KR20180061446A - 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 및 그 응용 - Google Patents

세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 및 그 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 워터-자켓 배양 챔버; 질량 유량 조절계(mass flow controller);주 조절계 (main controller)1 및 2; 모니터링 시스템; 및 배지 공급 시스템을 포함하고, 상기 워터-자켓의 배양 챔버는 가스 센서를 포함하고, 상기 질량 유량 조절계로부터 가스를 공급받고, 상기 배지 공급 시스템은 연동 펌프 및 압력 센서를 포함하여, 연동 펌프를 통하여 상기 배양 챔버에서 사용된 배지를 배양 챔버로부터 배지 공급 시스템으로 배출하며, 배출된 양과 동량의 배지를 연동 펌프를 통하여 배양 챔버에 공급하며, 상기 모니터링 시스템은 상기 질량 유량 조절계 및 상기 배양 챔버에 부착된 가스 센서로부터 오는 가스에 대한 신호는 주 조절계 2를 통하여 모니터링하고 배지 공급 시스템 부착된 온도, 습도, pH, O2 농도 및 용존산소량 센서에서 오는 신호는 주 조절계 1을 통하여 모니터링하며, 배양 챔버의 조건이 줄기세포의 연속 배양 조건을 충족하게 주 조절계를 통하여 배지 및 가스에 공급이나 배출을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 및 그 응용{An automated bioreactor system for precise control of cell proliferation and differentiation and a use of the same}
본 발명은 정확한 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템 및 그 응용에 관한 것으로 더욱 상세하게는 줄기 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템 및 그 응용에 관한 것이다.
줄기세포는 그들의 높은 증식 및 다분화성으로 인하여 세포 치료 및 조직 공학에서 유망한 소스로서 간주된다. 그러나 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 임상적 사용에서 현재 한계점은 대량 생산, 높은 제조비 및 오염을 포함한다.이러한 문제점을 해결하기 위하여 줄기세포는 pH, 용존산소(DO), 및 CO2 농도의 변화에 의하여 영향을 받기 때문에 환경적으로 정확한 조절이 필요하다.
대량 생산 및 줄기세포 조절을 위하여 바이오리액터 시스템은 환경적 및 생화학적 신호를 조절할 뿐만 아니라 전단응력 및 저산소증(hypoxia)과 같은 생체역학적(biomechanical) 신호를 유도한다.
바이오리액터는 O2 농도를 용이하게 조절할 수 있기 때문에 산소 분압과 관련된 환경적 조건, 예를 들어 저산소, 중간산소 및 과산소 조건을 유도할 수 있다. 또한 바이오리액터는 환경적 및 생화학적 신호를 조절할 뿐만 아니라, 전단응력 및 저산소증과 같은 생체역학적 신호를 유도한다. 따라서 바이오리액터는 동시에 그러한 신호를 조절하여야 하고, 측정 및 조절 장치가 부착되고, 정확하게 여러 신호들이 조절되는 통합형 바이오리액터 시스템(integrated bioreactor 시스템;IBS)이 필요하다.
[선행 특허 문헌]
대한민국특허공개번호 10-2012-0139399
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 환경적 및 생화학적 신호를 조절하고, 측정 및 조절 장치가 부착되고, 정확하게 여러 신호들이 조절되는 통합형 바이오리액터 시스템(integrated bioreactor 시스템;IBS)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정확한 줄기 세포 증식 및 분화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 워터-자켓 배양 챔버; 질량 유량 조절계(mass flow controller);주 조절계 (main controller)1 및 2; 모니터링 시스템; 및 배지 공급 시스템을 포함하고,상기 워터-자켓의 배양 챔버는 가스 센서를 포함하고, 상기 질량 유량 조절계로부터 가스를 공급받고, 상기 배지 공급 시스템은 연동 펌프 및 압력 센서를 포함하여, 연동 펌프를 통하여 상기 배양 챔버에서 사용된 배지를 배양 챔버로부터 배지 공급 시스템으로 배출하며, 배출된 양과 동량의 배지를 연동 펌프를 통하여 배양 챔버에 공급하며, 상기 모니터링 시스템은 상기 질량 유량 조절계 및 상기 배양 챔버에 부착된 가스 센서로부터 오는 가스에 대한 신호는 주 조절계 2를 통하여 모니터링하고 배지 공급 시스템 부착된 온도, 습도, pH, O2 농도 및 용존산소량 센서에서 오는 신호는 주 조절계 1을 통하여 모니터링하며, 배양 챔버의 조건이 세포의 연속 배양 조건을 충족하게 주 조절계를 통하여 배지 및 가스에 공급이나 배출을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 세포는 줄기 세포인 것이 바람직하고, 상기 워터-자켓 배양 챔버는 외부에 물이 순환하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서 상기 바이오리액터 시스템은 연속으로 배양시 PH, 및 용존산소 값이 내려갈 경우 배지 공급 시스템의 연동 펌프가 작동하여 사용한 배지를 배양 챔버로부터 배지 공급시스템으로 버리고, 버린 배지의 양을 주 조절계에서 계산하여 빠져나간 양만큼 신선한 배지를 배지 공급 시스템의 연동펌프를 작동하여 배양 챔버로 채우는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예 있어서 상기 바이오리액터 시스템의 주조절계 2는 질량 유량 조절계(Mass Flow Controller) 4개 (CO2,O2, 공기, N2)가 가스 조절 역할을 하여 저산소조건을 제어하는 것이 바람직하고,
상기 바이오리액터 시스템의 주조절계 2는 가스를 계속 배양 챔버 내로 넣게 되면 압력이 과도하게 상승하기 때문에 압력센서를 질량 유량 조절계로 연결하여 밸브를 작동하여 압력을 빼주는 역할을 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 　
또 본 발명은 상기 본 발명의 바이오리액터 시스템의 배양 챔버에 줄기세포를 배양하고 상기 배양 챔버에 전단 응력을 가하여 상기 줄기세포의 성장을 증가시키는 방법을 제공한다. 　
