KR20180029965A - 섬유아세포 증식 인자 수용체 2(fgfr2) 단백질에 대한 srm/mrm 분석법 - Google Patents

섬유아세포 증식 인자 수용체 2(fgfr2) 단백질에 대한 srm/mrm 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선택 반응 모니터링 (SRM)/다중 반응 모니터링 (MRM) 질량 분석법에 의해 포르말린에 고정된 샘플을 포함하는, 생물학적 샘플에서 직접적으로 섬유아세포 증식 인자 수용체 2 (fibroblast growth factor receptor 2, FGFR2) 단백질을 정량하기 위한 방법을 제공한다. 분석될 수 있는 샘플은, 포르말린 고정 조직/세포, 포르말린 고정/파라핀 포매 (FFPE) 조직/세포, FFPE 조직 블록 및 이 블록으로부터의 세포, 및 포르말린 고정 및/또는 파라핀 포매 조직 배양 세포를 포함하는, 포름알데하이드 함유 제제/고정제로 처리되는 조직 및 세포를 포함한다. 이러한 생물학적 샘플로부터 단백질 샘플을 제조하는 방법이 제공되며, FGFR2 단백질은 단백질 샘플에서 기술된 펩타이드 중의 적어도 하나 이상을 정량함으로써 SRM/MRM 질량 분석법으로 정량된다.

Description

섬유아세포 증식 인자 수용체 2(FGFR2) 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법
본 출원은, 그 전문이 본원에 참조로서 포함되는, 2015년 5월 14일자로 출원된 가출원 제62/161,757호의 우선권을 주장한다.
암은, 성장하고 분열하는 세포를 사멸시키고 다양한 방식으로 작용하는 일단의 치료제로 치료된다. 일반적인 화학치료제 컬렉션이 개별적으로 또는 조합되어 수십년간 사용되어 왔고, 이러한 일반적인 약제 컬렉션이 임상 종양학 실시에서 전통적이고 일상적인 암치료가 되었다. 이러한 전통적인 화학치료제는 빠르게 분열하는 모든 세포를 사멸시키는 작용을 한다 - 빠른 세포 분열은 대부분 암 세포의 주요 특징 중 하나이다. 그러나, 이러한 약제는 또한 성장하는 정상 세포 역시 사멸시키므로, 이러한 약제는 암세포를 사멸시키기 위한 "표적화" 접근법으로 간주되지 않는다. 최근 몇 년간 암세포만을 표적하는 대규모 그룹의 암 치료제가 개발되었고, 상기 치료제는 정상 세포에 의한 것이 아닌 암세포에 의해서만 발현되는 단백질을 특이적으로 공격한다. 이러한 접근법은 암 치료에 대한 "표적화" 접근법으로 간주된다. 최근, "표적화" 유행에 있어서 암세포를 사멸시키기 위한 다른 접근법은 암세포를 사멸시키기 위한 암 환자의 면역 체계의 능력을 강화시키기 위해 면역 체계를 특이적으로 조절하는 것이였다.
FGFR2로도 불리는 섬유아세포 증식 인자 수용체 2 단백질을 표적으로 하는 치료제는 초기 임상 시험에 유망함을 보였다. 그러나, 암세포가 다량의 FGFR2 단백질을 발현하는 환자만이, 이러한 FGFR2-표적 치료제에 의해 가장 큰 혜택을 보았다. 이하에 기재된 방법은, FGFR2이 정상 조직 및/또는 정상 상피 세포에서 정상적으로 발현되지 않기 때문에 FGFR2 신호 경로의 활성화에 중요한 수단을 제공하는 정량적 프로테오믹스 기반 분석법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 암환자의 포르말린 고정 조직에서 FGFR2을 정량화하고 암치료를 위해 개선된 치료를 결정할 수 있게 하는 질량 분석법을 제공한다.
CD332, 케라틴 세포 증식 인자 수용체 및 본 명세서에서 FGFR2로 불리는 섬유아세포 증식 인자 수용체 2 단백질의 서브서열에서 유래한 특정 펩타이드가 제공된다. 각 펩타이드에 대한 펩타이드 서열 및 단편화/전이 이온은, 본원에서 SRM/MRM이라고 지칭되는, 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 분석으로도 지칭될 수 있는, 질량 분석법(mass spectrometry)-기반 선택 반응 모니터링 (Selectial Reaction Monitoring, SRM)에 특히 유용하다. 상기 FGFR2 단백질의 SRM/MRM 정량 분석을 위한 펩타이드의 사용을 기재한다.
이 SRM/MRM 분석은 FGFR2 단백질로부터의 하나 이상의 특정 펩타이드의 상대적 또는 절대적 정량 수준을 측정하는데 사용할 수 있으며, 따라서 생물학적 샘플로부터 수득한 주어진 단백질 조제물 중의 FGFR2 단백질의 양을 측정하는 질량 분석법을 제공한다.
더욱 구체적으로, 상기 SRM/MRM 분석은, 포르말린으로 고정된 암 환자 조직과 같은 환자 조직 샘플로부터 조달된 세포로 조제된 복합 단백질 분해물 샘플 중의 이러한 펩타이드를 직접 측정할 수 있다. 포르말린 고정 조직으로부터 단백질 샘플을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,473,532호에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로서 통합된다. 미국 특허 제7,473,532호에 기재된 방법은 액체 ㅈ조조직 시약을 사용하여 용이하게 수행할 수 있으며, 프로토콜은 Expression Pathology Inc. (Rockville, MD)로부터 이용 가능하다.
