KR20180046066A - 미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법 - Google Patents

미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180046066A
KR20180046066A KR1020160140854A KR20160140854A KR20180046066A KR 20180046066 A KR20180046066 A KR 20180046066A KR 1020160140854 A KR1020160140854 A KR 1020160140854A KR 20160140854 A KR20160140854 A KR 20160140854A KR 20180046066 A KR20180046066 A KR 20180046066A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fucoxanthin
microalgae
phaeodactylum tricornutum
tricornatum
hours
Prior art date
Application number
KR1020160140854A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101883733B1 (ko
Inventor
주성수
장수길
Original Assignee
강릉원주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강릉원주대학교산학협력단 filed Critical 강릉원주대학교산학협력단
Priority to KR1020160140854A priority Critical patent/KR101883733B1/ko
Publication of KR20180046066A publication Critical patent/KR20180046066A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101883733B1 publication Critical patent/KR101883733B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 미세조류의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴에 관한 것으로, 보다 상세하게는 푸코잔틴 생산능이 우수한 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 배양약에 투입하여 배양한 후 빠른 시일 내에 대량으로 생산할 수 있는 미세조류의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 푸코잔틴 생산능이 우수한 미세조류를 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있고, 상기의 방법으로 생산한 미세조류로부터 푸코잔틴을 고수율로 분리할 수 있는 장점이 있다.

Description

미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법{Production method of microalgae and separation method of fucoxhantin by the production method}
본 발명은 미세조류의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 푸코잔틴 생산능이 우수한 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum) 을 배양액에 투입하여 배양한 후 빠른 시일 내에 대량으로 생산할 수 있는 미세조류의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법에 관한 것이다.
해양생물은 지구 전체 생물 종의 약 80% 이상을 차지하면서, 약 50만종 이상에 달하는 것으로 알려져 있다. 이러한 해양생물은 종의 다양성과 더불어 진화 과정의 독자성, 해양이라는 특수한 환경에서 생장과 대사 등의 요인에 의해 그 생리 활성과 효능을 나타내는 물질이 특수하기 때문에 새로운 형태의 바이오 신소재 및 유효성분의 발굴에 중요한 자원이다. 아울러 이들의 생합성분해 등에 관여하는 특이 효소와 보조인자들도 존재하고 있어 생리기능성 신물질신소재의 개발 및 이를 이용한 건강기능성 식품, 화장품 및 신약 개발에 대한 연구와 관심이 세계적으로 집중되고 있다. 또한, 세계 인구의 증가로 인한 식량부족, 지구온난화로 인한 해수면의 상승으로 육지 경작면적의 감소, 삼면이 바다인 대한민국의 해양환경 등의 요인으로 인하여 해양 바이오 산업은 미래지향적인 첨단산업으로써의 발전 가능성이 높아 관련기술의 선점이 요구되고 있다. 해양 바이오자원 중 푸코잔틴(fucoxanthin)은 인체 건강에 유익하다는 연구 결과가 보고되고 있고, 해외에서 판매중인 푸코잔틴은 대부분 미역이나 다시마에서 성분을 추출하여 판매하는데 성분 함량도 낮고, 또한 대형 갈조류는 일년에 한번만 채취가 가능하나 미세조류는 연중생산이 가능하므로 푸코잔틴 원료 수급면에서 더 경제성이 있다고 할 수 있다.
한국공개특허 제10-2016-0114962호 한국등록특허 제10-1070846호
본 발명의 목적은 (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계; (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; 및 (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계; 를 포함하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적으로는 (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계; (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계; 및 (d) 상기 농축물에 에틸 아세테이트를 넣고 초음파 처리한 뒤, 20 내지 48 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 유래 푸코잔틴(fucoxhanthin) 분리방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계; (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; 및 (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계;를 포함하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법을 제공한다.
한 구체예에서, 단계 (a)의 배양액은 conway 0.3 내지 0.7% (v/v)가 첨가된 해수 10 내지 20L인 것일 수 있다.
한 구체예에서, 단계 (a)의 파에오닥틸룸 트리코르누툼은 배양액 부피에 대해 1: 400 내지 1:600의 비율로 접종되는 것일 수 있다.
한 구체예에서, 단계 (b)의 응집제는 농도 0.01 내지 0.25 g/L인 FeCl2인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계; (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계; 및 (d) 상기 농축물에 에틸 아세테이트를 넣고 초음파 처리한 뒤, 20 내지 48 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 유래 푸코잔틴(fucoxhanthin) 분리방법을 제공한다.
한 구체예에서, 단계 (d)의 초음파 처리는 3 내지 8 분 동안 3회 이상 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 푸코잔틴 생산능이 우수한 미세조류를 배양하여 빠른 시일 내에 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있고, 상기의 방법으로 생산한 미세조류로부터 푸코잔틴을 고수율로 분리할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 조도 및 미세조류 접종 비율에 따른 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)의 증식 경향 비교 그래프이다.
도 2는 미세조류 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 배지의 농도에 따라 증식시킨 증식률 막대그래프이다.
도 3은 미세조류 배지 용량에 따른 증식 수준 비교를 위한 10 L, 20 L 대량 배양 초기 접종 흡광도에 비교하여 11일 동안의 성장량 그래프이다.
도 4는 일차별 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum) 생장 양상 (x200, bar = 200 μm) 비교 사진이다.
(A) 10 L 배양, (B) 20 L 배양.
도 5는 응집제별 농도에 따른 응집률 측정 그래프이다.
(A) FeCl2, (B) MgCl2, (C) FeCl2+MgCl2 (단위 : g/L)
도 6은 응집제 처리 후 1시간 경과 시 농도에 따른 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)의 응집 수준 비교 결과이다.
(A) Ctrl, (B) MgCl2 1 g/L, (C) FeCl2 0.1 g/L, (D) FeCl2 0.25 g/L, (E) FeCl2 0.5 g/L, (F) FeCl2 1 g/L, (G) FeCl2+MgCl2 0.1 g/L, (H) FeCl2+MgCl2 0.25 g/L, (I) FeCl2+MgCl2 0.5 g/L, (J) FeCl2+MgCl2 1 g/L (×200, scale bar=20 μm).
도 7은 응집제 처리 농도에 따른 상층부의 철염 잔존 수준 비교 결과이다. 화살표는 침강되지 않은 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)를 나타낸다. (×400, scale bar=20 μm).
도 8은 응집제 0.1 g/L 이하 농도의 응집 정도 비교 결과이다.
도 9는 대량배양시 동량의 FeCl2 0.1 g/L 응집제를 처리하였을 때 10 L와 20 L의 응집률을 비교한 결과이다.
