KR20180032491A - 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180032491A
KR20180032491A KR1020170102295A KR20170102295A KR20180032491A KR 20180032491 A KR20180032491 A KR 20180032491A KR 1020170102295 A KR1020170102295 A KR 1020170102295A KR 20170102295 A KR20170102295 A KR 20170102295A KR 20180032491 A KR20180032491 A KR 20180032491A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plasma
liquid
obesity
present
cells
Prior art date
Application number
KR1020170102295A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101933920B1 (ko
Inventor
김철호
강성운
Original Assignee
아주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교산학협력단 filed Critical 아주대학교산학협력단
Priority to PCT/KR2017/010234 priority Critical patent/WO2018056664A2/ko
Priority to US16/335,925 priority patent/US10537014B2/en
Publication of KR20180032491A publication Critical patent/KR20180032491A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101933920B1 publication Critical patent/KR101933920B1/ko

Links

Images

Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05H—PLASMA TECHNIQUE; PRODUCTION OF ACCELERATED ELECTRICALLY-CHARGED PARTICLES OR OF NEUTRONS; PRODUCTION OR ACCELERATION OF NEUTRAL MOLECULAR OR ATOMIC BEAMS
    • H05H1/00—Generating plasma; Handling plasma
    • H05H1/24—Generating plasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/44—Applying ionised fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0031—Rectum, anus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61G—TRANSPORT, PERSONAL CONVEYANCES, OR ACCOMMODATION SPECIALLY ADAPTED FOR PATIENTS OR DISABLED PERSONS; OPERATING TABLES OR CHAIRS; CHAIRS FOR DENTISTRY; FUNERAL DEVICES
    • A61G2200/00—Information related to the kind of patient or his position
    • A61G2200/10—Type of patient
    • A61G2200/16—Type of patient bariatric, e.g. heavy or obese
    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05H—PLASMA TECHNIQUE; PRODUCTION OF ACCELERATED ELECTRICALLY-CHARGED PARTICLES OR OF NEUTRONS; PRODUCTION OR ACCELERATION OF NEUTRAL MOLECULAR OR ATOMIC BEAMS
    • H05H2245/00—Applications of plasma devices
    • H05H2245/30—Medical applications
    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05H—PLASMA TECHNIQUE; PRODUCTION OF ACCELERATED ELECTRICALLY-CHARGED PARTICLES OR OF NEUTRONS; PRODUCTION OR ACCELERATION OF NEUTRAL MOLECULAR OR ATOMIC BEAMS
    • H05H2277/00—Applications of particle accelerators
    • H05H2277/10—Medical devices
    • Y10S514/909—

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지방세포 분화 또는 증식 억제용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 액상 플라즈마는 지방세포의 분화를 억제하고, 세포 내 지질 생성을 저하시키는 효과가 현저하며, 플라즈마를 대상체에 직접 처리하는 것보다 효과가 뛰어나므로, 비만의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법{Method for treating or preventing obesity with liquid type plasma}
본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지방세포 분화 또는 증식 억제용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
인류가 풍요로운 사회로 점점 발전해 감에 따라 비만이 심각한 질병 중의 하나로 등장하게 되었고 이에 세계보건기구(WHO)는 비만을 치료해야 할 질병의 대상이라고 선언하였다. 비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생되는 대사성 질환이며, 형태학적으로 볼 때 체내 지방세포의 크기 증가(hypertrophy) 또는 수의 증가(hyperplasia)에 의해 초래된다. 비만은 서구사회에서 가장 흔한 영양장애일 뿐만 아니라, 최근 우리나라에서도 경제발전에 의한 식생활의 향상과 생활 방식의 서구화로 비만의 빈도가 급속히 증가하는 추세에 있어서 그 치료와 예방에 대한 중요성이 크게 부각되고 있다. 비만은 심리적으로 개인을 위축시킬 뿐만 아니라 사회적으로도 여러 가지 성인병의 발병 위험을 증가시키는 중요한 요인이다. 비만이 2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심질환 등 여러 가지 성인병의 유병율 증가와 직접적인 관련이 있다고 알려져 있으며(Cell 87:377, 1999), 비만과 관련된 질환들을 함께 묶어서 대사증후군(metabolic syndrome) 또는 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)이라고 하며, 이들이 동맥경화증 및 심혈관질환의 원인으로 밝혀지고 있다. 이처럼 비만이 다양한 대사성 질환의 발병률을 증가시키고 실제 체중감소가 이러한 질환의 발병률을 현격히 감소시킨다는 사실로부터 지방을 많이 함유하는 지방세포가 이러한 현상을 매개할 것이라고 유추해 볼 수 있다.
