KR20180045921A - 인간 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 증식 및 골형성 분화 촉진 방법 및 그 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지를 유효성분으로 포함하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식 및 골형성 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포증식 및 골형성 분화를 촉진시키고, 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 분화 및 성숙을 상승적으로 촉진하여 조골세포 분화를 유도할 수 있다.

Description

인간 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 증식 및 골형성 분화 촉진 방법 및 그 조성물{A Method for promoting proliferation and osteogenic differentiation of Human Alveolar Bone-derived Mesenchymal Stem Cells and a composition therefor}
본 발명은 인간 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 증식 및 골형성 분화 촉진 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
골발생성 분화를 진행할 수 있거나 그러한 경향을 갖는 줄기 세포의 이식은 골-관련 질환의 치료를 위한, 특히 새로운 골의 생성이 치료에 필요한 경우에 유망한 방도이다.
골수 간질 세포 또는 간엽 줄기 세포(BMSC 또는 MSC 로 약칭됨)는, 이들 세포를 조직 배양 플라스틱에 부착함에 기초하여, 성체 골수 및 몇몇 다른 조직으로부터 쉽게 단리되고 증식될 수 있다. 신경, 간 및 근육 세포를 생성할 수 있는 MSC 가 또한 보고되었지만(Prockop 1997. Science 276: 71-4), MSC 는 대부분 세가지 잠재적,중배엽-관련 운명, 즉 골발생성, 지방세포성 및 연골세포성 분화를 진행할 수 있는 능력을 나타낸다(Pittenger et al. 1999. Science 284: 143-7).
골수 이식은 골 장애를 치료하기 위해 이용되어 왔다(Gangji et al. 2005. Expert Opin Biol Ther 5: 437-42).그러나, MSC 는 골수 샘플 내에 존재하는 모든 세포 중 오직 작은 비율을 나타낼 수 있고, 더욱이 골발생성 분화에 대한 가변적 경향을 나타낼 수 있어, 이렇게 이식된 세포 중 상당한 비율이 결국 바라던 골 조직의 형성에 기여하지 않을 수 있다. 사실, 인간 성체 간엽 줄기 세포 조상(progenitor)의 오직 약 14% 만이 골발생성 잠재성을 유지하는 것으로 밝혀졌다(D'lppolito et al. 1999. J Bone Miner Res. 14: 1115-22).
그러한 관점에서, 간엽 줄기 세포로부터 골조상세포, 골모세포 또는 골-형성 세포의 생성 수율을 개선시킬 계속적 필요가 존재한다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허공개번호 제10-2016-0065213호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 hABMSC의 증식 및 골형성 분화를 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 hABMSC의 증식 및 골형성 분화를 촉진하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지(본 발명에서는 이를 'B-CSM'이라 하고 동결건조 형태로 얻어서 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 첨가한다)를 유효성분으로 포함하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식용 조성물을 제공한다.
