KR20180013836A - 휴먼 하플로타이핑 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간의 유전적 특성을 파악하기 위한 지노타입을 전산화된 시스템을 통해 검출함에 있어, 정확성 및 효율성이 향상된 휴먼 하플로타이핑에 관한 것으로, 본 발명은 검사 대상 유전자의 시퀀스를 수집하는 시퀀스 리드 수집단계와; 수집된 시퀀스 리드를 데이터베이스에 저장된 레퍼런스에 매칭시켜 정렬하는 시퀀스 리드 정렬단계와; 레퍼런스 대립유전자 중 후보 대립유전자를 선별하는 대립유전자 선별단계; 그리고 상기 후보 대립유전자 중 최종 대립유전자를 설정하는 대립유전자 확정단계를 포함하여 수행된다. 이와 같은 본 발명에 의하면, 본 발명은 정렬 접근법(Alignment based approach)을 기반으로 하여 짧은 시퀀스 리드(ort sequence reads)를 이용하여 하플로타이핑을 수행하되, 후보 대립유전자의 선별 효율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 고유리드 연산 알고리즘을 적용하여, phase issue로 인한 허위대립유전자를 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

휴먼 하플로타이핑 시스템 및 방법 {Human Haplotyping System And Method}

본 발명은 인간의 유전적 특성을 파악하기 위한 하플로타입을 전산화된 시스템을 통해 검출함에 있어, 정확성 및 효율성이 향상된 휴먼 하플로타이핑 시스템 및 방법에 관한 것이다.

인간 게놈 서열의 0.1% 이상을 차지하는 SNP는 인간 표현형 변이들(phenotypic variations)을 연결 짓는 주제가 되어왔다. 이에 따라 정확하면서도 신속한 하플로타이핑(haplotyping)을 하기 위한 다양한 플랫폼(platforms)들이 연구되고 있다.

여기서, 하플로타이핑은 인간의 전장유전체에 대하여 수행될 수도 있으나, 현재는 타이핑의 신속성 및 정확성을 위하여 대부분 특정 SNP 영역에 대하여 수행되고 있는 실정이다.

이는 하플로타이핑 결과의 정확성은 인간게놈 레퍼런스가 많이 확보될수록 증가되는 데, 지금까지는 특정 SNP 영역의 레퍼런스에 대하여만 신뢰성을 확보할 수 있는 정도의 레퍼런스가 확보되었기 때문이다.

상기 하플로타이핑은 다양한 영역의 SNP에 대하여 수행될 수 있으나, 최근 가장 활발히 활용되고 있는 분야는 인간 백혈구 항원 유전자에 대한 HLA 타이핑이다.

한편, 일반적인 하플로타이핑의 과정을 개략적으로 설명하면, 도 1에 도시된 바와 같이, 검사 대상 DNA sample로부터 BAM file을 생성하고, 검사 대상의 특정영역을 추출하여 Fastq 형태의 파일을 생성한다.

이후, 상기 Fastq 형태의 파일을 데이터베이스에 저장된 Haplotype의 대립유전자 레퍼런스와 대비하여, 검사 대상 DNA의 대립유전형을 판독한다.

이와 같은, 하플로타이핑 기술은 특정영역을 HLA 유전자로 한정한 HLA 타이핑에도 그대로 적용된다.

상기 HLA 타이핑의 최근 연구된 방법 및 기술이 아래 개시되어 있다.

그러나 상기한 바와 같은 선행 기술에서는 다음과 같은 문제점이 있다.

즉, 종래기술에 의한 하플로타이핑은 인간 유전자의 높은 다형성(highly polymorphic), 연관불균형(linkage disequilibrium) 및 유전자간 서열 유사성(sequence similarity) 때문에 정확한 검사결과를 기대하기 어려운 문제점이 있다.

이와 같은 문제를 극복하기 위해서 종래 선행기술을 이용하는 경우, 시퀀스 리드의 길이를 길게 하여야 하나, 이와 같은 경우, 분석시간 및 과정이 복잡해져, 분석 효율성이 저해되는 문제점이 있었다.

(001) Bai, Y., Ni, M., Cooper, B., Wei, Y., & Fury, W. (2014). Inference of high resolution HLA types using genome-wide RNA or DNA sequencing reads.　BMC genomics,　15(1), 325. (002) Huang, Y., Yang, J., Ying, D., Zhang, Y., Shotelersuk, V., Hirankarn, N., ... & Yang, W. (2015). HLAreporter: a tool for HLA typing from next generation sequencing data.　Genome medicine,　7(1), 25. (003) Warren, R. L., Choe, G., Freeman, D. J., Castellarin, M., Munro, S., Moore, R., & Holt, R. A. (2012). Derivation of HLA types from shotgun sequence datasets.Genome medicine,　4(12), 1-8. (004) Erlich, R. L., Jia, X., Anderson, S., Banks, E., Gao, X., Carrington, M., ... & de Bakker, P. I. (2011). Next-generation sequencing for HLA typing of class I loci.BMC genomics,　12(1), 42. (005) de Bakker, P. I., McVean, G., Sabeti, P. C., Miretti, M. M., Green, T., Marchini, J., ... & Morrison, J. (2006). A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC.　Nature genetics,38(10), 1166-1172. (006) Liu, C., Yang, X., Duffy, B., Mohanakumar, T., Mitra, R. D., Zody, M. C., & Pfeifer, J. D. (2013). ATHLATES: accurate typing of human leukocyte antigen through exome sequencing.　Nucleic acids research,　41(14), e142-e142

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 인간 유전자의 높은 다형성(high polymorphic)과 시퀀스 유사성(sequence similarity)로 인하여, 기존(Illumina)장비로부터 생성된 짧은 사퀀스 리드(short sequence reads)을 이용한 하플로타이핑의 정확성 저하문제를 해결하고자 하기 위한 것이다.

즉, 본 발명은 정렬 접근법(Alignment based approach)을 기반으로 하여 짧은 시퀀스 리드(short sequence reads)을 이용하여 하플로타이핑을 수행하되, 정확성이 향상된 하플로타이핑 방법 및 시스템을 제공하고자 하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따르면, 본 발명은 검사 대상 유전자의 시퀀스를 수집하는 시퀀스 리드 수집단계와; 수집된 시퀀스 리드를 데이터베이스에 저장된 레퍼런스에 매칭시켜 정렬하는 시퀀스 리드 정렬단계와; 레퍼런스 대립유전자 중 후보 대립유전자를 선별하는 대립유전자 선별단계; 그리고 상기 후보 대립유전자 중 최종 대립유전자를 설정하는 대립유전자 확정단계를 포함하여 수행된다.