도 10은 10L 대량 배양 후 0.1 g/L 응집제를 처리하여 시간대별로 관찰한 사진이다.
도 11은 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 유래 푸코잔틴(fucoxanthin) 확보를 위한 분리 대표도이다.
도 12는 에틸 아세테이트 추출 과정을 시간대별 24 시간 (A), 48 시간 (B)로 추출한 후 실리카겔 컬럼(silica gel column)을 통해 확보된 천연색소에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 13은 추출 용매 및 시간별 추출 수율에 대한 결과이다.
도 14는 푸코잔틴에 대한 UV spectra 흡광도 그래프이다.
도 15는 본 발명의 분리 공정에 따른 최종산물에 대한 HPLC 분석 결과 (A) LC-MS을 이용하여 푸코잔틴(fucoxanthin) 예상물질의 성분을 분석한 결과 peak. (B) 58.762 min에서 모든 분자량과 푸코잔틴 예상 분자량 표시.
도 16은 LC-MS을 사용하여 여러 농도의 푸코잔틴(fucoxanthin)표준물질 peak 확인 결과이다.
(A) 250 μg/mL, (B) 125 μg/mL, (C) 62.5 μg/mL, (D) 31.25 μg/mL.
도 17은 푸코잔틴(Fucoxanthin) 표준물질의 검정선(calibration curve)이다.
도 18은 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 추출 분리한 푸코잔틴(fucoxanthin) 3 mg/mL으로 LC-MS을 통해 peak, area를 확인한 결과이다.
도 19는 푸코잔틴 복합체(Fucoxanthin complex)의 GC-MS 분석 결과이다(숫자에 대한 정보는 표 3에 명시하였음).
도 20은 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 유래 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)의 DPPH scavenging assay 결과이다(*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001).
도 21은 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 유래 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)의 단백질 분해 분석(Protein degradation assay) 결과이다.
도 22는 푸코잔틴(Fucoxathin)을 이용한 티로시나아제(tyrosinase) 활성 억제 실험 결과이다.
(A) 멜라닌(melanin) 형성 현미경 사진(x200, bar = 20 μm),
(B) 멜라닌(melanin) 형성 수준 정량적 비교
도 23은 B16F10 melanoma cell에 대한 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex) 처리 후 멜라닌(melanin) 생합성 억제 효능 검증 결과이다.
도 24는 CCD986sk cell에서 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)에 의한 세포 보호 효능 검증결과이다.
본 발명은 (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계; (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; 및 (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계;를 포함하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법을 제공한다.
한 구체예에서, 단계 (a)의 배양액은 conway 0.3 내지 0.7% (v/v)가 첨가된 해수 10 내지 20L인 것일 수 있고, 바람직하게는 conway 0.5% (v/v)가 첨가된 해수 10L인 것이 바람직하다. 상기 배양액은 미세조류의 생육을 증진시키면서 다량생산에 적합한 특징이 있다.
한 구체예에서, 단계 (a)의 파에오닥틸룸 트리코르누툼은 배양액 부피에 대해 1: 400 내지 1:600의 비율로 접종되는 것일 수 있고, 바람직하게는 배양액 부피에 대해 1:500의 비율로 접종되는 것이 바람직하다. 상기 파에오닥틸룸 트리코르누툼이 배양액 부피에 대해 1:400 미만인 경우에는 초기 접종 농도가 적기 때문에 미세조류의 생장이 늦어지는 문제가 있고, 배양액 부피에 대해 1:600을 초과하는 경우에는 접종 농도가 증가하여 미세조류 생장에 미치는 영향이 크지 않은 문제가 있다.
한 구체예에서, 단계 (b)의 응집제는 농도 0.01 내지 0.25 g/L인 FeCl2인 것일 수 있고, 바람직하게는 농도 0.1 g/L가 바람직하다. 상기 응집제의 농도가 0.01 g/L 보다 낮을 경우에는 응집이 잘 되지 않는 문제가 있고, 농도가 0.25 g/L 보다 높을 경우에는 철염이 많이 소비되어 경제적인 비용이 증가하는 문제가 있다.
또한 본 발명은 (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계; (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계; 및 (d) 상기 농축물에 에틸 아세테이트를 넣고 초음파 처리한 뒤, 20 내지 48 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 유래 푸코잔틴(fucoxhanthin) 분리방법을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 (d) 단계에서 초음파 처리는 3 내지 8 분 동안 3회 이상 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 초음파 처리를 5분 동안 3회 수행하는 것이 바람직하다. 초음파 처리를 3분 미만으로 수행할 경우에는 세포벽이 충분히 깨지지 않아 푸코잔틴 분리가 어렵고 수율이 낮은 문제가 있고, 초음파 처리를 8분 이상 수행할 경우에는 고온 등 물리적 환경변화에 따른 구조변화가 유발되는 문제가 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
< 실시예 1> 대상 미세조류
실내 배양 조건에서 최적 배양 속도 및 최대 생물량을 확보하기 위한 미세조류로 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 을 사용하였다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼은 ㈜ 리스토어랩스에서 분양받아 본 발명의 실험에 사용하였다.
<실시예 2> 최적 광조건 도출
상기 실시예 1을 통해 선발된 미세조류 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)는 해양 바이오 소재 개발에 이용할 최종 생물자원 수득을 위해 조절된 광 조건 하에서 배양을 수행하였다. 실내의 제한된 공간이라는 변수를 감안하여 인공적인 광을 조사할 때 상대적으로 낮은 광 수준 (500 lux)에서부터 높은 광 수준 (2000 lux)까지 단계적으로 배양한 후 각기 다른 광 수준(500, 1000, 1500, 2000 lux)으로 배양한 각 미세조류의 증식 정도를 비교하였으며, 미세조류 접종 비율은 배지 총량의 2, 4, 6%로 각각의 배양 초기 흡광도는 각각 약 0.43, 0.49, 0.65 nm 로 설정하였다.
각기 다른 광 조건(조도)으로 배양하고 관찰한 결과, 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)은 1500 lux이상의 광 조건(조도) 하에서 원활한 증식을 보였으며, 2000 lux와 큰 차이를 보이지 않았다. 1500과 2000 lux사이에 큰 차이가 없다면 보다 높은 lux를 이용하여 광을 쪼여줄 필요가 없으므로, 효율성을 고려하였을 때 최적 광 조건(조도)는 1500 lux로 확인하였다. 또한 접종 비율(2%, 4%, 6%)과 무관하게 경시적으로 유사한 증식 수준이 확인되었다(도 1 참조).