본 발명은 일 구현예에 있어서, 상기 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)는 인간 치조골 유래 중간엽 줄기 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 골형성 배지는 덱사메타존, 아스코르빅산 및 β-글리세로포스페이트를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 5-10%(w/v)첨가하는 것이 바람직하고, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 10%(w/v)첨가하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지를 유효성분으로 포함하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 일 구현예에 있어서, 상기 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)는 인간 치조골 유래 중간엽 줄기 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 골형성 배지는 덱사메타존, 아스코르빅산 및 β-글리세로포스페이트를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 5-40%(w/v)첨가하는 것이 바람직하고, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 10-20%(w/v)첨가하는 것이 더욱 바람직하고 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 20%(w/v)첨가하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지에서 를 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase)-9을 수득하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 인 비트로에서 인간 치조골 유래 중간엽 줄기 세포(Human Alveolar Bone-derived Mesenchymal Stem Cell; 이하, 'hABMSCs'라 함)-조건화 분비 배지(B-CSM)의 hABMSCs의 골형성 분화에 대한 효과를 조사하였다. 또한 골형성 분화를 촉진시키는 인자들을 동정하기 위하여 프로테오믹스 어세이를 통한 B-CSM를 분석하였다. 최적 농도를 결정하기 위하여, BCSM를 배양 배지 대비하여 여러 농도 (5, 10, 20, 40, 및 60%)로 먼저 첨가하였다. hABMSCs의 생존률 및 증식은 5-20% B-CSM로 세포에 처리한 것이 40-60%와 비교하여 더 높았다. 또한, 줄기 세포 마커 CD146 및 STRO-1의 발현이 5-20% B-CSM로 처리한 세포에서는 증가하였으나, 40-60% 처리 세포에서는 감소하였다. 또 광화 결절(mineralized nodules)과 같은 hABMSC의 골형성 분화를 5-20%의 B-CSM에서 촉진한다. BCSM은 Vinculin 및 osteocalcin (OCN)의 발현을 hABMSCs의 골형성 분화에서 증가시키는데 가장 효과적이다. 이러한 결과는 물리적 자극에 의하여 유도된 hABMSCs에서 BCSM은 hABMSCs의 증식 및 골형성 분화를 유도한다는 것을 시사한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 물리적으로 자극된 hABMSCs 유래 B-CSM은 인 비트로에서 hABMSCs의 증식 및 골형성 분화를 촉진시켰고, B-CSM은 오토크라인 또는 파라크라인 효과를 통하여 hABMSCs의 분화 및 성숙을 상승적으로 촉진하여 조골세포 분화를 유도할 수 있다.
도 1은 줄기 세포 신호전달에서 Autocrine 및 paracrine 기작을 나타냄.
세포는 환경 자극에 반응하여 생리활성 물질을 분비하고, 이 인자들인 파라크라인 작용에 의해 영향을 주고, 줄기 세포를 조절하는 오토크라인 작용을 수행한다(A). rocking 배양에 의해 유체 전단 응력(Fluid shear stress) 조건이 수행된다 (K. T. Lim, J. Kim, H. Seonwoo, J. U. Chang, H. Choi, J. Hexiu, W. J.Cho, P. H. Choung, and J. H. Chung, Tissue Eng. Part C Methods, vol. 19, no. 2, pp. 128-145, 2013). 이것은 로킹 배양 모델 내에서 전단 응력 프로파일의 유체 동적 시뮬레이션을 나타낸다(B). 오토크라인 인자들이 세포에서 분비되면 그들은 수용체에 결합하여 다운스트림 반응을 촉발한다. 세포 분비된 가용 신호의 트랜스포트 모드는 소스로부터 싱크(sink)로부터 리간드의 확산, 반응 및 대류(convection)을 포함한다(C).
도 2는 B-CSM의 물리적으로 자극된 hABMSCs에서 제조. 0,5, 10, 20, 40 및 60% B-CSM으로 처리된 hABMSC의 대표적인 광현미경 이미지. (c) 대조군과 비교한 5, 10, 20, 40 및 60% B-CSM 처리된 세포 이동을 나타내고, 5 및 10% 처리 군에서 통계적으로 유의적인 차이를 나타냄(*p<0.05) (n=3). 별표를 가지는 위쪽 괄호는 그룹 사이 유의적인 차이를 시사함.
도 3은 유도 그룹에서 분비-없는 조건(a1-d1) 또는 5% (a2-d2), 10% (a3-d3), 20% (a4-d4), 40% (a5-d5), 및 60% (a6-d6) B-CSM에서 5일간 배양된 hABMSC의 대표적인 광학 형광 현미경 이미지로 세포 핵(a1-a6), 액틴 필라민트(b1-b6), STRO-1 (A) 또는 CD146 (B) (c1-c6), 및 형광 염색의 결합된 이미지(d1-d6). 형광 이미지는 대조군과 비교하여 B-CSM 처리 군에서 더 강한 강도를 나타냄(화살표: 세포 방향).