과거에는 지방 조직은 과다한 에너지를 트리글리세롤(triacylglycerol)의 형태로 저장하고 필요할 때 방출하는 에너지 저장 기관으로만 생각되었으나, 최근에는 지방 조직이 아디포넥틴(adiponectin), 렙틴(leptin) 및 레지스틴(resistin) 등 여러 가지 아디포카인(adipokine)들을 분비하여 에너지의 항상성(homeostasis)을 조절하는 중요한 내분비 기관으로 받아들여지고 있다(Trends Endocrinol Metab 13:18, 2002). 따라서 지방세포의 증식과 지방세포에서 분비되는 물질들에 대한 이해와 그 생체 내 조절 메카니즘에 대한 규명이 비만 및 그로 인한 여러 가지 질병들을 이해하고 효과적인 치료제를 개발할 수 있는 밑거름이 될 것으로 여겨지고 있고 이에 따라 지방세포 분화 조절에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 비만 환자에서의 증가한 지방세포의 유래와 관련하여 체내의 전구지방세포(pre-adipocytes)로부터 분화된다는 것이 가장 주된 기전으로 받아들여지고 있다. 전구지방세포의 지방세포로의 분화 과정은 3T3-L1과 같은 세포를 이용하여 연구되어 왔으며, 여러 종류의 전사인자(transcription factor)들, 특히 지방화에 관여하는 것으로 알려진 전사인자, C/EBPs(CAAT enhancer binding protein), PPARs(Peroxisome Proliferator Activated receptors)와 ADD1/SREBPs(Adipocyte determination and differentiation dependent factor1/sterol response element binding proteins) 등이 시간의 차이에 따라 발현하며 그 과정을 조절한다는 것이 알려져 있다(Bart A Jessen et al., Gene, 299, pp95-100, 2002; Darlington et al., J . Biol. Chem., 273, pp30057-30060, 1998; Brun R.P et al., Curr. Opin.Cell. Biol., 8, pp826-832, 1996). MDI(isobutylmethylxanthin, dexamethasone and insulin)와 같은 호르몬의 자극이 주어질 때, C/EBP β와 δ가 가장 먼저, 일시적으로 발현되며, 지방세포로의 분화를 개시하게 한다(Reusch J. E et al., Mol. Cell. Biol., 20, pp1008-1020, 2000). 이는 계속해서 C/EBPδ와 PPARg의 발현증가를 유도하게 된다(James M. N. et al., J. Nutr., 130, pp3122S-3126S, 2000). PPARg는 특히 지방세포 분화에 중요한 전사인자로 알려져 있으며, 레티논산 X 수용체(retinoic acid X receptor) 단백질과 이합체(dimer)를 형성한 뒤, 다양한 지방세포 유전자의 프로모터(promoter)에 존재하는 PPRE(peroxisome proliferator response elements)에 결합한다 (Tontonoz P.E et al., Genes Dev., 8, pp1224-1234, 1994 ; Hwang, C. S et al., Cell Dev. Biol., 13, pp873-877). PPARγ와 C/EBP-α의 상호 작용이 성숙한 지방세포로의 분화에 매우 결정적인데, 이러한 전사인자들 및 지방세포 조절 인자들에 의해 지방세포로의 분화가 촉진되고, aP2(adipocyte fatty acid-binding protein 2)와 같은 지방세포 특이적 단백질 및 Fas(fatty acid synthase)와 같은 지방 대사 효소의 발현량이 증가한다. 더불어 ADD1/SREBPs는 지방 대사에도 중요한 역할을 하지만, 또한 분화과정에도 관여하는 것으로 알려졌다. 미성숙 지방세포에서 ADD1/SREBP1c가 발현되는 것은 PPARγ의 활성화에 기여하는 것으로 여겨진다(Rosen E.D. et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 16, pp145-171, 2000; Osborn T.F., J. Biol. Chem., 275, pp32379-32382, 2000). 분화과정을 마친 지방세포만이 지방산(fatty acid)을 합성하고 중성지질(triglycerides)을 저장하게 된다. 따라서, 현재 연구 동향은 비만 및 지질 관련 대사성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 지방세포 분화에 관한 대사과정을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는데 초점이 맞추어져 있다. 즉, 비만의 발생 기전에 의거하여 지방세포 조절을 통해 비만을 치료하려는 시도가 이루어지고 있으며, 이것은 지방 합성을 억제하거나 지방 분해 및 산화를 촉진하여 지방 양을 감소시키려는 것과 지방세포 분화를 억제하여 지방세포 수를 감소시키려는 것으로, 이들 과정을 매개하거나 조절하는 것으로 알려진 전사인자들이나 단백질 그리고 지방세포 분비 물질들(adipokines)을 새로운 비만치료제 개발의 표적으로 떠오르게 하였다. 실제로 지방세포 분화 전사인자인 PPAR(Peroxisome proliferator-activated receptor) 패밀리, 지방세포 분비 물질인 렙틴(leptin) 및 아디포넥틴 (adiponectin) 등은 많은 새로운 약제 개발의 표적이 되고 있다.