< 실시예 3> 선발된 미세조류 최적 배양조건 도출
3-1. 미세조류 배지 농도에 따른 증식 수준 비교
미세조류 증식에 요구되는 것으로 알려진 무기염류 및 비타민류 등의 농도에 따른 미세조류의 증식 속도 변화를 알아보기 위해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 배양에 일반적으로 사용되는 conway 배지를 기준으로 첨가되는 배지 농도에 따른 증식 속도를 확인하였다. 각 실험군에 대한 conway 배지의 조성을 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75% 및 1% (v/v) 비율로 넣은 후 0.22 μm 필터(filter)로 여과된 공기를 주입하였고, 배양 환경의 온도는 20±2℃에서 5일 동안 배양하였다.
각 농도별로 5일 동안 배양한 결과, 2일차까지는 변화가 나타나지 않았으나 3일차부터 가시적인 증식 속도 변화가 관찰되었다. 3일차 배지무첨가군(0%)을 제외한 나머지 실험군은 유사한 증식 속도를 보였으며 4일차에 접어들면서 0.75%, 1%에서 다른 군들과 통계적인 차이는 없으나 높은 증식을 갖는 경향이 관찰되었다. 그러나 5일 배양 후 1%는 오히려 다소 감소하였고 0.5%, 0.75%는 다른 실험 군에 비해 유리한 증식률을 보였으며, 초기 배양시점과 비교하였을 때 0.5%에서 가장 높은 증식률을 보임을 확인하였다. 따라서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)의 대량 배양시 배지의 조성을 0.5% (v/v)로 5일 동안 배양하는 것이 최적 조건임을 확인하였다(도 2 참조).
3-2. 미세조류 배지 용량에 따른 증식 수준 비교
파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)의 최적 성장 조건 구축하고 10 L 이상부터 배양할 시, 단계적 대량배양 조건을 확립하기 위해 미세조류의 성장 속도 및 성장량을 평가하여 최적 생장 효율을 보이는 조건을 도출하고자 하였다. 따라서 최적 배양 스케일(scale)을 도출하기 위해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 10 L와 20 L 규모에서 11일간 동일 환경 조건하에 성장량을 비교한 결과, 6일까지는 10 L와 20 L 비슷한 성장 속도로 증식하는 것을 확인하였으나, 10 L에서는 6일 이후에도 계속 증식을 하는 것이 나타난 반면, 20 L는 점차 감소하는 추세를 보이는 것을 확인하였다(도 3 및 4 참조).
따라서 현재 구축되어 있는 배양 시스템 환경에서는 10 L와 20 L 배양을 했을 때 10 L에서 보다 높은 효율성을 보였으므로 10 L가 가장 적절한 배양 스케일(scale)로 확인하였다.
3-3. 미세조류 응집 수준 비교
미세조류는 종류와 특성이 다양하여 보편화된 수확 방법이 정형화되지 않은 상황이며, 연구에 따라 최적화된 수확 방법을 제시하는데, 안정적이고 최적화된 수확 방법을 구축하고자 본 발명에서는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 을 배양한 후 물리적 및 화학적 응집 방법을 수행하였다.
화학적 응집법은 미세조류의 세포벽이 가지는 정전기적 성질을 이용하여 유기고분자 응집제 또는 무기 응집제와 결합시킨 뒤 밀도와 부피가 증가하여 가라앉은 덩어리를 농축하여 수거하는 방법이다. 주로 사용되는 응집제로는 aluminium sulfate, aluminium potassium sulfate, sodium aluminate, ferrous sulfate, ferric sulfate, ferric chloride, ferrous chloride, magnesium chloride 등으로 주로 알루미늄 또는 철 이온을 함유하는 물질로 이루어져 있다. 본 발명의 목적이 기능성 바이오 원료의 개발이라는 점을 감안할 때 상대적으로 독성이 높은 것으로 알려진 알루미늄이 함유된 물질은 배제하였으며, 철(FeCl2) 및 마그네슘(MgCl2)을 포함하는 물질 중 가장 일반적인 것을 시험에 사용할 응집제로 선정하여 실험하였다.
철(FeCl2)과 (MgCl2)의 유효성을 확인하기 위해 675 nm에서 흡광도 0.06~0.07 수준까지 배양한 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 50 mL conical tube에 50 mL씩 분주한 뒤 응집제의 최종 농도가 0.1, 0.25, 0.5, 1 g/L가 되도록 첨가하였으며, 응집제를 넣은 후 충분히 섞은 뒤 12시간까지 경시적인 변화를 확인하기 위해 수면에서부터 3 cm 지점에서 시료를 채취하여 675 nm에서 흡광도를 측정하였다. 원심분리법은 향후 적용하게 될 경우 제한적인 요소가 있어 자연 침강하여 응집되는 정도를 비교하였다. 한편, 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)의 응집체 형성을 유도하기 위해 FeCl2 처리하게 되면 배양액의 색이 대조군에 비해 상대적으로 진한 노란색을 띄게 되며, 시간이 지남에 따라 점차 투명하게 변하는 것을 확인하였다. 이에 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 배양하지 않은 배양액에 FeCl2를 첨가하여 흡광도를 측정하였고, 배양군에서 측정한 흡광도를 보정하는 기준값으로 설정하였으며, FeCl2에 의한 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 의 응집률을 산출하기 위한 공식은 다음과 같다.
Flocculation efficiency (%) = [1-(A-B)/C] × 100
A: FeCl2 첨가한 배양군의 흡광도,
B: FeCl2 첨가한 해수의 흡광도,
C: FeCl2를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도
FeCl2 첨가 후 모든 농도에서 1시간부터 약 80% 이상의 응집률을 보였으며, 2시간 경과 시 100%에 가까운 응집률을 갖는 것으로 확인되었고, FeCl2과 MgCl2를 동일 농도로 동시에 첨가한 배양군에서도 FeCl2 첨가 배양군과 유사한 경향을 보였다. 그러나 MgCl2 첨가 시에는 고농도에서도 응집이 일어나지 않는 것으로 나타나 이상의 응집 효과는 FeCl2에 의한 것으로 확인하였다(도 5 참조). 응집제 첨가 후 1시간 경과 시 부터 모든 농도에서 유사한 수준의 응집률 보인 결과는 철 이온에 의해 미세조류의 응집체를 효과적으로 형성되어 침강속도가 증가되었기 때문으로 판단되나 응집체의 형성 여부를 가시적으로 확인하기 위해 침강된 미세조류를 동량 채취하여 현미경하에서 관찰하였다. 확인 결과 FeCl2가 농도별로 처리된 모든 실험군에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 응집체가 관찰되었으며, 0.1 g/L의 농도에서는 상대적으로 작은 응집체를 형성하고 있었고, 0.25 g/L 이상의 농도에서는 농도와 무관하게 유사한 수준의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 응집체가 관찰되었다(도 6 참조). 따라서, 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 배양 후 수확을 위해서는 총 배양 용량에 대해 FeCl2을 0.1 g/L 이상의 농도가 되도록 첨가한 후 충분히 교반한 뒤 2시간 이상 자연 침강하는 것이 적합한 것으로 확인하였다.