도 4는 B-CSM의 hABMSCs의 골형성 분화에 대한 효과. 인 비트로에서 B-CSM의 hABMSCs의 광화 결절 형성에 대한 효과를 조사하기 위하여 세포를 5, 10, 20, 40 및 60% B-CSM으로 처리함. (a) 및 (b) Alizarin red S 염색을 7일간 수행하고 샘플을 탈색함. (c) Von Kossa 염색을 7일간 수행. 모든 그룹들은 대조군과 통계적으로 차이가 있음(*p<0.05 및 **p<0.001)(n=3).
도 5는 유도 그룹에서 분비-없는 조건(a1-d1) 또는 5% (a2-d2), 10% (a3-d3), 20% (a4-d4), 40% (a5-d5), 및 60% (a6-d6) B-CSM에서 7일간 배양된 hABMSC의 대표적인 광학 형광 현미경 이미지로 세포 핵(a1-a6), 액틴 필라민트(b1-b6), Vinculin (A) 또는 OCN (B) (c1-c6), 및 형광 염색의 결합된 이미지(d1-d6). 형광 이미지는 대조군과 비교하여 B-CSM 처리 군에서 더 강한 강도를 나타냄(화살표: 세포 방향).
도 6은 B-CSM 처리군과 대조군으로 수행된 VEGF 및 BMP-2 단백질의 정량 분석. B-CSM 처리 군은 대조군과 통계적으로 현저한 차이가 있음(*p<0.05 및 **p<0.001) (n=3). 별표를 가지는 위쪽 괄호는 그룹 사이 유의적인 차이를 시사함.
도 7은 물리적 자극을 가진 hABMSCs으로부터 B-CSM의 주요 분자의 조사. 인간 matrix metalloproteinase 항체 어세이 키트는 대조군과 비교하여 B-CSM에서 강하게 발현되는 5 인자를 나타냄; MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9、및 TIMP-2. MMP-9는 독특하게 검출되었고, 골형성 분화에서 주요한 기능을 하는 것을 시사함. 어레이 데이터는 chemiluminescent 시약에 노출 후 X-레이 필름에서 현상.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 세포 배양
인간 ABMSCs를 서울대 치대 연구센터, 지능형 생체계면공학연구센터(Intellectual Biointerface Engineering Center)에서 수집하였다. 세포를 10% 우태아 혈청(FBS, Welgene Inc., South Korea), 10mM ascorbic acid (L-ascorbic acid), 항생물질 및 sodium bicarbonate을 포함하는 알파-최소배지(MEM)에서 37°C, 5% CO2(Steri-Cycle 370 Incubator, Thermo Fisher Scientific. USA)에서 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다. 세포가 컨프루언트하게 된 때, 그들을 1 ml trypsin-EDTA로 떨어트려서 계수하고 계대하였다. 인간 ABMSCs를 컨프루언스에 도달하기 전에 계대하고, 3-4 계대 후에 사용하였다.
실시예 2. 물리적 자극에 의한 HABMSCs -Conditioned Secretion Media (B- CSM )의 제조
인간 ABMSCs를 35 mm 배양 디쉬에서 1.0×104 cells/cm2의 밀도에서 위치하고, 물리적 자극을 가하거나 가하지 아니하고 50 mM β-glycerophosphate 및 50 μg/ml ascorbic acid을 포함하는 알파-MEM 배지에서 5일 또는 10일 동안 배양하였다. 그 후 세포를 골형성 배지(100 nM dexamethasone, 50 μg/mL ascorbic acid, 및 10 nM β-glycerophosphate; Sigma)로 14 일 동안 배양하였다. 배양 기간 동안 세포를 rocking culture 방법[K. T. Lim, J. Kim, H. Seonwoo, J. U. Chang, H. Choi, J. Hexiu, W. J.Cho, P. H. Choung, and J. H. Chung, Tissue Eng. Part C Methods, vol. 19, no. 2, pp. 128-145, 2013]을 통한 낮은 유체 전단 응력으로 배양하였다. 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하기 위하여 180 min, 18°C에서 3,400 g로 원심분리하였다. 0.2 um pore size 필터(Nalgene, Rochester, NY, USA)를 사용하여 여과 후, 수확된 조건화된 배지의 양을 그 추출물로부터 얻어서 B-CSM로서 준비하였다.
