KR20180024795A - 천연물 비료 - Google Patents

Abstract

천연 미생물을 유효성분으로 포함하며, 상기 미생물의 효과를 향상시킬 수 있는 효과증진용 첨가제를 포함하여, 미생물에 의한 식물 생장효과를 극대화한 천연물 비료가 개시된다. 본 발명은, 유효미생물 배양액, 구아노 및 계면활성제를 포함하는 천연물 비료를 제공한다.

Description

천연물 비료{Natural fertilizer}

본 발명은 천연물 비료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연 미생물을 유효성분으로 포함하며, 상기 미생물의 효과를 향상시킬 수 있는 효과증진용 첨가제를 포함하여, 미생물에 의한 식물 생장효과를 극대화한 천연물 비료에 관한 것이다.

최근 환경문제가 인류의 생존,특히 식량문제와 직접적으로 관련되어 전 세계적으로 관심이 집중되어 있는 가운데 국내에서도 농산물에 대한 농약 잔류 문제가 꾸준히 대두되어 문제시 되고 있는 실정이다.

국내 농약 사용량은 1990년대 중반 1,205kg/km2로 OECD 회원국 중 일본에 이어 2위이며,OECD 평균 사용량 263kg의 4.6배,농약 최소 사용국인 뉴질랜드(25kg)의 48배에 해당하며 농약 과다 사용으로 인해 자연 환경 생태계 파괴,지하수 오염,농작물의 잔류 독성 및 해충의 저항성 출현 등 심각한 문제를 야기하고 있는 실정이다.이러한 문제 해결을 위해 '92 Rio 환경회의에서는 유기합성 농약의 사용량을 2004년까지 50% 감소하자는 국가 간의 협약을 체결하기에 이르렀고 1997년 미국에서는 기존 유기합성 살충제 사용의 46%,특히 채소 및 과수 재배에서 68%가 대체 농약(alternativepesticides)으로 전환하였으며,이중 과수 재배지의 14%와 채소 재배지의 6%를 곤충병원성곰팡이와 천적곤충 등을 이용하여 해충 방제('98,USDA-NASS)를 실시하고 있다.이러한 생물학적 방제는 환경 친화적인 방제 수단으로 농업생태계에 지속적으로 병해충밀도 억제효과를 발휘할 수 있으므로 외국에서는 범국가적인 차원에서 많은 연구가 수행 중이며,일부 단일 유효성분에 의해 병해충에 대한 생물학적 개발을 완성하여 시판 중이다.이처럼 대체 농약이 차지하는 비중은 점차 증가할 것으로 예상되고 있다.

세계적으로는 지난 20여 년간 생물적 방제기술의 발달로 인하여 환경에 대한 위해성을 감소시킬 수 있게 되었다.그럼에도 우리나라에서는 아직까지 화학농약의 오남용으로 인한 농작물 피해가 심각한 실정으로 이와 관련된 농촌진흥청 민원은 연간 2만4천 여 건이 접수되고 있으며 공식 접수되지 않은 민원을 포함하면 연간 4만 건 수준에 이르고 있는 실정이다(농업과학기술원,2006).이를 개선하기 위해서는 개별 농가에서 농약의 안전 사용기준을 준수하는 것이 중요하지만 이와 더불어 친환경 작물보호제와 같은 제품과 이를 이용한 기술을 개발보급하는 것도 시급히 해결해야 할 과제임에는 틀림없다.

또한 한칠레,한미,한EU FTA 등 각국 간의 자유무역협정(FTA)이 체결됨에 따라 값싼 수입농산물이 물밀 듯이 수입되고 있는 상황에서 이러한 값싼 수입농산물에 효과적으로 대처하기 위해서는 생산이 필요한 것은 분명한 사실이다.이러한 친환경 농산물을 꾸준히 생산하기 위해서는 친환경 농산물 재배농가의 소득을 향상시키고 안정적인 수익성을 확보해야 하며,이를 위해서는 친환경 농산물을 생산할 수 있는 기술이 개발되어 널리 보급되어야 한다.

경제산업적 측면에서 친환경 미생물농약의 개발비는 화학농약에 비해 투자가 상대적으로 경제적일 수 있다.이는 화학농약 개발비의 대부분을 차지하는 독성,잔류 관련 시험 등이 비교적 완화적이고,개발에 필요한 시간과 노력이 적은 이유에서이다.대부분 수입에 의존하는 기존 화학농약을 대체할 경우 수입 대체 효과와 더불어 식량주권의 회복에도 크게 일조하리라 여겨진다.

그러나 생물농약이 무조건 장점만 있는 것이 아니라 단점도 있기 때문에 미생물 농약 개발시에 해결해야 할 난제도 많이 있다. 특히 짧은 유통기간 및 지속기간, 적용범위가 좁아 특정 대상에만 작용하는 문제점, 효과의 발생이 늦으며, 약효가 낮은 문제점을 가지고 있어 이에 대한 연구가 지속적으로 수행되고 있다.

대한민국 등록특허 제 1616006호에서는 토착미생물을 이용한 맞춤형 토착 미생물 제제에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 바실러스, 트리코데르마, 슈도모나스, 유산균등의 토착미생물을 이용하여 토양을 개선시키고 있지만, 토양개선에는 많은 시간이 필요하며, 기존의 미생물과의 기질 경쟁으로 효과가 감소할 수 있다는 단점을 가진다.

대한민국 공개특허 제 2016-0028719호에서는 인광석과 미생물을 이용한 천연 비료의 제조방법에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 인광성 분말에 유기 발효물을 혼합하여 천연 비료를 제조하고 있지만, 비료의 제조시 발효에 걸리는 시간이 길며, 인의 공급을 인광석에 의존하고 있어 제조시 비용이 상승할 수 있다.

또한, 친환경작물보호제 및 비료가 개발될 경우 기존에 사장될 수 있는 많은 유용미생물의 상품화에 응용되어 국내에서 경쟁력 있는 다양한 미생물농약 원제 및 제품을 확보할 수 있는 기반이 될 수 있으며 농가들에게 보다 안전한 제품을 보급할 수 있는 장점이 있다.

환경 친화적인 작물보호제 및 효과적인 생산 공정의 개발은 차세대 생물 산업의 핵심 분야이다. 21세기형 작물보호제 개발은 국제경쟁력을 확보하고 과학기술선진국으로 도약해야 할 우리나라의 현시점에 있어서 매우 중요한 과제이다.국내 미생물 전문기관에서 확보된 미생물들을 이용하여 친환경 방제제를 개발하면 화학 농약 잔류문제로부터 해방되고 수출 시장에도 접목을 할 수 있을 것으로 기대를 한다.

기술적인 측면에서도 현재 친환경 미생물농약/비료의 제형화 기술은 국내는 물론 세계적으로도 초보적인 수준을 벗어나지 못하고 있다.특히 제형화 기술에 있어 첨가제 선발 및 제조공정,살충ㆍ항균성 기작을 가진 미생물과 작물성장을 촉진하는 미생물들이 안정적으로 현장에 살포되기 까지 효과와 안정성을 유지시키는 배합기술은 매우 까다롭다.따라서 본 연구의 기술이 개발되면 세계적인 수준의 기술로 인정받게 될 것이다.또한 미생물의 가장 큰 약점인 환경조건에 따라 효과의 편차가 심하다는 것과 실제 포장에서의 효과 지속성이 약하다는 단점을 보완할 수 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 식물성장 효과를 가지는 천연 미생물 및 상기 미생물의 효과를 더욱 높일 수 잇는 효과증진용 첨가제를 포함하여 기존의 천연 비료에 비하여 높은 효과를 가질 수 있는 천연물 비료를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 유효미생물 배양액, 구아노 및 계면활성제를 포함하는 천연물 비료를 제공한다.

또한 상기 천연물 비료는 유효 미생물 배양액 5~15%, 구아노 80~95%, 당밀 0.1~5%, 부식산 0.1~5%, 계면활성제 0.001~1%를 포함하는 입제인 것을 특징으로 하는 천연물 비료를 제공한다.

또한 상기 천연물 비료는 유효 미생물 배양액 50~70%, 구아노 20~40%, 잔탄검 0.01~0.5%, 계면활성제 1~10%, 시트릭산 1~5%를 포함하는 액상수화제인 것을 특징으로 하는 천연물 비료를 제공한다.

또한 상기 유효미생물은 Achromobacter속, Arthrobacter속, Brevibacillus속, Bacillus속, Burkholderia속, Chitinophaga속, Chryseobacterium속, Herbirhizobacter속, Kaistobacter속, Mucilaginibacter속, Paenibacillus속, Rhizobium속, Rhodopseudo - monas속, Shigella속, Sphingomonas속 또는 Variovorax속인 것을 특징으로 하는 천연물 비료를 제공한다.

또한 상기 천연물 비료는 오이, 토마토 또는 배추의 생육을 촉진하는 것을 특징으로 하는 천연물 비료를 제공한다.

이러한 본 발명에 따르면, 식물성장 효과를 가지는 천연 미생물 및 상기 미생물의 효과를 더욱 높일 수 잇는 효과증진용 첨가제를 포함하고 있으므로, 효과의 발현이 신속하며, 기존의 천연 비료에 비하여 높은 효과를 가질 수 있어 친환경 농산물 재배에 유용하다.

도 1은 미생물처리에 의한 토마토와 오이 종자의 발아 및 유근 생장 양상 사진,
도 2는 rRNA 유전자 염기서열을 이용한 선발균주 TO51 균주의 계통수상의 위치 (neighbor-joining)
도 3은 IAA 표준정량곡선 그래프,
도 4는 식물생육촉진활성 선발 Bacillus megaterium 균주 (6,8,9)의 배양실험 사진,
도 5는 식물생육촉진활성 측정 Br. brevis TO129 균주 (10,19)의 배양실험 사진,
도 6은 선발 균주에 대한 auxin 활성 확인 실험결과,
도 7은 선발 균주의 siderophore 활성 실험결과,
도 8은 선발균주의 phytase 활성 실험결과,
도 9는 선발 균주의 protease 활성 실험결과,
도 10은 배추 및 오이생육용 최종선발 균주의 배양사진,
도 11은 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 선발균주 TO129 균주의 계통수상의 위치 (neighbor-joining),
도 12는 미생물 처리에 따른 배추 생육실험결과 사진
도 13은 오이 생육에 대한 미생물의 효과 실험 사진

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명자들은 천연 비료에 있어서, 기존의 비료가 효과의 지속간이 짧으며, 그 식물 생육증진효과 역시 높지 않은 것이 주목하고 이를 해결하기 위하여 예의 노력을 한 결과, 유효미생물 배양액, 구아노 및 계면활성제를 포함하는 천연물 비료를 사용하는 경우 이러한 문제점을 해결 가능하다는 것을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명은 유효미생물 배양액, 구아노 및 계면활성제를 포함하는 천연물 비료에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 유효미생물은 식물의 생육을 촉진하는 활성을 가진 것이라면 제한 없이 사용 가능하지만, 바람직하게는 Achromobacter속, Arthrobacter속, Brevibacillus속, Bacillus속, Burkholderia속, Chitinophaga속, Chryseobacterium속, Herbirhizobacter속, Kaistobacter속, Mucilaginibacter속, Paenibacillus속, Rhizobium속, Rhodopseudo - monas속, Shigella속, Sphingomonas속 또는 Variovorax속일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 천연물 비료는 유효 미생물 배양액 5~15%, 구아노 80~95%, 당밀 0.1~5%, 부식산 0.1~5%, 계면활성제 0.001~1%를 포함하는 입제인 것을 특징으로 하는 천연물 비료일 수 있으며, 바람직하게는 유효 미생물 배양액 7~10%, 구아노 85~95%, 당밀 0.5~2%, 부식산 1~3%, 계면활성제 0.001~1%를 포함하는 입제일 수 있다. 지속적인 효과를 위하여 비료를 살포하거나, 인력에 의하여 비료를 살포하는 경우, 입상의 비료를 사용하는 것이 효과적이다. 따라서 본 발명의 유효성분인 미생물 배양액을 구아노를 담체로 하여 입상으로 제조하는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 당밀은 미생물 배양액을 구아노에 부착시키는 역할을 하며, 부식산은 구아노를 천천히 부식시켜 유효성분의 확산을 돕는 역할을 한다. 계면활성제는 상기 당밀과 부식산을 보조하여 부착 빛 확산의 효과를 높일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 천연물 비료는 유효 미생물 배양액 50~70%, 구아노 20~40%, 잔탄검 0.01~0.5%, 계면활성제 1~10%, 시트릭산 1~5%를 포함하는 액상수화제인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 유효 미생물 배양액 60~68%, 구아노 25~35%, 잔탄검 0.05~0.2%, 계면활성제 3~7%, 시트릭산 1~3%를 포함하는 액상수화제일 수 있다. 넓은 범위에 단시간의 효과를 가지는 비료를 살포하거나 기계를 이용하여 살포하는 경우 액상 수화제는 이용하는 것이 효과적이다. 따라서, 유효미생물 배양액에 분쇄한 구아노 분말을 혼합한 다음, 잔탄검, 계면활성제 및 시트릭산을 혼합하여 액상수화제를 제조하는 것이 바람직하다. 이때 사용되는 잔탄검은 구아노 분말을 액상내에 부유시키며, 계면활성제는 유효성분을 액상내로 확산시키는 역할을 한다. 시트릭산은 액상 수화제의 정균 작용 및 악취를 방지하는 역할을 수행한다.

본 발명에 있어서, 상기 천연물 비료는 오이, 토마토 또는 배추의 생육을 촉진하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 천연물 비료는 씨앗의 발아시 곁뿌리의 수를 증대시켜 식물의 생장을 촉진하므로, 다양한 작물에 사용될 수 있지만 바람직하게는 오이, 토마토 또는 배추의 생육을 촉진할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.

○ 오이 및 토마토식물생육촉진 미생물 선발

- 오이 및 토마토 종자의 발아 및 유근 생장을 증진시키는 PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) 작물생육촉진 미생물을 선발하기 위하여 목원대학교 미생물생태자원연구소(IMER)에서 보유하고 있는 세균 중, 인삼, 당귀, 황귀, 마 등의 약초 근권에서 분리한 1,000 여 종의 세균을 대상으로 PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) 활성 및 다당생성능을 측정하고 작물생육촉진능이 우수한 18균주를 선발하였다(표 1, 도 1).

Strain No.	오이 종자				토마토 종자
	Control	미생물 처리	표준오차 (±)	생장률 (%)	Control	미생물 처리	표준오차 (±)	생장률 (%)
TO1	7.0	6.7	0.1	-4.9	1.1	2.1	0.1	90.9
TO4	6.5	5.7	0.2	-11.7	2.1	3.1	0.1	47.6
TO5	3.0	6.4	0.2	113.3	1.1	2.6	0.2	136.3
TO13	1.5	4.0	0.1	166.7	1.0	2.1	0.1	110.0
TO16	3.5	4.9	0.2	40.6	1.7	2.7	0.1	285.1
TO28	2.6	4.3	0.2	69.4	2.6	5.4	0.1	58.8
TO39	2.5	6.1	0.3	141.0	3.9	4.1	0.2	6.5
TO40	2.2	5.9	0.1	168.2	1.7	5.1	0.2	200.0
TO44	6.3	6.7	0.1	6.7	0.7	1.2	0.1	71.4
TO46	6.8	6.8	0.3	0.0	1.7	2.2	0.2	29.4
TO47	6.6	5.4	0.1	-17.1	1.7	2.0	0.1	17.6
TO50	2.2	4.9	0.2	122.7	2.5	1.0	0.1	-58.4
TO51	2.4	5.8	0.1	144.7	1.8	1.6	0.1	-10.0
TO52	3.3	3.5	0.1	6.1	2.4	3.5	0.2	45.8
TO55	3.0	2.6	0.2	-13.3	1.2	1.9	0.1	58.3
TO101	6.8	4.3	0.1	-36.8	1.8	2.4	0.1	33.3
TO115	6.1	5.5	0.2	-9.1	1.9	3.2	0.2	68.4
TO129	2.2	6.3	0.1	186.4	1.9	4.0	0.1	113.5

○ 오이 및 토마토식물생육촉진 미생물 동정

- 식물생육촉진 및 다당생성 특성으로 선별된 세균의 동정은 대상균주에 대한 DB가 구축되어 안정된 분류동정 key로 인정 받고 있는 16S rRNA 부분 유전자염기서열을 분석하여 결정하였다. 분리균의 동정결과는 분석된 염기서열을 NCBI에서 Blast 검색을 통해 기 보고되어 있는 표준균주와의 유사도를 비교하여 가장 높은 유사도를 나타내는 표준균주명을 동정결과에 반영하였다.

- 1차 선발균주들의 염기서열을 결정하여 미국 NCBI의 BLAST 검색방법을 통해 기존에 등록된 다양한 균주들의 염기서열과 비교하여 가장 높은 유사도를 나타내는 표준균주명을 동정결과에 반영한 결과, 아래 표와 같이 세균에 속하는 Achromobacter 속 1종, Arthrobacter속 3종, Brevibacillus속 1종, Burkholderia속 1종, Chitinophaga속 1종, Chryseobacterium속 3종, Herbirhizobacter속 1종, Kaistobacter속 1종, Mucilaginibacter속 4종, Paenibacillus속 1종, Rhizobium속 6종, Rhodopseudo- monas속 1종, Shigella속 1종, Sphingomonas속 4종 및 Variovorax속 1종 등, 다양한 균속의 균주들로 동정되었다(표 2).

No.	목원대학교 IMER 보유 미생물	균주명	No.	목원대학교 IMER 보유 미생물	균주명
1	Chryseobacterium sp.	TO39	16	Sphingomonas sp.	Tan 25
2	Chryseobacterium sp.	TO50	17	Arthrobacter sp.	Tan-22
3	Sphingomonas sp.	TO51	18	Rhizobium sp.	Tan-RII-7
4	Sphingomonas sp.	TO13	19	Rhizobiums sp.	Sap-110
5	Kaistobacter sp.	TO47	20	Variovorax sp.	Wha-35
6	Brevibacillus sp.	TO129	21	Rhizobium giardinii	Tan-9
7	Paenibacillus sp.	TO5	22	Rhizobium mesosinicum	PNP 8
8	Achromobacter sp.	TO40	23	Rhizobium mesosinicum	1NP2
9	Chryseobacterium sp.	TO4	24	Arthrobacter defluvii	3MP1
10	Burkholderia caribiensis	DR 14	25	Arthrobacter oryzae	5MP1
11	Mucilaginibacter polysacchareus	DRP 28	26	Mucilaginibacter polysacchareus	DRP 31
12	Mucilaginibacter polysacchareus	DRP 29	27	Rhodopseudomonas faecalis	LP-1
13	Mucilaginibacter herbaticus	DR-9	28	Shigella sp.	DR-33
14	Herbirhizobacter polysaccharae	DRP-35	29	Chitinophaga sp.	MRP-15
15	Sphingomonas sp.	Tan-11	30	Rhizobium tibeticum	MR-8

○ 배추생육촉진 균주의 선발

시험작물의 종자를 70% EtOH로 표면살균하여 NaOCl 2% 용액에 15분간 침지한 후 D.W로 3회 수세한 다음 멸균수로 적셔진 petri dish에 치상하여 암조건에서 발아를 유도하였다. 2～3일 후 1mm 크기로 균일하게 자란 발아종자를 시험균주 배양액에 30분간 침지시킨 후 water agar (0.8%, pH 5.8) 위에 5립씩 3반복으로 치상하여 28℃에서 7일간 배양하면서 1일 간격으로 주근의 길이 및 측근수를 조사하였다. 무처리구로 D.W를 사용하였고, 대조구로는 E. coli를 사용하였으며 무처리구 및 대조구와 비교하여 주근의 길이 및 측근형성성율이 높은 균주 중에서 가장 우수한 균주를 최종선발균주로 선정하였다(표 3).

No.	목원대학교 IMER 보유 미생물	균주명	No.	목원대학교 IMER 보유 미생물	균주명
1	Chryseobacterium sp.	TO39	16	Sphingomonas sp.	Tan 25
2	Chryseobacterium sp.	TO50	17	Arthrobacter sp.	Tan-22
3	Sphingomonas sp.	TO51	18	Rhizobium sp.	Tan-RII-7
4	Sphingomonas sp.	TO103	19	Rhizobiums sp.	Sap-110
5	Kaistobacter sp.	TO47	20	Variovorax sp.	Wha-35
6	Brevibacillus sp.	TO129	21	Rhizobium giardinii	Tan-9
7	Paenibacillus sp.	TO5	22	Rhizobium mesosinicum	PNP 8
8	Achromobacter sp.	TO40	23	Rhizobium mesosinicum	1NP2
9	Chryseobacterium sp.	TO4	24	Arthrobacter defluvii	3MP1
10	Burkholderia caribiensis	DR 14	25	Arthrobacter oryzae	5MP1
11	Mucilaginibacter polysacchareus	DRP 28	26	Mucilaginibacter polysacchareus	DRP 31
12	Mucilaginibacter polysacchareus	DRP 29	27	Rhodopseudomonas faecalis	LP-1
13	Mucilaginibacter herbaticus	DR-9	28	Shigella sp.	DR-33
14	Herbirhizobacter polysaccharae	DRP-35	29	Chitinophaga sp.	MRP-15
15	Sphingomonas sp.	Tan-11	30	Rhizobium tibeticum	MR-8

- 식물생육활성능을 가진 30균주에 대하여 배추를 대상으로 실험한 결과, 배추에서는 TO51, TO13, TO4, DR-9, DRP-35, Tan-11 및 MR-8 등 7개 균주가 주근의 길이 및 측근수에서 무처리구(D.W) 및 대조구 (E. coli) 보다 우수한 생육양상을 나타냈다(표 4 및 표 5)

배추 (7일)	Ⅰ					Ⅱ					Ⅲ					평균값 (mm)
주근길이 (mm)	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
D.W	35	52	35	50	38	36	35	33	52	31	48	35	30	40	48	39.9
E. coli	43	45	52	55	45	53	45	50	55	40	42	38	42	45	40	46.0
3. TO51	46	60	53	56	54	53	85	63	65	53	54	65	58	53	43	57.4
4. TO13	50	45	65	50	45	65	50	65	50	47	52	65	45	54	64	54.1
9. TO4	40	45	79	73	35	60	55	40	37	37	65	65	65	45	58	53.3
13. DR-9	65	68	55	68	65	40	65	45	47	57	40	45	55	61	50	55.1
14. DRP-35	41	45	41	45	42	47	52	42	40	45	45	40	41	42	39	46.1
15. Tan-11	40	43	47	57	42	48	46	39	43	49	41	40	42	50	46	48.1
30. MR-8	60	45	53	63	43	63	65	58	51	51	48	52	50	43	50	53.0

배추 (7일)	Ⅰ					Ⅱ					Ⅲ					평균값
측근수	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
D.W	11	12	0	12	12	11	0	12	13	12	13	11	12	0	11	9.5
E. coli	11	12	12	13	12	13	11	13	13	10	12	11	12	12	11	11.9
3. TO51	15	14	15	17	16	13	15	14	16	14	15	14	14	15	16	14.9
4. TO13	13	12	12	13	12	12	13	11	13	13	13	12	12	13	13	12.5
9. TO4	11	13	13	11	12	12	13	12	13	11	11	13	13	11	13	12.1
13. DR-9	13	13	12	13	11	13	11	13	13	13	11	13	11	12	13	12.3
14. DRP-35	13	13	12	12	10	11	12	13	13	12	13	12	11	13	12	12.1
15. Tan-11	13	13	13	13	10	13	13	12	13	13	12	12	12	12	12	13.4
30. MR-8	14	13	13	11	12	12	12	12	12	12	14	12	12	13	12	12.4

- 그 중 Sphingomonas sp . TO51 균주 처리구는 무처리구(D.W)가 평균 39.9 mm, E. coli 처리구가 평균 46.0 mm 인 것과 비교하여 주근의 길이가 대조구보다 24.8% 신장된 평균 57.4 mm를 나타냈으며, 측근수는 대조구 평균 11.9개 보다 12.5% 증가한 평균 14.9개를 나타냈다. 따라서, 배추생육촉진 미생물로서 Sphingomonas sp. TO51 균주를 처리한 것이 가장 우수한 생육을 나타낸 것으로 결정하여 선정하였다.

○ 배추 생육촉진 우수균주 TO51 균주의 계통분류학적 분석

- 선발균주 TO51 균주의 정확한 동정을 위하여 계통분류학적 분석을 실시하였다. 16S rRNA 전체 유전자 염기서열을 획득하여 결정된 염기서열은 미국 NCBI의 BLAST 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 균주들의 염기서열과 비교하여 가장 높은 유사도를 나타내는 표준균주명을 동정결과에 반영하였다.

- 배추 생육촉진 우수균주 TO51 균주에 대하여 1,241 bp의 16S rRNA 유전자 염기서열을 획득하였고, NCBI의 BLAST search 결과, Sphingomonas pseudosangunis G1-2T 균주와 99.8%의 유사도를 나타내어 Sphingomonas pseudosangunis로 동정되었다(도 2).

○ Auxin 활성에 따른 우수균주선발

Bacillus 속 균주 및 Brevibacillus 속 TO129 균주를 포함한 26 균주에 대하여 auxin 생성능을 측정하였다(표 6). 식물호르몬 auxin 활성은 King’s B (KB) 배지를 사용하여 측정 하였으며, KB배지 100mL에 옥신 전구체인 L-tryptophan을 0.1% 첨가하고 균주를 접종하여 28℃에서 24시간 배양한 다음 배양액을 4℃에서 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 salkowski 용액 (35% HClO4 50 mL, 0.5M FeCl3 1mL)과 1:2로 30분간 암실에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 시판 auxin 표준물질(IAA, indole-3-acetic acid)의 표준곡선을 작성하여 정량하였다(도 3). 그 결과, 표15와 같이 기존의 균주의 활성과 비교하여 그림과 같이 Bacillus 속 균주로서 약 20 μg IAA/ml 이상의 세 균주 (6, 8, 9)를 선발하였고, Brevibacillus 속 TO129 균주에서도 50 μg IAA/ml 이상의 강한 활성을 나타낸 두 균주 (10, 19)를 선발하였다(도 4, 5).

번호	균주명	OD540nm	μg IAA/ml
1	Pb. polymyxa A (PPA)	0.288	7.8
2	Pb. polymyxa B (PPB)	0.523	19.1
3	Pb. polymyxa C (PPC)	0.354	11
4	B. subtilis (BS1-2)	0.241	5.6
5	B. megaterium (BM1)	0.114	0.05
6	B. megaterium BM2 (BM2-2)	0.736	29.3
7	B. megaterium (BM3)	0.124	0.01
8	B. megaterium 4BJ -23 (BM4-2)	0.082	0.04
9	B. megaterium 4BH32 (BM5)	0.505	18.2
10	Br . brevis TO129 1 ( TSA ) hard	1.232	53.1
11	Br. brevis TO129 2 (TSA) wide	0.612	23.3
12	Br. brevis TO129 3 (TSA)	0.26	6.47
13	Br. brevis TO129 4 (TSA)	0.501	18
14	Br. brevis TO129 5 (TSA)	0.347	10.6
15	Br. brevis TO129 6 (TSA)	0.35	10.8
16	Br. brevis TO129 (TSA)	0.086	0.04
17	Br. brevis TO129 (R2A)	0.908	37.5
18	Br. brevis TO129 A8	0.706	27.9
19	Br . brevis TO129 B-8	1.305	56.6
20	TO5 A	0.112	0.05
21	TO5 B	0.181	2.7
22	TO51 (vial)	2.659	121.5
23	261 A	2.635	120.4
24	261 B	2.635	120.4
25	261 C	2.635	120.4
26	E. coli DSM1116 (negative control)	0.319	9.3

○ 배추 생육촉진 Bacillus 속 균주의 PGPR 활성측정

① Auxin 생성능

앞서 1차 실험을 통해 선발된 Bacillus 속 세 균주 및 Brevibacillus 속 TO129 두 균주에 대하여 auxin 생성능을 확인하기 위하여 제측정한 결과. 1차에서와 거의 유사하게 Bacillus 속 균주에서는 20 μg IAA/ml 이상, Brevibacillus 속 TO129 균주에서는 50 μg IAA/ml 이상의 활성을 나타내었다 (도 6, 표 7).

번호	균주명	OD540nm	μg IAA/ml
6	B. megaterium BM2 (BM2-2)	0.750	30.0
8	B. megaterium 4BJ-23 (BM4-2)	0.167	2.0
9	B. megaterium 4BH32 (BM5)	0.560	21.3
10	Br. brevis TO129 1 (TSA) hard	1.272	54.5
19	Br. brevis TO129 B-8	1.320	56.8

② Siderophore 생산능 측정

철이온 경쟁으로 타 미생물의 생육을 억제하는 경쟁적 길항작용으로 특히 병원성 곰팡이의 생육을 억제하는 siderophore의 생성능을 측정하였다. 활성은 CAS (chrome azurol S) blue agar 배지에 분리균을 접종하여 28℃에 배양하여 오렌지색의 투명환 생성유무를 관찰하여 siderophore 생산능을 측정하였다. 그 결과, Bacillus 속 균주로서는 8번 균주가 가장 활성이 높았고 그 다음으로 9번, 6번 순이었으며, Brevibacillus 속 TO129는 19번 균주가 10번 균주보다 활성이 높게 나타났다(도 7, 표 8).

번호	균주명	Siderophore 활성
6	B. megaterium BM2 (BM2-2)	++
8	B. megaterium 4BJ-23 (BM4-2)	+++++
9	B. megaterium 4BH32 (BM5)	++++
10	Br. brevis TO129 1 (TSA) hard	+
19	Br. brevis TO129 B-8	++

③ Phytase (인산 가용화) 활성

난용성 인산염의 분해능을 통해 인산의 흡수를 용이하게 하여 식물생육을 촉진시키는 인산가용화능의 활성을 측정하였다. 인산가용화능은 LB-calcium phosphate agar배지(LB agar 배지에 CaCl2와 K2HPO4를 0.5% 첨가)에 분리균을 도말하여 28℃에서 5일간 배양하면서 균체 주위에 인산용해 투명환이 생성되는 것을 통해 분해능을 측정하였다. 그 결과, Bacillus 속 균주는 세 균주 모두 활성을 보였고, Brevibacillus 속 TO129는 19번 균주에서만 활성을 나타냈다(도 8, 표 9).

번호	균주명	Phytase 활성
6	B. megaterium BM2 (BM2-2)	+++
8	B. megaterium 4BJ-23 (BM4-2)	+++
9	B. megaterium 4BH32 (BM5)	+++
10	Br. brevis TO129 1 (TSA) hard	―
19	Br. brevis TO129 B-8	+++

④ Protease (단백질분해) 활성

단백질분해능은 Skim milk agar배지(DB)에 균주를 도말하여 28℃에서 5일간 배양하면서 균체 주위에 단백질분해 투명환이 생성되는 것을 통해 분해능을 측정하였다. 그 결과, Bacillus 속 균주는 세 균주 모두 활성을 보인가운데 9번 균주가 가장 강한 활성을 나타냈고, Brevibacillus 속 TO129는 19번 균주에서만 활성을 나타냈다(도 9, 표 10).

번호	균주명	Protease 활성
6	B. megaterium BM2 (BM2-2)	+++
8	B. megaterium 4BJ-23 (BM4-2)	+++
9	B. megaterium 4BH32 (BM5)	+++++
10	Br. brevis TO129 1 (TSA) hard	―
19	Br. brevis TO129 B-8	+++

○ 배추 생육촉진 Bacillus 속 우수 균주 최종선정

Bacillus 속 세 균주에 대하여 auxin 생산성을 중심한 PGPR 활성을 측정한 결과 auxin 생산성을 포함한 PGPR 활성이 전체적으로 우수한 9번 균주 Bacillus megaterium BM5 균주를 최종활성균주로 선정하였다. 한편, Brevibacillus brevis TO129 균주에서 나타난 두 가지 타입의 콜로니에 대하여 각각 PGPR 활성을 측정한 결과, 19번 균주에서 더 높은 활성을 보였으며, 기 선발된 균주로서 PGPR 활성이 존재함을 확인하였고, 특히 auxin 활성이 약 57 μg IAA/ml로 높았다(표 11).

번호	균주명	μg IAA/ml	Siderophore	Phytase	Protease
6	B. megaterium BM2 (BM2-2)	30.0	++	+++	+++
8	B. megaterium 4BJ-23 (BM4-2)	2.0	+++++	+++	+++
9	B. megaterium 4BH32 (BM5)	21.3	++++	+++	+++++
10	Br. brevis TO129 1 (TSA) hard	54.5	+	―	―
19	Br . brevis TO129 B-8	56.8	++	+++	+++

배추생육용으로 선발되었던 TO51 균주에 대하여 Bacillus 속 균주로서 Bacillus megaterium BM5 균주로 대체하여 향후 실험에 사용하였으며, 오이생육용 기 선발균주 Brevibacillus brevis TO129는 식물호르몬 auxin 생성능, 항진균성 경쟁적저해제 siderophore 활성과 인산가용화능 및 단백질분해능 등의 식물생육촉진 효능을 갖고 있음을 확인하여 오이생육용 미생물제제로 적합한 효능을 갖고 있는 균주임을 확인하였다(도 10).

○ 오이생육촉진 균주 선발

식물생육활성능을 가진 30균주에 대하여 오이를 대상으로 배추에서와 같은 방법으로 생육촉진실험을 실시한 결과, 오이에서는 배추에서는 TO39, TO50, TO129, Wha-35 및 PNP8 등 5균주가 주근의 길이, 측근수 및 측근의 길이에서 무처리구(D.W) 및 대조구 (E. coli) 보다 우수한 생육양상을 나타냈다(표 12, 표 13 및 표 14).

오이 (7일)	Ⅰ					Ⅱ					Ⅲ					평균값 (mm)
주근길이 (mm)	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
D.W	80	115	90	85	102	85	112	95	87	115	75	125	102	76	88	95.5
E. coli	142	150	102	114	95	105	142	107	125	120	90	80	110	152	35	111.3
1. TO39	122	131	125	100	105	132	109	107	105	102	132	102	107	135	117	115.4
2. TO50	115	120	121	102	120	115	116	110	110	112	105	115	112	117	108	113.2
6. TO129	110	145	150	132	132	130	125	126	132	127	130	120	150	135	122	131.1
20. Wha-35	100	115	140	145	100	95	110	120	125	145	115	110	150	110	115	119.7
22. PNP 8	90	190	130	162	110	122	152	110	130	85	95	90	150	140	95	123.4

오이 (7일)	Ⅰ					Ⅱ					Ⅲ					평균값
측근수	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
D.W	10	12	10	8	14	14	13	12	11	6	11	5	10	7	7	10.0
E. coli	15	15	17	15	18	16	15	15	15	17	15	14	16	14	16	15.5
1. TO39	15	17	15	14	13	15	14	14	17	15	18	13	18	18	16	15.5
2. TO50	15	15	16	18	14	18	15	15	15	15	14	18	18	15	14	15.7
6. TO129	15	16	17	16	18	16	17	16	15	15	18	15	15	18	17	16.3
20. Wha-35	15	15	15	18	15	15	15	15	18	15	15	15	15	15	15	15.4
22. PNP 8	15	18	15	15	17	15	15	14	15	17	15	15	18	15	15	15.6

오이 (7일)	Ⅰ					Ⅱ					Ⅲ					평균값 (mm)
측근길이 (mm)	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
D.W	3	3	2	2	3	3	2	3	2	3	3	2	2	3	2	2.5
E. coli	2	3	3	3	3	3	3	3	2	3	3	3	2	3	3	2.8
1. TO39	3	4	3	4	3	3	3	3	3	4	3	3	3	4	3	3.3
2. TO50	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	2	3	2.9
6. TO129	3	4	5	4	4	3	3	3	3	4	5	3	4	3	3	3.6
20. Wha-35	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3.0
22. PNP 8	4	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3.1

그 중 Brevibacillus sp. TO129 균주 처리구는 무처리구(D.W)가 평균 95.5 mm, 대조구 E. coli 처리구가 평균 111.3 mm 인 것과 비교하여 주근의 길이가 대조구보다 17.8% 신장된 평균 131.1 mm를 나타냈으며, 측근수는 대조구 평균 15.5개 보다 5.2% 증가한 평균 16.3개를 나타냈고, 측근의 길이는 대조구 평균 2.8 mm 보다 29% 증가한 평균 3.6 mm를 나타냈다. 따라서, 오이생육촉진 미생물로서 Brevibacillus sp. TO129 균주를 처리한 것이 가장 우수한 생육을 나타낸 것으로 결정하여 선정하였다.

○ 오이 생육촉진 최우수균주 선발 및 계통해석

식물생육활성능을 가진 30균주에 대하여 오이를 대상으로 배추에서와 같은 방법으로 생육촉진실험을 실시한 결과, TO129 균주에서 주근의 길이, 측근수 및 측근의 길이가 가장 우수한 것으로 나타나 오이 생육촉진 최우수 균주로 선발하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열분석 및 NCBI의 BLAST search 결과, Brevibacillus brevis NBRC 15304T 균주와 99.7%의 유사도를 보여 Brevibacillu brevis로 확인되었다(도 11).

○ 입상제 활용 천연물의 선발

친환경 비료의 경우 가장 큰 문제점이 화학비료에 비해 비효함량이 낮아 생육 및 수확량의 감소에 있다. 따라서, 천연물 선발의 중점을 친환경 자제중 비효 성분이 높은 자제들을 우선적으로 선발하여 그 가능성을 검토하였다.

- 재 료: 입상 아미노산박(NPK=10-0.5-0.5),

질소구아노(NPK=11-8-17),

입상 부식산(부식산 80%)

- 시험 작물: 오이 유묘

- 시험 방법: 100kg/㎡기준 와그너 pot당 1g씩 기비 처리

- 생육 조사: 정식 12일모를 대상으로 처리 10일후 초장, 근장, 생체중 조사

- 시험 결과: N-구아노 입상의 효과가 가장 우수하였으며, 아미노산박도 무처리에 비해 높은 생육 증진 효과를 보였다. 또한, 입상부식산은 타 처리구에 비해 지하부 생육 효과가 양호하였다. 따라서, 미생물의 비효적 효과를 크게 보완하면서 비효 함량이 높아 생육증진에 큰 효과를 보이는 N-구아노를 미생물의 효과 보조제 및 증량제로 선발하였다(표 15).

구분	초장 (cm)	지상부 생체중량 (g)	뿌리 건조중량 (g)	뿌리길이 (cm)
입상부식산	44.3?1.2	44.1?0.5	0.32?0.6	17.6?0.1
입상 아미노산박	48.0?0.4	50.1?0.6	0.31?0.4	17.2?0.2
N-구아노 입상	51.7?0.6	50.9?0.9	0.29?0.6	16.9?0.3
무처리	34.2?0.5	42.2?0.4	0.18?0.2	14.9?0.2

○ 액상수화제 활용 천연물의 선발

친환경 자재의 경우 자체 비료분의 함유량이 낮고 속효성이 많이 결여되는 단점을 가지고 있다. 또한, 함량이 높은 구아노, 아미노산 부산물의 경우도 기비 위주로 추비에 적합성이 낮고, 차후 미생물의 함유량을 높이기 위해 부수적인 공정 과정을 거친다. 따라서, 비료분이 높은 원료를 추비가 가능한 형태인 액상수화제 형태로 만들어 상기의 단점을 보완하고자 하였다.

- 재 료: 질소구아노 분말(NPK=11-8-17)

- 시험 작물: 배추 유묘

- 시험 방법: 질소구아노 분말을 500배, 1000배, 2000배 희석하여 7일 간격 으로 300ml/pot씩 2회 관주 처리

- 생육 조사: 최종 처리 1주일후 초장, 엽폭

- 시험 결과: N-구아노 2000배 이상의 처리구 모두에서 무처리에 비해 효과 우수로 액상화시 25% 이상 첨가시 효과를 기대할 수 있었다(표 16). 단, 수화형의 경우 장기 정체 보관시 침전에 의한 굳는 증상 등이 발생할 수 있어, 제형화시 부유제, 확산제, 점도증가제 등의 첨가 시험을 통해 제품 안정화할 필요성이 있다.

구분	방울토마토 (초장)	백다다기 (초장)	열무 ( 엽장 )	상추 ( 구폭 )
구아노 500배	39.2 ± 2.2cm	42.2 ± 1.6cm	22.8 ± 0.6cm	17.4 ± 1.4cm
구아노 1000배	38.8 ± 1.8cm	41.6 ± 3.2cm	23.2 ± 1.2cm	17.2 ± 1.8cm
구아노 2000배	36.3 ± 2.6cm	37.4 ± 2.8cm	21.3 ± 0.8cm	16.4 ± 1.4cm
무처리	29.6 ± 3.4cm	33.2 ± 3.8cm	18.2 ± 1.6cm	14.2 ± 2.2cm

실시예 1( 입제 )

구아노 입상을 40℃ 열풍건조기에서 24hr 건조하여 수분 함량을 5%이하로 낮추고 미생물 배양원액 10%를 Air 교반하며 스프레이 하여 미생물이 입상제형의 안쪽까지 흡수되도록 하였다. 이후 당밀과 물 1:1 혼합액을 1% 첨가하고 Air 교반하여 입상 표면에 접착력을 갖게 한 후 다시 분말 부식산 2%에 대해 각각 SA-DT7W 5%, SA-SLS 2% 첨가한 혼합 분말을 투입하며 Air 교반하며 시제품을 조제하였다(표 17).

구 분	원료명	투입비율(%)	비고
유효성분	유효미생물 배양액 ( Sphingomonas pseudosangunis TO51)	7-10	-
효력보조제	구아노(입상)	90	담채부유 고착
성형보조제	당밀:물=1:1	1	접착
	부식산	2	확산
계면활성제	SA-DT7W	분말부식산의 5%	접착
	SA-SLS	분말부식산의 2%	확산
Total		103

실시예 2(액상 수화제 )

N-구아노 분말을 믹서기를 통해 미세 분쇄하여 균질화하고, 유효미생물 배양액(Brevibacillus sp. TO129 6.8×108cfu/ml) 65%에 구연산 2%를 녹인 배양액(pH 3.5)에 UT-100PX 1%와 혼합하여 묽은 진탕액을 조제하였다(30min). 다시 UT-34TDP 2%, SA-SC500 2%의 액상계면활성제에 NK-XG(잔탄검) 0.1%를 혼합한 액을 서서히 넣으며, 점도를 증가하여 부유된 안정화 상태의 액상 수화제를 조제하였다(표 18).

구 분	원료명	투입비율(%)	비고
유효성분	유효미생물 배양액	65	-
	N-구아노분말 쎌매스	30	NPK+Ca 5-0-0
증점제	NK-XG(잔탄검)	0.1	담채부유 고착
전착/확산	UT-100PX	1	확산
	UT-34TDP	2	확산
부유제	SA-SC500	2	담채부유
안정제	Citric acid	2	정균/악취
Total		100

실험예 1 : 미생물제를 이용한 배추 생육 증진효과 폿트 검정

생육촉진 미생물의 생육증진 효과를 검정을 위해 시설하우스에서 11 x 10cm의 원예용 상토를 넣은 비닐폿트에 배추(품종 : 휘파람골드)를 정식하고, Chryseobacterium sp. 등 6종의 미생물을 포함하는 실시예 1의 방법으로 제조된 비료를 100배, 500배 농도로 5∼7일 간격 3회 폿트에 관주 처리하였다(표 19).

처리내용	미생물수(cfu/mL)	처리농도	처리간격 및 횟수	비 고
Chryseobacterium sp.	4.2 × 109	500, 100배	5∼7일, 3회	배추
Chryseobacterium sp.TO39	1.2 × 1010	〃	〃	〃
Achromobacter sp .TO40	1.0 × 109	〃	〃	〃
Chryseobacterium sp.TO50	1.1 × 1010	〃	〃	〃
Sphingomonas sp.TO51	1.4 × 109	〃	〃	〃
Brevibacillus spTO129	6.6 × 108	〃	〃	〃
대조자재(제품명 :엑스텐)		1,000배	〃	〃
무처리(물)			〃	〃

배추 생육시험 결과, Sphingomonas sp .TO51과 Brevibacillus sp . 2종은 생체중의 증가가 우수하게 나타났다. 처리농도에서는 100배에서 증가경향이 높으나 유의한 차이는 없었다. 이들 미생물은 대조자재와 무처리 보다 생체중이 증가하였다(표 20 도 12).

처리내용	처리 농도	초장 (㎝)	엽장 (㎝)	엽폭 (㎝)	엽수 (매/주)	엽색도 (SPAD)	지상부 생체중(g/10주)	지하부 생체중(g/10주)
Chryseobacterium sp.TO4	500배	8.4?0.4	7.7	3.8	5.6	23.2	23.8?2.2 z)	2.9?0.5
	100배	8.5?0.1	7.8	3.8	6.5	25.9	26.1?1.0	4.6?0.2
Chryseobacterium sp.TO39	500배	9.2?0.4	8.5	4.0	6.5	23.6	26.2?2.3	3.4?0.3
	100배	9.5?0.4	8.9	4.0	5.8	24.9	26.5?1.7	5.2?0.2
Achromobacter sp .TO40	500배	8.6?0.1	7.7	3.8	6.5	22.3	26.6?1.3	2.9?0.3
	100배	8.7?0.4	8.0	3.9	5.9	22.5	25.4?0.3	4.0?0.3
Chryseobacterium sp.TO50	500배	8.0?0.4	7.5	3.5	6.1	25.3	24.5?1.8	5.2?0.4
	100배	7.6?0.2	7.1	3.4	5.5	23.4	20.1?1.5	5.3?0.7
Sphingomonas sp.TO51	500배	9.3?0.4	8.7	4.1	6.4	25.9	33.1?2.7	3.3?0.3
	100배	9.7?0.5	9.0	4.0	6.6	25.7	34.6?2.4	4.1?0.8
Brevibacillus sp.TO129	500배	9.6?0.2	9.0	4.1	6.9	26.9	35.7?2.6	3.5?0.3
	100배	9.2?0.3	8.5	4.0	6.6	24.3	36.0?1.8	3.9?0.3
대조자재	1,000배	8.8?0.4	8.2	3.8	6.1	24.8	26.8?0.6	4.8?0.6
무처리	물	8.7?0.3	8.0	3.8	6.2	25.1	29.0?1.8	2.9?0.2

실험예 2 : 미생물제를 이용한 배추 생육 증진효과 포장 검정 및 현장활용기술 개발

재배작형은 노지재배와 시설재배로 구분하여 2회에 걸쳐 수행하였다. 노지재배는 가을작형으로 배추(품종 : 휘파람골드)를 10월 1일 포장에 정식하였다. 시험에 사용한 미생물제는 실시예 2에서 제조한 시료를 사용하였다. 미생물제를 표 21의 처리 농도로 조절하여 정식 2주 후부터 5일 간격 4회, 7일 간격 3회, 10일 간격 2회 토양에 처리하였다. 12월 16일 배추를 수확하여 수량 및 생육특성을 조사하였다. 미생물 처리농도는 1×109cfu/mL이었고, 관주량은 평방미터당 2L이었다

시설재배는 봄작형으로 배추(품종 : 휘파람골드)를 3월 3일 포장에 정식하였다. 시험에 사용한 미생물제는 표21의 처리 농도로 조절하여 정식 2주 후부터 5일 간격 4회, 7일 간격 3회, 10일 간격 2회 토양에 처리하였다. 5월 11일 배추를 수확하여 수량 및 생육특성을 조사하였다. 미생물 처리농도는 1×109cfu/mL이었고, 관주량은 평방미터당 2L이었다. 생육특성 및 수량은 농업과학기술 연구조사분석기준(농촌진흥청, 2012)에 따라 조사하였다.

실험 포장은 전라남도 나주시의 노지포장 및 시설하우스에서 난괴법 3반복으로 설계하였으며, 반복당 40주 이상의 오이를 시험하였다. 통계분석은 R Project 프로그램 3.0.1 버전 (2013)을 이용하여 ANOVA 분석과 Duncan’s multiple range test 실시하였다.

처리내용	미생물수(cfu/mL)	처리농도	처리간격(횟수)
미생물제( Bacillus megaterium 및 보조제)	1.0 × 109	250, 500배	5(4), 7(3), 10일(2회)
보조제(바이오-N)		500배	7일(3회)
대조자재(제품명 : 엑스텐)		1,000배	7일(3회)
무처리		-	7일(3회)

노지배추에 미생물제를 250배와 500배 농도로 희석하여 처리한 결과, 두 농도간에 구중 등 수량구성요소와 수량에 있어서 유의한 차이는 없었다. 500배 처리구에서 처리간격에 따른 생육 및 수량특성은 처리횟수가 많을수록 증가하는 경향이었으며, 5일과 7일 간격 처리구에서 유의한 차이는 없었다. 미생물제 500배 처리구를 대조자재와 비교하였을 때, 7일 간격 처리구에서 생육이 양호하였고, 수량도 증가하였다. 미생물제 500배 처리농도를 7일 간격으로 처리할 경우, 무처리구에 비해 24.8%의 수량이 증가하였다(표 22). 따라서 미생물제를 500배 희석하고 7일 간격으로 처리할 경우 대조자재 보다 생육 및 수량이 우수할 것으로 판단된다.

처리내용	처리 농도	처리 간격	엽장(㎝)	엽폭 (㎝)	엽수 (매)	구고 (㎝)	구폭 (㎝)	구중 (g)	수량 (kg/10a)	수량 지수
미생물제	250배	5	34.2	23.0	72.1	32.5	23.7	1457.4	5,397 az )	104
		7	35.0	23.8	71.9	33.6	23.0	1448.7	5,364 a	103
		10	32.5	21.6	66.2	30.9	20.8	1415.6	5,242 ab	101
	500배	5	32.9	22.0	67.0	31.5	20.1	1446.8	5,357 a	103
		7	30.4	21.6	67.3	31.1	20.7	1435.9	5,317 a	102
		10	28.6	22.9	69.4	31.1	20.8	1397.9	5,176 ab	99
대조자재	1,000배	7	28.4	23.0	64.7	32.7	19.4	1405.3	5,204 ab	100
보조제	1250배	7	31.0	19.6	58.1	29.8	17.6	1174.2	4,348 ab	84
무처리	물	7	32.4	21.2	64.2	30.3	20.5	1150.3	4,260 b	82

시설배추에 미생물제를 250배와 500배 농도로 희석하여 처리한 결과, 두 농도간에 구중 등 수량구성요소와 수량에 있어서 유의한 차이는 없었다. 500배 처리구에서 처리간격에 따른 생육 및 수량특성은 처리횟수가 많을수록 증가하는 경향이었으며, 처리횟수에 따른 수량의 유의한 차이는 없었으나 대조자재와 비교하였을 때 500배 희석 처리구에서 7일 간격으로 처리할 경우 생육 및 수량이 양호하였다. 미생물제 500배 처리농도를 7일 간격으로 처리할 경우, 무처리구에 비해 15.5%의 수량이 증가하였다(표 23).

처리내용	처리 농도	처리 간격	엽장(㎝)	엽폭 (㎝)	엽수 (매)	구고 (㎝)	구폭 (㎝)	구중 (g)	수량 (kg/10a)	수량 지수
미생물제	250배	5	39.1	25.7	86.9	36.7	22.2	2194.8	8,127 a z)	104
		7	39.2	25.6	85.0	35.2	20.5	2179.1	8,069 a	103
		10	38.0	25.9	84.5	34.0	20.3	2170.9	8,039 a	102
	500배	5	39.4	26.1	83.2	35.3	20.1	2187.1	8,099 a	103
		7	39.1	24.8	84.2	35.3	20.7	2177.7	8,064 a	103
		10	39.7	25.4	84.6	35.2	19.9	2123.8	7,864 a	100
대조자재	1,000배	7	38.7	24.9	81.3	35.1	20.7	2118.7	7,846 a	100
보조제	1250배	7	37.8	24.2	81.4	34.8	19.5	1914.1	7,088 b	90
무처리	물	7	35.6	23.2	85.3	34.6	19.9	1885.5	6,982 b	89

실험예 3 : 미생물제를 이용한 오이 생육 증진효과 폿트 검정

생육촉진 미생물의 생육증진 효과를 검정을 위해 시설하우스에서 32구 육묘용 트레이에 오이(품종 : 장형낙합)를 정식하고, 실시예 1의 방법으로 제조된 Chryseobacterium sp . 등 6종의 미생물을 포함하는 비료를 100배, 500배 농도로 5∼7일 간격 3회 관주 처리하였다(표 24).

처리내용	미생물수(cfu/mL)	처리농도	처리간격 및 횟수	비 고
Chryseobacterium sp.	4.2 × 109	500, 100배	5∼7일, 3회	오이
Chryseobacterium sp.TO39	1.2 × 1010	〃	〃	〃
Achromobacter sp .TO40	1.0 × 109	〃	〃	〃
Chryseobacterium sp.TO50	1.1 × 1010	〃	〃	〃
Sphingomonas sp.TO51	1.4 × 109	〃	〃	〃
Brevibacillus spTO129	6.6 × 108	〃	〃	〃
대조자재(제품명 :엑스텐)		1,000배	〃	〃
무처리(물)			〃	〃

오이 생육시험 결과, Chryseobacterium sp .과 Brevibacillus sp . 2종은 생체중의 증가가 우수하게 나타났다. Brevibacillus sp . 의 경우 100배 처리농도에서 생육이 양호하였다. Chryseobacterium sp .의 경우 100배와 500배 처리농도에서 비슷한 생육을 나타내었다. 이들 미생물은 대조자재보다 생체중이 낮은 경향이었으나, Brevibacillus sp . 의 경우 100배 처리농도에서 대조자재와 대등한 생육을 나타내었다(표 25, 도 13).

처리내용	처리농도	초장 (㎝)	엽장 (㎝)	엽폭 (㎝)	엽수 (매/주)	엽색도 (SPAD)	지상부 생체중(g/10주)	지하부 생체중(g/10주)
Chryseobacterium sp. TO4	500배	20.6?0.5	7.4	8.7	3.0	34.6	49.4?3.3 z)	15.7?2.4
	100배	21.5?1.5	7.2	8.7	3.0	29.6	44.8?0.8	13.9?1.6
Chryseobacterium sp. TO39	500배	26.5?1.5	9.1	11.0	3.0	36.4	80.5?3.5	19.8?2.6
	100배	28.3?1.3	9.3	11.5	3.5	33.5	79.5?0.5	20.6?2.0
Achromobacter sp . TO40	500배	22.4?1.2	7.3	8.9	3.0	34.2	61.0?1.5	19.8?1.8
	100배	27.0?1.1	8.8	10.8	3.4	30.9	84.0?2.6	24.3?1.9
Chryseobacterium sp. TO50	500배	22.2?2.5	7.7	9.5	3.1	34.8	54.6?3.8	18.0?0.7
	100배	22.1?0.9	7.7	9.1	3.1	33.3	59.4?0.8	25.8?1.9
Sphingomonas sp. TO51	500배	22.1?2.7	7.7	9.5	3.1	34.8	54.6?2.2	18.0?2.1
	100배	28.6?0.7	9.6	11.9	3.8	33.1	90.1?1.9	19.8?0.7
Brevibacillus sp TO129	500배	25.1?0.5	8.7	10.7	3.3	35.2	71.0?1.3	16.8?1.0
	100배	28.6?1.9	9.6	11.9	3.8	33.1	90.1?2.5	20.8?0.8
대조자재(제품명 :엑스텐)	1,000배	28.1?1.5	9.5	11.6	3.5	29.5	94.0?2.3	19.9?3.2
무처리(물)	물	24.3?1.7	8.2	9.9	3.2	31.1	65.4?2.3	20.4?1.8

시험에 사용한 미생물에 대한 질소고정력, Siderophore 생성능 및 인산가용화능을 분석한 결과(표 26), Chryseobacterium sp.과 Brevibacillus sp. 2종에서 Siderophore를 생성하였다.

구 분	질소고정 (색변화 정도)	Siderophore 생성 (mm)	인산가용화 (TCP)
Chryseobacterium sp.TO4	0	7.3	0
Chryseobacterium sp.TO39	0	10.5	0
Achromobacter sp .TO40	+	4.6	0
Chryseobacterium sp.TO50	0	5.5	0
Sphingomonas sp.TO51	+	3.4	0
Brevibacillus spTO129	0	7.8	0
엑스텐(대조)	+	11	0

실험예 4 : 미생물제를 이용한 오이 생육 증진효과 포장 검정 및 현장활용기술 개발

재배작형은 가을재배와 봄재배로 구분하여 2회에 걸쳐 수행하였다. 가을작형으로 오이(품종 : 장형낙합)를 10월 5일 포장에 정식하였다. 시험에 사용한 미생물제는 실시예 2에서 제조한 시료를 사용하였다. 미생물제를 표 27의 처리 농도로 조절하여 정식 2주 후부터 5일 간격 4회, 7일 간격 3회, 10일 간격 2회 토양에 처리하였다. 수량조사는 11월 9일부터 12월 14일까지 수확하여 수량 및 생육특성을 조사하였다. 미생물 처리농도는 1×109cfu/mL이었고, 관주량은 평방미터당 2.5L이었다.

봄작형으로 오이(품종 : 호동청정)를 3월 8일 포장에 정식하였다. 시험에 사용한 미생물제는 실시예 2의 방법으로 제조한 시료를 사용하였다. 미생물제를 표 27의 처리 농도로 조절하여 정식 2주 후부터 5일 간격 4회, 7일 간격 3회, 10일 간격 2회 토양에 처리하였다. 수량조사는 5월 9일부터 6월 2일까지 수확하여 수량 및 생육특성을 조사하였다. 미생물 처리농도는 1×109cfu/mL이었고, 관주량은 평방미터당 2.5L이었다. 생육특성 및 수량은 농업과학기술 연구조사분석기준(농촌진흥청, 2012)에 따라 조사하였다.

실험 포장은 전라남도 나주시의 시설하우스에서 난괴법 3반복으로 설계하였으며, 반복당 40주 이상의 오이를 시험하였다. 통계분석은 R Project 프로그램 3.0.1 버전 (2013)을 이용하여 ANOVA 분석과 Duncan’s multiple range test 실시하였다.

처리내용	미생물수(cfu/mL)	처리농도	처리간격(횟수)
미생물제( Brevibacillus sp. 및 보조제)	1.0 × 109	250, 500배	5(4), 7(3), 10일(2회)
보조제(구아노-N)		1,500배	7일(3회)
대조자재(제품명 : 엑스텐)		1,000배	7일(3회)
무처리		-	7일(3회)

가을재배 작형 오이에 미생물제를 250배와 500배 농도로 희석하여 처리한 결과, 오이 착과수는 처리농도가 높을수록 많은 경향이었다(표 28). 수량에 있어서도 250배 처리구가 500배 처리구보다 증수되었다. 250배 처리에서 5일과 7일 간격 처리구에서는 유의한 수량의 차이는 없었으나, 10일 처리구는 유의성이 인정되었다. 대조자재와 수량을 비교하였을 때, 250배 처리구에서 대등하거나 증가하는 경향이었다. 500배 처리구는 5일 간격 처리를 제외하고는 대조자재보다 수량이 낮았다. 미생물제 250배 처리농도를 7일 간격으로 처리할 경우, 무처리구에 비해 13.6%의 수량이 증가하였다(표 29). 따라서 미생물제를 250배 희석하고 7일 간격으로 처리할 경우 대조자재와 생육 및 수량이 대등하거나 높을 것으로 판단된다.

구 분	희석 배수	처리간격 (회)	초장 (cm)	마디수 (마디)	엽장 (cm)	엽폭 (cm)	착과수 (개)
미생물제	250	5	173.9	18.1	19.6	26.1	8.3
		7	173.0	17.5	18.7	25.1	8.2
		10	163.3	17.2	19.1	24.8	8.2
	500	5	166.0	17.5	19.3	25.8	8.3
		7	163.4	17.4	18.5	24.5	8.1
		10	160.0	17.0	18.9	24.8	8.1
대조자재	1000	7	170.8	17.6	19.0	25.5	8.2
보조제	1500	7	159.2	17.1	18.8	24.5	7.8
무처리		7	157.5	16.5	17.7	23.6	7.5

구 분	희석배수	처리간격 (회)	주당 과수 (개)	주당 수량 (kg)	총수량 (kg/10a)	상품율 (%)	상품 수량 (kg/10a)	수량 지수
미생물제	250	5	4.1	0.515	2,385 a	68.2	1,625 a	102
		7	3.8	0.517	2,391 a	66.9	1,597 a	100
		10	3.7	0.469	2,171 ab	69.0	1,498 bcd	94
	500	5	3.9	0.487	2,256 ab	69.0	1,548 ab	97
		7	3.7	0.486	2,251 ab	67.2	1,512 bc	95
		10	3.6	0.468	2,166 ab	66.3	1,431 de	90
대조자재	1000	7	3.8	0.494	2,288 ab	69.5	1,589 a	100
보조제	1500	7	3.7	0.482	2,233 ab	65.3	1,457 cde	92
무처리		7	3.8	0.445	2,062 b	68.4	1,405 e	88

봄재배 작형 오이에 미생물제를 250배와 500배 농도로 희석하여 처리한 결과, 250배 처리구가 500배 처리구보다 증수되는 경향이었다. 250배 및 500배 처리에서 각 처리간격에서는 유의한 수량의 차이는 없었다. 대조자재와 비교하였을 때, 250배 처리구는 수량이 증가하는 경향이었고, 500배 처리구는 5일과 7일 간격 처리구에서 증가하는 경향이었다. 미생물제 250배 처리농도를 7일 간격으로 처리할 경우, 무처리구에 비해 20.1%의 수량이 증가하였다(표 30). 따라서 미생물제를 250배 희석하고 7일 간격으로 처리할 경우 대조자재보다 생육 및 수량이 높을 것으로 판단된다.

구 분	희석배수	처리간격 (회)	주당 과수 (개)	주당 수량 (kg)	총수량 (kg/10a)	상품율 (%)	상품 수량 (kg/10a)	수량 지수
미생물제	250	5	6.3	1.423	4,942	68.3	4,454 a	104
		7	6.4	1.447	6,696	65.7	4,382 a	102
		10	5.8	1.370	6,340	68.7	4,345 ab	101
	500	5	5.8	1.387	6,422	67.6	4,354 ab	102
		7	5.8	1.350	6,248	68.2	4,266 ab	100
		10	5.9	1.349	6,246	68.5	4,221 ab	98
대조자재	1000	7	5.9	1.336	6,186	70.1	4,285 ab	100
보조제	1500	7	5.3	1.299	6,012	63.6	3,788 bc	88
무처리		7	5.3	1.261	5,836	64.9	3,648 c	85

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

1. 유효미생물 배양액, 구아노 및 계면활성제를 포함하는 천연물 비료.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 천연물 비료는 유효 미생물 배양액 5~15%, 구아노 80~95%, 당밀 0.1~5%, 부식산 0.1~5%, 계면활성제 0.001~1%를 포함하는 입제인 것을 특징으로 하는 천연물 비료.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 천연물 비료는 유효 미생물 배양액 50~70%, 구아노 20~40%, 잔탄검 0.01~0.5%, 계면활성제 1~10%, 시트릭산 1~5%를 포함하는 액상수화제인 것을 특징으로 하는 천연물 비료.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 유효미생물은 Achromobacter속, Arthrobacter속, Brevibacillus속, Bacillus속, Burkholderia속, Chitinophaga속, Chryseobacterium속, Herbirhizobacter속, Kaistobacter속, Mucilaginibacter속, Paenibacillus속, Rhizobium속, Rhodopseudo - monas속, Shigella속, Sphingomonas속 또는 Variovorax속인 것을 특징으로 하는 천연물 비료
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 천연물 비료는 오이, 토마토 또는 배추의 생육을 촉진하는 것을 특징으로 하는 천연물 비료.
   

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