본 발명의 일 구현예항에 있어서, 상기 전단 응력은 1.018x10-6 Pa인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 바이오리액터 시스템의 배양 챔버에 줄기세포를 배양하고 상기 배양 챔버에 전단 응력을 가하여 상기 줄기세포의 골형성 분화를 증가시키는 방법을 제공한다. 　
본 발명의 일 구현예항에 있어서, 상기 전단 응력은 1.018x10-6 Pa인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 바이오리액터 시스템의 배양 챔버에 줄기세포를 배양하고 상기 배양 챔버에 저산소 조건을 유지하여 상기 줄기세포의 연골형성 분화를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 저산소 조건은 8% 산소 농도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 줄기세포의 운명을 정확하게 조절하는 통합 바이오리액터 시스템(integrated bioreactor 시스템, 이하 'IBS'라 함)을 개발하고 그것을 인간 중간엽 줄기 세포(hMSCs)의 증식과 분화에 적용하였다. 본 시스템은 주로 6 시스템으로 구성되었다:모니터링 시스템, 주 조절 시스템, 배지 공급 시스템, 몇 peristaltic pump, 질량 유량 조절게(mass flow controller), 및 세포 배양 시스템. 그것의 정확한 환경적 조절을 평가하고 시스템에 의하여 유도된 전단응력이 hABMSCs' 증식 및 골형성 분화를 촉진하였다. 또 IBS에 의하여 유도된 저산소증은 연골분화를 증가시켰다. 이 시스템은 대량 생산, 골형성 분화 및 연골 분화와 같은 다목적에 사용될 수 있고, 우수한 배양 시스템일 것이다.
본 발명은 줄기세포를 배양하기 위해서는 최적화된 줄기세포의 배양배지를 통해 배양하지만, 고가이므로 한번 쓰고 버리는 컨셉이 아니라 두번, 세번 연속으로 배지를 쓸 수 있도록 하는 발명이다.
즉 이에 대한 데이터는 정밀제어 데이터 중 PH, DO 값이 반증하고 있다.
연속으로 배양시 PH, DO 값이 유지하고 있지만, 두 값이 내려갈 경우 펌프 4번째가 ON하여 사용한 배지를 버리게 된다. 그러면, 버린 배지의 양을 제어부에서 계산 (로드셀) 하여 빠져나간 양만큼 펌프 1번이 ON하여 중앙 VESSEL부로 채워지는 통합 시스템이다.
다시 말하여, 세포배양을 위한 배지를 삽입하면, 펌프 4개가 각자의 역할을 함으로써 폐배지는 버리고 (펌프 4번이 역할), 버린 양만큼 새 배지로 채워지는 (펌프 1번이 역할)　시스템이다. 이에 대한 레퍼런스는 결국 중앙베슬에 있는 센서 PH, DO 이온센서가 역할을 하게 된다.
그리고, 가스제어부는 MFC (Mass Flow Controller) 4개 (CO2,O2, AIR, N2)가 가스 조절 역할을 하여 HYPOXIA 컨디션을 제어한다. 또한, 가스를 계속 챔버 내로 넣게 되면 압이 차기 때문에 압력센서를 MFC로 연결하여 밸브를 ON하여 VENT하여 (데이터가 그래프에 있음) 압을 빼주는 역할도 수행한다.　