미세조류가 들어있지 않은 배양액에서도 FeCl2 첨가 후 노란색의 발색이 나타남을 확인하였으나 배양군의 상층액에서 나타나는 발색의 원인이 침강되지 못한 미세조류인지 아니면 첨가한 철 이온의 잔여물인지를 재확인하기 위해 수면으로부터 3 cm 지점에 200 μL를 채취하여 96well plate에 넣은 뒤 현미경하에서 관찰하였다. 시간 대 별로 부유되어 있는 총량을 가시적으로 확인하기 위해 시료 채취 후 6시간 동안 방치하여 채취한 시료에 있는 철염이 모두 침강한 뒤 촬영하였다. 최초 1시간 경과 시 상층액에는 철염과 함께 침강되지 않은 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)가 일부 관찰되었으나(도 7의 흰색 화살표) 2시간 경과 후 상층액에는 대부분 철염만이 존재하는 것을 확인하였으며, 시간이 지남에 따라 상층액의 철염 밀도는 감소하였다(도 7 참조).
FeCl2 첨가 후 1시간 경과 시 상층부에 잔존하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)는 고농도에서 상대적으로 적은 수가 확인되었으나 2시간 경과 시부터 농도별로 큰 차이를 보이지 않을 뿐만 아니라 4시간 이후부터는 거의 동일한 응집 및 침강률을 보이며, 농도별로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 배양 후 수확 시 원가 절감 차원에서 철염의 농도는 가장 낮은 0.1 g/L가 타당할 것으로 판단되며, 낮은 농도의 철염 첨가는 별도의 철염 제거 공정이 불필요하게 되어 보다 효율적이고 경제적인 공정 확립이 가능할 것으로 사료된다.
한편, 0.1 g/L의 농도 이하에서 나타나는 응집 및 침강률을 검토하기 위해 0.1 g/L부터 0.01 g/L까지 연속 희석하여 동일한 조건에서 관찰하였다. 관찰 결과 1시간까지의 초기 침강률 및 경시적 침강 정도 모두 0.1 g/L보다 상대적으로 낮은 효율을 보여 응집제로서의 철염 최종 농도는 0.1 g/L가 가장 적합할 것으로 검증하였다(도 8 참조).
3-4. 미세조류의 대량배양에 대한 침지 농도 최적화
현재 구축되어 있는 제한된 환경 하에서 최적 및 최대 배양 용량을 확인하기 위해 Conway 배지가 0.5% (v/v)로 첨가된 해수 10 L와 20 L에 원종으로부터 배양한 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 배양액의 부피를 기준으로 1:500 비율로 접종하여 생장추이를 관찰하였다. 미세조류의 응집률은 흡광도 675 nm에서 분광학적인 방법으로 측정하며, 응집 전에 미세조류 배양액의 수면으로부터 3 cm 아래에서 상등액을 채취하여 흡광도를 확인하였다. 그 뒤 미세조류 배양액에 응집제의 농도가 0.1 g/L가 되도록 첨가하여 반응시켜 침천 시킨 후 12시간까지 경시적인 변화를 확인하기 위해 응집제 첨가 전과 마찬가지로 수면으로부터 3 cm 아래 상등액을 채취한 후 흡광도를 이용하여 확인하였다.
10 L 용량 배양군에 응집제를 처리한 후 1시간 경과 시 약 70%의 높은 응집률이 있는 반면 20 L에서 46%의 응집률이 확인되었으며, 2시간 경과 시 10 L에서는 80%이상의 응집률을 보인 반면 20 L에서는 50% 수준으로 나타났음. 한편, 10 L 배양군의 경우 4시간이후에 응집률의 증가 폭이 거의 변화가 없는 반면 20 L 배양군은 지속적으로 증가하였으나 10 L 배양군의 2시간째 응집률 보다도 낮은 응집률을 보였다도 9 및 10 참조).
10 L와 20 L의 증식 수준을 비교한 결과, 10 L 용량에서 상대적으로 원활한 생장을 보였을 뿐만 아니라 응집률 역시 높은 효율을 보이는 것으로 확인되어 시간적, 공간적으로 10 L 용량의 배양이 타당할 것으로 판단됨. 또한, 배양 기간은 7일 내지 10일, 응집제 처치 후 침전시간은 4시간으로 설정하는 것이 최적인 것으로 확인하였다.
< 실시예 4> 선발된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리
4-1. 추출 및 분리 공정
상기 실시예 2 및 3에서 규명한 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 대량 생산방법을 이용하여 675 nm에서 흡광도 0.06~0.07 수준까지 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 성장시킨 후 화학적 응집법을 이용하여 FeCl2 0.1 g/L를 처리하여 침전시킨 후 상층액은 모두 버리고 침전물을 50 mL conical tube에 aid를 이용하여 옮겼다. 4000 rpm, 15 min 원심분리한 후 상층액을 제거시켜줌으로써 수분을 최대한 배제한 뒤 동결건조를 실시하여 수분이 완전히 제거된 미세조류를 대상으로 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하였다.
동결건조 된 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum m tricornutum)을 1 g을 정량하여 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1 L에 넣고 교반 한 후 30% AMPL 강도 1회당 5 분씩 총 3회 초음파 처리(sonication)한 후, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출 시간에 따라 푸코잔틴(fucoxanthin) 함량의 차이를 알아보기 위해 24 시간, 48 시간 동안 교반기(stirrer)로 교반하여 실온에서 추출하였다. 24 시간, 48 시간 동안 추출 후 감압 농축기를 이용하여 완전히 농축하였다.
농축된 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 추출물을 실리카겔(silicagel) 충진제와 동일 한 용매로 5 mL 이하로 녹여 loading sample을 준비하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silicagel column chromatography)를 수행하기 위해 약 15 cm의 실리카겔 레이어(silica gel layer)를 충진 후 헥산(Hexane)과 에틸 아세테이트(E.A)의 비율이 1:1인 용매계로 슬러리(slurry)를 만들어 컬럼(column)에 충진시킨 후 loading하였으며, Flash column을 통해 용출된 각각의 획분에 대해 푸코잔틴(fucoxanthin)의 전형적인 색인 주황 및 빨간색 색소를 분리 및 정제하였다(도 11 참조).
