 그러나, 용출 프로파일 및 용출액 순서는 두 경우 모두 동일하고; pH 구배 용출은 보다 많은 수의 분해 피크 그러나 덜 효율적으로 분리된 생성물 풀을 나타내는 반면 (도면 10 의 왼쪽 상부 크로마토그램의 피크 6), 하이브리드 구배 용출에서는 그와 반대이다 (도면 10 의 왼쪽 하부 크로마토그램의 피크 4). 다시 한 번, 하이브리드 구배 용출 시스템이 높은 로딩 정제를 위해 사용될 수 있다는 것이 나타난다.
하기는 동일한 완충 시스템을 사용하는 하이브리드 pH-염 구배 용출에서 일련의 단계식 용출로의 분리 방법의 전환을 나타낸다.
도면 11: (도. 11) 왼쪽 칼럼은 Eshmuno® CPX 에서의 단계 용출을 사용하는 다중생성물 분리를 나타낸다. 피크 1 은 제 1 단계에서 용출되고 (28.5% 완충액 B), 피크 2 는 제 2 단계에서 용출되고 (34% 완충액 B), 피크 3 은 제 3 단계에서 용출되고 (46% 완충액 B), 피크 4 는 제 4 단계에서 용출되고 (63% 완충액 B), 피크 5 는 제 5 단계에서 용출된다 (76%). 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 중앙 및 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 HPLC 분석이다. MAb- 천연 단량체성 mAb B, 2/3 Fg.- 2/3 단편, Fc- 결정성 단편, Fab- 항원-결합 단편. CEX-HPLC 의 A - H 는 상이한 단량체성 전하 변이체를 나타낸다.
실시예 1 과 유사하게, 분리 방법은 하이브리드 구배 용출 시스템에서 일련의 단계식 용출로 전환된다. 도면 11 의 SE-HPLC 결과에 따르면, 피크 1 은 > 99% 의 순도 및 ~91% 의 수율의 Fab 를 함유하는 반면, 피크 4 는 > 99% 의 순도 및 ~70% 의 수율을 갖는 mAb 를 함유한다. 피크 2 는 ~75% 순도의 2/3 단편과 ~25% 순도의 Fc 를 함께 포함한다. 약 50% 수율의 2/3 단편은 피크 2 에서 용출되는 반면, 나머지 절반은 피크 3 에서 일부 mAb 와 함께 확인된다. 또한, 피크 4 및 5 에서, 전하 변이체 분리가 관찰되고 이는 도면 10 의 CEX-HPLC 결과에 나타나고, 여기서 산성 변이체 A, B, C, D, E, 및 F 는 분획 풀 4 에서 확인되고 염기성 변이체 G 및 H 는 최종 분획 풀 5 에서 확인된다. 단계 용출을 사용하는 전하 변이체의 분리는, 상응하는 완충 시스템이 염기성 전하 변이체로부터 산성 전하 변이체의 분리에 적합하다는 실시예 2 에 나타난 하이브리드 구배 용출에서의 관측을 재확증한다.
요약하면, 실시예 3 은 크기 변이체 및 전하 변이체 분리를 위한, 높은 로딩에서 작동하며 또한 일련의 단계식 용출로 쉽게 전환가능한 본 발명의 반대 하이브리드 pH-염 구배 시스템의 완전한 적합성을 나타낸다.
실시예 4
MMC 를 사용하는 mAb B Fc, Fab, 2/3 단편, 및 단량체성 종의 분취 분리
분취 크로마토그래피 실행을 하기와 같이 수행한다:
장치:
Figure pct00019
KTApurifier 100
칼럼: Capto® MMC, GE Healthcare, 평균 입자 크기 75 ㎛, 이온 수용력 70-90 μmol/mL, 칼럼 치수 8 i.d. x 20 mm (1 mL)
공급물: Fc/Fab, 및 2/3 단편과 MAb B 천연 단량체 스파이크
이동상:
(A) 선형 pH 구배에 있어서, 완충액 A 은 12 mM 아세트산, 10 mM MES, 및 10 mM MOPS 로 이루어진 반면, 완충액 B 는 6 mM MOPS, 6 mM HEPES, 10 mM TAPS, 및 9 mM CHES 로 이루어진다. 완충액 A 및 B 는 각각 NaOH 에 의해 pH 5 및 9.5 로 조정된다.
(B) 상승 pH 및 하강 염 구배의 반대 pH-염 하이브리드 구배에 있어서, (A) 에서와 동일한 완충 성분이 사용되지만 특정 양의 염화나트륨 (50 mM 또는 100 mM) 이 완충액 A 에 첨가되는 반면 완충액 B 에는 아무것도 첨가되지 않는다. 두 완충액은 모두 NaOH 에 의해 각각 pH 5 및 9.5 로 조정된다.
구배 기울기: 60 CV (1 mL/CV)
유량: 1 mL/min (= 119 cm/h)
단백질 로드: 1 mg/mL
CIP: 0.5 M NaOH (3 - 5 CV)
하기와 같이 분석을 수행한다:
장치:
Figure pct00020
KTAmicro
SE-HPLC 를 Superdex™ 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare, 칼럼 치수 10 i.d. x 300 mm, 평균 입자 크기 8.6 ㎛ 를 사용하여 수행한다. 사용된 완충액은 50 mM NaH2PO4 및 300 mM NaCl, pH 7 로 이루어진다. 0.5 mL/min 의 유량으로 등용매 용출을 사용한다. 주입 부피는 40 ㎕ 내지 100 ㎕ 에서 가변적이다.
결과:
MMC 를 사용하여 2/3 단편, Fc 및 Fab 와 같은 기타 가용성 크기 변이체로부터 천연 mAb 를 분리하기 위한, pH 구배에 대한 본 발명의 이점을 나타내는 하기 데이터가 수집된다.
도면 12: (도. 12) 왼쪽 칼럼은 Capto® MMC 에서의 선형 pH 구배 용출 pH 5 - 9.5, 0 M NaCl 및 반대 pH-염 하이브리드 구배 pH 5 - 9.5, 0.05 - 0 M NaCl 각각의 분취 크로마토그래피 실행을 나타낸다. 파선- 전도도 (cond.), 점선- pH. 오른쪽 칼럼은 왼쪽의 각각의 분취 크로마토그래피 실행으로부터 풀링된 개개의 피크의 SE-HPLC 분석을 나타낸다. MAb- 천연 단량체성 mAb B, 2/3 Fg.- 2/3 단편, Fc- 결정성 단편, Fab- 항원-결합 단편.
도면 12 에 있어서, 선형 pH 구배는 4 개의 피크 (피크 1 - 4) 를 유도하고, 이때 단백질은 SE-HPLC 에서 검출된 반면, 반대 pH-염 하이브리드 구배는 단백질과 3 개의 피크 (피크 2 - 4) 를 유도하였다. 그러나, 선형 pH 구배에 비해 반대 pH-염 하이브리드 구배를 사용하는 경우, 생성물 피크 (피크 4) 는 다른 피크 (즉, 불순물) 로부터 보다 양호하게 분해된다. 이는 CEX 에서 이소단백질의 분리로부터의 결과와 일치하고 (도면 9 참조), 이는 또한 불순물로부터 생성물 분리를 위한 단계 용출을 진전시키기 위한 최적화 윈도우가 전형적인 선형 pH 구배 접근법에 비해 반대 pH-염 하이브리드 구배 시스템을 사용하는 경우 보다 넓다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명이 IEC 뿐 아니라 MMC 에서도 이소단백질 분리에 적합하다는 것이 나타난다.