암 환자 조직으로부터 가장 넓고 유리하게 이용 가능한 조직 형태는 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직이다. 외과적으로 제거된 조직의 포름알데하이드/포르말린 고정은 지금까지 세계적으로 암 조직 샘플을 보존하는 가장 일반적인 방법이고, 표준 병리학 실시를 위한 관행이다. 포름알데하이드 수용액은 포르말린이라고 지칭된다. "100%" 포르말린은 물 중 포름알데하이드 포화 용액 (부피 기준으로 약 40% 또는 질량 기준 37%)과 소량의 안정제, 보통 산화 및 중합도를 제한하는 메탄올로 구성된다. 조직을 보존하는 가장 흔한 방법은, 일반적으로 10% 중성 완충 포르말린이라고 불리는 수성 포름알데하이드에 전체 조직을 장시간 (8시간에서 48시간) 담근 다음, 고정된 전체 조직을 실온에서 장기간 저장하기 위해 파라핀 왁스에 포매한다. 따라서, 포르말린 고정 암 조직을 분석하기 위한 분자 분석 방법은 암환자 조직 분석을 위한 가장 많이 수용되고 많이 활용되는 방법이 될 것이다.
SRM/MRM 분석 결과는, 수집 및 보존된 상기 조직 (생물학적 샘플)을 가지는 환자 또는 개체의 특정 조직 샘플 (예를 들어, 암 조직 샘플) 중의 FGFR2 단백질의 정확하고 정밀한 정량 수준을 연관시키는 데 사용될 수 있다. 이는 암에 대한 진단 및 예후 정보를 제공할 뿐만 아니라, 의사 또는 다른 의료 전문가가 환자를 위한 적절한 치료법을 보다 정확하게 결정할 수 있게 한다. 이러한 분석법은 병변 조직 또는 다른 환자 샘플 중의 단백질 발현 수준에 대한 진단적, 예후적 및 치료학적으로 중요한 정보를 제공하는 동반 진단 분석법 (companion diagnostic assay)이라고 한다. 예를 들어, 이러한 분석법은 암의 단계 또는 등급을 진단하고, 환자가 가장 반응을 보일 수 있는 치료제를 결정하도록 설계할 수 있다.
본원에 기재된 분석법은 FGFR2 단백질로부터의 특이적인 비변형된 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정하며, 또한 FGFR2 단백질로부터의 특이적인 변형된 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정할 수 있다. 변형의 예로는, 펩타이드에 존재할 수 있는 인산화된 아미노산 잔기 및 글리코실화된 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 FGFR2 단백질의 상대적 정량 수준은 SRM/MRM 방법, 예를 들어, 상이한 샘플 내 개별 FGFR2 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적 (예를 들어, 시그니처 피크 면적 또는 통합된 단편 이온 강도)을 비교함으로써 결정된다. 또는, 다중 FGFR2 시그니처 펩타이드에 대한 다중 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 비교하는 것이 가능하며, 각 펩타이드는 하나 이상의 부가적인 또는 상이한 생물학적 샘플 중의 상기 FGFR2 단백질 함량에 대해 하나의 생물학적 샘플 중의 상대적 FGFR2 단백질 함량을 결정하기 위한 각자의 특이적 SRM/MRM 시그니처 피크를 가진다. 이러한 방식으로, 상기 FGFR2 단백질의 특정 펩타이드 또는 복수의 펩타이드 양, 즉 FGFR2 단백질의 양은 동일한 실험 조건하에서 두 개 이상의 생물학적 샘플에 걸처 동일한 FGFR2 펩타이드 또는 복수의 펩타이드에 상대적으로 결정된다. 또한, 상대 정량은 생물학적 샘플로부터 동일한 단백질 제조물 내 다른 단백질 또는 복수의 단백질의 상이한 펩타이드 또는 복수의 펩타이드에 대한 시그니처 피크 면적과 그 펩타이드에 대한 시그니처 피크 면적을 SRM/MRM 방법으로 비교함으로써 단일 샘플 내 상기 FGFR2 단백질로부터 주어진 펩타이드 또는 복수의 펩타이드에 대해 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 FGFR2 단백질의 특정 펩타이드의 양, 즉, FGFR2 단백질의 양은 동일한 샘플 내에서 서로 상대적으로 결정된다.
이러한 접근법은 샘플 간 및 샘플 내 다른 펩타이드 또는 복수의 펩타이드 양에 대한 FGFR2 단백질의 개별 펩타이드 또는 복수의 펩타이드 정량을 가능하게 하고, 시그니처 피크 면적에 의해 결정된 상기 양은 생물학적 샘플로부터의 단백질 조제물 중의 FGFR2 펩타이드의 절대 부피 중량 또는 무게 중량에 상관없이, 서로 상대적이다. 상이한 샘플 간 개별 시그니처 피크 면적의 상대적 정량 데이터는 샘플당 분석된 단백질 양으로 표준화되었다. 상대 정량은 다른 펩타이드/단백질에 대한 하나의 펩타이드/단백질의 상대적 단백질 양의 통찰력을 얻기 위해, 여러 단백질의 많은 펩타이드와 FGFR2 단백질을 단일 샘플 및/또는 다수의 샘플에 걸쳐 동시에 수행할 수 있다.