파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 분리한 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex) 내 순도를 확인하기 위해 TLC를 이용하여 분석하였다. TLC 전개용매는 헥산(Hexane)과 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 1:1 비율로 섞어주었으며, 분리한 푸코잔틴(fucoxanthin)이 TLC plate에 점적되는 양은 10 μL 정도로 spoting 하였다. 다음으로 시료를 점적한 TLC plate는 전개 용매를 붓고 뚜껑을 닫아 내부가 전개용매로 포화되도록 만든 TLC용 용기 속에 살며시 넣고 약 5분간 전개시켰다. 전개가 끝나면 TLC plate를 드라이어를 이용해 전개용매를 날린 후 분석하였다.
파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 후 실리카겔 컬럼(silica gel column)으로 푸코잔틴(fucoxanthin) 예상 물질 분리한 뒤 TLC를 이용하여 푸코잔틴(fucoxanthin)을 분석한 결과, Rf값이 0.33~0.35로 확인되었으며, 24hr와 48hr 추출물 모두 동일한 위치에서 관찰되었다(도 12 참조). 이상의 시료들을 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석을 통해 푸코잔틴(fucoxanthin) 표준물질과 대비한 결과 표준물질과 동일한 물질임이 검증되었다.
아세톤(Acetone) 추출 공정의 경우 동결건조된 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 1.5 g에서 15 mg을 분리하였으며, 이는 동결건조된 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 건조중량 대비 1%에 해당하는 수율로 확인하였다. 한편, 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 이용한 추출 공정 24 시간에서 확보된 푸코잔틴(fucoxanthin)은 동결건조된 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 1 g에서 20 mg을 분리하여 평균 2%의 수율을 확인하였다. 또한 48 시간으로 추출한 결과와 24 시간 추출한 결과의 수율 차이를 확인한 결과, 유의한 차이가 없는 것으로 확인되어 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 이용하여 24 시간 추출하는 것이 가장 효율적인 것으로 확인하였다(도 13 참조).
4-2. HPLC -MS를 이용한 푸코잔틴의 정성, 정량 분석
실리카겔 컬럼(Silicagel column)을 통해 얻어진 포코잔틴(fucoxanthin)은 에탄올(ethanol)에 5 mg/mL의 농도로 sampling 후 13000 rpm에 1 min 원심분리하여 상층액을 0.22 μm 시린지 필터(syringe filter)를 이용하여 필터링(filtering)하여 HPLC-MS에 분석하였다.
푸코잔틴 복합체(Fucoxanthin complex)의 성분과 함량정도를 알아보기 위하여 LC-MS (HP 1100 series, Agilent, CA, USA)로 분석하였다. 분석 조건은 에탄올(ethanol)을 사용하여 희석하였고 물(water) (A)와 아세토나이트릴(acetonitrile/HPLC grade, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) (B)를 이동상으로 하여 유속은 1.0 mL/min으로 하였으며 흡광도는 450 nm에서 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼(column)으로는 Zorbax SB-Aq C18 column (4.615mm, 5 μm)으로 컬럼(column) 온도를 30.0°C로 설정하여 측정하였고, 시료 10 μL를 주입하였다. 이동상의 조건으로는 아래와 같다(표 1 참조).
푸코잔틴 분석을 위한 LC-MS 분석 조건
Parameters Conditions
LC/MS model HP 1100 series, Agilent,
Column Zorbax SB-Aq C18 column (4.615mm, 5 μm)
Column Temperature 30℃
Flow rate 1 mL/min
Injection 10 μL
A water (in 0.02% TFA)
B Acetonitrile (in 0.02% TFA)
Time (min) A (%) B (%)
Gradient step
 0 0 100
60 100 0
Detector Agilent 1100/1200 Diode Array Detector (450nm)
푸코잔틴(Fucoxanthin)의 UV spectra 흡광도를 확인하고자 푸코잔틴을 파장대별로 측정한 결과, 푸코잔틴을 250~600 nm 파장 범위로 측정하였을 때 450 nm에서 가장 큰 광흡수를 나타내는 것으로 확인하였다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 LC-MS을 통해 표준물질 및 추출시료에 함유된 푸코잔틴 검출을 위한 파장값을 450 nm로 설정하였다(도 14 참조).
분석 결과 58 min에 높은 파장의 peak가 측정되었으며(도 15A 참조), Mass spectrometry로 분석한 결과 푸코잔틴으로 예상되는 분자량이 58.762 min에 확인되었다(도 15B 참조). 단일 peak의 형태를 보일뿐만 아니라 푸코잔틴의 분자량과 동일한 분자량이 확인됨에 따라 개선된 추출방법에 의해 확보된 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex) 내에는 푸코잔틴의 함량 및 순도가 상대적으로 높은 것으로 확인하였다.
분석 결과를 바탕으로 전체 area 값 24351.3 mAU*S에 대해 fucoxanthin에 해당하는 peak의 area 값 22632.3 mAU*S을 백분율로 환산하면 92.24%의 순도를 갖는 것으로 확인하였다.
4-3. 표준물질을 이용한 함량 검증
푸코잔틴 표준물질(sigma-aldrich 16337)을 에탄올에 녹여 푸코잔틴으로서 1 mg/mL이 되도록 만든 후, 최종 농도가 250, 125, 62.5, 31.25 μg/mL가 되도록 희석하여 검량선용 표준물질을 조제하였다.
파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 분리한 푸코잔틴 3 mg을 에탄올에 완전히 녹인 후 0.22 μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과하였으며, 조제한 표준시료 및 시험용액은 호일로 밀봉하여 빛을 차단시켜 4℃에 냉장 보관하였다.
검체 중 일정 농도 범위에 있는 푸코잔틴의 양에 대하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는지를 확인하기 위해 푸코잔틴 표준물질의 직선성을 평가하였다. 표준검량선은 31.25 - 250 μg/mL 농도에서 상관계수가 (R2)가 0.9989로 높은 직선성을 보임을 확인하였다(도 17 참조). 표준시료로부터 구한 푸코잔틴 검량선의 계산식은 y=55.8740x+520.0583 [y=fucoxanthin/내부표준물질 peak 면적의 비율, x=fucoxanthin의 농도(μg/mL)]였고, 위에서 산출된 계산식 범위에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 분리한 푸코잔틴의 농도를 확인하였다. 분석을 위해 하기 표 2와 같이 분석 조건을 조정하여 실시하였다.
푸코잔틴 분석을 위한 LC-MS 분석 조건
Parameters Conditions
LC-MS model HP 1100 series, Agilent,
Column Zorbax SB-Aq C18 column (4.615mm, 5 μm)
Column Temperature 30℃
Flow rate 1 mL/min
Injection 10 μL
Mobile Phaeodactylum tricornutumse
A water (in 0.02% TFA)
B Acetonitrile (in 0.02% TFA)
Time (min) A (%) B (%)
Gradient step 0 100 0
3 70 30
8 40 60
12 10 90
15 0 100
18 20 80
22 100 0
Detector Agilent 1100/1200 Diode Array Detector (450nm)
표준물질을 분석한 결과, retention time 17.59~18.4 min의 범위에서 peak가 확인되었는데 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 유래 푸코잔틴 복합체(fucoxathin complex)의 경우 17.87~17.98 min의 범위에서 peak가 형성되어 있어 추출물 내에 포함되어 있는 물질들은 fucoxathin 또는 fucoxathin 유사 색소체가 대부분인 것으로 확인하였다.
파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 추출 분리한 푸코잔틴 복합체(fucoxathin complex) 3 mg/mL으로 LC-MS을 통해 확인하였을 때 peak의 높이는 2539.7876 mAU이며, area는 22632.3 mAU*S로 나타났다(도 18 참조). 표준물질의 검량선으로부터 산출된 계산식에 대입하면 395.7519의 값을 나오게 되며, 이는 푸코잔틴 3 mg/mL 내에 395.7519 μg/mL의 푸코잔틴이 함유되어 있음을 나타내었다.
따라서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 1 g을 추출하였을 때 평균적으로 20 mg의 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)가 분리되고, 이 중 푸코잔틴은 2638.35 μg으로 2.638 mg/1g의 수율을 가지며, 상기 공정에 따라 확보되는 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)의 표준물질은 푸코잔틴(fucoxanthin)으로 확인하였다.
fucoxanthin 함량에 대한 기존 연구에 따르면 미역의 부위별 fucoxanthin 함량은 미역엽 87.6 mg/100 g, 미역줄기에 62.4 mg/100 g 그리고 미역귀에 127.7 mg/100 g으로 보고된 바 있으며(S. J. Kim. et. al. 2004), Sargassum filipendula에서 추출한 푸코잔틴(fucoxanthin) 함량은 0.1957 ± 0.0173 mg/g (Kartini Zailanie and Sukoso, et. al. 2014)으로 알려져 있어 본 발명에서 확인된 수율은 상대적으로 높은 것으로 확인하였다.
4-4. 푸코잔틴 복합체(Fucoxanthin complex)에 함유된 2차대사산물 확인
실리카겔 컬럼(Silicagel column) 분획을 수행한 후 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)에 함유되어 있는 저분자 2차 대사산물의 종류를 확인함으로써 향후 상승작용을 야기할 물질을 잠정적으로 평가하고자 GC-MS 분석을 수행하였다. GC-MS 분석을 위해 CTC CombiPAL autosampler system (Palo, Alto, CA, USA)이 장착되어 있는 GC-MS (Agilent Technologies 5975C)를 사용하였다. 시료 분석에 사용된 컬럼은 HP-5 column (Agilent Technologies, 250 μm × 0.25 μm × 30 m)으로 에탄올(ethanol)에 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 추출 분리한 푸코잔틴(fucoxanthin)을 10 mg/mL로 녹인 injection 5 μL를 분석하였다. split 비율은 2:1로 하였으며 injector temperature는 250℃이며 GC oven은 50℃에서 5분 정지 후 분당 10℃ 간격으로 310℃까지 측정한 후 5분 정지하였다. 용매 피크를 고려하여 4분 후 부터 데이터를 수집하여 분석하였으며, 성분 분석을 위해 Wiley7N library data를 사용하였다(도 19 참조).
GC-MS 분석 결과 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum)으로부터 추출 분리한 푸코잔틴(fucoxanthin) 내에 가장 높은 area값을 보인 물질은 4-Dehydroxy-N-(4,5-methylenedioxy-2-nitrobenzylidene)tyramine이였으며, 이 외에도 p-Cumylphenol을 비롯하여 BENZENE, 1,4-BIS(TRIMETHYLSILYL), Diisooctyl phthalate 등이 검색되었다(표 3 참조).
푸코잔틴 복합체 내에 함유되어 있는 대표적인 저분자 2차대사산물
Peak RT (min) Library Area % Qual %
1 32.0798 4-Dehydroxy-N-(4,5-methylenedioxy-2-nitrobenzylidene)tyramine 16.789 52
2 22 p-Cumylphenol 13.7589 72
3 31.095 BENZENE, 1,4-BIS(TRIMETHYLSILYL)- 7.9733 46
4 27.9217 Diisooctyl phthalate 4.1052 91
5 30.2003 Cyclononasiloxane, octadecamethyl- 4.095 43
6 27.3296 2-,2-Dibenzylethanol 3.7917 25
7 13.1496 Benzene, 1,2,4,5-tetramethyl- 2.4987 97
8 28.707 4H-Dibenz[de,g]isoquinoline, 5,6,6a,7-tetrahydro-1,2,9,10-tetramethoxy-5-methyl- (CAS) 1.7206 86
9 14.5078 2-Hydroxypyridine 1.6013 30
10 29.7884 Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-hexadecamethyl- 1.4382 80
11 25.714 (E)-2-Methyl-1-(2-methylphenyl)-1-phenyl-1-butene 1.2777 64
12 19.2001 s-Hydrindacene, 1,1,7,7-tetramethyl- 1.0044 58
13 22.4184 Bicyclo[4.3.0]nonan-1-ol, 7,9-bis(methylene)-2,2,6-trimethyl- 0.9808 86
14 23.5384 Benzene, (3-methyl-2-butenyl)- 0.9781 42
15 27.7544 Nitrazepam 0.5323 22
<실시예 5> 미세조류 유래 푸코잔틴의 항산화 효능 평가
5-1. DPPH scavenging assay
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)은 화학적으로 안정화된 수용성 자유 라디칼(free radical)로서 517nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. 이 라디칼(radical) 은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼 (DPPH)이 소멸되어 최초 용액의 보라색빛깔에서 노란색으로 색깔이 변화하여 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 대표적인 항산화 활성 실험법이다. 라디칼은 DPPH 0.3 mM을 함유한 methanol 용액을 제조하여 100 μg/mL 시험물질을 혼합한 후 실온에서 10분간 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 실험물질 간 라디칼 소거능을 비교분석하였다.