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
바이오리액터 구성 및 평가
도 1은 본 발명에서 개발된 IBS의 구성을 나타낸다. 그것은 주로 5 시스템으로 ㄱ구성된다: 모니터링 시스템, 주요 조절 시스템, 배지 공급 시스템, 질량 유량 조절계, 및 세포 배양 시스템. 결국, 세포 배양 시스템은 처리된 배지 및 가스를 받아서 그것들을 배양하는 세포들에 공급한다. 그들의 대표적인 이미지를 도 2에 나타내었다. 모니터링 시스템은 환경적 변화 예를 들어 온도, 습도, pH, O2 농도 및 DO를 체크하고 감독한다. 주요 조절 시스템은 환경적 평형을 유지하기 위하여 모니터링 시스템 및 다른 센서들 사이의 신호를 중재한다. 배지 공급 시스템은 배지 상태를 측정하여 사용된 배지를 배출하고 신선한 배지를 보충하여 신선도를 조절한다. 본 시스템은 또 혼합된 배지를 그 세포 배양 시스템에 전달한다. 몇 연동 펌프(peristaltic pumps)들은 배지의 운반에서 중요한 역할을 가진다. 질량 유량 조절계는 그 배양 시스템으로 가스의 삽입 및 CO2, O2, N2, 및 공기의 농도를 독립적으로 조절한다. 그들은 결합되어 있고 본 발명에서 사용되었다.
IBS의 확인
세포 배양 시스템 중에서, WJCC를 특별하게 CAD로 고안하였다(도 3A 및 B). 온도를 안정적으로 유지하기 위하여 배양 챔버를 워터 자켓으로 둘려 쌓게 고안하였다. 다음 본 발명자들은 배지 액체에 의하여 유도되는 전단 응력을 측정하기 위하여, CFD 시물레이션에 의한 배지 액체를 시물레이션하였다(도 3C). 세 배지 유량 강도, 0.035 mL/min, 0.21 mL/min, 및 0.35 mL/min를 시물레이션하였다. 결론적으로 속도의 등고선(Contour)을 계산하고, 세포에 가해진 평균 유체 전단응력은 각각 1.018x10-6, 6.108x10-6, 및 1.018x10-5 Pa로 평가되었다(도 3C). 세포 배양 동안, 환경적 신호의 조절자로서 개발된 IBS의 효과를 평가하였다. WJCC의 측정된 파라미터의 실시간 변화를 5일간 모니터하였다(도 5). 챔버의 온도 및 습도를 각각 37±0.5 및 90±2%로 유지되었고, O2 및 CO2 농도는 각각 20±0.5% 및 5±0.1%로 유지하였다. 질량 유량 조절 시스템은 안정된 생화학적 환경을 가지고 수행되었다. 배지의 pH는 7.0에서 7.3으로 유지하고 DO는 8.0%를 유지하였다.
세포 성장 및 골형성 분화에 대한 전단응력의 효과
바이오리액터 퍼포먼스의 평가 후, 본 시스템을 인 비트로 연구에 사용하였다. hABMSCs의 증식 및 골형성분화에 대한 IBS에 의하여 유도된 유체 전단 응력의 효과를 평가하였다(도 6A). 실험 동안, hABMSCs를 1.018x10-6, 6.108x10-6, 및 1.018x10-5 Pa를 가지는 유체 전단응력에 노출하였다. 증식 연구에서, 1.018x10-6 Pa의 낮은 전단응력은 광학 현미경과 WST-1 어세이에 의하여 결정된 것과 같이 세포 증식을 유도하였다(도 6B 및 C). 1.018x10-6 Pa 군의 세포 생존률은 대조군과 비교하여 20% 증가한 반면( * p < 0.05), 그 세포들은 더 높은 전단응력 1.018x10-5 (p > 0.05)에서는 부정적인 효과를 나타내었다. 낮은 전단응력에 의하여 수행된 hABMSCs의 줄기세포성(stemness)을 면역조적화학으로 체크하였고, MSC 마커인 CD146 및 Stro-1의 우수한 발현을 야기하였다(도 6D). 또한 본 발명자들은 이동 어세이를 조사하였다(도 7). 결론적으로 모든 실험군은 증가된 이동능력을 나타내었다. 다음 전단응력으로 골형성 분화를 분석하였다. ALP 활성의 경우, 모든 실험군은 현저하게 높은 값을 나타내었다(도 8A). 14일간 배양된 hABMSCs의 대표적인 광학 현미경 이미지들(세포 핵, 액틴 필라멘트, OCN, 및 형광 염색의 통합 이미지)을 골형성 분화 배지의 첨가 후에 얻었다. 그 이미지들은 대조군과 비교하여 유체 유량 노출군에서 더 라이닝 업(lining-up)과 더 강한 OCN 발현을 나타내었다. 또 alizarin red S 후 대표적인 광학 현미경 이미지(도 8C)를 얻었다. 그들은 골 석회화(화살표)를 유체 전단응력 1.018x10-6 (p = 0.00081) 및 6.018x10-6 (p = 0.00312) Pa에서 현저하게 개선된 것을 나타내었다. 이 그룹들은 탈염 처리 후에 현저한 차이를 나타내었다(도 8D). 따라서, 낮은 전단 응력은 hMSCs의 증가된 세포 성장, 골형성 분화를 야기하였다.
저산소증 연구
본 발명의 바이오리액터의 장점은 질소, 산소, CO2, 등 가스의 농도를 조절하는 것이다. 일반적으로 줄기세포 조절에서 산소 농도가 매우 중요하므로, 저산소, 일반산소 및 과산소증을 유발하는 8%에서 40%까지의 산소 농도를 조절하고 그것을 줄기 세포 조절에 대한 산소 농도의 효과를 평가하기 위해 hABMSCs에 적용하였다. 먼저 저산소증으로 8%, 대조군으로 20% 그리고 과산소 조건을 위하여 30% 및 40% 산소 농도의 효과를 hABMSCs' 생존률에 대해 평가하였다(도 9A). 광학 현미경에서 증가된 세포 증식이 8% 군에서 관찰되었으나, 30% 및 40% 군에서는 감소된 세포 생존률을 나타내었다. 세포 대사 어세이에서, 8% 군은 현저하게 더 높은 세포 대사 활성을 나타내지만 30 및 40% 군들은 현저한 결과가 없었다(도 9B). 게다가, 저산소 조건의 효과는 hABMSCs의 연골 분화에 적용되었다. hABMSCs는 2주간 일반산소 조건 및 저산소 조건하에서 연골형성 배지에서 배양하였고, 골형성 분화와 관련된 배양된 줄기 세포들의 유전자 발현을 평가하였다. 결론적으로, 연골형성 분화와 관련된 모든 유전자들 예를 들어 aggrecan, COL1A2, COMP, TGFβR1, BNIP3, 및 Glut1이 현저하게 증가된 발현을 나타내었다.
본 발명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 IBS는 hABMSCs' 복합분화능력을 유지할 뿐만 아니라 골형성으로 그들을 성공적으로 분화시켰고, 또한 O2 분압의 조절에 의한 저산소증을 본 시스템에 의하여 성공적으로 유도하였고, 더 우수한 증식 및 연골분화를 야기하였다, 이러한 결과에 기초하여 본 시스템은 보건의료 산업에 우수한 장치가 될 것이다.
도 1은 본 발명의 바이오리액터 시스템의 블록도. 본 시스템은 5개의 서브시스템으로 구성: 세포 배양 시스템, 질량 유량 조절계, 배지 공급 시스템, 주 조절계, 및 모니터링 시스템. 세포 배양 시스템에서, 워터 자켓 배양 챔버(water-jacketed culture chamber)를 규칙적인 온도를 조절하기 위해 개발. 질량 유량 조절계는 공기, CO2, O2, 및 N2 가스를 혼합하여 배양 챔버에 공급. 배양 공급 시스템은 여러 센서 및 연동 펌프로 구성되어 배지 조건을 검출하고 그 배지를 세포 배양 시스템에 공급. 주 조절계는 장치 및 모니터링 시스템 사이에 신호를 매개하고, 모니터링 시스템은 센서로부터 데이터를 받아서 전체 시스템을 조절한다.
도 2는 자동화된 본 발명의 바이오리액터 시스템의 주된 구성요소: 세포 배양 시스템, 배지 공급 시스템, 질량 유량 조절계, 주 조절계, 및 모니터링 시스템.
도 3은 워터 자켓 배양 챔버(Water-jacked culture chamber;WJCC). (A) WJCC의 디자인. 안정된 온도를 유지하기 위하여 배양 챔버를 워터 자켓으로 둘러쌈. 또 세포 조건을 체크하기 위하여 투명하게 고안. (B)WJCC의 렌더링 이미지. (C) 유체 동력 시뮬레이션 결과. 배지의 동적 흐름을 시뮬레이션하고 작도함. 세 케이스, 0.035, 0.21, 0.35 mL min-1 이 적용하고 세포에 유도된 평균 유체 전단 응력은 각각 1.018E-06, 6.018E-05, 및 1.018E-05 Pa임.
도 4는 IBS의 어셈블리. IBS를 어셈블리하여 본 발명에 사용함.
도 5는 본 발명의 통합 바이오리액터 시스템의 모니터링. (A) 본 시스템에 사용된 소프트웨어. 소프트웨어는 Boland C++ Ver. 5.0®사용하여 만듬, (B) 모니터링의 결과. 온도, 상대습도, O2 농도, CO2 농도, pH, 및 DO와 같은 여러 환경 인자를 5일간 안정적으로 유지하여 IBS를 확인.
도 6은 IBS의 인 비트로 연구. (A) 연구의 타임라인. hABMSCs를 TCPS 상에 시딩하고, WJCC으로 세팅. 다음, 3일간 증식배지로 배양한 후 배양 배지를 골형성 배지로 교체하고, 2주간 배양. (B)광학 현미경 결과. hABMSCs는 모든 실험 조건에서 잘 성장. 특히, 1.018E-06 Pa 군 상에서 더 높은 생존률을 나타냄. Bars = 500 um. (C) WST 결과. 3 일에, WST를 조사. 1.018E-06 Pa 군이 현저하게 증가된 결과를 나타냄. 에러 바는 표준편차를 의미. (D) ICC 결과. 본 시스템에서 성장한 hABMSCs는 MSC 마커인 CD146 및 Stro-1를 잘 발현. 바 = 50 um.
도 7은 이동 어세이. 이동 연구는 72시간 동안 조사. 결론적으로 모든 실험군이 증가된 이동 능력을 나타냄. Bars = 500 um.
도 8은 골형성 분화 연구. (A) ALP 활성 결과. 1 주에, ALP 발현을 평가. 결론적으로, 1.018E-06 Pa 및 6.108E-06 Pa 군들은 현저하게 증가된 ALP 활성을 나타냄. 에러 바는 표준편차를 의미. (B) ICC 결과. 모든 실험군들은 대조군과 비교하여 증가된 OCN 발현을 나타냄. Bars = 100 um (C) 대표적인 ARS 결과. 1.018E-06 Pa 및 6.108E-06 Pa 군들의 결과는 더 좋은 것으로 나타냄. (D) ARS의 정량적인 결과. 1.018E-06 Pa 및 6.108E-06 Pa 군들이 현저하게 증가된 칼슘 축적을 나타냄. 그들 중, 1.019E-06 군이 가장 높은 칼슘 축적을 나타냄. 에러 바는 표준편차를 의미.
도 9는 저산소 연구. (A) 광학현미경 결과. O2 농도 변화, 8, 30, 및 40%로 인한 여러 환경 조건들이 IBS에 의하여 유도되고, hABMSCs에 적용됨. 결론적으로, 8% 군의 hABMSC가 더 우수한 성장을 나타냄. Bars = 500 um (B) WST 결과. 결과는 광학현미경 결과와 일치. *는 p < 0.05 의미. 에러 바는 표준편차를 의미. (C) RT-PCR 결과. IBS에 의하여 유도된 저산소조건을 연골형성분화에 적용. 결론적으로, 저산소는 연골형성분화와 관련된 유전자인 Aggrecan, COL1A2, COMP, TGFβR1, BNIP3, 및 Glut1를 현저하게 증가시킴. *는 p < 0.05. 에러 바는 표준편차를 의미.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 워터 자켓 배양 챔버 (water-jacketed culture chamber;WJCC )의 고안
WJCC를 컴퓨터 수치 조절(CNC) 밀링 머신(KIT250, Hyundai Machine, Republic of Korea)을 사용하여 제조하였다. WJCC는 이중벽 구조 및 두 분리된 파트로 구성하였다(도 3). 챔버 온도를 온도 조절된 수조(HW101, Hanil Science, Republic of Korea)를 통하여 이동하는 물로 계속적으로 조절하였다. 그것은 온도 조절된 물(청색)로 챔버 벽을 가열하여 안정된 환경을 제공하였다. 배양 챔버의 외부 사이즈(230 x 230 mm)는 역상 현미경으로 용이한 설치를 가능하게 한다.
배지 유량에 의하여 유도된 전단응력을 CFD software® (Fluent v6.3.26, Fluent Inc., Canonsburg, PA, USA)로 시물레이션하였다. No-slip boundary 조건을 ㅁ모nd든 표면과 유체 도메인의 바운더리(Ateshian, Nims, Maas, & Weiss, 2014)에 사용하였다. 배양 배지를 비압축성, 균질, Newtonian 유체(밀도 1007.7 kg m-3 및 속도 0.00124 kg m s- 1)로 모델화하였다 본 연구에서 최대 Reynolds 넘버를 < 10 [최대 값은 2.71(0.35 ml min-1, 최고 유속에서)]로 계산되었다.
실시예 2. 바이오리액터 셋업
이 시스템은 각 메인 시스템 및 구성을 접속할 수 있는 리모트 콘트롤 소프트웨어를 포함한 완전하게 자동화된 세포 배양 플랫폼으로 설계되었다(도 1). 배지 공급 시스템은 배지를 포함하는 저장소의 공급을 조절하기 위하여 고안되었다. 저장소에 pH 센서(InPro 3250, Mettler Toledo, 한국), DO 센서(InPro 6050, Mettler Toledo, Line Tech, 한국), 가스 버블을 위한 스파저(sparger) 및 교반기(AG1, Hanil Science, 한국)를 구비하였다. 본 WJCC는 온도(RTD, TI, Republic of Korea), 습도(HM1500, Humirel, 한국), 및 O2 (SS1118, Senko, 한국)에 대한 센서 및 CO2 (GMT221, GBM, 한국)에 대한 트랜스미터, 및 압력 센서(S-11, Dwyer, Republic of Korea)를 구비하였다. WJCC는 세포 모양을 모니터하기 위하여 역상 현미경을 구비하였다. 주요 조절 시스템은 중앙 조절 유닛으로 작동하는 각 주요 구성요소를 조절하기 위하여 개발하였다. 배양 배지를 0.01에서 34mL/분 범위의 유속을 조절할 수 있는 가변 속도 연동 펌프(Watson Marlow, 한국)에 의한 재순환 과정을 사용하여 WJCC로 펌핑하였다. 전체 튜브 회로는 오토크레이브를 사용하여 살균하였다. WJCC를 가스 출입구 필터(0.2 um 포어 사이즈, PALL)를 통하여 통과하는 순환 가스(95% air, 5% CO2)로 세팅하였다. 질량 유량 조절계는 배양 배지의 pH 변화를 보충하고 O2 또는 CO2 농도를 개별적으로 조절하기 위하여 용존 산소, 이산화탄소, 질소 및 공기에 대한 조절을 제공하였다. 특히, 질량 유량 조절계(KRO4000, Line-Tech, 한국)를 가스의 용적 속도를 정확하게 조절하기 위하여 사용하였다. 본 연구에서, 4 질량 유량 조절계(CO2, O2, air, 및 N2)를 설치하였다. Tygon® R3603 튜브[내경 1 16-1 in (1.59 mm) 및 외경 1 8-1 in (3.20 mm)]를 오토크레이브 가능하고 가스 투과적이어서 사용하였다. 결론적으로, 살아있는 세포 이미지들을 디지털 카메라를 가지는 위상차 현미경(Nikon TS100, Japan)을 사용하여 4일간 30초 간격으로 캡처하였다.
실시예 3. 자동화된 프로세스 조절을 가지는 바이오리액터 시스템
자동화된 프로세스 조절을 가지는 본 시스템의 모니터링 시스템은 통상 소프트웨어 회사(Boland C++ Ver. 5.0®)를 사용하여 수행하였다. 모니터링 프로그램은 프로세스 콘트롤을 가지는 바이오리액터 시스템의 작동의 상태를 신속하게 모니터하기 위하여 개발하였다. 바이오리액터 시스템을 작동하는 초기 단계는 배지를 수동으로 준비하고, 배지 공급 시스템의 일부로 위치한다. 다음, 챔버 뚜껑을 연 후 작동자는 표준 배양 배지에 hMSCs를 주입하였다. 시작 단계를 완성한 후, 사용자들은 모니터링 시스템을 사용하여 프로세스 값을 세팅한다. 이 초기 단계들에서 동안 만 사용자는 세포 배양을 핸들링하여야 한다; 사용자는 역상 현미경을 통하여 세포 상태를 관찰할 수 있다. 실험적 셋업은 2 주 이내에 hMSCs의 골형성 분화를 유도하는 타임라인을 따른다. 자동화된 배양을 수행하기 위한 요건 중 하나가 재순환된 배지를 일단 버리고 연동 펌프를 조절하여 배지를 보충하는 능력이다. 가변 연동 펌프에 의한 유체 흐름은 대조군으로서 정치 배양과 비교하여 0.035 mL min-1, 0.21 mL min-1, 및 0.35 mL min-1 으로 구동되었다. 배지를 부착된 세포를 떨어트리지 않게 하기 위하여 WJCC로 천천히 투입하였다.
실시예 4. 세포 배양
인간 치조골 유래 중간엽 줄기 세포(Human alveolar bone-derived mesenchymal stem cells;hABMSCs)은 서울대 치대 지능형 생체계면공학 연구센터에서 수집하였다. 세포를 10% 우태아 혈청(FBS, Welgene Inc., South Korea), 10 mM ascorbic acid (L-ascorbic acid) 및 항생물질을 포함한 알파-최소 필수배지(MEM)에서 37℃, 5％ CO2 조건 하에서 배양하였다(Steri-Cycle 370 Incubator, Thermo Fisher Scientific, USA). hABMSCs는 24 시간 동안 배양하여 부착을 촉진하였다. 세포가 컨푸루언트되기 전, 그들을 1 ml trypsin-EDTA로 떼어내어, 계수하고 계대하였다. 세포들을 4 계대 동안 사용하였다. 골형성 배지(OM; 100 nM dexamethasone, 50ug mL-1 ascorbic acid, 및 10nM β-glycerophosphate; Sigma) 및 골형성 분화의 유도는 (Jo YY, Lee HJ, Kook SY, Choung HW, Park JY, Chung JH, Choung YH, Kim ES, Yang HC, Choung PH. Tissue Eng. 2007 Apr;13(4):767-73)에 기재된 것과 같이 수행하였다.
실시예 5. 세포 증식, ALP, 및 광물질 함유 결절(mineralized nodule) 형성
hABMSCs의 세포 생존률을 WST-1 어세이(EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, Daeillab Service Co., LTD)로 측정하고 DNA 농도를 제조업자의 가이드라인에 따라 CyQUANT® Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen)를 사용한 형광분석형광법으로 정량화하였다. 세포 층의 ALP 활성을 SensolyteTM ALP Assay 키트(AnaApec, USA)의 지시에 따라 분광학적으로 정량화하였다. 2500 x g에서 10 분간, 4°C에서 원심분리 후, 효소 활성을 405 nm (Victor 3, Perkin Elmer, USA)에서 형성된 황색 p-나이트로페놀 산물을 측정하여 계산하였다. 광물질 함유 결절(칼슘 축적)의 존재를 alizarin red S로 염색하여 결정하였다. 세포를 2회 증류수로 린스하고 공기 건조하였다; 광화 이미지를 광학 현미경을 사용하여 캡쳐하였다.
실시예 6. 공초점 레이져 스캐닝
세포를 인산 버퍼 식염수(PBS, Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)에서 세척하여, 4% paraformaldehyde 용액(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)에서 20분간 고정하고, 0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, WI, Milwaukee, USA)으로 15분간 투과하였다. 세포를 TRITC-conjugated phalloidin, Anti-Vinculin, 2차 항체(Millipore Cat. No. AP124F), 및 4, 6-diamidino-2-phrnykinodole (DAPI; Millipore, Billerica, MA, USA)로 1시간 동안 배양하여 각각 액틴 필라멘트, focal contacts 및 핵을 염색하였다. Cytoskeleton 조직은 액틴 cytoskeleton 및 focal adhesion 염색키트(FAK100; Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 확인하였다. hABMSCs의 주요 중간 필라멘트 단백질은 제조업자의 지시에 따라 anti-osteocalcin 항체(Cat.#PIXP01250, Millipore)를 사용하여 확인하였다. 세포를 PBS로 세척 후 유리 슬라이드 상에서 글리세롤/버퍼에서 마운트하였다. 표지된 세포의 이미지는 공초점 레이져 스캐닝 현미경(Carl Zeiss, LSM710)으로 얻었다.
실시예 7. 저산소 연구
산소 조절 조건은 본 발명의 바이오리액터 시스템으로 만들었다. 네 O2 조건, 예를 들어 저산소용 8%, 대조군으로 일반산소용 20%, 및 과산소용 30% 및 40%을 7일간, hABMSCs에 유도하였다. hMSCs의 세포 생존률을 WST-1 어세이(EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, Daeillab Service Co., LTD)로 측정하였고, DNA 농도를 제조업자 가이드에 따라 형광분석법으로 CyQUANT® Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen)를 사용하여 정량화하였다. 본 발명의 시스템에 의하여 유도된 저산소의 연골형성 활성을 평가하였다. 대조군으로 일반산소 및 저산소는 hABMSCs에 연골형성 배지 (C-28012, PromoCell, Germany) 하에서 유도하였다. RT-PCR를 1 주일 에 수행하였다. 전체 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen, USA)으로 추출하고 제조업자의 지시에 따라 cDNA를 첫-가닥 cDNA synthesis kit (Invitrogen, USA)를 합성하는데 사용하였다. 프라이머 정보는 표 1에 나타내었고, 산물들은 1% agarose gel에서 전기영동으로 분리하고 ultraviolet-유도된 형광으로 확인하였다.