실시예 3. 세포 생존, 증식 및 이동 어세이
인간 ABMSCs 증식은 WST-1 어세이 (EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, Daeillab Service Co., LTD)로 측정하였다. 생존 세포에 의해 형성된 formazan dye를 460nm에서 염료 용액에서 흡광도를 측정하는 multi-well spectrophotometer (Victor 3, Perkin Elmer, USA)로 정량화하였다. DNA 농도는 CyQUANT® Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen)를 사용한 형광광도법으로 정량화하고, λ 형광은 Cytofluor II fluorescence multi-well plate reader를 사용하여 측정하였다. 세포를 B-CSM, 또는 없이 배양하고, 세포 형태를 주기적으로 위상 차 현미경(Nikon TS100, Japan)으로 관찰하였다. In vitro 세포 이동은 제조업자의 프로토콜에 따라 CytoSelect™ Wound Healing Assay로 평가하였다. Wound closure는 72시간까지 현미경으로 측정하고 촬영하였다.
실시예 4. 광화 결절 형성의 측정
인간 ABMSCs를 7일간 B-CSM을 가지거나 또는 가지지 않은 골형성 배지에서 배양하였다. 광화 결절(칼슘 축적)의 존재를 alizarin red 염색으로 결정하였다. 에탄올-고정화 세포 및 matrix를 1시간 동안 40 mM alizarin red-S (pH 4.2)로 염색하고, 물로 헹구었다. 촬영 후, 결합된 염료를 10% (wt/vol) cetylpyridinium chloride로 용출하고, 샘플에서 alizarin red-S를 544 nm에서(Victor 3, Perkin Elmer, USA) 흡광도를 측정하여 정량화하였다. Vitamin C, β-glycerophosphate, alizarin red-S, 및 cetylpyridinium chloride는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,USA)에서 구입하였다. 인간 ABMSCs는 von Kossa 염색을 사용하여 광화를 조사하기 위하여 골형성 배지에서 7일간 배양하였다. 세포를 15분간 4% (wt/vol) formaldehyde로 PBS에서 고정화하였다. 세포를 UV 광 하에서 1시간 동안 5% (wt/vol) silver nitrate (Sigma-Aldrich, USA)로 배양한 후, 5 분간 5% (wt/vol) sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich, USA)에서 배양하였다. 웰들을 증류수로 2회 헹구고 공기 건조하고 광화 이미지를 광학 현미경을 사용하여 캡쳐하였다.
실시예 5. 형광 현미경 분석
세포를 PBS(phosphate buffered saline ,Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)로 세척하고, 4% paraformaldehyde 용액(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI,USA)에서 20분간 고정하고, 0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, WI, Milwaukee, USA)으로 15분간 투과하였다. 세포를 TRITC-conjugated phalloidin, anti-Vinculin, 그것의 2차 항체(Millipore Cat. No. AP124F), 및 4, 6-diamidino-2-phrnykinodole (DAPI; Millipore, Billerica, MA,USA)로 1시간 동안 배양하여 각각 액틴 필라민트, focal contracts, 및 핵을 염색하였다. Cytoskeleton 조직은 actin cytoskeleton 및 focal adhesion 염색 키트(FAK100;Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 제조업자 지시에 따라서 확인하였다. Osteocalcin (OCN)도 제조업자의 지시에 따라 anti-OCN (Cat. # AB10911, Millipore)을 사용하여 측정하였다. 음성 대조군은 면역염색 동안 1차 항체를 생략하여 제조하였고 적어도 독립적인 두번의 ㅇ염색이 수행되었다. 또한 본 발명자들은 분비물 처리 후 STRO-1 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 CD146 (BD Bioscience, USA) 줄기 세포 마커를 확인하였다. 세포를 PBS로 세척 후 유리 슬라이드 상에서 글리세롤/버퍼에서 마운트하였다. 표지된 세포의 이미지를 형광 이미지 회복 현미경(Applied Precision, USA)으로 얻었다.
실시예 6. VEGF 및 BMP-2 정량화를 위한 ELISA 어세이
hABMSC의 VEGF 및 BMP-2 생성의 레벨을 측정하기 위하여, ELISA 키트를 VEGF-specific 항체(Quantikine human VEGF immunoassay, R&D Systems, USA) 및 BMP-2-specific 항체(Quantikine human BMP-2 immunoassay, R&D Systems, USA)로 사용하였다. BCSM를 5일 후 인 비트로에서 hABMSCs에 의해 생성된 VEGF 및 BMP-2의 레벨을 정량화하기 위하여 수집하였다. 어세이 프로토콜은 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도를 microplate reader (SunriseTM, TECAN, Austria)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 각 샘플을 3회 반복 측정하였다.
실시예 7. 인간 Matrix Metalloproteinase Antibody Array 분석
인간 matrix metalloproteinase 항체 어레이 분석은 제조업자의 프로토콜(RayBio™ Human matrix metalloproteinase antibody array,Raybiotech, Inc. Norcross, GA, USA)에 따라 수행하였다. 양성 대조군은 4 spots (red box)을 포함하고 각 막의 좌 상단 및 우 하단에 위치한 반면, 음성 대조군은 각 막의 상단 양성 대조군 스팟 근처에 위치한 4 스팟을 포함한다.
상기 실시예의 통계 분석은 SAS Statistical Analysis System for Windows v9.3 (SAS Institute, Inc., Cary,NC, USA)을 사용하여 수행하였다. 대조군 및 처리군 사이이 비교를 위한 통계적 유의성은 two-way ANOVA 및 Duncan’s 다중 범위 테스트로 p<0.05에서 평가하였다. 데이터들은 평균 ± 표준편차로 보고하였다.
상기 실시예의 결과를 하기에 기술한다.
물리적 자극에 의한 B- CSM의 HABMSCs 신호전달 기작에 대한 효과
대조군과 비교하여 줄기 세포의 자극에서 주된 분자를 조사하였다. 물리적으로 자극된 hABMSC-조건화된 배지에 의하여 유도된 주된 분비 인자를 나타내었다.
도 1은 본 발명에서 줄기 세포 신호전달에서 파라크라인 또는 오토크라인 기작을 묘사하였다. 세포는 외부 자극에 반응하여 일시적인 형태로 생리활성 물질을 분비한다. 그 인자들은 여러 세포 타입에서 파라크라인 작용을 수행하여 조직 재생을 이끄는 작용을 하고, 줄기 세포의 활성화 및 재생, 자기 재생, 증식, 분화를 포함하는 줄기 세포의 생리를 조절하는 오토크라인 작용을 수행할 수도 있다(A).
rocking 배양에 의해 유체 전단 응력(Fluid shear stress) 조건이 수행된다 (K. T. Lim, J. Kim, H. Seonwoo, J. U. Chang, H. Choi, J. Hexiu, W. J.Cho, P. H. Choung, and J. H. Chung, Tissue Eng. Part C Methods, vol. 19, no. 2, pp. 128-145, 2013). 이것은 로킹 배양 모델 내에서 전단 응력 프로파일의 유체 동적 시뮬레이션을 나타낸다(B).
오토크라인 인자들이 세포에서 분비되면 그들은 수용체에 결합하여 다운스트림 반응을 촉발한다. 세포 분비된 가용 신호의 트랜스포트 모드는 소스로부터 싱크(sink)로부터 리간드의 확산, 반응 및 대류(convection)을 포함한다(C).
인 비트로에서 B- CSM의 HABMSCs의 세포 생존, 증식 및 이동에 대한 효과
도 2A는 대조군과 비교한 5, 10, 20, 40 및 60%(w/v) B-CSM에 노출된 hABMSC의 광학 현미경 대표적인 이미지의 세포 형태를 나타낸다. 결과들은 대조군 세포에 비하여 최적 BCSM에 노출된 군에서 더 높은 세포 수 또는 세포 성장을 나타내었다. hABMSCs의 세포 대사 생존률을 WST-1을 사용한 흡광도로 측정하였다(도 2B). 10% B-CSM로 처리된 군은 대조군보다 더 높은 세포 대사 생존률을 나타내었다 (p<0.05).
그러나 hABMSCs의 세포 생존력은 40-60% B-CSM에서 대조군과 비교하여 50-60% 이상 감소하였다(p<0.05). B-CSM이 hABMSCs 이동을 촉진하는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 B-CSM 또는 그것 없이 배양하였다. 그 결과는 대조군과 비교하여 B-CSM 처리군이 현저하게 높은 이동 속도를 나타내었고 5 및 10% BCSM 군이 처리 군에서 가장 높은 이동 속도를 나타내었다(p<0.05)(도 2C). 이들 군의 이동 속도는 약 30-40% 증가하였다. 이 결과들은 높은 농도의 B-CSM은 세포 증식에 대하여 부정적인 효과를 나타낸다는 것을 시사한다. 이러한 결과에 기초하여, hABMSCs의 성장은 10%에서 크게 증가하였고, 최적 농도인 것을 시사한다.
형광 현미경에 의한 STRO -1 및 CD146의 분석
MSCs 마커들의 효율성 및 특이도를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 면역조직화학을 통하여 hABMSCs의 세포 형태를 측정하였고 형광 현미경 분석을 사용하여 양성 마커를 분석하였다. hABMSCs의 대표적인 면역조직화학 이미지를 도 3에서 나타내었다. B-CSM 처리된 세포들은 hABMSCs의 세포 형태를 나타내었고, 세포 핵 (a1-a6), 액틴 필라민트(b1-b6), STRO-1 (c1-c6) (도 3A), CD146 (c1-c6) (도 3B), 및 형광 염료의 결합 이미지(d1-d6)를 나타내었다. 그 결과들을 통하여, 본 발명자들은 B-CSM이 STRO-1 및 CD146를 포함하는 MSC 특이 마커의 성장을 증가시켰다고 결론을 내렸다. 이것은 B-CSM 유도된 hABMSCs는 세포 증식 및 분화와 강한 연관이 있다는 것을 의미한다.
B- CSM의 HABMSCs의 골형성 분화에 대한 상승 효과
B-CSM의 인 비트로 hABMSCs의 분화에 대한 효과를 조사하기 위하여, 세포들을 7일간 B-CSM 처리 또는 미처리된 골형성 분화 배지에서 배양하고, 광화 결절의 형성을 alizarin red 염색 후 현미경 이미지에 의하여 평가하였다. 본 발명자들은 모든 B-CSM-처리된 군에서 대조군에 비하여 더 강한 강도를 나타내었다. 특히, 5-20% BCSM 처리된 군들은 크게 증가된 광화 결절을 나타내었다(도 4A). 유사하게, hABMSCs의 대표적인 광학 현미경 이미지들을 7일간 유도 군에서 B-CSM 처리 또는 미처리 군의 Von-Kossa 염색 처리 후에 얻었다.
5-20% B-CSM 처리군이 증가된 광화 결절을 나타내었다(도 4B). 광화 결절의 흡광도(562 nm의 흡광)를 탈염 처리 후 측정하였다(도 4C). 모든 군들은 대조군과 통계적으로 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05 및 p<0.001)(n=3). 이 결과들은 B-CSM가 인 비트로에서 hABMSCs의 분화 및 광화를 촉진한다는 것을 나타내었다.
B- CSM의 HABMSCs 부착에 대한 효과 및 형광 분석
도 5는 미네랄 유도 그룹에서 분비-없는 조건(a1-d1) 또는 5% (a2-d2), 10% (a3-d3), 20% (a4-d4), 40% (a5-d5), 및 60% (a6-d6) B-CSM에서 7일간 배양된 hABMSC의 대표적인 광학 형광 현미경 이미지로 세포 핵(a1-a6), 액틴 필라민트(b1-b6), Vinculin (A) 또는 OCN (B) (c1-c6), 및 형광 염색의 결합된 이미지(d1-d6)를 보여준다.
Vinculin 흡착의 형광 이미지들은 대조군과 비교하여 B-CSM 처리된 군에서 더 큰 강도를 나타내었고; 같은 경향이 cytoskeleton 이미지(화살표: 세포 움직임)에 대해 관찰되었다. 전체적으로, actin microfilaments 및 Vinculin intermediate filament 구조들이 B-CSM 처리 하에서 더 높게 발현되었다.
Vinculin filaments는 핵 주위에 정상적으로 분포하였다(도 5A). 이 결과들은 골형성 리니지로 분화되는 hABMSCs는 골 관련된 유전자들의 특이적인 발현에 의하여 특징되고 오토크라인 또는 파라크라인 신호에 의한 미네랄 유도의 상승 효과에 의하여 결정된 여러 다양한 기능적인 상태를 얻을 수 있다는 것을 시사한다. 이들 cytoskeletal 변화는 인 비트로에서 전구체 세포들의 분화를 오리엔트할 수 있고, 따라서 이들 결과들은 B-CSM이 골형성 분화와 직접 관련이 있는 세포 흡착을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 다음으로 본 발명자들은 B-CSM의 hABMSCs에서 골형성 마커 OCN에 대한 효과를 확인하였다.
OCN의 형광 이미지들은 대조군과 비교하여 cytoskeleton 이미지들(화살표: 세포 움직임)에서와 같이 B-CSM 처리된 그룹에서 더 강하였다(도 5B).
VEGF 및 BMP-2 단백질들의 정량적 분석
B-CSM 처리를 수반하여 제조된 hABMSCs (7 일간 배양된)의 VEGF 및 BMP-2 단백질들을 조사하기 위하여, 정량적 분석을 B-CSM 처리 군 및 대조군에 대해서 수행하였다. B-CSM은 VEGF 및 BMP-2 단백질들의 양을 hABMSCs의 용량 의존적인 형태로 크게 증가시켰다(도 6).
이 결과들은 B-CSM이 이들 기작을 통하여 hABMSCs의 골형성 분화를 촉진한다는 것을 시사한다.
단백질 어레이를 사용한 B- CSM의 평가
B-CSM이 인 비트로에서 hABMSCs의 골형성 분화를 촉진한다는 것을 본 발명에서 확인하였으므로, 골형성 분화와 관련된 B-CSM의 주된 물질들을 조사하기 위하여, MMPs(matrix metalloproteinases)를 조사하였다. MMPs (Cat# AAH-MMP-1, RayBio®)는 10종 인간 matrix metalloproteinase 항체 어레이 키트로 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8,MMP-9, MMP-10, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, 및 TIMP-4를 포함한다.
인간 matrix metalloproteinase 항체 어레이는 MMP-9이 B-CSM에서 강하게 발현되었다는 것을 나타낸다(도 7).

Claims (12)

  1. 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지를 유효성분으로 포함하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)는 인간 치조골 유래 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 골형성 배지는 덱사메타존, 아스코르빅산 및 β-글리세로포스페이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 5-10%(w/v)첨가하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 10%(w/v)첨가하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포 증식용 조성물.
  6. 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지를 유효성분으로 포함하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)는 인간 치조골 유래 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 골형성 배지는 덱사메타존, 아스코르빅산 및 β-글리세로포스페이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 5-40%(w/v)첨가하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 10-20%(w/v)첨가하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 치조골 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지에 20%(w/v)첨가하는 것을 특징으로 하는 치조골 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화 촉진용 조성물.
  12. 치조골 유래 중간엽 줄기세포(ABMSCs)를 β-글리세로포스페이트(glycerophosphate) 및 아스코르빅산(ascorbic acid)을 포함하는 알파-최소 필수 배지에서 배양한 후 그 세포를 골형성 배지로 변경하여 추가 배양하면서 상기 배양 기간 동안 상기 세포를 유체 전단 응력으로 배양하고, 4-6 일 후, 배양 배지를 모아서 세포 찌거기를 제거하고, 필터를 사용하여 여과한 후, 수확된 배지에서 를 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase)-9을 수득하는 방법.
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