FGFR2 단백질의 절대적 정량 수준은, 예를 들어 하나의 생물학적 샘플중의 FGFR2 단백질의 개별 펩타이드의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 스파이크된 내부 표준의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적에 비교하는 SRM/MRM 방법에 의해 결정된다. 일 실시 양태에서, 상기 내부 표준은 하나 이상의 중동위원소로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 정확히 동일한 FGFR2 펩타이드의 합성 버전이다. 이러한 동위 원소 표지 내부 표준은 합성되고, 질량 분석법으로 분석할 때, 천연의 FGFR2 펩타이드 시그니처 피크와는 다르며, 또한 비교 피크로서 사용될 수 있는 예측가능하고 일관성 있는 SRM/MRM 시그니처 피크를 생성한다. 따라서, 상기 내부 표준 물질을 공지된 양의 생물학적 샘플의 단백질 제조물에 넣어 질량 분석법으로 분석할 때, 천연 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적은 내부 표준 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적에 비교되고, 이러한 수치 비교는 생물학적 샘플의 오리지널 단백질 조제물 내에 존재하는 천연 펩타이드의 절대 몰 농도 및/또는 절대 중량을 나타낸다. 단편 펩타이드의 절대 정량 데이터는 샘플당 분석된 단백질의 양에 따라 표시된다. 절대 정량은 개별 샘플학적 샘플 및 개별 샘플의 전체 코호트 내 절대 단백질 양의 통찰력을 얻기 위해, 여러 펩타이드들 및 단백질을 단일 샘플 및/또는 다수의 샘플에 걸쳐 동시에 수행할 수 있다.
SRM/MRM 분석 방법은, 예를 들어 포르말린 고정 조직과 같은 환자 유래 조직에서 직접적으로 암의 단계 및/또는 환자 예후의 진단을 보조하고, 그런 환자를 치료할 때의 치료제의 사용에 있어서 가장 유리한 결정을 보조할 수 있다. 부분적 또는 전체 종양의 치료적 제거와 같은 수술, 또는 의심되는 질환의 존재 여부를 결정하기 위해 실시한 조직 검사를 통해 환자로부터 제거된 암 조직은 특정 단백질, 또는 복수의 단백질 및 어떤 형태의 단백질이 환자 조직에 존재하는지 결정하기 위해 분석한다. 또한, 단백질 또는 여러 단백질의 발현 수준을 결정하여 건강한 조직에서 발견되는 "정상" 또는 기준 수준과 비교할 수 있다. 건강한 조직에서 발견되는 정상 또는 기준 수준의 단백질은, 예를 들어 암을 가지지 않는 하나 이상 개별적 관련 조직으로부터 유래 될 수 있다. 또는, 정상 또는 기준 수준은 암에 영향받지 않은 관련 조직의 분석을 통해 암을 가지는 개인에게서 수득될 수 있다. 단백질 수준의 분석 (예: FGFR2 수준) 역시 FGFR2 수준을 사용하여 암으로 진단받은 환자 또는 개체에서 암 단계를 진단하고 예후 정보를 제공하는 데 사용할 수 있다. 개별적 FGFR2 펩타이드의 수준은 분석된 단백질 용해물 총량 당 SRM/MRM 분석에 의해 결정된 펩타이드의 몰량으로서 정의된다. 따라서 FGFR2에 관한 정보는 FGFR2 단백질 (또는 FGFR2 단백질의 단편 펩타이드)의 수준과 정상 조직에서 관찰되는 수준을 상호 연관시킴으로써 암의 단계 또는 등급을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. 일단 FGFR2 단백질의 정량적인 양이 암세포에서 결정되면, 그 정보는 예를 들어, 단백질 또는 단백질들 (예, FGFR2)의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 암 조직을 특이적으로 치료하기 위해 개발된 치료제 (화학적 및 생물학적) 목록과 일치할 수 있다. FGFR2 단백질 분석으로부터, 예를 들어 단백질을 발현하는 FGFR2 단백질 또는 세포/조직을 특이적으로 표적으로 하는 치료제 목록에 대한 정보를 일치시키는 것은 질병 치료에 대한 맞춤 의학(personalized medicine) 접근법으로 정의한다. 본원에 기재된 분석 방법은 진단 및 치료 결정을 위한 소스로서 환자 자신의 조직으로부터의 단백질 분석을 사용함으로써 맞춤 의학 접근법의 기초를 형성한다.
원칙적으로, 예를 들어 공지된 특이성을 가지는 (예를 들어, 트립신) 프로테아제로 분해시킴으로써 제조된 FGFR2 단백질로부터 유도된 임의의 예측된 펩타이드는, 질량 분석법에 기반한 SRM/MRM 분석을 사용하여 샘플 내 FGFR2 단백질의 존재량을 결정하기 위한 대용 리포터로서 사용될 수 있다. 마찬가지로, FGFR2 단백질 중의 잠재적으로 변형된 것으로 알려진 부위에서 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 예측된 펩타이드 서열 또한 샘플 중의 FGFR2 단백질의 변형 정도를 분석하는데 잠재적으로 사용될 수 있다.
FGFR2 단편 펩타이드는 미국 특허 제7,473,532호에서 제공된 액체 조직 프로토콜의 사용법을 포함하여 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 상기 액체 조직 프로토콜 및 시약은 조직/생물학적 샘플 내 단백질의 단백질성 분해에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매된 조직으로부터 질량 분광 분석에 적합한 펩타이드 샘플을 생성할 수 있다. 액체 조직 프로토콜에서, 조직/생물학적 물질은 완충제 중에서 장시간 (예를 들어, 약 80℃ 내지 약 100℃에서 약 10분 내지 약 4시간 동안) 가열하여 단백질 교차 결합을 역전 또는 방출한다. 사용된 완충액은 중성 완충액 (예를 들어, 트리스-기반 완충액 또는 계면활성제를 함유하는 완충액)이다. 열처리 후에 상기 조직/생물학적 샘플을 트립신, 키모트립신, 펩신 및 엔도프로티나제 Lys-C를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 프로테아제로 상기 생물학적 샘플의 조직 및 세포 구조를 파괴시키고, 샘플을 액화시키기에 충분한 시간 동안 (예: 37℃ 내지 65℃ 온도에서 30분 내지 24시간) 처리하였다. 가열 및 단백질 분해의 결과는 액체, 가용성, 희석 가능한 생체 분자 용해물이다.
놀랍게도, FGFR2 단백질의 많은 잠재적 펩타이드 서열은 즉시 분명하지 않다는 이유 때문에 질량 분석법에 기반한 SRM/MRM 분석법에 사용하기에 부적절하거나 효과적이지 않다는 것이 발견되었다. 이는 포르말린 고정 조직으로부터 유도된 펩타이드의 경우 특히 그러하다. MRM/SRM 분석에 가장 적합한 펩타이드를 예측하는 것은 불가능하기 때문에 FGFR2 단백질에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위해서는 실제 액체 조직 용해물 중의 변형된 및 비변형된 펩타이드를 실험적으로 확인하는게 필요하다. 어떠한 이론에 구속되기를 바지는 않지만, 일부 펩타이드는 예를 들어, 이온화가 잘되지 않거나 다른 단백질로부터 유도된 펩타이드와 구별되지 않는 단편을 생성하기 때문에 질량 분석법으로 검출하는데 어려울 수 있다. 또한, 펩타이드는 분리 (예: 액체 크로마토그래피)에 의해 잘 분해되지 않거나, 유리 또는 플라스틱 제품에 부착 될 수 있다.
본 명세서의 다양한 실시 양태에서 발견된 FGFR2 펩타이드 (예를 들어, 표 1 및 표 2)는 포르말린 고정 암 조직으로부터 조달된 세포로 제조된 복합 액체 조직 용해물 중의 모든 단백질의 프로테아제 분해에 의한 FGFR2 단백질로부터 유래되었다. 달리 명시하지 않는 한, 각각의 경우에 프로테아제는 트립신이다. 이후, 액체 조직 용해물을 질량 분석법으로 분석하고, FGFR2 단백질로부터 유도된 이러한 펩타이드를 검출하고 질량 분석법으로 분석하였다. 질량 분광 분석을 위한 펩타이드의 특정 선호 서브세트의 동정은; 1) 액체 조직 용해물의 질량 분광 분석에 있어서 단백질의 펩타이드 또는 복수 펩타이드가 이온화하는 실험적 결정, 2) 액체 조직 용해물을 제조하는데 사용된 프로토콜 및 실험 조건에서 생존할 수 있는 펩타이드의 능력에 기반한다. 이런 후자의 특성은 펩타이드의 아미노산 서열뿐만 아니라 샘플 제조 중에 변형된 형태로 생존하기 위한 펩타이드 중의 변형된 아미노산 잔기의 능력까지 확장된다.
포르말린 (포름알데하이드) 고정 조직으로부터 직접 조달된 세포의 단백질 용해물은 조직 미세절제술를 통해 샘플 튜브 안으로 세포를 수집한 후 장기간 액체 조직 완충액에서 세포를 가열하는 것을 수반하는 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 조제되었다. 일단 포르말린-유도 교차 결합이 부정적으로 영향을 받으면, 조직/세포는 예를 들어, 프로테아제 트립신을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 프로테아제를 사용하여 예측 가능한 방식으로 완전히 분해된다. 각 단백질 용해물은 온전한 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해시켜 펩타이드 집합체로 전환된다. 각 액체 조직 용해물은 (예: 이온 트랩 질량 분석법) 펩타이드에 대한 여러 글로벌 프로테옴 조사를 수행하기 위해 분석하였고, 데이터는 각 단백질 용해물에 존재하는 모든 세포 단백질을 질량 분석함으로써 확인 가능한 수많은 펩타이드의 동정을 제시하였다. 이온 트랩 질량 분광계 또는 단일 복합 단백질/펩타이드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩타이드를 동정하기 위해 글로벌 프로파일링을 수행할 수 있는 질량 분광계의 다른 형태가 일반적으로 사용된다. 그러나 이온 트랩 질량 분광계는 펩타이드의 글로벌 프로파일링을 수행하기 위한 최상의 유형의 질량 분광계 일 수 있다. SRM/MRM 분석은 MALDI, 이온 트랩 또는 삼중사극를 포함한 모든 유형의 질량 분광계에서 개발 및 수행될 수 있지만, SRM/MRM 분석을 위한 장비 플랫폼은 삼중사극 장비 플랫폼인 것이 유리하다.
일단 채용된 조건하에서 단일 용해물의 단일 MS 분석에서 가능한 한 많은 펩타이드가 동정되면, 그 펩타이드의 목록을 대조하고 그 용해물에서 검출된 단백질을 결정하는데 사용하였다. 이 과정을 여러 액체 조직 용해물에 대해 반복하였고, 펩타이드의 대규모 목록을 단일 데이터 세트에 대조하였다. 이러한 유형의 데이터 세트는 분석된 생물학적 샘플의 유형 (프로테아제 분해 후), 특히 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 검출될 수 있는 펩타이드를 나타내는 것으로 간주 될 수 있으며, 따라서 특정 단백질에 대한 펩타이드, 예를 들어 FGFR2 단백질을 포함한다.
일 실시 양태에서, FGFR2 단백질의 절대적 또는 상대적 양의 결정에 유용한 것으로 확인된 FGFR2 트립신 펩타이드는, 표 1에 나열된 서열번호 1 및 서열번호 2 중 하나 이상을 포함한다. 이들 펩타이드는 각각 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직으로 제조된 액체 조직 용해물에서 질량 분석에 의해 검출되었다. 따라서, 각 펩타이드는 포르말린 고정 환자 조직에 직접적으로 포함되는, 인간 생물학적 샘플 중의 FGFR2 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 분석을 개발하는데 사용하기 위한 후보이다.
서열번호 펩타이드 서열 모노
동위원소 질량		 전구체
전하 상태		 전구체
m/z		 전이
m/z		 이온 형태
서열번호 1 EAVTVAVK 815.4752 2 408.745 317.218 y3
2 408.745 416.286 y4
2 408.745 517.334 y5
2 408.745 616.402 y6
2 561.795 451.753 y8
서열번호 2 YGPDGLPYLK 1121.5756 2 561.795 520.312 y4
2 561.795 690.418 y6
2 561.795 805.445 y7
2 561.795 902.498 y8
표 1에 나열된 FGFR2 트립신 펩타이드는 전립선, 결장 및 유방을 포함하는 상이한 인간 기관의 다수의 상이한 포르말린 고정 조직의 여러 액체 조직 용해물로부터 검출되었다. 이들 펩타이드 각각은 포르말린 고정 조직 중의 FGFR2 단백질의 정량적 SRM/MRM 분석에 유용하다고 여겨진다. 이러한 실험에 대한 추가 데이터 분석은 어떠한 특정 기관 부위로부터 이들 펩타이드 중의 어느 하나에 대해서도 선호도가 관찰되지 않았음을 나타낸다. 따라서, 이들 펩타이드 각각은 임의의 생물학적 샘플 또는 임의의 신체 기관 부위에서 유래한 임의의 포르말린 고정 조직의 액체 조직 용해물 상에 FGFR2 단백질의 SRM/MRM 분석을 수행하는데 적합하다고 여겨진다.
SRM/MRM 분석을 수행할 때 중요한 고려 사항이 펩타이드의 분석에 사용될 수있는 장비의 유형일 수 있다. SRM/MRM 분석법은 MALDI, 이온 트랩 또는 삼중사극을 포함한 모든 유형의 질량 분광계에서 개발 및 수행할 수 있지만, SRM/MRM 분석에 가장 적합한 장비 플랫폼은 현재 삼중사극 장비 플랫폼으로 간주된다. 이러한 유형의 질량 분광계는 현재 세포 내에 포함된 모든 단백질의 수십만에서 수백만 개의 개별 펩타이드로 구성될 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 중의 단일 단리된 표적 펩타이드의 추정 분석에 가장 적합한 장비이다.
FGFR2 단백질로부터 유도된 각각의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 분석을 가장 효율적으로 수행하기 위해서는, 분석 중에 펩타이드 서열에 추가하여 정보를 이용하는 것이 바람직하다. 그 추가 정보는 분석이 효율적으로 수행될 수 있도록 특정 표적화 된 펩타이드(들)의 정확하고 집중된 분석을 수행하기 위해 질량 분광계 (예: 삼중사극 질량 분광계)를 디렉팅하고 지시하는데 사용될 수 있다.
일반적으로 표적 펩타이드 및 특정 FGFR2 펩타이드에 관한 부가적인 정보는 펩타이드의 하나 이상의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이이온 및 각 전이이온의 이온 유형을 포함할 수 있다. 부가적인 펩타이드 정보는 FGFR2 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위해 사용될 수 있으며, 표 1에 이들 FGFR2 펩타이드를 나타내었다.
하기 기재된 방법은 1) FGFR2 단백질에 대한 질량 분석법에 기반한 SRM/MRM 분석에 사용할 수 있는 FGFR2 단백질로부터 후보 펩타이드 동정, 2) 연관시키기 위한 FGFR2 단백질의 표적 펩타이드에 대한 개별 SRM/MRM 분석법 또는 분석법들 개발 및 3) 암 진단 및/또는 최적 치료의 선택에 정량적 분석법을 적용하는데 사용된다.
분석 방법
1. FGFR2 단백질에 대한 SRM/MRM 후보 단편 펩타이드의 동정
a. 단백질 분해를 위해, 프로테아제 또는 복수의 프로테아제 (트립신을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있음)를 사용하여 포르말린 고정 생물학적 샘플로부터 액체 조직 단백질 용해물을 제조한다.
b. 이온 트랩 탠덤 질량 분광계에서 액체 조직 용해물 중의 모든 단백질 단편을 분석하고, 개별 단편 펩타이드가 인산화 또는 글리코실화와 같은 펩타이드 변형을 포함하지 않은 FGFR2 단백질의 모든 단편 펩타이드를 동정한다.
c. 이온 트랩 탠덤 질량 분광계에서 액체 조직 용해물 중의 모든 단백질 단편을 분석하고, 예를 들어 인산화 또는 글리코실화된 잔기와 같은 펩타이드 변형을 수행하는 FGFR2 단백질의 모든 단편 펩타이드를 동정한다.
d. 전장 FGFR2 단백질 전체로부터 특이적 분해 방법에 의해 생성된 모든 펩타이드는 잠재적으로 측정될 수 있지만, SRM/MRM 분석법 개발에 사용되는 선호 펩타이드는 포르말린 고정 생물학적 샘플로부터 제조된 복합 액체 조직 단백질 용해물에서 직접 질량 분석에 의해 동정된 것이다.
e. 포르말린 고정 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물을 분석할 때 환자 조직에서 특이적으로 변형되고 (인산화, 글리코실화 등), 질량 분광계에서 이온화되어 검출되는 펩타이드는 FGFR2 단백질의 펩타이드 변형을 분석하기 위해 부호 펩타이드로서 동정된다.
2. FGFR2 단백질 유래의 단편 펩타이드에 대한 질량 분석법
a. 액체 조직 용해물에서 동정된 개별 단편 펩타이드에 대한 삼중사극 질량 분광계에서의 SRM/MRM 분석이 FGFR2 단백질 유래 펩타이드에 적용된다:
i. 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노 역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 최적의 크로마토그래피 조건을 위한 단편 펩타이드 최적 보유 시간 결정,
ii. 각 펩타이드에 대한 SRM/MRM 분석법 개발을 위한 펩타이드의 모노 동위 원소 질량, 각 펩타이드에 대한 전구체 전하 상태, 각 펩타이드에 대한 전구체 m/z 값, 각 펩타이드에 대한 m/z 전이 이온, 및 각 단편 펩타이드에 대한 각 전이 이온의 이온 유형 결정,
iii. SRM/MRM 분석은 삼중사극 질량 분광계에서 (i) 및 (ii)의 정보를 사용하여 실시할 수 있으며, 각각의 펩타이드는 삼중사극 질량 분광계에서 실시된 고유한 SRM/MRM 분석을 정확하게 정의하는 특징적이고 고유한 SRM/MRM 시그니처 피크를 가짐;
b. SRM/MRM 질량 분석의 고유한 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적의 함수로서, 검출된 FGFR2 단백질의 단편 펩타이드 양을 SRM/MRM 분석을 실시하여, 특정 단백질 용해물 내의 단백질의 상대적 및 절대적 양을 나타낼 수 있다:
i. 상대 정량은 다음과 같이 수행할 수 있다:
1. 하나의 포르말린 고정 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 검출된 주어진 FGFR2 펩타이드의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 적어도 2, 3, 4 또는 그 이상의 포르말린 고정 생물학적 샘플의 적어도 2, 3, 4 또는 그 이상의 액체 조직 용해물의 동일한 FGFR2의 동일한 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적과 비교함으로써 FGFR2 단백질의 증가 또는 감소된 존재량을 결정,
2. 하나의 포르말린 고정 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 검출된 주어진 FGFR2 펩타이드의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 펩타이드 단편에 대한 두 샘플 간의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적 비교를 각 샘플에서 분석된 단백질의 양을 표준화한, 상이한 별도의 생물학적 소스에서 유래된 다른 샘플 내의 다른 단백질의 단편 펩타이드로부터 개발된 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적과 비교함으로써 FGFR2 단백질의 증가 또는 감소된 존재량를 결정,
3. 주어진 FGFR2 펩타이드에 대한 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 FGFR2 단백질의 변화하는 수준을 다양한 세포 조건하에서 그들의 발현 수준을 변화시키지 않는 다른 단백질 수준으로 표준화하기 위해 포르말린 고정 생물학적 샘플의 동일한 액체 조직 용해물 내 다른 단백질로부터 유래한 다른 단편 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 비교함으로써 FGFR2 단백질의 증가 또는 감소된 존재를 결정,
4. 이러한 분석법은 비변형된 단편 펩타이드 및 FGFR2 단백질의 변형된 단편 펩타이드 모두에 적용될 수 있으며, 상기 변형은 인산화 및/또는 글리코실화를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 변형된 펩타이드의 상대적인 수준은 비변형된 펩타이드의 상대적 양을 결정하는 동일한 방법으로 결정;
ii. 주어진 펩타이드의 절대적 양은 개별 생물학적 샘플 내 FGFR2 단백질의 주어진 펩타이드에 대한 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 생물학적 샘플의 단백질 용해물 내로 스파이크된 내부 단편 펩타이드 표준의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교함으로써 성취될 수 있다:
1. 내부 표준은 조사되고 있는 FGFR2 단백질의 단편 펩타이드의 표지 합성 버전이다. 이 표준은 알려진 양으로 시료에 스파이크되며, SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적은 내부 단편 펩타이드 표준 및 생물학적 샘플의 천연 단편 펩타이드 모두에 대해 별도로 결정되고, 이어서 두 피크 면적을 비교,
2. 이는 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드에 적용될 수 있으며, 상기 변형이 인산화 및/또는 글리코실화를 포함하지만 이에 한정되지는 않고, 변형된 펩타이드의 절대적 수준은 비변형된 펩타이드의 절대적 수준을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정될 수 있음.
3. 암 진단 및 치료에 단편 펩타이드 정량을 적용
a. FGFR2 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 실시하고, 환자 종양 조직에서 암의 단계/등급/상태에 대한 FGFR2 단백질 발현이 암 분야에서 잘 알려진 바와 같이 이전에 결정된 연관성이 확인됨을 입증한다.
b. FGFR2 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 실시하고, 다른 치료 전략의 임상 결과와의 상관관계를 입증하고, 이 상관관계는 현장에서 이미 입증되었거나 환자의 코호트 및 그러한 환자 조직의 상관관계 연구를 통해 향후 입증될 수 있다. 일단 이전에 확립된 상관관계 또는 향후의 상관관계가 이 분석에 의해 확인되면, 상기 분석법은 최적의 치료 전략을 결정하는데 사용될 수 있다.
특정 FGFR2 펩타이드에 대한 특이적이고 고유한 특성은 이온 트랩 및 삼중사극 질량 분광계에서 모든 FGFR2 펩타이드를 분석함으로써 개발되었다. 그 정보는 펩타이드의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, 전구체의 전이 m/z 값, 및 확인된 전이 이온 유형을 각각 포함한다. 그 정보는 포르말린 고정 샘플/조직의 액체 조직 용해물에서 직접적으로 각각 및 모든 후보 SRM/MRM 펩타이드에 대해 실험적으로 결정되어야 한다; 흥미롭게도 FGFR2 단백질의 모든 펩타이드를 본원에 기재된 바와 같이 SRM/MRM을 사용하여 그러한 용해물에서 검출할 수는 없기 때문에, 검출되지 않은 FGFR2 펩타이드는 포르말린 고정 샘플/조직의 액체 조직 용해물에서 직접적으로 펩타이드/단백질의 정량화에 사용하기 위해 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위한 후보 펩타이드로 간주 될 수 없다.
특정 FGFR2 펩타이드에 대한 특정 SRM/MRM 분석은 삼중사극 질량 분광계에서 수행된다. 특정 FGFR2 SRM/MRM 분석법에 의해 분석된 실험적 샘플은, 예를 들어 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 조직으로부터 제조된 액체 조직 단백질 용해물이다. 이러한 분석법과 같은 데이터는 포르말린 고정 샘플 중의 이 FGFR2 펩타이드에 대한 고유한 SRM/MRM 시그니처 피크의 존재를 나타낸다.
이 펩타이드의 특이적 전이 이온의 특성은 포르말린 고정 생물학적 샘플에서 특정 FGFR2 펩타이드를 정량적으로 측정하는데 사용된다. 이러한 데이터는 분석된 단백질 용해물 1 마이크로그램 당 펩타이드의 몰량의 함수로서 이 FGFR2 펩타이드의 절대양을 나타낸다. 포르말린 고정 환자 유래 조직의 분석에 기초한 조직에서의 FGFR2 단백질 수준의 평가는, 각각의 특정 환자에 대한 진단적, 예후적 및 치료학적 관련 정보를 제공할 수 있다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중의 섬유아세포 증식 인자 수용체 2 단백질 (FGFR2)의 수준을 측정하기 위한 방법을 기재하며, 상기 방법은 질량 분석기를 이용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 중의 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계; 및 상기 샘플 중의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고, 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다. 관련된 실시 양태에서, 하나 이상의 FGFR2 단편 펩타이드를 정량화하는 단계는 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 생물학적 샘플 중의 각각의 FGFR2 단편 펩타이드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 FGFR2 단편 펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 표준 펩타이드와 비교된다. 일부 실시 양태에서, 상기 내부 표준은 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정된 중동위원소를 포함하는 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드이다.
본원에 기재된 생물학적 샘플 (또는 그의 대용물로서의 단편 펩타이드) 중의 FGFR2 단백질의 수준을 측정하는 방법은, 환자 또는 개체에서 암의 진단 및/또는 예후 지표로서 사용될 수 있다. 일 실시 양태에서, 상기 FGFR2 단백질 수준의 측정 결과는 조직에서 발견되는 FGFR2 단백질 수준과 정상 및/또는 암 또는 전암성 조직에서 발견되는 FGFR2 단백질 수준을 연관시킴으로써 (예를 들어, 비교하는), 암의 진단 단계/등급/상태를 결정하는데 채용될 수 있다.
핵산과 단백질은 모두 동일한 Liquid Tissue™ 생체 분자 조제물로부터 분석할 수 있기 때문에, 단백질이 분석된 동일한 샘플의 핵산으로부터 질병 진단 및 약물 치료 결정에 대한 추가적인 정보를 생성할 수 있다. 예를 들어, FGFR2 단백질이 증가된 수준의 특정 세포에 의해 발현되는 경우, SRM에 의해 분석될 때, 데이터는 세포의 상태 및 통제되지 않은 성장, 잠재적인 약물 내성 및 암 발생 가능성에 대한 정보를 제공할 수 있다. 동시에, SMLN 유전자 및/또는 이들이 코딩하는 핵산 및 단백질 (예: mRNA 분자 및 그 발현 수준 또는 스플라이스 변형)의 상태에 대한 정보는 FGFR2 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가할 수 있는 동일한 Liquid Tissue™ 생체 분자 조제물에 존재하는 핵산에서 얻을 수 있다. 동일한 생체 분자 조제물에 존재하는 FGFR2 유래가 아닌 유전자 및/또는 핵산은 FGFR2 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가할 수 있다. 일 실시 양태에서, FGFR2 단백질 및/또는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 추가 단백질에 관한 정보는 이들 단백질을 코딩하는 핵산을 조사함으로써 평가할 수 있다. 이들 핵산은, 예를 들어, 단일 염기쌍 다형, 전이, 변위 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 서열 분석 방법, PCR 방법, 제한 단편 다형 분석, 결실, 삽입의 확인 및/또는 변이의 존재 결정의 하나 이상, 둘 이상 또는 세 가지 이상에 의해 조사될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> EXPRESSION PATHOLOGY INC. <120> SRM/MRM Assay for the Fibroblast Growth Factor Receptor 2 (FGFR2) protein <130> IPA171243-US <150> US62/161,757 <151> 2015-05-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Val Thr Val Ala Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu Lys 1 5 10

Claims (28)

  1. 생물학적 샘플 중의 섬유아세포 증식 인자 수용체 2 (FGFR2) 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법으로서,
    질량 분석법을 이용하여 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 중의 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및 상기 샘플 중의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고;
    여기서 상기 수준이 상대적 수준 또는 절대적 수준인 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계 전에 상기 단백질 분해물을 분획화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분획화 단계가 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 분해물이 액체 조직 프로토콜 (Liquid Tissue protocol)에 의해 제조되는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 프로테아제 분해물을 포함하는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 트립신 분해물을 포함하는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 사용되는 질량 분석법 모드가 선택 반응 모니터링 (Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 및/또는 다중 선택 반응 모니터링 (multiple Selected Reaction Monitoring, mSRM)인 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGFR2 단편 펩타이드가 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 소변 샘플, 혈청 샘플, 복수 샘플, 담 샘플, 림프액, 타액 샘플, 세포 또는 고형 조직인 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조직이 포르말린 고정 조직인 것인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 조직이 파라핀 포매된 조직인 것인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 조직이 종양으로부터 수득된 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 종양이 원발성 종양인 것인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 종양이 속발성 종양인 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드를 정량하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 FGFR2 단편 펩타이드를 정량하는 단계가 하나의 생물학적 샘플에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시된 FGFR2의 약 8 내지 약 45개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 FGFR2 단편 펩타이드의 양과, 상이한 별도의 생물학적 샘플에서 동일한 FGFR2 단편 펩타이드의 양을 비교하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 FGFR2 단편 펩타이드를 정량하는 단계가 알려진 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 생물학적 샘플 중의 상기 FGFR2 단편 펩타이드 각각의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 FGFR2 단편 펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 표준 펩타이드와 비교되는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드가 동위원소 표지 펩타이드인 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드가 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정된 중동위원소(heavy stable isotope)를 포함하는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해물 중의 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계가 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단백질의 존재 및 개체 내 암과의 연관성을 나타내는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 MSLN 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 단계/등급/상태와 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 FGFR2 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 단계/등급/상태와 연관시키는 단계가, 암의 진단 단계/등급/상태에 대한 부가적인 정보를 제공하기 위해 멀티플렉스 형식으로 다른 단백질 또는 다른 단백질의 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계와 조합되는 것인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 FGFR2 단편 펩타이드의 존재, 부재 또는 양 또는 FGFR2 단백질의 수준에 근거하여, 상기 생물학적 샘플이 수득되는 개체를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 수득되는 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 치료제 및/또는 투여되는 치료제의 양이 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드의 양 또는 FGFR2 단백질의 수준에 근거하는 것인, 방법.
  26. 제24항 및 제25항에 있어서, 치료제가 FGFR2 단백질에 결합하고/하거나 이의 생물학적 활성을 억제하는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 치료제가 FGFR2-발현 암세포를 특이적으로 표적하기 위해 선택되는 것인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 액체 조직 프로토콜 및 시약을 사용하여 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 FGFR2 단편 펩타이드를 정량하기 위해 처리된 포르말린 고정 종양 조직인 것인, 방법.
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