이때, 상기 시퀀스 리드 수집 단계는, 특정영역의 시퀀스 리드를 선별하여 수집하는 단계를 포함하여 수행될 수도 있다.

그리고 상기 특정영역은, HLA 유전자 영역일 수도 있다.

또한, 상기 데이터베이스는, IMGT/HLA DB 일 수도 있다.

그리고 상기 시퀀스 리드의 정렬 단계는. 데이터베이스에 저장된 레퍼런스에 시퀀스 리드를 정렬시키는 단계와; 정렬된 시퀀스 리드를 레퍼런스 대립유전자와의 매칭 절대치에 따라 필터링하는 단계를 포함하여 수행될 수도 있다.

또한, 상기 대립유전자의 선별은, 정렬된 시퀀스 리드의 분포도(the distribution of read alignments)에 따라 후보 대립유전자(candidates alleles)를 선별함에 의해 수행될 수도 있다.

한편, 상기 정렬된 시퀀스 리드의 분포도 판정은, 정렬된 리드의 레퍼런스 상의 분포도의 분산이 낮은 경우, 해당 레퍼런스의 대립유전자를 허위 대립유전자로 판정하는 것일 수도 있다.

그리고 상기 정렬된 시퀀스 리드의 분포도 판정은, 상기 정렬된 리드의 분포도를 스코어로 환산하여, 상기 스코어가 기준치보다 낮은 경우, 허위 대립유전자로 판별할 수도 있다.

이때, 상기 스코어는, 수식

에 의해 산출되고; 상기 m은 대립유전자 길이에 따라 설정되는 값이고, C는 상수이며, 상기 noread는 시퀀스 리드가 정렬되지 않은 영역에 대하여 설정된 상수일 수도 있다.

그리고 상기 대립유전자 확정 단계는, 고유리드 연산 알고리즘에 의해 수행되고; 상기 고유리드 연산 알고리즘은, 레퍼런스 상에 후보 대립유전자(Candidate alleles)가 4개 이상 존재하는 경우, 상기 후보 대립유전자들 중 시퀀스 리드에 의한 완전 매치(mapping with 100% match)가 이루어진 대립유전자를 제외한 나머지 후보 대립유전자를 상기 후보 대립유전자에서 제외시키는 것일 수도 있다.

또한, 상기 대립유전자 확정 단계는, 고유리드 연산 알고리즘에 의해 수행되고; 상기 고유리드 연산 알고리즘은, 레퍼런스 상에 후보 대립유전자(Candidate alleles)가 3개 이하로 존재하는 경우, 각각의 후보 대립유전자(candidate allele) 중 어느 하나에만 정렬(aligned)된 시퀀스 리드(sequence reads)인 고유리드의 개수를 카운트(count)하고; 상기 고유리드의 개수에 따라 최종 2개의 후보 대립유전자(candidate allele)를 선정할 수도 있다.

그리고 상기 고유리드 연산 알고리즘은, 상기 최종 2개의 후보 대립유전자(candidate allele)가 각각 서로 다른 고유리드를 포함한 경우, 상기 대립유전자를 이형접합체의 대립유전자로 판별할 수도 있다.

또한, 상기 고유리드 연산 알고리즘은, 상기 최종 2개의 후보 대립유전자(candidate allele) 중 어느 하나에만 고유리드가 포함된 경우, 상기 대립유전자는 동형접합체의 대립유전자로 판별할 수도 있다.

한편, 본 발명은, 전술한 바와 같은 휴먼 하플로타이핑 방법을 수행하기 위해, 검사 대상 유전자로부터 수집된 시퀀스 리드를 데이터베이스에 저장된 레퍼런스 대립유전자에 매칭시켜 정렬하고: 상기 레퍼런스 대립유전자 중 후보 대립유전자를 선별하며: 상기 후보 대립유전자들로부터 2개의 최종 대립유전자를 선별하고: 상기 시퀀스 리드의 정렬은, 데이터베이스에 저장된 레퍼런스에 시퀀스 리드를 정렬시킨 후, 정렬된 시퀀스 리드를 레퍼런스 대립유전자와의 매칭 절대치에 따라 필터링함에 의해 수행되는 휴먼 하플로타이핑 시스템을 포함한다.

위에서 살핀 바와 같은 본 발명에 의한 휴먼 하플로타이핑 시스템 및 방법에서는 다음과 같은 효과를 기대할 수 있다.

즉, 본 발명은 정렬 접근법(Alignment based approach)을 기반으로 하여 짧은 시퀀스 리드(short sequence reads)를 이용하여 하플로타이핑을 수행하되, 정렬된 시퀀스리드의 분포도 스코어 기능을 사용하여, 후보 대립유전자의 선별 효율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은, 고유리드 연산 알고리즘을 적용하여, phase issue로 인한 허위대립유전자를 검출하여 제거함으로써, 정확성이 향상된 휴먼 하플로타이핑 결과를 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 의한 하플로타이핑의 전체적인 수행 단계를 도시한 예시도.
도 2는 본 발명의 구체적인 실시예에 의한 HLA타이핑의 전체적인 수행 단계를 도시한 예시도.
도 3은 본 발명의 구체적인 실시예에 의해 정렬된 시퀀스 리드의 분포도에 따라 후보 대립유전자를 선별하는 일 예를 도시한 예시도.
도 4는 본 발명의 구체적인 실시예에 의해 고유리드 연산 알고리즘에 의해 최종 후보 대립유전자를 선별하는 일 예를 도시한 예시도.
도 5는 본 발명의 구체적인 실시예를 설명하기 위한 오류 대립유전자의 일 예를 도시한 예시도.
도 6은 본 발명의 구체적인 실시예를 설명하기 위한 오류 대립유전자의 다른 예를 도시한 예시도.

이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 실시예에 의한 휴먼 하플로타이핑 시스템 및 방법을 설명하기로 한다.

본 발명에 의한 하플로타이핑 시스템 및 방법은 인간의 전장 유전체에 대한 하플로타이핑에 적용될 수도 있고, 특정 영역의 SNP에 대하여 적용될 수 있다.