유전자 서열
Aggrecan F: 5'-AGGGCGAGTGGAATGATGTT-3'
R: 5'-GGTGGCTGTGCCCTTTTTAC-3'
COL1A2 F: 5'-TTGCCCAAAGTTGTCCTCTTCT-3'
R: 5'-AGCTTCTGTGGAACCATGGAA-3'
COMP F: 5'-CCGACAGCAACGTGGTCTT-3'
R: 5'-CAGGTTGGCCCAGATGATG-3'
TGFβRI F: 5'-GGCTTTTCTCCACATGCTTAGG-3'
R: 5'-GGCAACAGAGATCACCTGTAGACA-3'
BNIP3 F: 5'-GCTCCTGGGTAGAACTGCAC-3'
R: 5'-ACTCCGTCCAGACTCATGCT-3'
Glut1 F: 5'-CTTCACTGTCGTGTCGCTGT-3'
R: 5'-CCAGGACCCACTTCAAAGAA-3'
표 1은 본 발명에 사용된 프라이머 서열이다.
본 발명의 통계분석은 Windows v9.3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) 용 SAS 통계 분석 시스템을 사용하여 수행하였다. 대조군과 처리군 사이에 통계적 유의성을 *p < 0.05에서 two-way ANOVA 및 Duncan's 다중 범위 테스트로 비교하였다. 데이터를 평균 ± 표준편차로 보고하였다.

Claims (12)

  1. 워터-자켓 배양 챔버; 질량 유량 조절계(mass flow controller);주 조절계 (main controller)1 및 2; 모니터링 시스템; 및 배지 공급 시스템을 포함하고,
    상기 워터-자켓의 배양 챔버는 가스 센서를 포함하고, 상기 질량 유량 조절계로부터 가스를 공급받고, 상기 배지 공급 시스템은 연동 펌프 및 압력 센서를 포함하여, 연동 펌프를 통하여 상기 배양 챔버에서 사용된 배지를 배양 챔버로부터 배지 공급 시스템으로 배출하며, 배출된 양과 동량의 배지를 연동 펌프를 통하여 배양 챔버에 공급하며, 상기 모니터링 시스템은 상기 질량 유량 조절계 및 상기 배양 챔버에 부착된 가스 센서로부터 오는 가스에 대한 신호는 주 조절계 2를 통하여 모니터링하고 배지 공급 시스템 부착된 온도, 습도, pH, O2 농도 및 용존산소량 센서에서 오는 신호는 주 조절계 1을 통하여 모니터링하며, 배양 챔버의 조건이 세포의 연속 배양 조건을 충족하게 주 조절계를 통하여 배지 및 가스에 공급이나 배출을 조절하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템.
  2. 제1항에 있어서 상기 세포는 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템.
  3. 제1항에 있어서 상기 워터-자켓 배양 챔버는 외부에 물이 순환하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템.
  4. 제1항에 있어서 상기 바이오리액터 시스템은 연속으로 배양시 PH, 및 용존산소 값이 내려갈 경우 배지 공급 시스템의 연동 펌프가 작동하여 사용한 배지를 배양 챔버로부터 배지 공급시스템으로 버리고, 버린 배지의 양을 주 조절계에서 계산하여 빠져나간 양만큼 신선한 배지를 배지 공급 시스템의 연동펌프를 작동하여 배양 챔버로 채우는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템.
  5. 제1항에 있어서 상기 바이오리액터 시스템의 주조절계 2는 질량 유량 조절계(Mass Flow Controller) 4개가 가스 조절 역할을 하여 저산소조건을 제어하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템.
  6. 제1항에 있어서 상기 바이오리액터 시스템의 주조절계 2는 가스를 계속 배양 챔버 내로 넣게 되면 압력이 과도하게 상승하기 때문에 압력센서를 질량 유량 조절계로 연결하여 밸브를 작동하여 압력을 빼주는 역할을 하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 및 분화의 정확한 조절을 위한 자동화된 바이오리액터 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이오리액터 시스템의 배양 챔버에 줄기세포를 배양하고 상기 배양 챔버에 전단 응력을 가하여 상기 줄기세포의 성장을 증가시키는 방법. 　
  8. 제7항에 있어서, 상기 전단 응력은 1.018x10-6 Pa인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 성장을 증가시키는 방법. 　
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이오리액터 시스템의 배양 챔버에 줄기세포를 배양하고 상기 배양 챔버에 전단 응력을 가하여 상기 줄기세포의 골형성 분화를 증가시키는 방법. 　
  10. 제9항에 있어서, 상기 전단 응력은 1.018x10-6 Pa인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 골형성 분화를 증가시키는 방법. 　
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이오리액터 시스템의 배양 챔버에 줄기세포를 배양하고 상기 배양 챔버에 저산소 조건을 유지하여 상기 줄기세포의 생존 및 연골형성 분화를 증가시키는 방법. 　
  12. 제9항에 있어서, 상기 저산소 조건은 8% 산소 농도인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 생존 및 연골형성 분화를 증가시키는 방법.





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