현재 비만을 치료하기 위한 방법은 식사요법, 운동요법, 행동요법 등 생활 습관을 교정하는 방법과 약물치료 및 수술적 치료로 나눌 수 있다. 비만치료제로는 제니칼(Xenical, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(Reductil, 에보트사, 미국), 엑소리제(Exolise, 아토파마, 프랑스) 등으로 크게 식욕억제제, 에너지소비 촉진제, 지방흡수억제제로 분류되며, 대부분의 비만치료제는 시상하부와 관련된 신경전달물질을 조절함으로써 식욕을 억제하는 식욕억제제이다. 그러나 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮은 것으로 보고되어 있다. 또한 비만 수술법으로는 지방을 제거하는 수술이나 몸이 소화할 수 있는 음식량을 제한하기 위한 위성형술 또는 위밴드 삽입술 등이 시행되고 있으나, 부작용 및 수술비용 등에 비해 치료효과도 만족할 만한 수준은 아니며, 비만의 근본적인 치료를 위해서는 전구지방세포로부터 지방세포로의 분화를 억제할 수 있는 기전에 근거한 새로운 개념의 비만 치료 방법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명의 출원인들은 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 지방세포의 분화를 억제하고, 세포 내 지질 생성을 저하시키는 효과가 현저하며, 플라즈마를 대상체에 직접 처리하는 것보다 효과가 뛰어나므로, 비만의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 비만의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “비만”이란, 에너지 불균형에 의하여 체내에 축적된 지방이 정상수치보다 높은 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 세계보건기구 WHO에 의하면 아시아태평양 지역의 경우, 비만의 진단에 이용되는 것은 키(meter 단위)의 제곱으로 자신의 체중을 나눈 값이 되며, 이 값이 23이상 25미만은 위험체중, 25 이상은 과체중, 30이상이면 비만, 40이상이면 고도비만 50이상이면 초고도비만으로 정의하고 있다. 비만은 분류에 따라 내분비성 비만(내분비 이상 또는 뇌질환으로부터 기인), 단순성 비만(과다한 영양 섭취로부터 기인), 증식성 비만(지방세포수의 증가로 인한 비만), 비대형비만(지방세포의 크기 증대로 인한 비만), 상반신 비만, 하반신 비만, 내장형 비만, 피하지방형 비만 등으로 나눌 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서 “비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)”란, 디바이 차폐(Debye shielding)을 만족하는 이온화된 기체를 말한다. 이는 물질의 기본적인 세 가지 상태인 기체, 액체, 고체와 더불어 또 하나의 상태로 여겨지며 제 4상태로 표현된다. 본 발명에 따른 플라즈마는 외부 전압에 의해 중성 기체가 플라즈마로 상전이 하여 중성 기체의 여기, 이온화에 의하여 전자 및 양이온이 발생할 수 있고, 분자 가스가 여기된 라디칼이 존재할 수 있다. 상기 플라즈마 생성 장치는 본 발명의 목적에 따른 저온 대기압 플라즈마를 생성할 수 있다면, 공지된 플라즈마 생성 장치를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “액상 플라즈마(Liquid type plasma, LTP)”란, 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시키는 것을 의미하며, 대기압의 상온 비열 플라즈마(nonthermal plasma, NTP)에 노출시켜 제조될 수 있다. 상기 용어 “액상 플라즈마”는 용어 “플라즈마 처리된 액상 물질(plasma-conditioned liquid material)"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기의 “액상 물질”은 액상 형태의 물질은 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 물, 식염수, 완충액, 또는 배지이고, 가장 바람직하게는 배지이다.
본 발명의 일 구체예에서 “배지(culture media)”란, 인 비트로(in vitro)에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12,(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 세포의 유지, 증식, 또는 분화를 위한 것이라면 크게 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 “치료”란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 비만 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 비만의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 “예방”이란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 비만 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 비만에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 비만의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 있어서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 플라즈마를 액상 물질에 조사하여 제조한 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시 형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있다. 본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 캐리어 가스는 헬륨과 산소를 20:80 부피%로 혼합한 것인 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 1분간 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는 지방세포의 분화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 지방세포의 분화 억제용 조성물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 약학조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 지방세포의 분화를 억제하고, 세포 내 지질 생성을 저하시키는 효과가 현저하며, 플라즈마를 대상체에 직접 처리하는 것보다 효과가 뛰어나므로, 비만의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 액상 플라즈마의 제조 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라즈마 처리 시간에 따른 배지의 온도 및 산도(pH) 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 세포 독성 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 아넥신V-PI 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 TUNEL 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 Oil Red O 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 트리글리세라이드 함량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 지방 생성 인자의 유전자 발현 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 지방 생성 인자의 단백질 발현 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 지방 생성 인자의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 분화된 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 후기 지방세포 분화에 억제 효과를 mRNA 발현 수준으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 분화된 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 후기 지방세포 분화에 억제 효과를 Oil Red O 염색 및 트리글리 세라이드(TG) 함량 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 분화된 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 후기 지방세포 분화에 억제 효과를 단백질 발현 수준으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 ER 스트레스 및 UPR 활성화 정도를 단백질 발현 수준으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 액상 플라즈마 처리 시 ER 스트레스 및 UPR 활성화 정도를 면역형광염색으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, 3T3-L1 전 지방세포에 대한 액상 플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리의 지방세포의 분화 및 지질 생성 억제 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 액상 플라즈마(NTP)의 비만 치료 효과 확인
실시예 1-1. 액상 플라즈마(NTP)의 제조
액상 플라즈마(NTP; Non thermal plasma treated solution)는 세라믹 장벽에 의해 플라즈마와 직접 접촉으로부터 격리된 한 쌍의 고전압 및 접지 전극(Al2O3, 10X40 mm2, 전극 사이의 갭은 2 mm)을 구비하는 플라즈마 장치를 이용하였고, 캐리어 가스로 헬륨과 산소를 20:80 비율로 이용하여, 10L/min 유량으로, 10 ㎖의 세포 배지가 분주된 배양 접시(100mm, TPP, Renner, Dannstadt, Germany)의 바닥 표면으로부터 4cm 이격된 거리에서 1 ㎖당 1분간 플라즈마를 처리하는 방법으로 제조하였다. 이 때, 플라즈마 장치의 전원 공급 장치 사양은 최소 2 kV, 최대 13 kV 및 평균 주파수 20 내지 30 kHz인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 4 kV 전력이다. 상기 액상 플라즈마의 제조 모식도를 도 1에 나타내고, 플라즈마 처리 시간에 따른 배지의 온도 및 산도(pH) 변화를 도 2에 나타내었다. 실험 결과, 1분간 플라즈마 처리시 배지의 온도는 27.5 ℃로부터 28.3 ℃로 변화되었고, 산도는 7.59에서 8.02로 변화되었다.
실시예 1-2. 3T3-L1 세포에 대한 액상 플라즈마(NTP)의 세포 독성 확인
액상 플라즈마가 지방세포에 세포 독성을 나타내는지 여부를 확인하였다. 3T3-L1 전 지방세포는 미국세포주은행(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 수득하여, 10 % 혈청 및 항생제가 첨가된 DMEM(GIBCO, Carlsbad, CA, USA) 성장 배지(GM)로 5 % CO2 및 가습조건에서 해동하였고, 해동 2일째에 0.5 mM 3-isobutly-1-methylxanthine(IBMX, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1 mM dexamethasone, 10 % FBS, 및 10 ㎎/㎖ 인슐린을 포함하는 분화 배지(DM)로 교체하고 이후 매 3 일마다 배지를 교환하는 방법으로 배양하였다.
세포사 분석(Apoptotic cell death analysis)은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 3T3-L1 예비 지방세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 분화 유도 후, 세포를 액상 플라즈마 또는 비히클로 처리하였다. 세포 생존력 결과는 미처리 세포를 기준으로 표준화된 백분율로 환산하여 도 3에 나타내었다. 실험 결과, 액상 플라즈마는 3T3-L1 세포에 세포 독성이 없는 것을 알 수 있었다.
또한 세포 독성 여부를 아넥신V-PI 염색(초기 세포사 마커)과 TUNEL 어세이(후기 세포사 마커)로 확인하였다. 아넥신V-PI 염색은 AnnexinV-FITC/PI 세포사 검출 키트 (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)를 이용하여, 제조사의 권장 프로토콜에 따라 수행하였고, 여기 및 방출 파장 488 및 530 nm로 BD FACS AriaIII 기기(BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다. TUNEL 어세이는 커버 슬립에서 성장한 세포를 액상 플라즈마 또는 비히클로 24 시간 동안 처리하고, 실온에서 4 % 파라포름알데히드로 1 시간 동안 고정시킨 후, 제조사의 지시에 따라 세포사 검출 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 DNA 단편 분석을 실시하였다. 염색된 세포는 형광 현미경 (CarlZeiss, Oberkochen, Germany)으로 촬영하였다. 그 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타내었다. 실험 결과, 액상 플라즈마 처리가 3T3-L1 세포의 세포 사멸을 유도하지 않음을 알 수 있었다.
실시예 1-3, 3T3-L1 세포에 대한 액상 플라즈마(NTP)의 지방세포 분화 억제 효과 확인
지방 생성 분화에 대한 액상 플라즈마의 영향을 확인하기 위해, Oil Red O 염색 및 트리글리세라이드 함량 분석으로 세포 내 지질 축적을 모니터링 하였다. Oil Red O 염색은 세포를 PBS로 세척하고, 10 % 포르말린으로 고정시키고, 실온에서 20 분 동안 60 % Oil Red O 용액(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 침지시키는 방법으로 수행하였다. 염색된 세포는 증류수로 세척하고 EVOS FL 자동 세포 이미징 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 사진 촬영하고, 이를 도 6에 나타내었다. 촬영 후에는 Oil Red O 염료를 100 % 이소프로판올에 용해시켜, ELISA 판독기(Bio-Tek, Winooski, VT, USA)로 520 nm 파장에서 흡광도 측정하였다. 트리글리세라이드 함량 분석은 트리글리세라이드 비색 분석법 키트(Cayman, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 세포를 PBST(PBS 중의 1 % Triton X-100, pH 7.4)로 3회 세척 하고, 5분간 초음파 처리하여 세포 현탁액을 균질화시키고, 세포 용해물을 제조사의 지시에 따라 분석하여 트리글리세리드 함량을 흡광도 측정하였다. 상기 Oil Red O 염색 및 트리글리세라이드 함량 분석한 흡광도 결과를 도 7에 나타내었다.
실험 결과, 대조군 세포에서는 Oil Red O 염색 강도와 트리글리세라이드 함량이 점차 증가하는 것에 비해서, 4일 동안 액상 플라즈마로 처리 된 3T3-L1 세포는 지방 형성 분화에서 유의적인 억제를 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히, 액상 플라즈마는 분화된 세포에서 대조군과 비교하여 오일의 형성을 유의하게 감소시켰다(67 % ± 3 %). 트리글리 세라이드(TG) 함량 분석에서도, 액상 플라즈마 처리된 세포는 액상 플라즈마 비처리된 대조군 세포와 비교하여 지방화 세포 분화가 23±2 %로 유의하게 억제되었다. 이러한 결과는 액상 플라즈마 처리가 3T3-L1 세포의 지방 형성 분화를 극적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 1-4. 3T3-L1 세포에 대한 액상 플라즈마(NTP)의 지방 생성인자 발현 억제 효과 확인
3T3-L1 세포에 대한 액상 플라즈마(NTP)의 지방 생성 인자 발현 억제 효과 확인하기 위해서, PPARγ, C / EBPα, Acetyl-CoA carboxylase(ACC), fatty acid synthase(FAS), FAT, 및 SCD1 의 발현 수준을 qPCR로 확인하였다. 지방 생성 전사 인자 PPARγ와 C / EBPα는 지방세포 분화를 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 이를 위해, 3T3-L1 세포에서 TRIzol® reagent(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)로 세포의 총 RNA를 추출하고, cDNA 합성을 위해 1μg의 RNA와 10 ㎕의 ReverTrace qPCR RT (Toyobo Co., Osaka, Japan)를 혼합하고, 표적 유전자를 Lightcycler 96 (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland)을 사용하여 1 단계 Real Time PCR로 정량화하였다. 상기 qPCR에 사용한 프라이머들의 서열은 표 1에 기재하였고, qPCR 결과를 도 8에 나타내었다.
PPARγ Forward(순방향) 5'-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3 '
Reverse(역방향) 5'-CGAAGTTGGTGGGCCAGAAT-3 '
C / EBPα Forward(순방향) 5'-GTGTGCACGTCTATGCTAAACCA-3 '
Reverse(역방향) 5'-GTTAGTGAAGAGTCTCAGTTTG-3 '
ACC Forward(순방향) 5 'GCGTCGGGTAGATCCAGTT-3'
Reverse(역방향) 5'-CTCAGTGGGGCTTAGCTCTG-3 '
FAS Forward(순방향) 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3 '
Reverse(역방향) 5'-AACAGCCTCAGAGCGACAAT-3 '
FAT Forward(순방향) 5'-TAGTAGAACCGGGCCACGTA-3 '
Reverse(역방향) 5'-CAGTTCCGATCACAGCCCAT-3 '
SCD1 Forward(순방향) 5'-CATCGCCTGCTCTACCCTTT-3 '
Reverse(역방향) 5'-GAACTGCGCTTGGAAACCTG - 3 '
또한, 액상 플라즈마 처리가 단백질 수준에서 지방 형성 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위해서 Western blot 분석을 수행하였다. 1차 항체는 PPARγ, C / EBPγ, CHOP, BIP, PERK, p-PERK, p-eIF2α, eIF2α, IRE1α, IRE1α, FABP4, Perilipin, α-tubulin(1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)을 사용하였고, 2차 항체는 anti-rabbit IgG 또는 anti-mouse IgG(1: 2000, cell signaling technology, Danvers, MA, USA)을 사용하였다. 면역 반응 검출은 ECL Western blotting kit(GE, Hercules, CA, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
마지막으로, PPARγ 및 Perilipin의 면역형광염색을 수행하였다. 구체적으로, 3T3-L1 세포를 커버슬립(Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)에서 배양하고, 분화하고, 액상 플라즈마(1분/㎖) 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 배양 24 시간 후, 세포를 4% 포름 알데히드로 고정시키고, PBS에서 5 시간 동안 5 % BSA(Millipore, Bedford, MA, USA)로 블럭하고, 세포를 polyclonal 토끼 PPARγ 또는 perilipin (1: 100, cell signaling, 미국)와 함께 2 시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세척하고, Alexa 546 및 Alexa 488이 부착된 항체(1: 500, Molecular Probe, Eugene, Oregon, CA, USA)로 1 시간 동안 처리하였다. 핵은 Hoechst 33258(Molecular Probe)로 실온에서 15분간 항온 처리하여 염색하였다. 형광 염색된 사진은 형광 현미경(EVOS FL Auto, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 시각화하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
실험 결과 흥미롭게도, 3T3-L1 세포에 액상 플라즈마 처리는 2 일 및 4 일째에 PPARγ 및 C / EBPα의 mRNA 수준을 유의하게 감소시켰다. 그러나 이러한 감소는 성장 배지 그룹에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 액상 플라즈마 치료가 유전자 전사 수준에서 지방 생성을 억제할 수 있음을 시사한다. 유전자 발현 양상과 일치하게, 지방 생성 배지에서 세포를 배양하였을 때 지방 합성 관련 단백질(PPARγ, C / EBPα, perilipin, acetyl CoA carboxylase, 지방산 합성 및 FABP4)이 점차적으로 유도되었다. 액상 플라즈마 처리는 2 일째에 PPARγ와 C / EBPα의 발현을 억제하였으나, C / EBPα의 발현은 4 일째에 액상 플라즈마에 의해 억제되지 않는 것으로 나타났다. 또한, 면역형광염색 결과는 PPARγ가 전 지방세포가 아닌 분화된 3T3-L1 지방세포의 핵에 분명히 국한되었음을 보여 주었다. ACC, FAS, FAT, 및 SCD1을 포함하는 지방 형성 관련 유전자의 mRNA 수준은 액상 플라즈마 처리 군에서 유의하게 감소하였다. mRNA 발현 패턴과 일치하게, ACC 및 FAS 단백질 수준 또한 액상 플라즈마 처리에 의해 유의하게 감소되었다. perilipins과 FABP4는 세포 내 지질 방울 형성에 중요한 역할을 한다고 알려져있다. 본 발명의 결과에서, 액상 플라즈마 처리는 perilipins과 FABP4 단백질 수준을 유의하게 감소시켰다. Perilipins의 면역형광염색 결과에서, perilipins의 지질 방울 염색이 액상 플라즈마 처리군에서 비처리군에 비해 유의하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 액상 플라즈마 치료가 지방 생성과 관련된 유전자 발현 및 지방 생성 특성을 극적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 1-5. 3T3-L1 세포에 대한 액상 플라즈마(NTP)의 후기 지방세포 분화에 억제 효과 확인
액상 플라즈마가 지방세포 분화의 후기 단계에서 억제 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 세포 분화 4 일째에 액상 플라즈마를 처리하고, 5 일째에 지질 축적 및 지방 발생 관련 유전자 발현을 조사하였다. mRNA 및 단백질 발현 수준의 확인은 실시예 1-4와 동일한 방법으로 수행하였다.
액상 플라즈마 처리된 세포에서 PPARγ 및 C / EBPα의 mRNA 수준을 측정한 결과, 액상 플라즈마 처리에 의해 PPARγ 및 C / EBPα의 mRNA 발현 수준이 현저하게 감소되었지만, 초기 발현 단계에 액상 플라즈마를 처리하는 것에 비하여 효과가 미비한 것으로 나타났다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
또한, 세포 내 지질의 축적을 Oil Red O 염색 및 트리글리 세라이드(TG) 함량 분석으로 검사한 결과, 분화된 지방세포에서 지질 축적 또한 액상 플라즈마 처리 세포에서 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, TG 함량은 액상 플라즈마에 의해 89 %로 감소되었다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
PPARγ, C / EBPα, ACC, FAS, perilipin, 및 FABP4를 포함하는 지방세포 특이적 마커의 단백질 수준 역시 액상 플라즈마 처리된 세포에서 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 13에 나타내었다. 이러한 결과는 액상 플라즈마가 3T3-L1 세포 분화에서 초기 지방 형성뿐만 아니라, 후기 지방 형성에서도 현저한 억제 효과가 있음을 시사한다.
실시예 1-6. 3T3-L1 세포에 대한 액상 플라즈마(NTP)의 지방세포 분화 중 ER 스트레스 및 UPR 활성화 억제 효과 확인
액상 플라즈마가 세포에 미치는 영향의 기본 메커니즘을 확인하기 위해서, 지방세포 분화 중 ER 스트레스 및 UPR 활성화에 대한 액상 플라즈마의 효과를 확인하였다. ER 스트레스는 3T3-L1 전 지방세포가 지방세포로 분화하기 위한 필수 조건으로 알려져 있다. 실험 결과, 4 일째에 액상 플라즈마를 처리한 3T3-L1 세포는 액상 플라즈마 비처리 대조군 세포와 비교하여 Bip, CHOP, p-PERK 및 p-eIF2가 극적으로 억제되는 것으로 나타났다. Bip, p-IRE1, p-PERK, p-eIF2, 및 CHOP를 포함하는 UPR 및 ER 스트레스 마커의 발현 수준은 분화 시작시 지방세포에서 증가한다. 최근에는 CHOP가 eIF2α 인산화를 통해 유도되는 것으로 보고되었다. 또 다른 UPR 분자인 p-IRE1은 저해되지 않았다. 상기 결과를 도 14에 나타내었다.
또한, 면역형광염색으로 CHOP의 핵으로의 전좌를 확인하였다. 액상 플라즈마 처리는 효과적으로 CHOP의 핵 전좌를 억제하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 15에 나타내었다. 이러한 결과는 액상 플라즈마가 ER 스트레스 및 UPR 활성화를 억제함으로써 전 지방세포의 지방 형성 분화를 강력하게 억제 할 수 있음을 시사한다.
실시예 2. 액상 플라즈마(NTP)와 플라즈마 직접 처리(Direct plasma)의 비만 치료 효과 비교
본 발명의 액상 플라즈마(NTP)와 세포에 대한 플라즈마 직접 처리의 효과를 비교하였다. 플라즈마 직접 처리는 액상 플라즈마 제조 시 사용한 것과 동일한 플라즈마 장치를 이용하여, 동일한 조건으로 플라즈마를 발생시키되, 세포가 배양되고 있는 배양 접시에 플라즈마를 직접 노출시키는 방법을 이용하였다.
상기 액상 플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리한 세포들을 현미경으로 관찰하고, Oil Red O 염색한 결과를 도 16에 나타내었다. 실험 결과, 성장배지(GM)와 분화배지(DM) 모두 액상 플라즈마 처리한 3T3-L1 세포들은 플라즈마 직접 처리한 세포에 비하여 증식이 현저하게 억제되었고, 특히 분화배지(DM)의 경우, 플라즈마 직접 처리한 세포들은 Oil Red O 염색되어 세포 내 지질 침착이 있는 것으로 나타났으나, 액상 플라즈마 처리한 세포들은 세포 내 지질 침착이 억제되는 것으로 나타났다. 상기의 결과는 세포에 플라즈마를 직접 처리하는 것보다 액상 플라즈마의 형태로 처리하는 것이 지방세포의 분화와 지질 생성 억제에 더 효과적임을 의미한다.
상기 실시예 1과 2의 결과로부터, 전 지방세포에 액상 플라즈마를 처리하는 것이 지방세포의 분화와 세포 내 지질 생성을 억제하는데 현저하게 효과가 있다는 것을 알 수 있었고, 액상 플라즈마의 형태로 처리하는 것이 플라즈마를 세포에 직접 처리하는 것보다 효과가 현저함을 알 수 있었다.

Claims (10)

  1. (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
    (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
    (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 캐리어 가스는 헬륨과 산소를 20:80 부피%로 혼합한 것인, 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 1분간 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, 지방세포의 분화 억제용 액상 플라즈마 제조 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는, 지방세포의 분화 억제용 조성물.
  7. 제 6항의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 하나 이상의 약학조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만의 예방 또는 치료 방법.
KR1020170102295A 2016-09-22 2017-08-11 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법 KR101933920B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2017/010234 WO2018056664A2 (ko) 2016-09-22 2017-09-19 액상 플라즈마를 포함하는 비만 치료용 조성물
US16/335,925 US10537014B2 (en) 2016-09-22 2017-09-19 Composition for obesity treatment comprising liquid-phase plasma

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160121357 2016-09-22
KR1020160121357 2016-09-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180032491A true KR20180032491A (ko) 2018-03-30
KR101933920B1 KR101933920B1 (ko) 2018-12-31

Family

ID=61900322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170102295A KR101933920B1 (ko) 2016-09-22 2017-08-11 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US10537014B2 (ko)
KR (1) KR101933920B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101933920B1 (ko) * 2016-09-22 2018-12-31 아주대학교 산학협력단 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법
US11510853B2 (en) * 2017-09-18 2022-11-29 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Composition for skin soothing containing liquid-phase plasma

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1832756A (zh) 2003-06-09 2006-09-13 约翰·A·麦金太尔 通过氧化还原反应改变血浆蛋白质结合专一性的方法
ATE556745T1 (de) 2005-01-18 2012-05-15 Alma Lasers Ltd Verbessertes system zur erwärmung von biologischem gewebe mit hf-energie
GB201006327D0 (en) * 2010-04-15 2010-06-02 Linde Ag Gas treatment methods
KR101248668B1 (ko) 2011-03-10 2013-03-28 부산대학교 산학협력단 저온 상압 플라즈마 노출을 이용한 세포의 생장 조절 방법
KR101409390B1 (ko) 2012-02-29 2014-06-27 아주대학교산학협력단 바이오-메디컬 응용을 위해 플라즈마를 이용하는 질환세포 및 병원성 미생물의 사멸 방법
JP2015084290A (ja) 2013-10-25 2015-04-30 立山マシン株式会社 大気圧プラズマ発生装置
KR101592081B1 (ko) 2014-01-13 2016-02-04 연세대학교 산학협력단 저온 상압 플라즈마를 이용한 ｐ５３ 결핍 암세포 또는 약물 내성 암세포의 선택적 세포사멸 방법
US10669169B2 (en) 2014-12-15 2020-06-02 VitalFluid B.V. Plasma activated water
KR101577207B1 (ko) 2015-01-12 2015-12-21 주식회사 다오닉스 휴대용 플라즈마 피부개선 장치
KR101657063B1 (ko) 2015-04-09 2016-09-13 아주대학교산학협력단 암 예방 또는 치료용 액상 플라즈마
KR101933920B1 (ko) * 2016-09-22 2018-12-31 아주대학교 산학협력단 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20190313520A1 (en) 2019-10-10
US10537014B2 (en) 2020-01-14
KR101933920B1 (ko) 2018-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sakuma et al. Molecular mechanism of sarcopenia and cachexia: recent research advances
Yao et al. Adipogenic miR-27a in adipose tissue upregulates macrophage activation via inhibiting PPARγ of insulin resistance induced by high-fat diet-associated obesity
Gao et al. Au clusters treat rheumatoid arthritis with uniquely reversing cartilage/bone destruction
McVicker et al. Novel anti-fibrotic therapies
Sakamoto et al. Macrophage infiltration into obese adipose tissues suppresses the induction of UCP1 level in mice
Wu et al. Genetic and pharmacological inhibition of Rheb1-mTORC1 signaling exerts cardioprotection against adverse cardiac remodeling in mice
Johri et al. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases
Byun et al. Epigallocatechin-3-gallate ameliorates both obesity and autoinflammatory arthritis aggravated by obesity by altering the balance among CD4+ T-cell subsets
Suh et al. Blockade of lipid accumulation by silibinin in adipocytes and zebrafish
Ji et al. Cafestol preconditioning attenuates apoptosis and autophagy during hepatic ischemia-reperfusion injury by inhibiting ERK/PPARγ pathway
KR101933920B1 (ko) 액상 플라즈마를 이용한 비만의 예방 또는 치료 방법
Xue et al. Ginsenoside Rc alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing mitochondrial oxidative stress and apoptosis: role of SIRT1 activation
Zhang et al. Ginsenoside-Rg1 protects podocytes from complement mediated injury
Murugan et al. Adipogenesis and therapeutic potentials of antiobesogenic phytochemicals: Insights from preclinical studies
Kou et al. LIGHT/TNFSF14 signaling attenuates beige fat biogenesis
Lee et al. Reduction in endoplasmic reticulum stress activates beige adipocytes differentiation and alleviates high fat diet-induced metabolic phenotypes
US8652540B2 (en) Method of using rhein for treating fibrotic conditions and tumors
Lee et al. Melatonin promotes neuroblastoma cell differentiation by activating hyaluronan synthase 3‐induced mitophagy
NISHIkAWA et al. Co-administration of curcumin and artepillin C induces development of brown-like adipocytes in association with local norepinephrine production by alternatively activated macrophages in mice
Tieyuan et al. Piceatannol-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway inhibition contributes to the alleviation of oxidative injury and collagen synthesis during pulmonary fibrosis
WO2018118907A1 (en) Pharmaceutical composition and methods comprising immune cells and ponatinib
WO2017092663A1 (zh) 小分子组合物诱导人肿瘤细胞直接重编程为非致瘤性细胞的方法
Zhao et al. Chlorogenic acid alleviates chronic stress-induced intestinal damage by inhibiting the P38MAPK/NF-κB pathway
Zong et al. 5-HEPE reduces obesity and insulin resistance by promoting adipose tissue browning through GPR119/AMPK/PGC1α activation
Liang et al. Caffeic acid phenethyl ester reverses doxorubicin resistance in breast cancer cells via lipid metabolism regulation at least partly by suppressing the Akt/mTOR/SREBP1 pathway

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant