KR20180010035A - 이온방출형 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이의 용도 - Google Patents

이온방출형 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어 및 상기 코어 둘레를 감싸는, 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체에 있어서, 상기 코어 또는 상기 쉘은 생활성 글라스 나노파티클(BGn: bioactive glass nanoparticle)을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법에 관한 것으로서, 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 쉘물질을 염화칼슘을 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는 제조방법 및 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골 또는 연골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체는 하이드로겔 형태로 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 조직 손상부분에도 직접 채워넣어 이식할 수 있으며, 생활성 글라스 나노파티클로부터 골 형성에 필요한 이온이 방출되어 효과적으로 골 분화를 유도할 수 있으므로, 치조골 등의 뼈가 결실된 부분의 조직 재생력을 크게 향상시킬 수 있다.

Description

이온방출형 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이의 용도{Core-shell fibrous cell carriers incorporating ion-emitting bioactive glass nanoparticles and its use}
본 발명은 코어-쉘 섬유상 세포전달체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 줄기세포의 분화를 촉진할 수 있는 생활성 글라스 나노파티클(BGn: bioactive glass nanoparticle)을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법 및 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물에 관한 것이다.
조직 공학에 있어서 중요한 것은 이식된 세포들로 하여금 자연적인 상태와 유사한 물리적 및 화학적 미세환경을 제공할 수 있는 기질을 개발하는 것이다.
제공된 물리화학적 환경은 세포로 하여금 직접적으로 흡착, 증식 및 분화에 있어서 그들의 표현형을 변형할 수 있도록 유도한다. 여러 형태의 기질 중, 하이드로겔은, 숙주 조직에 대해 적응가능한 물리화학적 특성을 갖춘 고분자 사슬 네트워크 내로 세포를 봉입 및 전달할 수 있는 매력적인 류의 스캐폴드 물질이다.
세포 봉입을 위해 가장 흔히 사용되는 하이드로겔 중 콜라겐은 우수한 생체적합성을 가지며, 세포로 하여금 정착 및 증식할 수 있도록 한다. 그럼에도 불구하고, 콜라겐은 수성 매질에서, 특히 세포가 존재하는 경우에 생화학적 안정성이 크게 결여되어 미리 성형된 하이드로겔의 형태를 효과적으로 유지할 수 없게 된다. 또한, 비콜라겐 기질 분자와 비교할 때 골분화를 위한 충분한 환경을 갖고 있지 않다.
콜라겐의 이러한 제한된 안정성 및 형태성을 극복하기 위해, 이전에 본 발명자들은 세포 봉입을 위한 콜라겐/알지네이트 코어-쉘 하이드로겔을 제조한 바 있는데, 구체적으로, 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트 및 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입한 섬유 구조의 스캐폴드를 개시한 바 있다(대한민국 특허 제1472045호).
상기 코어-쉘 하이드로겔은 산소 및 영양분 공급이 원활하여 줄기세포의 생존 및 분화에 유리한 미세환경을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 성형이 용이하여 복잡한 손상부위에도 맞추어 주입할 수 있으므로 효과적으로 세포를 전달하여 조직의 재생을 촉진할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 코어-쉘 하이드로겔은 봉입된 줄기세포의 골분화 유도 능력도 가짐을 확인하였는데, 그러나 이 경우에는 골분화 배지(osteogenic media)를 따로 보충을 해야만 대부분의 골분화가 유도될 수 있었다.
따라서, 골분화 배지를 별도로 보충하지 않고도 봉입된 줄기세포의 골분화를 보다 잘 유도할 수 있는 세포전달체의 개발이 요구되고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 종래의 콜라겐/알지네이트 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 장점을 살리면서 골분화 배지의 보충 없이도 줄기세포의 골분화를 유도할 수 있는 세포전달체를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, Si 및 Ca 이온이 담지된 생활성 글라스 나노파티클(BGn: bioactive glass nanoparticle)을 상기 코어 또는 쉘 부분에 포함시킨 세포전달체를 사용하면 종래의 안정성도 유지하면서 다른 골분화 배지의 보충없이도 골분화가 유도됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허 제1472045호
본 발명의 하나의 목적은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어 및 상기 코어 둘레를 감싸는, 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체에 있어서, 상기 코어 또는 상기 쉘은 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어 및 상기 코어 둘레를 감싸는, 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체에 있어서, 상기 코어 또는 상기 쉘은 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 제공한다.
기존의 코어-쉘 섬유상 세포전달체는 미세구(microsphere) 형태에 비하여 기계적 강도가 향상되어 형태 유지가 용이하면서도, 골 조직 손상부위에 맞추어 적용시킬 수 있는 장점은 있었지만, 외부적으로 골분화 배지를 보충시켜주지 않으면 골분화가 잘 유도되지 않는 단점이 있었다. 이러한 단점을 극복한 세포전달체를 제공하고자, 본 발명에서는 하이드로겔 스캐폴드 내에 골형성 물질을 포함시켜 내재적으로 줄기세포가 분화하여 골 형성이 되도록 생활성 글라스 나노파티클을 코어 또는 쉘 층에 포함시킨 세포전달체를 개발하였다.
본 발명에서 용어, "세포전달체(cell carrier)"란, 치료제로서의 세포를 환부에 전달하기 위한 시스템으로 전달하고자 하는 세포를 봉입시킨 고체 또는 반고체의 미세구조물을 의미한다. 상기 미세구조물은 일정량의 세포를 포함할 수 있도록 수십 내지 수백 마이크로미터 수준의 규모로 제조되나, 그 형태는 제한되지 않는다. 상기 고체 또는 반고체는 세포를 지지하기 위하여 도입된 부가물이 될 수 있는데, 일 예로서, 겔형태의 반고체이며, 세포 독성을 나타내지 않고 체내에서 서서히 분해될 수 있는 콜라겐을 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 제공하는 세포전달체는 콜라겐 코어에 세포를 포함하도록 제조하되 상기 세포가 외부와 직접 접촉하지 않도록 알지네이트를 포함하는 쉘을 외부에 추가로 포함하도록 제조한, 코어-쉘 구조의 세포전달체가 될 수 있다.
본 발명의 세포전달체에 봉입되는 세포는 배양 환경에 따라 다양한 조직세포로 분화가능한 미분화 줄기세포일 수 있다. 이때, 본 발명의 세포전달체의 코어 또는 쉘에 포함되어 있는 생활성 글라스 나노파티클로부터 칼슘 이온 또는 실리콘 이온이 방출되어 상기 미분화 줄기세포의 분화를 촉진할 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 코어는 100 μm 내지 1500 μm의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포전달체의 코어물질에 혼합하여 봉입된 세포는 산소 및 영양분을 제공받기에 용이한 쉘과의 경계면에 위치하여 서로서로 네트워크를 형성한다. 따라서, 이를 고려할 때, 코어가 상기 범위보다 작게 형성되는 경우, 세포들이 배열할 수 있는 충분한 코어-쉘 경계면적을 제공할 수 없어 다중층으로 배열될 수 있으며, 이 경우 코어의 내부에 배향된 세포는 충분한 산소 및 영양분을 공급받지 못하여 정상적인 생장이 어려워질 수 있다. 또는 분화조건에서는 분화를 위한 한편 코어가 상기 범위보다 크게 형성되는 경우 세포 수에 비해 표면적이 과다하여 세포밀도가 낮아 정상적인 세포 네트워크 형성이 어렵거나 형성되는 조직의 밀도가 너무 낮아질 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 쉘은 100 μm 내지 250 μm의 두께를 갖는 것이 바람직하다. 쉘이 상기 범위보다 얇게 형성되는 경우, 기계적 강도가 낮고 빠르게 분해될 수 있다. 한편, 상기 범위보다 두껍게 형성되는 경우에는 코어부분에 위치한 세포로의 영양분의 확산 및 산소전달이 저해되어 정상적인 세포생장을 저해할 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 코어는 코어 총 중량에 대하여 0.5 내지 5 중량%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 상기 콜라겐 함량이 0.5% 미만인 경우에는, 기계적 강도가 너무 낮아 물성이 약해질 수 있고, 5%를 초과할 경우에는, 세포의 성장과 이동에 제약을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체의 쉘은 쉘 총 중량에 대하여 2 내지 5 중량%의 알지네이트를 포함할 수 있다. 상기 알지네이트 함량이 2% 미만인 경우에는 내구성이 낮아 분해속도가 빠르고 기계적 성질이 악화될 수 있고, 5%를 초과할 경우에는 두껍고 조밀한 쉘층을 형성하여 코어부분에 봉입된 세포의 생존 및 증식을 위한 산소 및 영양분 등의 침투를 저해할 수 있다.
본 발명의 용어, “생활성 글라스 나노파티클(BGn: bioactive glass nanoparticle)"이란, 도 1에서 보는 바와 같이 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB) 등으로 형성된 바이오글래스 스피어에 실리카층과 칼슘포스페이트 층을 입혀 실리콘 이온 및 칼슘 이온을 효과적으로 방출할 수 있는 나노파티클로서, 중간엽줄기세포(MSC: mesenchymal stem cell) 등을 포함하는 세포의 골아 분화를 유도할 수 있는 능력을 가진다. 상기 생활성 글라스 나노파티클로부터 방출된 이온들은 코어층에 포함된 세포들을 활성화하는 작용, 즉, 골형성에 중요한 영향력을 발휘할 수 있는 세포 내에서의 혈관생성 프로세스를 자극할 수 있다.
또한, 상기 생활성 글라스 나노파티클이 세포를 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체에 포함되는 경우, 코어 내의 세포뿐만 아니라 주위 환경의 세포에도 영향을 주는 시너지 효과를 발휘하게 되어 세포 증식 및 골 분화의 유도가 잘 일어나도록 한다.
본 발명의 세포전달체에 함유된 생활성 글라스 나노파티클의 함량을 쉽게 표기하기 위하여 본 명세서에서는 CS0, CS10 등과 같은 표기를 사용하였는데, CS(Core-Shell) 뒤에 붙는 숫자가 전체 세포전달체 중의 생활성 글라스 나노파티클 중량%를 나타낸다. 즉, CS0는 생활성 글라스 나노파티클을 전혀 포함하고 있지 않은 세포전달체를 말하며, CS10은 생활성 글라스 나노파티클을 10중량% 포함하고 있음을 나타낸다. 생활성 글라스 나노파티클은 특별히 이에 제한되지는 않지만, 전체 세포전달체 중 10 내지 30중량% 포함될 수 있다. 상기 생활성 글라스 나노파티클 함량이 10중량% 미만인 경우에는, 골분화의 유도에 실질적으로 영향을 미치지 못할 수 있고, 30중량%를 초과하는 경우에는 생활성 글라스 나노파티클로부터 방출되는 이온으로 인해 세포의 생존력이 오히려 저하되는 현상이 발생할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법을 제공한다. 이때, 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체, 코어, 쉘, 생활성 글라스 나노파티클 및 세포에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 세포전달체는 콜라겐과 세포 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어부분과 알지네이트 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 쉘의 명확히 구분된 영역으로 구성되는 것이 특징이다. 이와 같은 구조적 특징을 갖는 세포전달체를 제조하기 위하여 특별히 고안된 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 코어물질을 외부 바늘로부터는 쉘물질을 방출하도록 하되 이를 가교제 용액을 포함하는 수조에 직접 잠기도록 하여 쉘의 알지네이트가 상기 가교제 용액과 접촉하면서 알지네이트의 낮은 원자가의 이온이 보다 높은 원자가의 이온과 교환하여 교차결합함으로써 쉘 외부에 경화된 네트워크를 성장시킨다. 상기 알지네이트 외부의 빠른 교차결합에 의한 경화는 세포가 로딩된 콜라겐 코어를 물리적 완전성(physical integrity)의 손실 없이 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 세포전달체 제조방법에서 가교제를 포함하는 수조에 코어 및 쉘물질을 20 내지 80 ml/h의 속도로 주입할 수 있는데, 상기 주입 속도가 20 ml/h 미만인 경우, 느린 속도로 인한 공정의 지연으로 제자리(in situ) 섬유상 세포전달체 제조과정 동안 세포사멸의 위험성이 증가할 수 있다. 한편, 주입 속도가 80 ml/h를 초과하는 경우, 부적절하게 두꺼운 쉘 형성을 유도하여 세포 생존에 요구되는 산소 및 영양분의 전달을 저해할 수 있다.
아울러, 상기 가교제는 이에 제한되지 않으나, 염화칼슘일 수 있다. 예컨대, 염화칼슘 용액과 접촉할 때 알지네이트의 1가의 나트륨 이온은 2가의 칼슘 이온으로 교환되어 교차결합을 형성함으로써 표면을 경화할 수 있다. 이때, 상기 염화칼슘은 5mM 내지 50mM의 농도로 사용할 수 있다. 상기 염화칼슘의 농도가 50mM을 초과하는 경우 알지네이트의 과도한 교차결합을 유발하여 고도로 경화된 전달체로 제조될 수 있으며, 5mM 미만인 경우 교차결합이 부족하여 형태를 유지하기 어렵다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물은 골조직 또는 연골조직을 재생시키고자 하는 부위에 이식하여 골조직 또는 연골조직을 재생시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "골조직(osseous tissue)"이란, 뼈를 형성하는 조직을 일컫는 용어이다. 뼈는 표면이 치밀골질로 이루어지며, 중심부나 장골의 양 끝은 그물눈 같이 연합된 해면골질로 되어 있다. 대부분의 뼈는 처음에 결합조직 중의 연골로서 발생하여 나중에 골조직으로 바뀌는데 일부는 결합조직 중에서 직접 생성된다. 말단에는 이웃 뼈와 접하는 부분에 관절면이 있고, 그 표면은 초자연골인 관절연골로 덮여있다. 해면질 가운데의 해면소주는 일정한 배열로 되어 있는 것이 특징이다. 골세포는 골층판 사이에 배열되어 있으며, 불규칙한 별모양으로 가는 원형질 돌기로 인접한 다른 골세포와 연결되어 있다. 뼈의 표면에는 질긴 결합조직성 골막이 있으며, 신경과 혈관이 분포되어 뼈의 보호와 영양을 맡고 있다. 골막이 결손되면 뼈의 생존, 신생, 재생 등이 곤란해진다. 골질의 성분은 수분 20%, 세포를 포함한 유기질 35%, 무기질 45%인데, 뼈가 일정한 탄력성을 유지하는 것은 유기질이 있기 때문이다. 연령이 증가함에 따라 무기질(주로 인산칼슘)이 증가하여 뼈의 경도도 증가한다.
본 발명의 용어 "연골조직(cartilage tissue)"이란, 인간 및 동물의 체내 여러 부분에서 발견되는 유연한 결합조직으로, 뼈, 흉곽, 귀, 코, 기관지 및 추간판 사이의 접합부를 포함한다. 뼈와 달리 딱딱하고 경직되지 않으나, 근육보다는 뻣뻣하고 덜 유연하다. 연골은 콜라겐 섬유(collagen fiber), 단백당(proteoglycan)이 풍부한 기반물질(ground substance) 및 탄력소 섬유(elastin fiber)로 구성된 다량의 세포외기질(extracellular matrix)을 생산하는 연골모세포(chondroblast)라 불리는 특화된 세포로 구성된다. 연골은 상기 세 가지 주요 요소들의 상대적인 함유량에 따라 탄성연골(elastic cartilage), 유리연골(hyaline cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)의 세 가지 타입으로 분류된다. 기질 내에 포획된 연골모세포를 연골세포(chondrocyte)라 하며, 이는 소강이라 불리는 공간에 위치한다. 하나의 공간은 8개의 연골세포까지 수용할 수 있다. 연골은 다른 결합조직과는 달리 혈관을 포함하지 않으며, 연골세포는 관절연골의 압박 또는 탄성연골의 굽힘에 의해 생성되는 펌핑작용에 의한 확산에 의해 제공된다. 따라서, 다른 결합조직에 비해 연골은 성장 및 회복이 매우 느리다.
본 발명의 용어 "재생"이란, 일반적으로 생물체에는 몸의 일부 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복하려는 작용을 일컫는다. 이러한 재생능력은 체계가 간단하고 계통적으로 진화의 정도가 낮은 것일수록 강하다.
바람직하게 상기 세포전달체는 미분화 줄기세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포전달체는 명확히 구분된, 콜라겐 및 세포를 포함하는 코어부분과 알지네이트를 포함하는 쉘부분을 포함하며, 상기 코어부분 또는 쉘부분은 생활성 글라스 나노파티클을 포함한다. 상기 알지네이트 쉘은 기공을 포함하여 코어에 존재하는 생존에 필요한 산소 및 영양분을 공급할 수 있으며, 분화에 필요한 신호전달물질, 성장인자 및/또는 사이토카인 등을 전달하여 분화를 유도할 수 있다. 이러한 구조적 특징에 의해 코어부분의 세포는 산소 및 영양분 등의 공급이 원활한 알지네이트와의 경계부분으로 이동하여 섬유상 구조의 축을 따라 네트워크를 형성한다. 이때, 코어부분 또는 쉘부분에 존재하는 생활성 글라스 나노파티클은 칼슘 이온 또는 실리콘 이온을 방출함으로써 골 분화를 보다 더 효과적으로 유도할 수 있다.
상기 세포전달체에 봉입되는 미분화 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등일 수 있으나, 다양한 조직세포로 분화가능한 세포이면 유래 또는 획득하는 방법과 무관하게 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 비자연적인 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 재생용 조성물은 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 바람직하게는 조직 손상부위에 알맞은 형태로 성형하여 직접 이식할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 하이드로겔의 일종으로 성형이 용이하므로 이러한 투여형태에 적합하다. 예컨대, 조직 손상 형태에 알맞은 형태로 성형되어 이식될 수 있어 효과적으로 조직재생을 촉진할 수 있다. 또한 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알콜 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 "이식(transplantation)"은 일반적으로 공여자의 세포, 조직 또는 장기 등을 수혜자의 손상 조직 또는 장기에 옮기는 과정을 의미한다. 공여자 형태에 따라 자기 세포나 조직을 다른 곳에 이식하는 자가이식(autograft), 수혜자와 동일한 종인 공여자로부터의 세포, 조직, 장기 등을 이식하는(예컨대 인간에서 인간으로) 동종이식(allograft), 다른 종으로부터의 장기 등을 이식하는(예컨대 동물의 장기를 인간에게) 이종이식(xenograft)로 분류될 수 있다. 이식의 대상은 보다 넓게는 공여자의 세포, 조직 또는 장기 뿐 아니라 수혜자의 손상된 조직의 재생을 도울 수 있는 물질이면 제한없이 포함한다. 이식은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 제한되지 않는다.
일반적으로 세포를 이식하는 경우 고형 지지체인 스캐폴드에 로딩시켜 이식하거나 주사를 이용하여 이식할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 반고체인 하이드로겔의 형태로서 별도의 지지체를 필요로 하지 않으면서도 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 손상 조직에도 맞추어 이식할 수 있다. 한편 세포 자체로 또는 비드형태에 봉입시켜 주사제 형태로 제제화하는 경우 주사액에 희석되고 부유되므로 원하는 위치에 정착되도록 하기 어려운 점이 있으나, 본 발명의 조성물의 경우 연속적인 반고체의 하이드로겔 섬유상으로 제조되므로 희석할 필요 없이 원하는 부위에 이식할 수 있어 도입된 세포의 빠른 생착을 도모할 수 있다. 한편 본 발명에 따른 조성물의 코어 및 쉘의 성분인 콜라겐과 알지네이트 또는 생활성 글라스 나노파티클은 모두 생체적합성 물질이며 생분해성을 갖는 물질이므로 체내에 이식되어도 부작용이나 독성을 나타내지 않으며, 시간이 흐름에 따라 자연적으로 분해되면서 도입된 세포가 생착할 수 있게 돕는다.
본 발명의 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체는 하이드로겔 형태로 성형이 용이하여 작거나 복잡한 형태의 조직 손상부분에도 직접 채워넣어 이식할 수 있으며, 생활성 글라스 나노파티클로부터 골 형성에 필요한 이온이 방출되어 효과적으로 골 분화를 유도할 수 있으므로, 치조골 등의 뼈가 결실된 부분의 조직 재생력을 크게 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 코어-쉘 세포전달체에 함유되는 생활성 글라스 나노파티클(BGn)이 골미네랄을 주위에 형성함으로써 우수한 생체활성을 나타낼 수 있음을 보여주는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 BGn을 함유하는 코어-쉘 세포전달체를 제조하는 장치의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 BGn을 함유하는 코어-쉘 세포전달체의 분해 사시도이다.
도 4의 (a)는 본 발명의 BGn을 함유하는 코어-쉘 세포전달체의 광학현미경 사진으로서, BGn의 함량에 따른 쉘층의 불투명도를 나타내고, 도 4의 (b)는 본 발명의 BGn을 함유하는 코어-쉘 세포전달체 표면의 주사전자현미경 사진으로서, 쉘층의 알지네이트 상에서의 BGn의 분포를 보여준다.
도 5는 BGn을 전혀 함유하지 않은 군(CS0) 및 BGn을 20% 함유한 군(CS20)에서의 이온 방출 정도를 비교한 그래프로서, (a)는 Ca2+ 이온의 방출농도를 나타내고, (b)는 Si4+ 이온의 방출농도를 나타낸다,
도 6의 (a)는 본 발명의 코어-쉘 세포전달체를 14일간 랫트 피하 조직에 이식한 샘플의 H&E 염색사진이며, 도 6의 (b)는 쉘 내의 BGn 함량에 따른 세포 밀도를 나타낸 그래프로서, 도 6의 (a)에서의 스케일 바의 크기는 100 ㎛이다.
도 7의 (a)는 BGn을 전혀 함유하지 않은 군(CS0) 및 BGn을 20% 함유한 군(CS20)에서의 세포 생존/사멸을 나타낸 형광 현미경 사진이며, 도 7의 (b)는 CS0 및 CS20군에서의 시간 경과에 따른 생존 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 8은 BGn을 전혀 함유하지 않은 군(CS0) 및 BGn을 20% 함유한 군(CS20)의 골형성 조건에서의 배양 14일 및 배양 21일째의 CLSM 사진이다.
도 9의 (a)는 BGn을 전혀 함유하지 않은 군(CS0) 및 BGn을 20% 함유한 군(CS20)의 골형성 조건에서의 배양 14일 및 배양 21일째의 봉입된 MSC의 ALP 정량분석 결과를 나타내는 그래프이며, 도 9의 (b)는 CS0 및 CS20에 대한 상이한 배양 시간에서의 골형성 표지 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프로서, Col1은 collagen type I을 의미하고, BSP는 bone-sialoprotein을 의미하며, OCN은 osteocalcin을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 달리 특정되지 않은 한 실험은 3회 수행하였다. 데이터는 평균(mean)±단일 표준편차(one standard deviation)로 표현하였다. 피셔 사후검정(Fisher post-hoc test)으로 변이의 일방분석(one way analysis of variance; ANOVA)에 의해 통계적 분석을 수행하였으며, p<0.05을 유의수준(significant level)으로 판단하였다.
실시예 1: 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조 및 특성분석
실시예 1-1: 생활성 글라스 나노파티클의 제조
세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)(Sigma-Aldrich, H5882)를 기공유도물질(porogen)로 사용하고, 2-에톡시에탄올을 공용매로 사용하여 메조포러스 생활성 글라스 나노파티클(BGn)(15% Ca, 85% Si)을 합성하였다. 통상적인 방법으로, 1g의 CTAB를 150mL의 H2O에 용해시키고, 이어서 2mL의 암모니아 용액(25-28%), 40mL의 2-에톡시에탄올 및 테트라하이드레이트 칼슘나이트레이트(Ca(NO3)2·4H2O)를 첨가시켰다. 그 후, 상기 용액에 테트라에틸오르쏘실리케이트(TEOS)(Sigma-Aldrich, 131903)를 점적 주입하고 닫힌 용기 내에서 상기 혼합물을 4시간 격렬하게 교반하였다. 백색 침전물을 수득, 여과 및 정제수로 세척하고 60℃에서 건조하였으며, CTAB 및 기타 유기 성분들을 550℃에서 5시간 공기 중에서 소성하여 제거하여, 생활성 글라스 나노파티클을 제조하였다.
실시예 1-2: 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조
본 발명자들이 이전 개시한(참고: 대한민국 특허 제1472045호) 이중 동심 노즐(dual concentric nozzle; 내부 23G 및 외부 17G)(도 2의 (4))을 사용하여 코어-쉘 구조의 섬유상 네트워크를 제조하였다(도 2 및 3).
도 2에서 보듯이, 상기 제조한 생활성 글라스 나노파티클(10 내지 30중량%)이 균일하게 분산된 3중량%의 알긴산나트륨(sodium alginate; A2158, Sigma-Aldrich) 용액을 외부 실린지(2)에 주입하는 한편, 콜라겐 용액(rat First Link, tail type I collagen, 2.05mg/mL)을 내부 실린지(1)에 로딩하였다. 상기 콜라겐 용액은 1mL의 콜라겐과 100㎕의 10x Dulbecco's modified Eagle 배지를 혼합하여 제조하였다. 각각의 실린지를 미세관을 통해 주입펌프(injection pump; KD Scientific)(3)에 부착하였으며, 50 ml/h의 속도로 50 mM 염화칼슘(CaCl2)을 포함하는 수조(5)에 주입하였다. 주입 후, 상기 수조 내에서 수득된 섬유상 구조체를 5분간 정치하였는데, 이로써 알긴산나트륨의 나트륨 이온과 칼슘 이온의 교환을 통하여 가교결합이 일어나도록 하였으며, 그 후 상기 섬유상 구조체를 웰 플레이트 내로 이송시키고 배양 배지로 수차례 세척하여 여분의 염화칼슘을 제거하였다. 얻어진 본 발명의 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 단면은 도 2의 (6)과 같다.
또한, 도 3에서 보듯이, 쉘 층에 존재하는 생활성 글라스 나노파티클은 내부 코어층에 있는 세포에 신호를 전달하여 골 형성(osteogenesis)을 유도하며, 주위의 외부 세포에 역시 신호를 전달하여 혈관형성(angiogenesis)을 유도하는 기능을 가지는 구조를 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-3: 제조한 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 생활성 글라스 나노파티클의 함량에 따른 물성 변화
상기 실시예 1-2에서 제조한 코어-쉘 섬유상 구조의 세포전달체 내에 함유된 생활성 글라스 나노파티클의 함량에 따른 물성 변화를 분석하였다. 세포전달체 총 중량에 대하여 각각 0%, 10%, 20% 및 30%(w/w)의 생활성 글라스 나노파티클을 함유시킨 후 각각을 CS0, CS10, CS20 및 CS30으로 명명하여 세포전달체의 물성 및 이온방출 정도를 평가하였다(도 4).
도 4의 (a)에서 보듯이, 셀층 내에 포함된 생활성 글라스 나노파티클의 농도가 높을수록 불투명도가 높아짐을 알 수 있었으며, 도 4의 (b)에서 보듯이, 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 알지네이트 상에 균일하게 분포한 생활성 글라스 나노파티클을 관찰할 수 있었다.
또한, 1mL의 본 발명의 코어-쉘 섬유상 세포전달체(CS0 또는 CS20)를 15mL의 Tris buffer 0.1M에 37℃, pH7.4 조건에서 담근 후, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 경과시점에서 이온 방출 정도를 ICP-AES(Perkin-Elmer, OPTIMA 4300DV)로 확인하였다(도 5).
도 5에서 보듯이, Ca2 + 이온 및 Si4 + 이온의 방출 정도가 생활성 글라스 나노파티클을 전혀 함유하고 있지 않은 군(CS0)에 비해 20중량%의 생활성 글라스 나노파티클을 함유하고 있는 군(CS20)에서 보다 높음을 알 수 있었다. 특히, 실리콘 이온의 경우는 CS0에 비해 이온 방출이 현저하게 높았는데, 이는 칼슘 이온의 경우는 생활성 글라스 나노파티클이 없는 군에서도 알지네이트에서 방출되는 칼슘 이온이 있어 어느 정도 칼슘 이온의 농도가 유지되었지만(도 5의 (a)), 실리콘 이온의 경우에는 생활성 글라스 나노파티클을 제외한 성분들에서 방출되는 양이 거의 미미하여 도 5의 (b)에 도시된 그래프와 같은 양상을 나타내게 된 것으로 보인다.
실시예 2: 코어-쉘 섬유상 세포전달체 내로의 세포의 봉입 및 봉입된 세포의 생존율 및 증식율
실시예 2-1: 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 체내 생체적합성 확인 및 조직염색 관찰
상이한 농도의 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어-쉘 하이드로겔의 생체적합성 및 세포 호밍 능력을 평가하기 위하여 12주령의 수컷 Sprague-Dowley 랫트를 이용하였다. 동물들을 각각 제어된 환경 내에서 사육하고 물 및 사료를 자유식이하도록 하였다. 본 연구 내에서 이루어지는 모든 동물의 취급 및 사용에 대한 실험 프로토콜은 단국대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 지침에 따라 행해졌다.
동물들을 케타민/크실라진의 근육내 주사로 마취하였으며, 랫트의 등쪽 영역상의 피부를 면도하고 포비돈 요오딘 및 70% 에탄올로 소독하였다. 2cm 크기로 4곳의 피부를 절개하여 각각 0.5㎕의 본 발명의 코어-쉘 세포전달체를 주입하고 절개부위를 다시 봉합하였다. 2주 후 상기 동물들을 희생시킨 후 즉각 조직학적 샘플을 수집하였으며, 조직분석을 위해 실온에서 24시간 10% 중성의 완충 포르말린으로 고정시켰다.
상기 고정시킨 샘플들을 에탄올 내에서 탈수시키고 절개하여 파라핀을 충진하였다. 로터리 마이크로톰(Leica, RM2245)을 사용하여 스캐폴드의 중심 영역에서 두께 5㎛의 섹션을 준비하고 유리 슬라이드로 옮겼다. 조직 섹션이 놓인 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 크실렌 및 일련의 에탄올을 통해 수화시켰다. 슬라이드를 통상의 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색법으로 염색하여 광학 현미경으로 관찰할 수 있도록 하였다(도 6).
도 6에서 보듯이, 조직 샘플의 H&E 염색은 모든 실험군에서 유의미한 염증 반응은 관찰되지 않았으며, BGn이 없는 군(CS0)과 BGn을 함유하는 군(CS10, CS20 및 CS30)에서 세포 반응은 큰 차이를 나타내었다(도 6의 (a)). CS0 하이드로겔 내에서는 매우 희박한 세포수가 관찰된 반면, BGn을 함유하는 하이드로겔 내에서는 높은 세포 침습이 관찰되었는데, 세포 수는 BGn의 함량에 비례하여 증가하였다.
실시예 2-2: BGn 함유 코어-쉘 섬유상 세포전달체 내로의 세포의 봉입
5주령 랫트(180 내지 200g) 골수로부터 중간엽 줄기세포(MSC)를 수득하였다. 수득한 시료를 원심분리하여 상등액을 수거하여 정상 배양 배지(10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 α-MEM(α-최소 필수 배지; α-minimal essential medium))의 배양 플라스크에 분산시켜 37℃의 5% 이산화탄소를 포함하는 습식 배양기에서 배양하였다. 1일간 배양한 다음, 배지를 교환하고 세포가 80% 이상 컨플루언시에 달할 때까지 배양하였다. 그 다음, 트립신으로 세포를 계대배양(subculture)하고 정상 배양 조건에 유지하였다. 2 내지 3 계대(passage)의 세포를 추가적인 실험에 사용하였다.
상기 MSC 세포를 봉입하기 위하여 생활성 글라스 나노파티클 및 알긴산나트륨 분말을 에틸렌옥사이드로 멸균하고 멸균조건 하에 보관하였으며, 상기 분말을 증류수와 혼합하여 3% 알긴산나트륨 용액을 제조하였는데, 생활성 글라스 나노파티클의 영향을 알아보기 위하여 전체 세포전달체의 중량에 대하여 20중량%의 생활성 글라스 나노파티클을 함유하는(CS20) 알긴산나트륨 용액 및 전혀 함유하지 않은(CS0) 알긴산나트륨 용액을 제조하였다.
또한, 염화칼슘 및 1N NaOH도 멸균하였으며 콜라겐에 중간엽 줄기세포(MSC)를 포함시키기 위하여 1N NaOH로 중성화한 콜라겐 3mL에 1x106 세포를 함유하는 100㎕의 배지를 첨가하였다. MSC를 로딩한 콜라겐 용액을 내부 실린지에 넣고 알지네이트 및 생활성 글라스 나노파티클(CSO 또는 CS20)을 포함하는 용액을 외부 실린지에 두었으며 전술한 방법에 따라 멸균 조건에서 섬유상 구조화를 수행하였다. 결과로서 수득한 세포를 봉입한 섬유상 하이드로겔(세포-콜라겐을 코어에, 알지네이트-생활성 글라스 나노파티클(BGn)을 쉘에 포함) 0.3mL을 48웰 플레이트에 옮기고 배양 배지로 반응하지 않은 염화칼슘 용액을 제거한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 세포가 봉입된 스캐폴드는 셀 봉입 후 24시간된 시점에서 10mM β-글리세롤 포스페이트, 10nM 덱사메타존 및 50㎍/mL의 아스코르브산을 포함하는 골형성 매질을 사용하여 자극하였다. 매 48시간마다 배지를 교체하였다.
실시예 2-3: BGn 함유 코어-쉘 섬유상 세포전달체 내에 봉입된 세포의 생존율 측정
상기 실시예 2-2에서 세포전달체로 봉입한 세포의 생존율을 LIVE/DEAD 생존/독성 분석법(InVitrogen, L3224)으로 알아보았다. 섬유상 스캐폴드를 2μM 칼세인 AM 및 4μM 에티듐호모다이머-1(EthD-1)를 포함하는 배지에서 30분간 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 스캐폴드 내에 존재하는 세포를 PBS로 세척한 후 형광 현미경(BX-50, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 살아있는 세포(녹색) 및 죽은 세포(적색)를 ImageJ 1.49k 소프트웨어를 사용하여 정량분석하였다(도 7).
도 7의 (a)에서 보듯이, 시간이 경과함에 따라 세포의 증식이 크게 일어나고 코어-쉘 세포전달체의 크기가 줄어듬을 알 수 있었으며, 도 7의 (b)에서 보듯이, BGn을 첨가한 CS20은 CS0와 유사한 80% 이상의 세포 생존율을 보였는데, 이로써 생활성 글라스 나노파티클이 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
실시예 3: 코어-쉘 섬유상 세포전달체 내에서 배양된 세포의 형태분석
상기 실시예 2-2에서 세포전달체로 봉입한 세포의 형태를 분석하기 위하여, 상기 세포를 배양 시작 후 14일 및 21일째 되는 날에 각 샘플상에서 성장한 세포들을 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 10분간 0.05% Triton X-100으로 처리하였다. PBS로 세척한 후, PBS에 희석한 Alexa Fluor 546-conjugated phalloidin(Invitrogen A22283)을 각 샘플에 첨가하여 F-actin을 염색하였다. DAPI 핵산 염색 반응제(4,6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드)(Invitrogen, D1306)를 사용하여 세포를 염색하였으며, 핵 내에서 dsDNA와 반응할 시 청색 형광을 나타내었는데, 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy; CLSM) 사진을 촬영하였다(도 8).
도 8에서 보듯이, 녹색으로 표시된 것은 α-액틴이며, 청색으로 표시된 것은 핵이다. BGn을 함유하지 않은 군(CS0) 및 BGn을 20% 함유한 군(CS20) 양쪽 모두에서 세포들은 별-모양의 형태로 길게 신장되었다. 14일째의 세포와 비교하면, 21일째의 세포들이 세포간 접촉을 많이하여 밀도가 높음을 알 수 있었으며, 코어의 경계부를 따라 주로 나란히 세포들이 배열됨을 알 수 있었다. 21일째 컨플루언스에 도달된 후, 양쪽 군은 모두 유사한 형태를 가진 비슷한 수의 세포를 나타내고 있었으며, 높은 사상위족 활성(filopodial activity)을 보였다.
실시예 4: 코어-쉘 섬유상 세포전달체 내에서 배양된 세포의 정량 및 유전자 분석
실시예 4-1: 세포 정량분석
상기 실시예 3의 세포전달체 내에서 배양된 세포를 대상으로, 세포이중가닥 DNA 검출 키트(Quanti-iT Picogreen, Invitrogen)를 이용하여 세포 증식 가능성을 측정하였다. 각 배양 주기에서 세포를 포함하는 하이드로겔 샘플을 PBS로 2회 세척하였으며 37℃에서 1시간 1%의 I형 콜라게네이즈 내에 용해시켰다. 초기 배양 주기 후, 알지네이트 분해 완충액(55mM 시트르산나트륨, 30mM EDTA, 0.115M NaCl)을 각 스캐폴드 내에 첨가하였다. 세포 펠릿을 모은 후, 각 샘플을 -20℃에 저장하였다. 그 후 상기 샘플에 대해 동결-융해 사이클을 3회 반복하였으며, 그 후, 10분간 0.2%의 Triton X-100을 첨가하고 초음파 교반을 수행하였다. 그런 후, DNA 분해를 피하기 위해 4℃에서 20분간 15000rpm으로 원심분리하였으며, 상등액을 후속 정량에 사용하기 위하여 수집하였다. 5분간 암실 조건에서 배양한 후, 485nm 여기 및 530nm 방출 파장에서 형광세기를 측정하여 제조업자의 설명서에 따라 세포를 정량하였다. 제조업자의 지시에 따라 표준곡선을 획득하고 형광세기를 DNA 함량으로 변환하는데 사용하였다. 이러한 분석법을 토대로 하기 실시예 4-2의 ALP 활성 판정 및 실시예 4-3의 유전자 발현수준 분석을 실시하였다.
실시예 4-2: 알칼리성 포스퍼타아제 활성 판정
골형성 표현형의 보유는 알칼리성 포스퍼타아제(ALP) 활성을 측정함으로써 평가하였다. ALP의 존재 하에서 p-나이트로페닐 포스페이트가 p-나이트로페놀로 전환되는 것에 기초한 열량 분석법이 사용되었다. 상기 세포 정량 단계에서 수득된 세포용해물을 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 완충액 1.5M(Sigma-Aldrich, A5888) 및 포스퍼타아제 기질 용액 20mM(Sigma-Aldrich, P4744)와 1mM MgCl2의 존재하에서 1:1:1의 비율로 혼합하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 상기 반응을 1M NaOH로 종결하고 405nm에서의 흡광도 측정으로 p-나이트로페놀의 생성을 확인하였다. p-나이트로페놀(Sigma-Aldrich, N7660)의 알려진 농도로부터 만들어진 표준 곡선에 대해 값들을 보정하고 ALP 활성에 대한 결과를 각 샘플의 dsDNA 수치에 의해 정규화하였다(도 9의 (a)).
도 9의 (a)에서 보듯이, CS0 및 CS20 양쪽 군에서 모두 비슷한 양상을 나타내었는데, 7 내지 14일 사이에는 ALP 활성이 증가하였고, 그 후 21일까지는 감소하였다. CS0에 비해서, CS20 하이드로겔은 모든 배양 시간에 걸쳐 우위의 ALP 활성을 나타내었는데 특히 14일에서 가장 현저한 차이를 나타내었다.
실시예 4-3: 정량적인 유전자 발현수준 분석
전술한 방법과 동일한 용해 방법을 사용하여 상이한 배양 주기(7일, 14일 및 21일)에서의 각 실험군으로부터 세포를 수집하였다.
제조업자의 지시에 따라 RNeasy 미니키트(Qiagen, 74106)를 이용하여 mRNA를 단리하였다. thermal cycler(HID Veriti® 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, 4479071)를 사용하여 역전사를 수행하였으며, 수득된 cDNA를 UV-Vis 분광계(Nanodrop 2000, Thermo Scientific)로 정량하였다. 유전자 발현을 SensiMix SYBR Kit(Bioline, QT605)을 사용한 실시간 PCR 장치(StepOneTMPlus, Applied Biosystems)로 평가하였다. 골형성 유전자 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다: GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GeneBank NM_017008): 5'-GGCAAGTTCAACGGCACAGT-3' (정방향; 서열번호 1), 5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3' (역방향; 서열번호 2); Col1(collagen type I, GeneBank NM_ NM_053304.1): 5'-CGTGACCAAAAACCAAAAGT-3' (정방향; 서열번호 3), 5'-GGGGTGGAGGAAAGGAACAGA-3' (역방향; 서열번호 4); 및 BSP(bone saloprotein, NM_012587): 5'-ATACGAACAAATAGGCAACG-3' (정방향; 서열번호 5), 5'-CCTCATAAGCTCGGTAAGTG-3' (역방향; 서열번호 6).
PCR은 95℃에서 20초간 활성 단계로 개시되었으며, 변성(15s, 95℃), 어닐링(30s, 60℃) 및 신장(30s, 72℃)의 사이클을 49회 반복하였다. 타겟 유전자에 대한 상대적인 유전자 발현 정도는 comparative Ct method(2-△△Ct)를 사용하여 분석하였으며, 내생적인 GAPDH 유전자에 대하여 표준화하였다(도 9의 (b)).
도 9의 (b)에서 보듯이, CS0에 비해 CS20에서 골형성 관련 유전자들이 전반적으로 잘 발현함을 알 수 있었다. 특히, 골형성 관련 유전자 중 상대적으로 초기의 골형성 지표인 Col1은 14일경에, 중기-후기의 골형성 지표인 BSP는 21일경에 잘 발현되었으며, 가장 나중의 골형성 지표인 OCN의 경우는 14일 및 21일의 발현양에 있어 큰 차이를 나타내지 않았으나, 각 발현양의 비교에서는 역시 CS0보다 CS20에서 더 높은 발현양을 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University Cheonan Campus <120> Core-shell fibrous cell carriers incorporating ion-emitting bioactive glass nanoparticles and its use <130> KPA151211-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADPH forward primer <400> 1 ggcaagttca acggcacagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADPH reverse primer <400> 2 cgctcctgga agatggtgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1 forward primer <400> 3 cgtgaccaaa aaccaaaagt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1 reverse primer <400> 4 ggggtggagg aaaggaacag a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP forward primer <400> 5 atacgaacaa ataggcaacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP reverse primer <400> 6 cctcataagc tcggtaagtg 20

Claims (13)

  1. 세포 및 콜라겐을 포함하는 코어; 및
    상기 코어 둘레를 감싸는, 알지네이트를 포함하는 쉘을 포함하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체에 있어서,
    상기 코어 또는 상기 쉘은 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 섬유상 세포전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 100 μm 내지 1500 μm의 직경을 갖는 것인 세포전달체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 쉘은 100 μm 내지 250 μm의 두께를 갖는 것인 세포전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 코어 총 중량에 대하여 콜라겐을 0.5 내지 5 중량% 포함하는 것인 세포전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 쉘은 쉘 총 중량에 대하여 알지네이트를 2 내지 5 중량% 포함하는 것인 세포전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 글라스 나노파티클은 상기 세포전달체 총 중량에 대하여 10 내지 30 중량% 포함되는 것인 세포전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 글라스 나노파티클은 칼슘 이온 또는 실리콘 이온을 방출하는 것인 세포전달체.
  8. 중심을 공유하는 서로 다른 직경의 바늘을 통해 내부 바늘로부터는 세포와 콜라겐 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 코어물질을, 외부 바늘로부터는 알지네이트 및 선택적으로 생활성 글라스 나노파티클을 포함하는 쉘물질을 가교제를 포함하는 수조에 일정한 속도로 주입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 코어-쉘 섬유상 세포전달체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 속도는 20 내지 80 ml/h인 것인 세포전달체의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 가교제는 염화칼슘인 것인 세포전달체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 염화칼슘은 5 mM 내지 50 mM 농도인 것인 세포전달체의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 코어-쉘 섬유상 세포전달체를 포함하는 골조직 또는 연골조직 재생용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 세포전달체는 미분화 줄기세포를 포함하는 것인 조성물.
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