여기서 특정 영역이라 함은 특정 기능 수행에 관련된 유전자(또는 유전자들의 조합) 영역을 의미하는 것으로, 대표적으로는, 인간의 면역체계조절기능을 담당하는 인간 백혈구 항원 유전자(HLA gene) 영역, 약물대사관련 기능을 담당하는 유전자(DMET gene) 영역, 면역세포 발현에 관련된 유전자(KIR gene) 영역 및 혈액 특성에 관련된 유전자(ABO gene) 영역 등이 될 수 있다.

따라서, 본원 발명은 인간 전장 유전체에 대한 하플로타이핑뿐만 아니라, HLA 타이핑, DMET 타이핑, KIR 타이핑 및 ABO 타이핑 등 특정 영역에 대한 하플로타이핑에도 적용될 수 있다.

여기서, DMET (Drug Metabolizing Enzymes and Transporters)은 약물의 흡수(absorption)와 처리(disposition), 약물작용에 관여하는 단백질 효소(enzymes)와 전달자(transporters)들을 일컫는다.

예를 들면, cytochrome p450 enzyme family (CYPs), uptake transporters, efflux transporters 등이 이에 속하고, 한 혈족(family) 안에 여러 개의 유전자가 있으며, 이들의 유전자 서열은 서로 비슷하면서도 다형성(polymorphism)을 갖는다.

개인간 DMET 유전자 서열 차이는 약물반응, 부작용, 질병민감성 등에 영향을 미칠 뿐만아니라 적절한 약물선택의 기준이 될 수 있기 때문에 최근 약물유전학(pharmacogenetics)에서 주목받는 연구분야이다.

그리고 KIR (Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors)은 Natural killer (NK) cell이나 T cell 과 같은 특정 면역세포의 표면에 발현되는 단백질이다.

KIR은 다른 세포의 표면에 있는 major histocompatibililty (MHC, 주조직적합성) class I 과 상호작용함으로써 NK cell과 T cell의 세포를 죽이는 능력을 조절한다.

따라서, KIR의 이러한 기능은 감염, 자가면역질환, 암 등에 대한 민감성과 반응성향과 관련이 있다.

그리고 상기 KIR은 매우 다양(polymorphic)하여 유전자 서열이 개인마다 차이가 크며, 개인마다 가지고 있는 유전자 양이나 종류가 다르다.

한편, ABO(blood type)는 ABO 혈액형과 수혈관계를 따지는 데 주요한 역할을 하는 유전자로, 크로모좀 9q34에 위치해 있으며 전통적인 혈청기법으로는 3개의 대립유전자(allele)(A, B, O types)을 구분할 수 있다.

A, B, O 각각의 대립유전자(allele)에도 세부그룹(subgroup)이 존재하며 드물게 같은 혈액형이라 하더라도 세부그룹(subgroup)간에 수혈이 불가능한 문제가 생기기도 한다.

이하에서는, 본 발명 설명의 구체성을 확보하기 위해, HLA 타이핑을 대표적인 실시예로 설명하기로 한다.

주요 조직 적합성 복합체 분야(The major histocompatibility complex regions)는 휴먼게놈(human genome) 중에서 가장 복잡한 영역 중 하나이고 인간의 면역체계 조절 기능(the regulation of the immune system)을 책임지고 있다. 그 중 인간의 백혈구 항원(the Human leukocyte antigens, HLAs) 유전자는 6번 염색체(chromosome)의 약 3Mbp stretch에 존재하고 병원균(pathogen)을 억제하고 제거하는 적응형 면역 반응(adaptive immune response)에 큰 역할을 담당한다.

임상 관점에서는 장기이식을 할 때 기증자(donor)와 수증자(recipient) 간의 HLA 유전자가 유사할 경우 거부반응(rejection)의 위험을 줄일 수 있다. 따라서 정확한 HLA 타이핑(typing)은 매우 중요한 문제이다.

그러나 HLA 유전자(genes)의 높은 다형성(highly polymorphic), 연관불균형(linkage disequilibrium) 및 유전자간 서열 유사성(sequence similarity) 때문에 정확한 HLA 타이핑은 매우 어렵다.

예를 들면 엑손(exons) 2-4 of HLA-A gene in class I에 대해 IMGT/HLA 데이터베이스(database)에 보고된 대립유전자(alleles)는 수 천 개가 존재하고, HLA-A, B 및 C genes 간의 대립유전자(alleles)들은 매우 유사하다.

낮은 해상도(2-digits)에 의해 같은 항원 펩티드(antigen peptide)일지라도 아미노산(amino acid)의 차이로 인해 동종 반응(allogeneic response)을 유발할 수 있기 때문에 아미노산 수준(amino acid level)의 고 해상도(4-digits)까지 HLA 타이핑(ydping)이 필요하다.

고해상도(High resolution) HLA 타이핑(typing)의 기존 방법은 특정 올리고 뉴클레오티드 시퀀스(SSO)에 의한 PCR 법(polymerase chain reaction by sequence specific oligonucleotide)과 SBT(sequence-based typing)법이 있지만 이와 같은 방법은 작업인력의 노동력에 의존하여 처리되어, 낮은 처리량(low-throughput)과 고비용이 문제시된다.

한편, TAS(Targeted amplicon sequencing) 접근법은 PCR법에 비해 상대적으로 높은 처리량(high-throughput)을 나타내므로, 저렴한 비용으로, 수백 bases의 long reads를 생성하여 높은 정확성을 가지는 HLA 타이핑이 가능하다.

그러나 효율성과 비용 때문에 최근 생성되고 있는 대다수의 데이터는 genome-wide sequence, whole genome sequence (WGS) 또는 whole exome sequence (WES)이고, 이와 같은 데이터는 long reads가 아닌 short sequence reads (~101bp)를 가진다. 따라서 이와 같은 short sequence reads 이용하여 TAS 접근법과 같은(또는 그 이상) 정확도와 경제성을 갖춘 HLA 타이핑에 대한 필요성이 대두되고 있다.

즉, 본 발명에 의한 HLA 타이핑은 short read를 이용하여, 정확성 및 효율성이 확보된 HLA 타이핑을 제공하기 위한 것이다.

Short sequence reads를 이용한 HLA typing 방법은 크게 두 분류로 나뉜다.

하나는 short reads들을 조합(assemble)하여 긴 콘티그(contigs)를 생성하여 전체 HLA type을 결정하는 것이고, 다른 하나는 알려진 대립 유전자 시퀀스(allele sequences)를 레퍼런스(reference)로 하여 short sequence reads 들을 정렬(align)한 후 정렬된 정보로 실제 대립 유전자(alleles)를 결정하는 방법이다.

조합(Assembly)에 기반한 방법은 short reads를 사용할 경우 phasing issue로 인한 대립유전자의 부정합(false positive allele) 판정 문제를 해결하기 어렵고, 요구되는 시간도 길어지게 된다.

한편, 얼라인먼트(Alignment)에 기반한 방법은 HLA 유전자 영역의 높은 다형성(high polymorphic)으로 인해 알려진 대립유전자(alleles)들이 매우 유사하기 때문에 실제 대립유전자(alleles)를 결정하는 것이 쉽지 않다.

이러한 문제점에도 불구하고 연구자들의 많은 관심 속에 조합에 기반한 방법으로는 HLAreporter가 소개되었고, 얼라인먼트에 기반한 방법으로는 PHLAT 등이 소개되었으며, 최근에 발표된 HLAreporter과 PHLAT은 이전 HLA 타이핑에 비하여 정확한 HLA 타이핑 결과를 나타낸다.

본 발명에 의한 HLA 타이핑은 genome-wide short sequencing data에 대해 매우 정확한 HLA 타이핑을 수행하는 것으로, 이하에서는 이를 HLAscan이라 칭한다.

PHLAT등의 종래기술에서는 정렬된 리드(aligned read)와 유전자 깊이(depth coverage)로 대립유전자 후보군(candidate alleles)을 선별하였으나, 본 발명에 의한 HLAscan은 대립유전자(alleles)에 정렬(align)된 리드의 분포도(read distribution)를 이용한다.

또한, 본 발명은 phase issue로 선택된 대립유전자의 부정합(false positive alleles)을 제거하기 위한 알고리즘(이하 '고유리드 연산 알고리즘'이라 한다)이 적용된다.

본 발명에 의한 HLAscan을 이용하여, 시험한 결과, 11개의 1000 genome samples, 51개의 HapMap samples, 자체 5개의 samples 에 대하여 종래기술에 비하여 정확성이 매우 향상된 결과를 보였다.

이하에서는 본 발명에 의한 HLAscan의 구체적인 구성을 설명하기로 한다.

본 발명에 의한 HLAscan은,

1) 대립유전자 후보군(Candidate alleles)을 선별함에 있어, 정렬된 리드의 분포도를 고려한 스코어 기능(score function considering the distribution of aligned reads)을 제공하고;

2) phase issue로 생성된 대립유전자의 부정합(false positive alleles)을 검출하기 위한 고유리드 연산 알고리즘을 제공한다.

본 발명에 의한 HLAscan은 기본적으로 정렬기반의 접근법(Alignment-based approach)을 기반으로 한 것으로, 도 2에 도시된 바와 같이, 크게 두 단계로 구분된다.

제1단계(Tier1)는 NGS 장비로부터 생성된 원시 시퀀스 리드(raw sequence reads)를 전장 유전체 레퍼런스(whole genome reference)에 정렬(alignment)하여 이진정렬맵(binary alignment/map, BAM)을 생성한 후 HLA 유전자 영역(genes region)에 해당되는 시퀀스 리드(sequence reads)들을 선별하는 과정이다.

제2단계(Tier2)는 먼저, IMGT/HLA database에 존재하는 모든 대립유전자(alleles)에 각각 그 시퀀스 리드(sequence reads)들을 각각 정렬(alignment)한다.

HLA-A 를 예로 들면 IMGT/HLA database에 HLA-A gene의 알려진 대립유전자(alleles)는 3182개가 존재하고, HLAscan은 이들 대립유전자(alleles)들을 레퍼런스로 하여 수집된 시퀀스 리드(sequence reads)를 각각 정렬(alignment)한다.

그리고 정렬(alignment)된 정보를 이용하여 최종 대립유전자(alleles)를 결정한다.

이때, 본원 발명은 정렬된 정보로부터 최종 대립유전자를 결정함에 있어, 후보군 대립유전자를 선별하기 위하여 정렬된 리드 분포도를 고려한 스코어기능을 제공하고; 최종 대립유전자의 선별함에 있어, phase issue를 해결하기 위해 고유리드 연산 알고리즘을 제공한다.

이하에서는, 본발명에 의한 HLAscan에서 제공하하는 정렬된 리드 분포도를 고려한 스코어기능 및 고유리드 연산 알고리즘의 구체적인 내용을 설명하기로 한다.

정렬된 리드 분포도를 고려한 스코어 기능(score function considering the distribution of aligned reads)

HLAscan은 IMGT/HLA database에 저장된 수천(약 8,000)개의 대립유전자 모델(alleles from) 중에 진정 대립유전자(true alleles)를 선택하기 위해 정렬된 리드의 분포도를 고려한 스코어 기능(score function considering the distribution of aligned reads)을 사용하여 허위 대립유전자(false alleles)를 제거한다.

이 과정에서 제거되지 않고 남은 대립유전자(alleles)는 후보 대립유전자(candidate allele)라고 한다.

이때 상기 정렬된 리드의 분포도를 고려한 스코어 기능(score function considering the distribution of aligned reads)은 정렬된 리드의 레퍼런스 상의 분포도가 균일하게 분산되지 않은 경우 , 해당 레퍼런스의 대립유전자를 허위 대립유전자로 판정하는 것을 말한다.

예를 들어, 레퍼런스 시퀀스(Reference sequence, ref)의 position s_i 내지 e_i에 정렬(alignment)된 read_i (1≤i≤n)가 주어졌다고 가정하면, 이때, 'read_i는 ref의 position (s_i+e_i)/2 에 정렬(alignment)되었다' 라고 정의된다. 그리고 리드(Read)가 정렬(align)되어 있지 않은 reference의 연속 포지션(consecutive positions)들을 noread_j (1≤j≤m)라 한다.

이 경우, score function은,

(c is a constant)

에 의해 산출될 수 있다.

이때, 산출된 스코어가 기준치보다 크게 산출된 레퍼런스를 허위 대립유전자에 대한 레퍼런스로 판정하여, 해당 대립유전자를 후보에서 제외시킬 수 있다.

고유리드 연산 알고리즘

본 발명에 의한 고유리드 연산 알고리즘은 1) 후보 대립유전자(Candidate alleles)가 다수 존재할 경우 불합치 후보 대립유전자(false positive candidate alleles)를 제거하는 알고리즘과, 2) 3개 이하의 후보 대립유전자(candidate alleles)가 존재할 경우 phase issue로 선택된 후보 대립유전자(candidate alleles)를 검출하여 제거하는 알고리즘을 포함한다.

또한, 본 발명에 의한 고유리드 연산 알고리즘은 전술한 바와 같은 판단결과를 바탕으로 최종 대립유전자가 동형접합체(homozygous)의 대립유전자 인지 이형접합체(heterozygous)의 대립유전자인지 여부를 판별할 수 있다.

예를 들어, 타이핑할 유전자(gene)로부터 시퀀스 리드(sequence reads)를 수집하였고 시퀀싱에 오류(sequencing error)가 없다고 가정한다.

이때, t 개의 candidate allele_i (1≤i≤t) 중 서로 다른 시퀀스를 갖는 두 개의 리드 A, B(two reads A and B which have different sequence)가 서로 다른 allele_p 및 allele_q (1≤p,q≤t)의 position x to y 에 각각 100% 매치 되어 맵핑(mapping with 100% match)되고, 다른 영역에는 맵핑(mapping)되지 않았을 때, 해당 검사체의 실제 유전자는 리드 A의 시퀀스(sequence)를 포함한 한 가닥 그리고 리드B의 시퀀스(sequence)를 포함한 한 가닥을 가진 이형집합체(heterozygous)이다.

따라서 리드 A 및 리드 B 중 어떤 것도 mapping with 100% match 되지 않는 후보 대립유전자(candidate alleles)는 불합치 대립유전자(false positive allele)이므로 제거한다.

또한, 본 발명에 의한 고유리드 연산 알고리즘은 3개 이하의 후보 대립유전자(candidate alleles)가 존재할 때, 각각의 후보 대립유전자(candidate allele)에 대하여 오직 자신에게만 정렬(aligned)되어 있는 시퀀스 리드(sequence reads)의 개수를 카운트(count) 하여 그 순으로 제1후보 대립유전자(the first candidate allele) 및 제2후보 대립유전자(the second candidate allele)를 선정한다. 그리고 선택된 두 개의 후보 대립유전자(candidate alleles)에 대해 같은 과정을 반복한다.

만약 두 후보 대립유전자(candidate alleles) 모두 고유 정렬 리드(unique aligned reads)를 가지고 있을 때 2개의 대립유전자(alleles)를 최종결과물로 산출한다. 이 경우 해당 대립유전자는 이형접합체의 대립유전자임을 의미한다.

그리고 하나의 후보 대립유전자(candidate allele)만 고유 정렬 리드(unique aligned reads)를 가지고 있을 때(하나의 allele에 aligned reads가 다른 allele의 모든 aligned reads를 포함한 경우), 고유 정렬 리드를 가진 대립유전자만을 최종 결과로 출력한다. 이 경우 해당 대립유전자는 동형접합체의 대립유전자임을 나타낸다.

본 발명에 의한 HLAscan 시험 내용

본 발명의 시험에는 전장 엑솜 염기서열(whole exome sequencing, WES)이 분석되어 공지(public)된 1000 게놈 프로젝트의 11명의 샘플(11 samples from the 1000 Genome projects), HapMap 프로젝트로부터 51명의 샘플(51 samples from the HapMap projects) 및 한국인 5명의 샘플(5 internal Korean samples) 가 사용되었다.

본 발명의 실험에서는 HLA class I (HLA-A, HLA-B, and HLA-C)과 class II (HLA-DRB1 and HLA-DQB1) 영역(regions)에 대한 HLAscan의 결과(predictions)를 보인다(Additional file: Table R12, R22, R32). HLAscan의 성능 평가를 위해 HLAreporter[ref]와 PHLAT[ref]의 결과(predictions)를 비교로 사용한다.

HLAscan에 편향된 비교를 피하기 위해 각 methods들이 그들의 논문에 제시한 기준으로 정확성을 평가한다. 11개의 1000 genome samples에 대한 결과는 Table R1, 51개의 HapMap samples에 대한 결과는 Table R2, and 5 Korean samples에 대한 결과는 Table R3에서 보인다.

1) HLA 유전자 영역의 시퀀스 수집

퍼블릭(Public)하게 생성되어 있는 대다수의 데이터는 홀 지놈 시퀀스 whole genome sequence (WGS) 또는 홀 엑솜 시퀀스 whole exome sequence (WES)이므로, HLA 타이핑(typing)을 위해 HLA genes region에서 생성된 시퀀스 리드(sequence reads)를 선별한다.

HLAscan은 sequence reads들을 bwa-mem v0.7.10-r789를 사용하여 hs37d5 WGS reference에 alignment하고 HLA-gene regions에 정렬(align)되어 있는 모든 시퀀스 리드(sequence reads)들을 수집한다.

시퀀스 간 유사성(sequence similarity)은 HLA genes 간에 높게 나타나고, 이외의 영역에서는 낮게 나타나므로, HLA genes 외에서 생성된 시퀀스 리드(sequence reads)들은 간단하게 제거할 수 있다.

단, 본 발명에 의한 HLAscan은 이 과정 중에 sequence reads 들을 특정 HLA 유전자(specific HLA genes)별로 구분하지 않으나, HLAreporter 및 HLAminer 등 assemble-based methods의 종래기술에서는 주어진 short sequence reads로부터 de novo assembly를 사용하여 최종 유전형(haplotype)을 결정한다.

따라서, 타이핑할 HLA gene에 대한 sequence reads 선별의 정확성은 HLA typing의 정확성에 직접적인 영향을 준다.

그러나 HLA 유전자들 간의 시퀀스 유사성(sequence similarity, ex: HLA-A, HLA-B, and HLA-C) 때문에 이 과정은 용이하지 않게 되고, HLA reporter는 IMGT/HLA database를 사용하여 특정 HLA gene의 시퀀스 리드(sequence reads)를 수집한다.

본 발명에 의한 HLAscan은 IMGT/HLA database를 기준으로 얼라인먼트(alignment) 과정 중에 해당 HLA gene의 시퀀스 리드(sequence reads)가 선별되므로, 해당 과정 동안 정확한 시퀀스 리드(sequence reads)를 선별할 필요성이 낮다.

이는 본 발명에 의한 HLAscan이 IMGT/HLA database에 시퀀스 리드(sequence reads)를 alignment하는 과정에서 100% 일치하는 시퀀스 리드(sequence reads)들만 남기기 때문에 해당 유전자(gene)의 시퀀스리드(sequence reads)들을 선별함에 있어, 정확도는 크게 문제되지 않는다.

즉, 본 발명에 의한 HLAscan이 HLA gene regions의 시퀀스리드(sequence reads)를 선별하는 이유는 정확성보다는 효율성이다. 이에 따라 매우 단순한 방법에 의해 상당수의 HLA genes region으로부터 생성된 시퀀스리드(sequence reads)를 제거할 수 있고, 이는 수집된 시퀀스리드 (sequence reads)를 IMGT/HLA database의 수 천 개의 대립유전자(allele)s 에 정렬(align)할 때 수 십 배 이상의 속도 향상을 가져올 수 있다.

이는 HLA-genes region에 대한 target sequencing이 이루어졌을 경우, 도 2의 제1단계(Tier 1)과정이 생략될 수 있기 때문이다.

2) 리드의 정렬(reads alignment)

HLAscan은 선택된 HLA genes region에 대하여 타깃 시퀀싱(Target sequencing)된 시퀀스리드 (sequence reads)들을 IMGT/HLA database에 존재하는 모든 레퍼런스 대립유전자(reference alleles)에 bwa-mem v0.7.10-r789를 사용하여 default 옵션으로 각각 얼라인먼트(alignment) 한다.

그 후, 레퍼런스 대립유전자(reference alleles)와 100% 일치하지 않는 리드들은 제거한다.

HLA 유전자 간의 시퀀스 유사성(sequence similarity)과 대부분의 HLA 유전자에 존재하는 대량의 대립유전자(existence of large number of alleles for most HLA genes) 때문에 HLAscan은 레퍼런스 대립유전자(reference alleles)와 100% 매치되는 리드(reads)만 매칭(mapping)함으로써 리드 정렬(read alignment)의 정확성을 높인다.

그러나 이와 같은 강력한 제한에도 불구하고 다른 유전자(gene)로부터 생성된 시퀀스 리드(sequence reads)가 해당 유전자(gene)의 대립유전자(alleles)에 매핑(mapping)될 수 있다.

3) 후보 대립유전자의 선별(Selection of candidate alleles)

후보 대립유전자(Candidate alleles)를 선별하기 위해 종래기술인 PHLAT 및 Major(2013')은 리드의 정렬과 이의 뎁스 범위(depth coverage)를 고려하여 간단하지만 정확성이 향상된 HLA 타이핑 방법을 선보이고 있다.

그러나 본 발명에 의한 HLAscan은 이들 종래기술보다 더욱 정확한 HLA 타이핑을 위해 정렬된 리드의 분포도(the distribution of read alignments)를 고려하여 후보 대립유전자(candidates alleles)를 선별한다.

도 3에 도시된 바와 같이, 4개의 대립유전자(alleles)에 얼라인먼트(alignment)된 리드(reads)들의 모습을 볼 수 있다. 대립유전자(allele) 2 및 4는 실제 sample의 대립유전자(alleles)이고 대립유전자(allele)1은 대립유전자(allele) 4의 앞 부분과 대립유전자(allele)2의 뒷부분이 결합하여 생긴 허위 대립유전자(phased allele)이다. 대립유전자(allele) 3은 실제 대립유전자(alleles) 2 및 4와 sequence가 다른 부분이 많은 대립유전자(allele)이다.

여기서, 종래기술인 PHLAT와 같이, 'reads'를 고려하면 명백하게 대립유전자(allele)4 및 대립유전자(allele)1이 선택되어 허위 대립유전자(phased allele) 1로 인해 실제 대립유전자(allele) 2가 선택되지 못한다. Depth coverage를 고려한 경우에도 대립유전자(allele)4는 명백하지만 대립유전자(allele)1과 대립유전자(allele)2 중 하나를 선택하는 것을 불가능하다.

한편, 본 발명에 의한 HLAscan 은 스코어 기능(core function)은 정렬된 리드(aligned reads)가 균등하게 분산된 정도를 고려하기 때문에 명확하게 대립유전자(allele)2와 대립유전자(allele)4 중 대립유전자(allele)2를 선별하는 것이 가능하다.

본 발명에 의한 HLAscan은 각각의 대립유전자(allele)에 대해 스코어 기능(score function)을 사용하여 스코어(score)를 계산하고, 특정 값을 넘는 대립유전자(allele)들은 제거하였다. 스코어 기능(Score function)에 사용된 constant value는 30이고, cutoff score 는 200이다.

여기서, score 는 0 이상 이면서 작을 수록 좋다.

즉, 제거되지 않은 대립유전자(alleles) 중 리드 분산도(reads distribution)가 완전히 동일한 대립유전자(alleles)는 하나의 그룹(group)으로 묶는다.

이와 같이, 후보 대립유전자(Candidate alleles)를 줄이는 것은, 후술할 최종 대립유전자(final alleles)의 결정 정확성을 높이는데 도움이 된다.

4) 최종 대립유전자의 결정(Determination of final alleles considering phase issue)

Phase issue는 연관불균형 영역(linkage disequilibrium region)이고 짧은 시퀀스 리드(short sequencing reads) 데이터를 사용하는 경우 심각한 문제이다.

본 발명은 이를 해결하기 위한 효율적인 알고리즘을 제안한다. 이와 같은, 알고리즘에 의해 실제 수행한 실험 범위 내에서는 phasing 문제가 해소되었음을 볼 수 있다.

즉, 본 발명에 의한 후보 대립유전자(candidate alleles) 각각에 대해 고유 정렬 리드(unique aligned reads)의 개수 정보를 이용하는 알고리즘은 phase issue를 효과적으로 해결한다.

특히, 후보 대립유전자(candidate allele)수가 3개 이하인 경우, 본 발명에 의한 알고리즘은 매우 정확하게 phased allele를 찾아낸다.

도 4에 도시된 예에서는, x and y가 실제 대립유전자(alleles)이고 z가 x와 y로부터 phased되어 생성된 대립유전자(allele)이다. Aligned reads중 x, y, and z에 모두 aligned 된 reads는 green, x와 z에 align된 reads는 blue, y와 z에 align 된 reads는 purple, and 하나의 대립유전자(allele)에만 고유하게(unique)하게 align 된 reads는 gray이다.

본 발명에 의한 HLAscan 알고리즘은 unique aligned reads를 각각 3개, 2개를 가지는 x and y를 최종 후보 대립유전자(candidates alleles)로 결정하고, 0개의 unique aligned reads를 가지는 z는 버린다.

HLA genes은 수많은 대립유전자(allele)들을 가지고 있고 그 대립유전자들(alleles)간에 매우 유사한 시퀀스(sequence)를 가지기 때문에 동형접합체의 하플로타입(homozygous haplotype)인지 이형접합체의 하플로타입(heterozygous haplotype)인지 결정하는 문제도 쉽지 않다.

그러나 본 발명에 의하면, 두 개의 최종 후보 대립유전자(final candidate alleles)가 주어져 있을 때, 하나의 대립유전자(allele) A에 정렬된(aligned)된 모든 리드(reads)를 다른 대립유전자(allele) B에 정렬(aligned)된 리드(reads)가 포함할 때 대립유전자(allele) A는 제거한다.

한편, 두 대립유전자(alleles) 모두 고유 정렬 리드(unique aligned reads)들을 가질 때 이형접합체(heterozygous)로 판단한다.

본 발명에 의한 HLAscan 실험 결과

1) 11개의 1000 genome samples에 대한 검사(Predictions of 11 samples from 1000 genome projects)

HLAscan의 정확성을 검증하기 위해 기존의 laboratory HLA-typing [Liu et al.]이 되어있는 11 samples from 1000 genome projects 을 검측(predictions)하였다. 동일한 11 samples 에 대한 HLAreporter의 검측(predictions) [HLAreporter]과 중복된 10 samples에 대한 PHLAT의 검측(predictions) [PHLAT]을 비교로 사용한다.

종래 비교기술로 적용된 PHLAT과 HLAreporter는 기존의 다른 선행기술에 의한 것보다 높은 정확성을 가진다고 보고되어 있다.

11개의 samples에 대해 각각 5개의 (HLA-A, B, C, DRB1, and DQB1) genes, 그리고 각 gene마다 2개의 대립유전자(alleles)를 선별하여, 총 110개 대립유전자(alleles)에 대하여 검측(predictions)을 진행한다.

이때, 동형접합체(homozygous)에 대한 검측의 경우 검측(prediction)된 대립유전자(allele)를 2개로 판단한다.

PHLAT는 100개의 대립유전자(alleles)에 대하여 검측(predictions)하였다. Additional file: Table R2에서 각 방법에 대한 검측결과가 도시되어 있다.

[표 1]을 보면 HLAscan과 HLAreporter는 110개의 대립유전자 검측(alleles predictions)에 대해 100% 정확성을 보여주는 반면, PHLAT은 100개의 대립유전자 검측(alleles predictions)에 대해 상대적으로 낮은 정확성(2-digits 3개 mistyped (97%), 4-digits 2개 mistyped (95%) 을 보여준다. 또한, HLAreporter는 phase에 대한 불명확성(ambiguity)으로 인해 다수의 대립유전자(alleles)가 보고된 경우가 13번 있으나 이를 오류(mistyped)로 판단하지 못하는 결과를 나타냈다.

Methods	# of examinated 대립유전자(allele)s	Phase	Wrong (2-digits)	Wrong (4-digits)	Accuracy (2-digits wrong)	Accuracy (4-digits wrong)
HLAreporter	110	13	0	0	100%	100%
PHLAT	100	-	3	2	97%	95%
HLAscan	110	-	0	0	100%	100%

<표 1. Accuracies (Liu et al. 의 predictions[Liu 2013]을 참으로 간주한 경우)>

2) 51개의 HapMap projects samples에 대한 검사 Predictions of 51 samples from HapMap projects

1000 genome samples에 대한 HLAscan의 높은 정확성이 검증되었고, 이에 더불어 HLAscan의 신뢰성(reliability)을 높이기 위해 추가적으로 public 51 HapMap samples 에 대하여 검측(predictions)을 수행하였다.

본 시험의 samples은 2013년에 Baylor College of Medicine (BCM) and Washington University Genome Sequencing Center (WUGSC) 에 의해 생성되었고 확인된(verified) HLA types를 가지고 있다[Erlich2013, HLAreporter2015 참조]

HLAreporter도 동일한 51 samples에 대하여 검측(predictions)하였고, 이 결과를 비교 대상으로 하였다.

HLA regions의 극단적인 다형성(extreme levels of polymorphism)과 연관불균형(linkage disequilibrium)등의 특성으로 인한 HLA-typing의 어려움으로, 그 정확성을 높이기 위해 high quality samples은 필수적이다.

HLA-reporter에서 제시한 Quality test를 통과한 samples의 개수는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, and HLA-DQB1에서 각각 18, 18, 11, 45, and 46개이고, 해당 samples에 대해 HLAscan의 검측(predictions)결과를 설명한다.

(A, B, C 최종 결과 설명)

통상 [de Baker, 2006]의 검측 결과가 HapMap samples의 최고의 표준(gold standard)으로 사용되고 있음에도 불구하고 [Rachel L Erlich 2011]는 class I 영역(regions)에 대해 심도있는 연구를 통해 몇 개의 오류(mistyped)를 찾아내어 더 정확한 HLA type을 제공하였다.

이를 정답으로 간주했을 때 HLA-A, HLA-B, and HLA-C genes 에 대해 HLAscan 및 HLAreporter 모두 2-digits에 대해 100% 정확성을 보인다. 4-digits level에서는 HLAscan은 100% 정확성을 가지는 반면 HLAreporter는 각 유전자에 대하여 80.5%, 83.3% 및95.5% 의 정확성을 가진다(표 2 참조).

(DRB1, DQB1 최종 결과 설명)

Class II 영역은 [de Baker, 2006]의 결과를 정답으로 간주했을 때, HLAscan은 HLA-DRB1 gene에 대해 2-digits 및 4-digits level에서 각각 96.6% 및 95.6%, HLA-DQB1 gene에 대해 100% 및 91.3%의 정확성을 가진다.

HLAreporter는 HLA-DRB1 gene에 대해 97.8% 및 95.6%, HLA-DQB1 gene에 대해 98.9% 및 89.1%의 정확성을 가진다.

Methods	Genes	# of tested 대립유전자(allele)s	Phase	Ambiguity (4-digits)	Wrong (2-digits)	Wrong (4-digits)	Accuracy (2-digits)	Accuracy (4-digits)
HLA reporter	A	36	5	7	0	0	100%	80.5%
	B	36	7	3	0	2	100%	83.3%
	C	22	4	0	0	1	100%	95.5%
HLA scan	A	36	-	-	0	0	100%	100%
	B	36	-	-	0	0	100%	100%
	C	22	-	-	0	0	100%	100%

<표 2. HLA-A, HLA-B, and HLA-C genes in class I (10x = 100% and 20x ≥ 90%) (hla-typing results[Rachel L Erlich2011])>

Methods	HLA Genes	# of tested 대립유전자(allele)s	Phase	Ambiguity (4-digits)	Wrong (2-digits)	Wrong (4-digits)	Accuracy (2-digits)	Accuracy (4-digits)
HLA reporter	DRB1	90	2	1	2	1	97.8%	95.6%
	DQB1	92	0	7	1	2	98.9%	89.1%
HLA scan	DRB1	90	-	-	3	1	96.6%	95.6%
	DQB1	92	-	-	0	8	100%	91.3%

< 표 3. HLA-DRB1 and HLA-DQB1 genes in class II (10x ≥ 95%)>

[오류 대립유전자(mistyped allele) 분석]

12개의 오류대립유전자((Mistyped alleles)들을 수집해보면, 특정 대립유전자(alleles)에서 오류(mistyped) 발생되고 있음을 알 수 있다.

[표 4]를 보면 HLAscna은 Gold standard에 비해 14:01을 14:141로 오류(mistyped)된 경우를 제외하면 모두 특정 대립유전자(alleles)에서 (15:01을 16:01의 경우 3개, 06:05를 06:09로 2개, and 02:01을 02:02로 6개) 반복하여 오류(mistyped)가 발생한다. 이는 [PHLAT]에서도 보고된 결과와 유사하다.

Genes	Gold standard		Predictions of HLA scan		# of the case
DRB1	11:04	14:01	11:04	14:141	1
	15:01	15:01	15:01	16:01	3
DRB1	xx:yy	06:05	xx:yy	06:09	2
	pp:qq	02:01	pp:qq	02:02	6

< 표 4. 오류 대립유전자 (Mistyped alleles) >

도 5를 살피면, DRB1*02:01:01:01과 DRB1*02:02:01:01 대립유전자(alleles)는 exome 3 region 의 162번째 포지션에서 각각 'T' and 'C'로 단지 1개의 sequence만 차이가 남을 볼 수 있다. 이때, exome 2 region은 동일하다.

도 6은 DRB1*02:01:01:01과 DRB1*02:02:01:01에 실제 NA11830 sample의 sequence reads들이 mapping된 모습을 samtools tview로 보인 것이다.

DRB1*02:02:01:01의 exome 3의 162번째 sequence 'C'를 지지하는 sequence reads들은 많이 존재하는 반면, DRB1*02:01:01:01의 상응되는 sequence 'T'를 지지하는 sequence reads는 존재하지 않는다.

12개의 오류(mistyped) 중 DRB1*14:01을 DRB1*14:141로 mistyped한 경우를 제외한 나머지 11개의 경우 모두 위와 유사하다.

5개의 한국인 샘플에 대한 검측(Predictions of 5 Korean samples) 결과

Public한 11개의 1000 genome samples와 51개의 HapMap samples에 대해 HLAscan이 매우 높은 정확성을 가짐을 보였다. 임상적 적용을 위해 한국인 5명에 대한 samples을 Invitrogen SeCore HLA-SBT kit를 이용하여 1000 genome 및 HapMap의 public한 데이터에 비해 high quality sequences를 생성하였고, HLAscan을 사용하여 predictions하였다.

HLAscan의 정확성을 검증하기 위해 PCR-SBT (sequence based typing) 방법을 통해 HLA typing을 진행하였고 그 결과를 비교하였다.

[표 5]를 살피면, 5개의 samples의 HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 영역에 대해 HLAscan의 predictions과 PCR방법의 결과가 100% 일치(concordance)함을 볼 수 있다. HLAreporter는 high quality sequence 데이터를 사용함에도 4개의 오류(mistyping) 결과를 보인다.

Samples	Methods	HLA-A		HLA-B		HLA-DRB1
77072421 NS1512240004	PCR-SBT	02:06	02:10	40:02	55:02	04:05	11:01
	HLAreporter	02:10	02:10	40:02:01	55:02:01	04:05:01	11:01:01
	HLAscan	02:06:01G	02:10	40:02:01	55:02:01G	04:05:01	11:01:01
77072412 NS1512240008	PCR-SBT	24:02	31:01	35:01	51:02	09:01	09:01
	HLAreporter	24:82	31:01:02	35:42:02	51:02:02	09:01:02	09:01:02
	HLAscan	24:02:01G	31:01:13	35:01:01G	51:02:01	09:01:02	09:01:02
77072374 NS1512240012	PCR-SBT	02:01	33:03	15:01	44:03	09:01	13:02
	HLAreporter	02:01:01	33:03:01	15:01:01	44:03:11	09:01:02	13:02:01
	HLAscan	02:01:01G	33:03:23	15:01:01G	44:03:01	09:01:02	13:02:01
77072406 NS1512240016	PCR-SBT	11:01	26:01	44:02	46:01	09:01	13:01
	HLAreporter	11:01:01	26:01:01	44:02:01	46:01:01	09:01:02	13:01:01
	HLAscan	11:01:01:01	26:01:01:01	44:02:01G	46:01:01	09:01:02	13:01:01
77072287 NS1512240020	PCR-SBT	02:01	02:06	13:01	40:02	08:02	12:02
	HLAreporter	02:01:01	02:01:01	13:01:01	40:02:01	08:02:01	12:02:01
	HLAscan	02:01:01G	02:06:01G	13:01:01	40:02:01	08:02:01	12:02:01

<표 5. OUR. Our results>

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

본 발명은 인간의 유전적 특성을 파악하기 위한 지노타입을 전산화된 시스템을 통해 검출함에 있어, 정확성 및 효율성이 향상된 휴먼 하플로타이핑에 관한 것으로, 본 발명에 의하면, 정렬 접근법(Alignment based approach)을 기반으로 하여 짧은 시퀀스 리드(ort sequence reads)를 이용하여 하플로타이핑을 수행하되, 후보 대립유전자의 선별 효율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 고유리드 연산 알고리즘을 적용하여, phase issue로 인한 허위대립유전자를 검출할 수 있는 효과가 있다.

Claims (1)

1. 검사 대상 유전자의 시퀀스를 수집하는 시퀀스 리드 수집단계와;
   수집된 시퀀스 리드를 데이터베이스에 저장된 레퍼런스에 매칭시켜 정렬하는 시퀀스 리드 정렬단계와;
   레퍼런스 대립유전자 중 후보 대립유전자를 선별하는 대립유전자 선별단계; 그리고
   상기 후보 대립유전자 중 최종 대립유전자를 설정하는 대립유전자 확정단계를 포함하여 수행됨을 특징으로 하는 휴먼 하플로타이핑 방법.
   

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