Claims (16)

  1. 하기 단계에 의한, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법:
    a) 적어도 2 개의 상이한 단백질을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
    b) 상기 혼합물을 총 단백질 로드 ≥5 mg/ml, 특히 ≥30 mg/ml, 특히 ≥60 mg/ml 로, 이온 교환 물질에 적용하는 단계,
    c) pH 및 전도도의 동시 변화를 특징으로 하는 용출에 의해 단백질을 분리하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 단계에 의한, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법:
    a) 적어도 2 개의 상이한 단백질을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
    b) 상기 혼합물을 이온 교환 물질에 적용하는 단계,
    c) 단백질을 분리하기 위해 상승 pH 및 하강 염 농도에 의해 반대 pH-염 구배를 실행하는 단계, 또는 그 반대로
    하강 pH 및 상승 염 농도를 실행하는 단계
    및 선택적으로
    d) 단백질 분리를 위한 단계 용출 프로파일을 정의 및 실행하기 위해 c) 로부터의 분리 데이터를 이용하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 단계에 의한, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법:
    a) 적어도 2 개의 상이한 단백질을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
    b) 상기 혼합물을 이온 교환 물질에 적용하는 단계,
    c) 단백질을 분리하기 위해 상승 pH 및 하강 염 농도에 의해 반대 pH-염 구배를 실행하는 단계, 또는 그 반대로
    하강 pH 및 상승 염 농도를 실행하는 단계
    및
    d) 단백질을 구배 용출에서 분리하는 단계.
  4. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항 중 한 항에 있어서, 총 단백질 로드가 ≥5 mg/ml, 특히 ≥30 mg/ml, 특히 ≥60 mg/ml 인, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 하나 이상에 있어서, 단백질의 혼합물이 이온 교환 물질에 흡착되거나 이에 결합되고 그로부터 용출되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 하나 이상에 있어서, 단백질의 혼합물이 음이온 또는 양이온 교환 물질에 흡착되고 그로부터 용출되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  7. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 단백질의 혼합물이 혼합 방식 크로마토그래피 물질에 흡착되거나 이에 결합되고 그로부터 용출되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  8. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, pH 가 4.5 내지 10.5 의 범위에서 변화하고 염 농도가 0 - 1M 염의 범위에서 변화하는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  9. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, pH 구배가 pH 5 및 9.5 로 조정된 완충 시스템을 적용함으로써 유도되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 하나 이상에 있어서, 염 구배가 0 내지 0.25 M 의 농도 범위에서 유도되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 하나 이상에 있어서, pH 구배가 적어도 2 개의 완충액의 완충 시스템을 적용함으로써 유도되고,
    이에 의해 단백질의 흡착 또는 결합이 하나의 완충액의 존재 하에 일어나고, 용출이 증가하는 농도의 다른 완충액의 존재 하에 일어나면서, pH 값은 상승하고 동시에 염 농도는 하강하는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 하나 이상에 있어서, pH 구배가 적어도 2 개의 완충액의 완충 시스템을 적용함으로써 유도되고,
    이에 의해 단백질의 흡착 또는 결합이 하나의 완충액의 존재 하에 일어나고, 용출이 증가하는 농도의 다른 완충액의 존재 하에 일어나면서, pH 값은 하강하고 동시에 염 농도는 상승하는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 하나 이상에 있어서, pH 구배가 MES, MOPS, CHAPS 등을 사용하는 완충 시스템 및 염화나트륨을 사용하는 전도도 변화 시스템에 의해 유도되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 하나 이상에 있어서, 단백질의 혼합물이 양이온 교환 물질에 흡착되거나 이에 결합되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 하나 이상에 있어서, 단백질의 혼합물이 음이온 또는 혼합 방식 크로마토그래피 물질에 흡착되거나 이에 결합되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 하나 이상에 있어서, 단백질, 특히 모노클로날 항체 (mAB) 가 그것의 관련된 전하 변이체, 당화 변이체, 및/또는 가용성 크기 변이체, 이량체 및 응집체, 모노머, 2/3 단편, ¾ 단편, 일반적으로의 단편, 항원 결합 단편 (Fab) 및 결정화가능 단편 (Fc) 으로부터 분리 및 정제되는, 단백질의 혼합물로부터의 단백질의 분리 및 정제 방법.
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