푸코잔틴 복합체(Fucoxanthin complex)를 100 μg의 용량부터 serial dilution하여 DPPH 활성산소 소거능을 측정한 결과, 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum) 에탄올(ethanol) 추출물에서는 뚜렷한 효능이 관찰되지 않은 반면 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)에서는 가장 저용량인 1.56 μg에서도 유의한 효과가 나타났으며, 25 μg 이상의 농도에서는 대조군에 대해 아스코르브산(ascorbic acid)와 동등한 수준의 차이를 보이는 것으로 확인하였다(도 20 참조).
5-2. Protein degradation assay
Protein degradation assay는 reactive oxygen species(ROS)에 의한 손상으로부터 단백질이나 효소를 보호하는 항산화 물질의 효과를 금속이온촉매반응을 이용해 확인하는 방법이다. Target protein으로 BSA(bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 사용하였고, Cu2 + (100 μM), H2O2 (2.5 mM)을 첨가하여 시험물질을 함께 혼합 및 반응 후 10% SDS-polyacryamide gel에 전기영동하여 BSA 단백질의 degradation 저해정도를 확인하였다. 양성대조군으로서 항산화 효과가 우수한 ascorbic acid (50μM)를 사용하였다.
과산화수소와 Cu2 +만을 첨가하여 반응시킨 실험군의 경우 BSA가 거의 분해된 것에 반해 에탄올 추출물에서 25 μg 이상의 용량부터 아스코르브산(ascorbic acid)과 동등한 수준의 단백질 보호능이 확인되었으며, 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)는 6.25 μg 이상부터 높은 보호 효능이 검증되었다. 이상의 결과는 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)가 에탄올 추출물에 비해 활성산소에 의한 단백질 분해 저해 효능이 높다는 것을 반증하는 것이며, 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex) 내에 높은 항산화 효능을 보이는 물질들의 상대적인 농도가 높다는 것을 시사하는 결과이다(도 21 참조).
< 실시예 6> 미세조류 유래 푸코잔틴의 미백 효능 평가
6-1. 비세포 티로시네이즈 활성 억제 실험
Disodium hydrogen phosPhaeodactylum tricornutumte 12-water, sodium dihydrogen phosPhaeodactylum tricornutumte dihydrate를 증류수 (D.W)에 녹여 100 mM sodium phosPhaeodactylum tricornutumte buffer (pH 6.5)를 제조하였고, 티로시나아제(tyrosinase)에 대한 반응기질로 사용하기 위하여 L-tyrosine (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 100 mM sodium phosphate buffer에 녹여 1.5 mM L-tyrosine 용액을 제조하였다. 반응 효소로 작용하는 mushroom tyrosinase (Sigma)는 100 mM sodium phosPhaeodactylum tricornutumte buffer에 녹여 2,500 units/mL의 티로시나아제(tyrosinase)를 준비하였다. 200 μL 기준, 100 mM sodium phosPhaeodactylum tricornutumte buffer 153 μL, 1.5 mM L-tyrosine용액 36 μL, sample 5 μL, 티로시나아제(tyrosinase) 6 μL을 혼합한 후, 37℃에서 1hr 반응한 후 현미경으로 측정하였으며, ImageJ software (version1.51 Java, USA)을 이용하여 명도 분석을 실시하였다.
푸코잔틴 복합체(Fucoxanthin complex)를 각각 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg의 용량으로 처리 후 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정한 결과 현미경을 통해 육안으로 확인하였을 때 12.5 μg이상의 용량에서부터 멜라닌(melanin) 형성이 눈에 띄게 억제되는 것을 확인 할 수 있다(도 22A 참조). 현미경 사진 명도를 25 μg 이상의 농도에서 통계적 유의성을 갖으며 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능이 확인되었으며, 100 μg 이상부터 양성대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)와 비슷한 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능이 검증되었다(도 22B 참조). 따라서 이상의 결과는 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)가 티로시나아제(tyrosinase) 활성의 직접적인 저해를 통한 미백 효과를 확인하였다.
6-2. 세포 내 멜라닌 생합성 억제 효과 측정 실험
B16F10 cell을 이용하여 멜라닌 생합성 저해 효과를 측정하기 위하여 세포를 6 well plate에 1x105 cell/well로 seeding하여 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)를 25, 50 μg/mL의 농도로 처리 한 후 멜라닌 합성을 유도시키기 위해 IBMX (200 μM)를 대조군을 제외한 각 well에 처리하여 48시간 동안 배양하였음. 배양 후 1N NaOH 300 μL을 처리하여 1시간 동안 60℃ incubator에서 반응시켜 멜라닌을 완전히 용해시킨 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid (10 mM)을 사용하였다.
실험 결과 IBMX에 의해 유도된 실험군에서 확인되는 멜라닌 축적 정도에 비해 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex) 처치군에서 유의한 저해율을 보였으며, 특히 50 μg/mL 이상의 농도에서 양성대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)과 유사한 수준의 멜라닌 생합성 억제 효능이 확인되었다(도 23 참조).
6-3. 자외선에 의한 피부 세포 보호 효과
UV-B에 의한 세포 손상 및 세포 보호 효과를 검증하기 위해 CCD986sk cell을 4-well chamber slide에 seeding한 후 6.25, 12.5 μg/mL 농도의 푸코잔틴 복합체(fucoxanthin complex)를 6시간 동안 처리한 뒤 15분 동안 20 mJ/cm2의 UV-B를 조사하였다. UV-B가 조사된 각 실험군의 세포 핵을 형광염색 한 후 형광현미경 하에서 핵의 형태변화를 관찰하였다.
관찰 결과, UV-B 처치군은 분명한 핵 응축이 확인된 반면 푸코잔틴 복합체에서는 control과 유사한 형태의 핵의 형태를 유지하고 있어 푸코잔틴 복합체에 의한 자외선 차단 및 세포 보호 효과가 입증되었다(도 24 참조).

Claims (6)

  1. (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계;
    (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계; 및
    (c) 침전된 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계;
    를 포함하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계 (a)의 배양액은 conway 0.3 내지 0.7% (v/v)가 첨가된 해수 10 내지 20L인 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    단계 (a)의 파에오닥틸룸 트리코르누툼은 배양액 부피에 대해 1: 400 내지 1:600의 비율로 접종되는 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    단계 (b)의 응집제는 농도 0.01 내지 0.25 g/L인 FeCl2인 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 대량 생산방법.
  5. (a) 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum) 을 배양액에 접종하고, 18 내지 22 ℃에서 5 내지 10 일 동안 광조건 1000 내지 2000 lux 에서 배양시키는 단계;
    (b) 상기 배양한 배양액에 응집제를 투입하여 2 내지 6 시간동안 침전시키는 단계;
    (c) 침전된 파에오닥틸룸 트리코르누툼을 회수하여 원심분리를 통해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 농축물을 얻는 단계; 및
    (d) 상기 농축물에 에틸 아세테이트를 넣고 초음파 처리한 뒤, 20 내지 48 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 유래 푸코잔틴(fucoxhanthin) 분리방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    단계 (d)의 초음파 처리는 3 내지 8 분 동안 3회 이상 수행하는 것을 특징으로 하는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 유래 푸코잔틴 분리방법.
KR1020160140854A 2016-10-27 2016-10-27 미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법 KR101883733B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160140854A KR101883733B1 (ko) 2016-10-27 2016-10-27 미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160140854A KR101883733B1 (ko) 2016-10-27 2016-10-27 미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180046066A true KR20180046066A (ko) 2018-05-08
KR101883733B1 KR101883733B1 (ko) 2018-08-29

Family

ID=62187566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160140854A KR101883733B1 (ko) 2016-10-27 2016-10-27 미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101883733B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020055082A3 (ko) * 2018-09-11 2020-05-07 한국과학기술연구원 페오닥틸럼 분획물을 대량 생산하는 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240055322A (ko) 2022-10-20 2024-04-29 주식회사 컴아트시스템 Ａｉ 인체 감지기를 활용한 침대 낙상 예방 시스템

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101070846B1 (ko) 2008-09-11 2011-10-06 아미코젠주식회사 갈조류로부터 푸코잔틴 추출물의 제조방법
KR101413874B1 (ko) * 2014-04-04 2014-07-01 주식회사 리스토어랩스 푸코잔틴 생산능이 우수한 미세조류의 대량 생산방법
KR101417718B1 (ko) * 2014-04-04 2014-07-09 주식회사 리스토어랩스 미세조류 유래 푸코잔틴의 정제방법 및 동 방법에 의해 정제된 푸코잔틴
KR20160114962A (ko) 2015-03-25 2016-10-06 한국수산자원관리공단 초임계 이산화탄소와 보조용매 및 혼합용매를 사용하여 갈조류로부터 생리활성물질을 회수하는 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101070846B1 (ko) 2008-09-11 2011-10-06 아미코젠주식회사 갈조류로부터 푸코잔틴 추출물의 제조방법
KR101413874B1 (ko) * 2014-04-04 2014-07-01 주식회사 리스토어랩스 푸코잔틴 생산능이 우수한 미세조류의 대량 생산방법
KR101417718B1 (ko) * 2014-04-04 2014-07-09 주식회사 리스토어랩스 미세조류 유래 푸코잔틴의 정제방법 및 동 방법에 의해 정제된 푸코잔틴
KR20160114962A (ko) 2015-03-25 2016-10-06 한국수산자원관리공단 초임계 이산화탄소와 보조용매 및 혼합용매를 사용하여 갈조류로부터 생리활성물질을 회수하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapp. et Proc.-Verb. Cons. Int. Explor. Mer., vol.171, p.84-90 (1977)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020055082A3 (ko) * 2018-09-11 2020-05-07 한국과학기술연구원 페오닥틸럼 분획물을 대량 생산하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101883733B1 (ko) 2018-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sun et al. Production of natural melanin by Auricularia auricula and study on its molecular structure
Madkour et al. Hepatoprotective and antioxidant activity of Dunaliella salina in paracetamol-induced acute toxicity in rats
Vamanu Biological activities of the polysaccharides produced in submerged culture of two edible Pleurotus ostreatus mushrooms
Ye et al. Purification, structure and anti-radiation activity of melanin from Lachnum YM404
Vanucci et al. Nitrogen and phosphorus limitation effects on cell growth, biovolume, and toxin production in Ostreopsis cf. ovata
Georgiev et al. Galanthamine production by L eucojum aestivum L. shoot culture in a modified bubble column bioreactor with internal sections
Sahraroo et al. In-vitro callus induction and rosmarinic acid quantification in callus culture of Satureja khuzistanica Jamzad (Lamiaceae)
KR100981184B1 (ko) 패 추출물을 유효성분으로 하는 천연 항산화용 조성물 및그의 제조방법
Ay et al. Assessment of antioxidant activity of giant snowdrop (Galanthus elwesii Hook) extracts with their total phenol and flavonoid contents
KR101883733B1 (ko) 미세조류 대량 생산방법 및 상기 방법으로 생산된 미세조류 유래 푸코잔틴 분리방법
Gumerova et al. Effect of methyl jasmonate on growth characteristics and accumulation of phenolic compounds in suspension culture of tartary buckwheat
Sharma et al. Variation of both chemical composition and antioxidant properties of newly isolated Parachlorella kessleri GB1, by growing in different culture conditions
Wijesinghe et al. Value-added fermentation of Ecklonia cava processing by-product and its antioxidant effect
Gao et al. Quality evaluation of the edible blue–green alga Nostoc flagelliforme using a chlorophyll fluorescence parameter and several biochemical markers
Guo et al. Removal of antibiotics by four microalgae-based systems for swine wastewater treatment under different phytohormone treatment
Chen et al. Employment of organic acids to enhance astaxanthin formation in heterotrophic Chlorella zofingiensis
Tsivileva et al. Antioxidant properties of the Artist's Conk medicinal mushroom, Ganoderma applanatum (Agaricomycetes), upon cultivation with para-substituted phenolic compounds and tea leaf extracts
Tavangar et al. Effect of salinity and drought stress on morphological and biochemical properties of two Iranian fenugreek (Trigonella foenum-graecum) populations
CN116814520A (zh) 一种利用亚精胺提高等鞭金藻中岩藻黄素含量的方法
CN106755276A (zh) 一种从植物中快速筛选细菌生物膜抑制剂的方法
CN110051769B (zh) 一种从薯莨中提取抗氧化成分的方法
CN103333922B (zh) 一种高色价朱红菌素的获取方法
Sumandiarsa et al. Antioxidant activities from different parts of Sargassum polycystum thalli through ultrasound-assisted extraction (UAE) method
Oscar et al. Physiological and biochemical traits, antioxidant compounds and some physico-chemical factors of Spirulina platensis cultivation as influenced by Moringa oleifera leaves extract culture medium enriched with sodium bicarbonate and kanwa
Noruzpuor et al. The Effect of the Type and Concentration of Some Elicitors on the Biochemical Characteristics and Production of the Secondary Metabolites in the Callus Culture of Moringa oleifera L.

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant