KR20180008374A

KR20180008374A - 바이러스 감염의 확인 및 구별을 위한 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR20180008374A
Application number: KR1020177016784A
Authority: KR
Inventors: 샤흐루즈 라비자데흐; 카이반 니아치; 스티븐 찰스 벤츠; 앤드류 응유옌
Original assignee: 난토믹스, 엘엘씨
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2018-01-24
Also published as: AU2015349661B2; CA2968527C; EP3221472A4; CA2968527A1; US20180258501A1; IL252393A0; CN107429302A; EP3221472A1; WO2016081892A1; AU2015349661A1; JP2017535270A; JP2019058175A

Abstract

다중의 독특한 병원체 종 및/또는 변이체를 포함하는 독특한 병원체(예를 들어, 바이러스) 과에 속하는 적어도 2개의 불특정된 병원체의 구별을 위해 프라이머를 결정하는 시스템 및 방법이 제공된다.

Description

바이러스 감염의 확인 및 구별을 위한 시스템 및 방법{Systems and methods for identification and differentiation of viral infection}

본 출원은 본원에 참조로 인용된, 2014년 11월 21일자로 출원된 일련번호 US 62/083125를 갖는 가출원의 우선권을 주장한다.

본 발명의 분야는 바이러스 감염, 특히, 이것이 에볼라(Ebola) 바이러스에 의한 감염 및 증상적으로 유사한 인플루엔자 바이러스 감염으로부터의 구별과 관련된 것으로서, 바이러스 감염의 신속한 확인 및 구별을 위한 진단 시스템 및 방법이다.

배경 기술은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술 분야이거나 본원에 청구된 발명과 관련된 것임을 인정하거나 구체적으로 또는 명백하게 참조로 인용된 임의의 공보가 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

미국에서, 계절성 인플루엔자 A ("독감(flu)")는 연간 인구의 5 내지 20%를 감염시켜 약 200,000명의 입원 및 약 39,000명의 독감 관련 사망을 유발하는 것으로 사료된다. 가장 최근 2009-2010년의 "돼지 독감"과 같은 유행병 시기 동안에, 이들 숫자는 추가로 430만 내지 890만 사례로 증가하였다(이는 추가로 8,870명 내지 18,300명으로 추정되는 인플루엔자 관련 사망을 초래하였다). 인플루엔자 A 뿐만 아니라, 에볼라 바이러스는 또한 유행성 잠재력을 입증하고 조기 임상적 증상을 인플루엔자 A 감염과 공유하고, 이는 열, 근육통/신체 통증, 두통 및 중증 피로의 존재를 포함한다. 상기 유사성은 독감 유행병이 에볼라 감염의 존재 또는 의심과 일치한다는 특정 과제를 부과한다. 바이러스 병원체의 신속한 확인 및 구별은 인플루엔자 환자의 임상적 간호 및 전염병학적 억제 (항바이러스 약물을 사용한 가정 간호)가 에볼라 환자 간호를 위해 요구되는 프로토콜과 상당히 상이함으로(예를 들어, 완화제 지원과 함께 격리에 크게 의존한다) 매우 중요하다.

에볼라 감염의 진단은 많은 방식으로 수행될 수 있고 대부분의 경우에 바이러스 핵산 검출 방법을 사용한다. 예를 들어, 바이러스 핵단백질 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하는 역전사-폴리머라제 연쇄 반응에 의한 많은 필로바이러스(filovirus) 종의 검출은 신속하게 에볼라 및 에볼라-관련 바이러스를 포함하는 다양한 바이러스 종을 다루는 것으로 보고되었다(문헌참조: J Virol Methods. 2011 Jan;171(1): 310-3). 상기 방법은 유리하게 신속한 분석을 가능하게 하지만 불행하게도 다른 비-필로바이러스에 대한 차등적 진단 가치를 제공하는데 실패한다. 바이러스 진단의 또 다른 방법에서, 환자 혈청으로부터의 총 RNA는 PCR 증폭에 이어서 차세대 서열 분석에 적용하였다(문헌참조: Virology 2012 Jan 5;422(1):1-5). 인플루엔자로부터 에볼라의 구별을 위해 강력하고 잠재적으로 적합한 기술은 과도한 샘플 취급을 요구하는 경향이 있고 흔히 상당한 비용과 관련된다. 샘플 중에 바이러스를 확인하기 위한 또 다른 공지된 방법에서, PCR 증폭은 공지된 계통수에 대해 정렬된 생성물을 생성하기 위해 사용된다(문헌참조: J Clin Microbiol 2007 Jan;45(1):224-6). 그러나, 상기 방법은 일반적으로 큰 계통 발생 거리를 갖는 바이러스의 확인을 위해서는 적합하지 않다.

인플루엔자 또는 에볼라 바이러스의 확인을 위해 추가로 공지된 PCR 프로토콜은 전형적으로, 진단학적 패널에서 다양한 바이러스 종의 존재를 확인하는 것을 도와주는 프라이머 세트를 사용한 멀티플렉스 PCR을 사용한다(문헌참조: 예를 들어, Clinical Infectious Diseases 1998;26:1397-1402; J Clin Microbiol 1999 Jan;37(1):1-7; J Clin Microbiol 1999 Jan;37(5):1352-1355; J Clin Microbiol 2007 Feb;45(2):584-589). 상기 시험 패널은 유리하게 고도의 특이적 구별 진단을 가능하게 하면서, 바이러스 및 혈청형 특이적 프라이머를 필요로 했다. 불행하게도, 상기 프라이머는 특정 바이러스에 매우 특이적이지만 다른 바이러스 변이체, 특히, 새로운 변이체 또는 고도의 다양성을 갖는 변이체에 특이적일 수 없다. 더욱이, 동일한 부류의 다중 바이러스의 검출이 요구되는 경우, 프라이머 복잡성은 이상적으로 디자인된 프라이머 세트의 인간 능력을 급격히 초과한다.

상기 복잡한 과제를 수용하기 위해, 다양한 소프트웨어 도구가 개발되었다. 예를 들어, Greene SCPrimer는 제1 단계에서 후보 프라이머를 확인하기 위한 바이러스 과에 대한 모든 서열의 계통수를 생성시키고, 이어서 정배향 및 역배향 프라이머에 대한 융점과 일치하도록 추가로 절단되는 최소 프라이머 세트에 도달하도록 그리디 (greedy) 세트 커버링 문제(SCP) 알고리듬을 수행하는 소프트웨어 슈트(문헌참조: 예를 들어, Nucleic Acid Res. 2006, Vol 34, No.22 p: 6605-6611)이다. 상기 분석은 프라머 쌍의 선택을 용이하게 하지만 컴퓨터적으로 복잡하고 여전히 바이러스 과(family) 또는 종(species) 내의 모든 바이러스를 다룰 수 없다. 더욱이, 상기 방법은 여전히 축퇴성(degenerate) 프라이머의 사용을 필요로 하고, 상기 프라이머는 비-특이적 결합의 위험을 증가시킨다. 여전히 추가로, 상기 방법은 또한 바이러스 표적 세트가 매우 다양한 경우 문제가 되는 경향이 있다.

다중 서열 정렬을 회피하면서 다양한 표적 세트를 사용하여 난점을 극복하기 위해, 또한 과 수준상에서 컨센서스 프라이머를 확인하기 위해 그리디 알고리듬을 사용하는 멀티플렉스 프라이머 예측(MPP) 도구가 개발되었다(문헌참조: 예를 들어, Nucleic Acid Res. 2009, Vol 37, No.19, p: 6291-6304). MPP 도구는 개념적으로 상기 방법과 유사하지만, 전형적으로 축퇴성 프라이머 서열을 요구하지 않고 상대적으로 짧은 프라이머 (10개 뉴클레오타이드)를 생성하고, 이는 인간 또는 인간 숙주 비-인간 서열 (예를 들어, 감염으로 인한 세균 또는 바이러스)의 비-특이적 결합 및 프라이밍의 가능성을 증가시킨다.

따라서, 에볼라 또는 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 여러 방법이 당업계에서 공지되어 있지만, 이들 모든 또는 거의 모든 방법은 하나 이상의 단점을 갖는다. 따라서, 특히 차등적 진단이 에볼라 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 바이러스 감염의 구별을 위해 요구되는 경우 개선된 검출 시스템을 제공할 필요성이 있다. 상기 필요성은 진단이 단일 샘플에서 에볼라 바이러스 및 인플루엔자 바이러스의 다중 종을 다루어야만 하는 경우 추가로 혼동된다. 따라서, 바이러스 서열의 상대적으로 큰 다양성으로 인해, 검정 조건하에서 병원체에 대한 높은 특이성을 갖고 인간 DNA에 대해 하이브리드화하지 않는 적합한 올리고뉴클레오타이드 서열을 신속히 확인하기 위한 시스템 및 방법이 또한 시급하게 요구된다.

발명의 요약

본원 발명자들은 독특한 부류의 병원체에 대한 프라이머가 독특한 부류의 구성원으로부터의 컨센서스 서열을 사용하여 결정될 수 있음을 밝혔다. 가장 전형적으로, 컨센서스 서열은 다양한 병원체 서열의 연속적 정렬 및 처리, 인간 서열에 대한 보정 및 독특한 부류에 대한 각각의 프라이머 간의 세트 차이에 의해 수득된다.

본 발명의 주요 대상의 하나의 양상에서, 본원 발명자들은 2개의 비특이적 병원체의 구별을 위한 프라이머 세트를 수득하는 방법을 고려한다. 고려된 방법에서, 불특정된 병원체 각각은 독특한 계통적 병원체 (예를 들어, 바이러스) 과에 속하고, 각각의 병원체 과는 다중의 독특한 병원체 종 및/또는 혈청형(serotype)을 포함한다. 가장 바람직하게, 고려되는 방법은 정렬 장치를 통해 각각의 독특한 병원체 과의 병원체 종 및 혈청형의 다수의 디지탈적으로 나타낸 게놈에 대한 각각의 다중 서열 정렬을 수행하여 독특한 병원체 과 각각에 대한 정렬 산출을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 각각의 정렬 산출에서 (i) 최소 역치 초과의 상동성, (ii) 최소 역치 초과의 길이, 및 (iii) 최소 역치 초과의 용융 온도를 갖는 각각의 컨센서스 서열을 확인하는 단계를 포함한다. 또 다른 단계에서, 확인된 컨센서스 서열은 독특한 병원체 과에 대해 각각의 조정된 정렬 산출 결과로 수집되고 여전히 추가의 단계에서, 서열은 각각의 바이러스-특이적 정렬 산출을 형성하기 위하여, 각각의 조정된 정렬 산출 서열로부터 제거된다(상기 제거된 서열은 인간 및 인간 숙주 서열에 대해 최소의 상동성을 갖는다). 세트 차이 분석은 이어서 바이러스 특이적 정렬 산출에 대해 수행하여 불특정된 병원체에 대한 각각의 컨센서스 서열 세트를 수득하고, 이어서 프라이머 서열은 각각의 컨센서스 서열 세트로부터 선택된다.

가장 바람직하게, 다중 서열 정렬은 Clustal X, Clustal W, 또는 Clustal 오메가를 사용하여 수행된다. 추가로 상동성에 대한 최소 역치가 적어도 97% (및 일부 경우에 상동성은 100%이다)이고, 길이에 대한 최소 역치가 적어도 15개, 및 보다 전형적으로 적어도 20개, 및 가장 전형적으로 적어도 25개 염기이지만 용융 온도에 대한 최소 역치는 적어도 60℃, 및 보다 통상적으로 적어도 65℃인 것이 고려된다.

추가의 고려되는 양상에서, 분석 엔진은 병원체 과 또는 목(order)의 여러 상이한 구성원 (예를 들어, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B)의 정렬을 포함하는 Clustal X, Clustal W, 또는 Clustal 오메가로부터 포맷된 산출을 처리하도록 프로그램화되고/구성된다. 모든 바이러스 구성원의 핵산 염기의 정렬을 비교함에 의해, 보존성 영역이 밝혀질 수 있다. 이들 보존성 영역은 이어서 한 부류의 병원체의 모든 구성원을 고유적으로 확인하기 위한 프라이머 서열의 개발을 위해 수집된다. 보존성 영역이 밝혀지지 않거나 영역이 용융 온도 요건을 충족하는 올리고머를 생성하는데 실패하는 경우에, 상기 알고리듬은 최소 불일치 염기가 목적하는 융점에 도달하도록 한다. 상기 정렬내 각각의 염기 위치는 불일치 염기의 첨가 시 바이러스 부류를 가장 대표하는 염기 위치가 가장 큰 정도의 양립성을 가능하게 하도록 할당된 보존성 스코어이다. 이어서 상기 프라이머 서열은 BlastN을 사용하여 여과시켜 인간 서열에 대한 임의의 잠재적 맵핑을 제거하여 위양성율(false positive rate)을 감소시킨다. 후속적 분석은 중첩하는 서열을 제거한다. 일반적으로 추가로 제거하는 단계가 BlastN을 사용하여 수행되는 것이 바람직하고, 여기서, 인간 및 인간 숙주 서열 (예를 들어, 인간에 존재하는 것으로 공지되거나 의심되는 바이러스 서열)에 대한 최소 상동성은 적어도 90%, 및 보다 전형적으로 적어도 95%이다. 본 발명의 주요 대상을 제한하는 것 없이, 세트 차이 분석은 세트 차이(Set Difference) 및 세트 유니온 작동(Set Union operations)을 사용하여 수행되고/되거나 프라이머 서열은 100 내지 800개 염기의 길이를 갖는 앰플리콘(amplicon)을 생성하기 위해 선택된다. 또한, 불특정된 병원체가 2개의 독특한 계통학적 목에 속하는 것으로 고려된다. 최종적으로, 방법이 바이러스 RNA로부터 cDNA를 생성하기 위한 프라이머 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있고/있거나 프라이머 세트가 불특정된 병원체의 각각에 대해 1개 내지 5개 프라이머 쌍을 포함하는 것으로 고려된다.

도 1은 본 발명의 주요 대상에 따른 컴퓨터 기반 프라이머 확인 방법의 예시적인 도식적 흐름도이다.

본 발명자들은 현재 단일 샘플에서 또 다른 병원체 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스)의 하나 이상의 균주(strain)에 대한 병원체 (예를 들어, 에볼라 바이러스)의 하나 이상의 균주의 멀티플렉스 차등 검출을 위한 시스템 및 방법을 밝혔고, 여기서, 상기 병원체(들) 및/또는 균주들 중 어느 것도 존재하는 것으로 공지되어 있지 않다. 가장 전형적으로, 상기 검출은 가장 통상적으로 전혈 또는 혈청 또는 혈장인 생물학적 샘플에서 다양한 증상적으로 유사한 바이러스, 및 특히 에볼라 바이러스 (Zaire) 및 인플루엔자 A를 표적화하는 올리고뉴클레오타이드 세트를 기준으로 한다. 특히 본 발명의 주요 대상의 바람직한 양상에서, 모든 올리고뉴클레오타이드는 고도로 보존된 영역 (일부 경우에 100%는 모든 균주에 걸쳐 보존되어 있다)을 표적화하고 ≥ 65℃의 융점 Tm을 갖는다.

다른 멀티플렉스 검정과는 대조적으로, 고려되는 검정은 많은 선택된 것들 중에서 단일 혈청형을 구별하고 확인하기 위해 사용되지 않고 각각의 부류내 대부분 또는 모든 혈청형을 다루면서 비공지된(불특정된) 부류의 병원체를 구별하기 위해 사용됨을 특히 주지해야만 한다. 더욱이, 고려되는 프라이머는 또한 비-표적 특이적 결합 및 특히 숙주 게놈에 존재하는 것으로 예상되거나 공지된 숙주 게놈 또는 핵산으로의 결합을 배제하기 위해 선택된다. 마지막으로, 프라이머는 프라이머 이량체 및 교차 하이브리드화 (즉, 제1 부류의 병원체에 대해 디자인된 프라이머는 제2 부류의 병원체에 결합한다)가 회피되도록 선택된다.

하기에 보다 상세하게 추가로 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 개념적으로 단순하고 효과적인 컴퓨터 수행된 알고리듬을 사용하여 인플루엔자 A 및/또는 에볼라 바이러스 함유 샘플의 신속한 확인을 가능하게 하기 위해 프라이머 패널(상보적 또는 역 상보적 배향에서)을 디자인하기 위해 이에 대한 고유한 표적 서열을 확인하였다. 물론, 하기 실시예는 에볼라 및 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 활용을 입증하면서 고려되는 시스템 및 방법은 본 발명의 주요 대상이 특정 서열 정보와는 무관함에 따라 임의의 병원체에 대해 적합한 것으로 인지되어야만 한다. 더욱이, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 다수의 표적 부위 (및 상기 개별 및 멀티플렉스 가능성과 함께)를 신속하게 확인하여 최종 사용자가 이들의 특정 증폭 플랫폼에 대한 최상의 프라이머 쌍(들)을 선택할 수 있게 하는 것으로 주지되어야 한다.

도 1은 예시적으로 본 발명의 주요 대상에 따라 전형적인 컴퓨터 수행 작업 흐름을 보여준다. 그러나, 본원에 기재된 모든 방법은 달리 본원에 지적되지 않는 경우, 또는 달리 문헌에 의해 명백하게 반박되지 않는 경우, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다는 것으로 주지되어야 한다. 본원에 특정 구현예와 관련하여 제공된 임의의 모든 실시예 또는 예시적 용어 (예를 들어 "와 같은")의 사용은 단순히 본 발명을 보다 양호하게 설명하는 것으로 의도되고 청구된 발명의 범위에 대한 제한을 부과하지 않는다. 본원 명세서에서 어떠한 용어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 지적하는 것으로서 해석되지 말아야 한다.

여기서, 제1 단계 110에서, 특정 부류의 병원체(예를 들어, 병원체 속 또는 종 혈청형의 모든 구성원)에 대해 모든 가용한 핵산 서열은 하나 이상의 공급원, 전형적으로 디지탈 FASTA 포맷에서 서열 데이터베이스로부터 수득된다. 당업계에 공지된 많은 상기 데이터베이스가 있고 모든 데이터베이스는 본원에 사용하기 위해 적합한 것으로 간주된다. 더욱이, 데이터 포맷은 FASTA 포맷으로 필수적으로 제한될 필요가 없는 것으로 주지되어야 하고 FASTQ, BAM, SAM, EMBL, GCG, GenBank, RAW, IG, 등을 포함하는 다양한 대안적 포맷이 또한 고려된다. 그러나, FASTA 포맷이 일반적으로 바람직하고 다른 포맷이 요구되는 경우 FASTA 포맷으로 재포맷될 수 있는 것으로 인지되어야 한다.

또한, 상기 데이터베이스는 데이터 온라인을 제공할 수 있거나 상기 데이터베이스는 CD-ROM, EPROM 메모리 등에 대한 물리적 파일일 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 제공 방식에 상관 없이, 서열 데이터는 바람직하게 단계 120에 나타낸 바와 같이 다중 서열의 신속한 정렬이 가능하도록 구성된 분석 엔진에 의해 획득된다. 대부분 바람직하게, 상기 정렬은 다중-서열 정렬이고, 특히 바람직한 정렬기는 ClustalO과 같은 정렬을 생성하여 Clustal 포맷 130으로 상응하는 정렬을 생성하기 위한 씨딩된 가이드 트리 및 HMM 프로파일-프로파일 기술을 사용하는 것들을 포함한다. 대안적으로, 정렬은 또한 다수의 대안적 방식으로 수행될 수 있고 국소 영역 (예를 들어, Kalign)을 기준으로, 신속한 퓨리어 전환 (예를 들어, MAFFT)을 기준으로 또는 계통발생-어웨어 방법(예를 들어, WebPRANK)을 기준으로 하는 정렬을 사용할 수 있다.

특정 방법과 상관 없이, 따라서 단일 부류의 병원체에 대한 모든 서열이 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 처리되고 이어서 이는 단계 140에서 추가로 처리되어 모든 구성원이 미리 결정된 파라미터를 충족시키는 적합한 서열 150의 수집물을 생성하는 것으로 고려된다. 처리 단계 140은 바람직하게 (i) 최소 역치 초과의 상동성, (ii) 최소 역치 초과의 길이, 및 (iii) 최소 역치 초과의 용융 온도를 갖는 전체 정렬을 위한 컨센서스 서열이 확인되는 방법에서 전체 다중-서열 정렬을 사용한다.

가장 전형적으로, 컨센서스 서열은 미리 결정된 최소 또는 최대 길이 (전형적으로 적어도 15개 염기, 적어도 20개 염기, 적어도 25개 염기, 적어도 30개 염기, 적어도 40개 염기, 적어도 50개 염기 등, 및 100개 미만의 염기, 90개 미만의 염기, 70개 미만의 염기 등)에 대해 미리 결정된 역치에서 또는 이의 초과 (예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%)에 있는 영역에 대해 증가적으로 확인된다. 용이하게 인지되는 바와 같이, 길이 결정은 또한 목적하는 융점의 함수이다. 가장 전형적으로, 융점 온도는 적어도 60℃, 또는 적어도 65℃, 또는 적어도 68℃이다. 따라서, 본원 발명의 주요 대상의 적어도 일부 양상에서, 상기 확인된 컨센서스 서열은 적어도 20개 염기 길이에 대한 최소 역치, 적어도 97%의 상동성에 대한 최소 역치를 갖고 용융 온도에 대한 최소 역치는 적어도60℃이다.

미리 결정된 상동성과 관련하여, 사용자는 목적하는 최소 역치를 제공하고 대부분의 경우에 상기 최소 역치는 90% 초과의 상동성인 것으로 고려된다. 예를 들어, 적합한 최소 상동성 역치는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%를 포함한다. 용이하게 인지되어야만 하는 바와 같이, 최소 상동성 정도는 병원체에 대한 부류 구성원의 다양성 및 개수의 함수이고 일반적으로 최소 역치는 보다 다양한 부류에 대해 보다 낮은 것이 바람직하고(예를 들어, 적어도 95%) 반면 상대적으로 보존된 부류는 보다 높은 최소 역치 (예를 들어, 적어도 98%)를 가질 수 있다.

유사하게, 미리 결정된 길이와 관련하여, 사용자가 필요한 최소 길이를 제공하고 적합한 최소 길이가 적어도 15개 염기, 적어도 20개 염기, 적어도 25개 염기, 적어도 30개 염기, 적어도 40개 염기, 적어도 50개 염기 등인 것이 고려된다. 한편, 실제 길이는 최소 길이, 요구되는 최소 상동성 및 목적하는 최소 용융 온도 (서열 각각에 대해)를 사용한 분석 엔진에 의해 결정될 수 있는 것으로 주지되어야 한다. 컨센서스 서열의 선택된 길이에 의존하여, 융점 결정은 13개 염기 미만의 크기를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 대한 화학식 I를 사용하여 그리고 13개 이상의 염기의 크기를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 대해 화학식 II에 따라 수행될 수 있다.

화학식 I

Tm

4*(G+C)+2*(A+T)-5

화학식 II

Tm = 64.9 +41*(G+C-16.4)/(A+T+G+C)

프라이머는 전형적으로 올리고뉴클레오타이드가 미리 결정된 융점 (예를 들어, 65℃)을 충족하거나 이를 초과하도록 하는 길이로 보유되고/선택된다. 상기 확인된 컨센서스 서열은 이어서 독특한 병원체 과에 대한 각각의 조정된 정렬 산출로 수집된다. 상이한 관점으로부터 보았을 때, 각각의 병원체는 이의 자신의 조정된 정렬 산출을 갖고 모든 서열은 상동성, 길이 및 용융 온도에 대한 최소 역치와 일치한다. 물론, 검정이 멀티플렉스 단일-팟 검정인 경우, 제1 및 제2의 독특한 병원체 부류에 대한 미리 결정된 용융 온도가 5℃ 이하로 격리되어 있고, 보다 전형적으로 4℃ 이하로 격리되어 있고, 보다 더 전형적으로 3℃ 이하로 격리되어 있고, 가장 전형적으로 2℃이하로 (예를 들어, 동일한 온도)로 격리되어 있는 것으로 인지되어야 한다.

단계 140에서 분석 엔진은 전형적으로 하나의 병원체 목, 과 또는 속에 속하는 상이한 병원체 종의 정렬을 포함하는, Clustal X, Clustal W, 또는 Clustal Omega로부터 산출 파일로 취한다. 이들 정렬 파일이 주어진 경우, 분석 엔진은 모든 구성원에 걸친 보존 영역을 검색하여, 우선적으로 염기가 100% 보존된 영역을 확인한다. 100% 보존된 영역을 탐색하는데 실패 하면, 분석 엔진은 최고 보존된 영역을 보고한다. 이들 영역으로부터, 상기 분석 엔진은 다양한 크기의 잠재적 올리고머를 생성한다: 적합한 최소 길이는 적어도 15개 염기, 적어도 20개 염기, 적어도 25개 염기, 적어도 30개 염기, 적어도 40개 염기, 적어도 50개 염기 등이다.

추가의 단계에서, 각각의 조정된 정렬 산출에서 상기 확인되고 특성 분석된 컨센서스 서열은 이어서 단계 160에 나타낸 바와 같은 분석 엔진에서 추가로 처리되어 서열에서 매칭될 수 있는 (또는 PCR 조건하에 하이브리드화하는) 서열, 인간 서열 및/또는 인간에 적어도 잠재적으로 존재하는 것으로 합리적으로 예상될 수 있는 다른 서열을 제거한다. 서열 일치는 다양한 방식으로 수행될 수 있고, 모든 공지된 방식은 본원에 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 그러나, 특히 적합한 매칭 알고리듬은 BlastN을 포함하여 매칭 서열을 확인한다. 인지된 바와 같이, 임의의 매칭 서열 (예를 들어, ≥70%, 보다 전형적으로 ≥80%, 및 가장 전형적으로 ≥90%의 상동성을 갖는 서열; 또는 7℃ 미만, 보다 전형적으로 5℃ 미만, 및 가장 전형적으로 3℃ 미만의 인간 또는 다른 바이러스 표적에 대한 Tm 차이)는 이어서 각각의 조정된 정렬 산출 서열로부터 제거되어 각각의 상응하는 병원체-특이적(예를 들어, 바이러스-특이적) 정렬 산출에 도달한다. 따라서, 추가의 처리는 프라이머의 숙주 (예를 들어, 인간) 게놈으로의 결합으로 인한 것일 수 있는 위양성 검정 결과의 제거를 도와준다.

최종적으로, 본원 발명자는 이어서 병원-특이적 정렬 산출 162 및 164에 대한 세트 차이 분석을 수행하여 병원체에 대한 각각의 컨센서스 서열 세트를 수득한다. 가장 전형적으로, 상기 세트 차이 분석 170은 세트 차이 및 세트 유니온 작동 (전형적으로 FASTA 모맷 파일을 사용하는)으로서 수행되고 이는 이어서 진단적 PCR 반응에서 프라이머로서 사용하기에 적합한 병원체 부류 둘다에 대해 고유한 서열 172를 생성한다. 용어 '세트'는 이전의 단계에서 밝혀진 서열을 나타내는 핵산 염기의 수집물이고 상기 용어 '세트 차이'는 또 다른 세트 A에 존재하지 않는 하나의 세트, B의 요소로서 정의되는 것으로 주지된다. 본 발명의 경우에, 상기 차이는 올리고머일 수 있다. 세트 유니온은 또한 세트 B에 있는 세트 A의 요소로서 정의된다. 이들 2개의 작동이 주어진 경우, 대칭 세트 차이는 세트 A 및 세트 B와 중첩되지 않는 모든 올리고머를 산출한다.

바이러스 서열로부터 유래된 올리고머를 함유하는 다중 FASTA 포맷된 파일이 주어진 경우, 단계 170에서 분석 엔진은 각각의 파일을 고유하게 병원체 과를 확인하는 올리고머 세트로서 처리한다. 이들 세트가 생성되는 경우, 세트 차이 및 세트 유니온 작동은 병원체 과의 다수의 세트에 속하는 올리고머를 발견하기 위해 수행된다. 이어서, 이들 올리고머는 이들이 또 다른 하나로부터 하나의 병원체 과를 고유하게 확인할 수 없음으로 제거된다. 이어서 올리고머의 나머지는 1개 바이러스 과를 고유하게 확인하는 올리고머 세트로서 복귀하고 이어서 동일한 검정 내에 별도의 병원체 과를 고유하게 확인하는 다른 올리고머 (예를 들어, DNA 칩)와 혼합될 수 있다.

물론, 본원에 제공된 적합한 서열은 합성 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 유사체일 수 있고, 모든 용융 온도의 계산은 상이한 화학 반응으로 인한 온도에서의 변화를 고려하는 것으로 인지되어야 한다. 예를 들어, 서열은 펩타이드 핵산 골격, 당-포스페이트, 또는 당 포스페이트/설포네이트 골격을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 고려되는 서열 중 염기들은 천연의 핵산염기(예를 들어, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 우라실), 및 천연의 염기와 안정하거나 불안정한 수소 결합을 만드는 비천연 염기 (예를 들어, 이노신, 이소-C, 이소-G, PICS, 3MN, 3FB, MICS, 등)일 수 있다. 추가로, 적합한 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 위치에서 축퇴성 염기를 가질 수 있거나 불일치를 가능하게 하는 염기를 가질 수 있다. 물론, 모든 핵산염기는 임의로 방사능동위원소 또는 다른 동위원소(예를 들어, NMR-활성 표지)를 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 마찬가지로, 바람직하지 않지만 골격은 하나 이상의 표지된 모이어티를 포함할 수 있는 것으로 고려된다.

올리고뉴클레오타이드는 여전히 추가로 단일 유형의 올리고, 전형적으로 DNA 올리고머인 것으로 고려된다. 그러나, RNA 올리로머 또는 혼합 유형의 올리고머는 또한 본원에 사용하기 위해 적합한 것으로 고려된다. 추가로, 적합한 올리고머는 친화성 마커(예를 들어, 비오틴) 또는 직접적인 (예를 들어, 형광단, 방사능동위원소) 또는 간접적 확인 및/또는 정량을 위한 다른 표지를 포함하는 것으로 주지되어야 한다.

전형적인 예에서, 멀티플렉스 검출이 요구되는 경우, 키트는 PCT 또는 LCR 반응을 통해 증폭 또는 연결 생성물을 생성하기에 적합한 적어도 한쌍의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 용이하게 인지되는 바와 같이, 상기 쌍은 바이러스의 특정 종 또는 혈청형에 특이적이거나 다중 종 또는 혈청형을 다룰 수 있도록 선택된다. 다중 쌍의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 쌍은 일반적으로 바이러스 표적 및/또는 증폭 생성물간의 최소의 교차 반응성을 갖거나 교차 반응성이 없도록 선택되고 상기 쌍은 멀티플렉스 반응에서 동시에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이와 관련하여, PCR 또는 LCR을 멀티플렉싱하는 것은 상이한 바이러스 (예를 들어, 에볼라 바이러스 및 인플루엔자 바이러스)의 특정 서열을 표적화하는 올리고 쌍을 사용하여 특별하게 수행될 수 있다.

바이러스의 다중 종을 커버하기 위해 올리고뉴클레오타이드가 바이러스 게놈의 고도로 보존된 영역 (예를 들어, RNA 의존성 RNA 폴리머라제 개시 구조물)을 표적화하고 유사하거나 심지어 동일한 용융점을 갖는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 본원 발명자들은 선택된 바이러스를 용이하게 확인하기 위해 커스텀 어셈블리된 키트에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 선택을 고려한다. 예시적 서열 및 조성물은 하기에 보다 상세하게 나타낸다. 상기 예는 본 발명의 주요 대상의 많은 예시적 구현예를 제공한다. 각각의 구현예는 본 발명의 요소들의 단일 조합을 나타내지만, 본 발명의 주요 대상은 기재된 요소들의 모든 가능한 조합을 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 하나의 구현예가 요소 A, B 및 C를 포함하고, 제2 구현예가 요소 B 및 D를 포함하는 경우, 본 발명의 주요 대상은 또한 심지어 명백히 기재되지 않은 경우 A, B, C 또는 D의 다른 나머지 조합을 포함하는 것으로 고려된다.

컴퓨터와 관련된 임의의 용어는 서버, 인터페이스, 시스템, 데이터베이스, 에이전트(agent), 피어스(peers), 엔진, 제어기 또는 개별적으로 또는 총체적으로 작동하는 다른 유형의 컴퓨터 사용 장치를 포함하는 임의의 적합한 조합의 컴퓨터 사용 장치를 포함하도록 기재되는 것으로 주지되어야 한다. 컴퓨터 사용 장치가 만질 수 있는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체 (예를 들어, 하드 드라이브, 고체 상태 드라이브, RAM, 플래쉬, ROM 등) 상에 저장된 소프트웨어 지침을 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하는 것으로 인지해야 한다. 소프트웨어 지침은 기재된 장치와 관련하여 하기에 논의된 바와 같은 역할, 책임 또는 다른 기능을 제공하기 위해 컴퓨터 사용 장치를 바람직하게 구성한다. 추가로, 상기된 기술은 프로세서가 컴퓨터-기반 알고리듬, 프로세스, 방법 또는 다른 지침의 수행과 관련된 기재된 단계를 실행하도록 하는 소프트웨어 지침을 저장하는 비-일시적 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 생성물로서 구현될 수 있다. 일부 구현예에서, 다양한 서버, 시스템, 데이터베이스, 또는 표준화된 프로토콜 또는 알고리듬을 사용하는 인터페이스 교환 데이터는 능히 HTTP, HTTPS, AES, 공개-비밀 키(public-private key) 교환, 웹 서버 API, 공지된 재정 거래 프로토콜 또는 다른 전자 정보 교환 방법을 기준으로 한다. 장치 중에서 데이터 교환은 패킷-교환(packet-switched) 네트워크, 인터넷, LAN, WAN, VPN, 또는 다른 유형의 패킷 교환 네트워크; 회로 교환 네트워크; 셀 교환 네트워크 또는 다른 유형의 네트워크 상에서 수행될 수 있다.

이미 기재된 것들 외에 많은 추가의 변형은 본원의 발명의 개념으로부터 벗어나는 것 없이 가능함은 당업자에게 자명해야만 한다. 본 발명의 주요 대상은 따라서 첨부된 청구항의 취지를 제외하고는 제한되지 말아야 한다. 더욱이, 본원의 발명의 상세한 설명 및 청구항 둘다를 해석하는데 있어서, 모든 용어는 상기 내용과 일치되는 가장 광범위한 가능한 방식으로 해석되어야만 한다. 특히, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 비-배제 방식으로 요소, 성분 또는 단계를 언급하는 것으로서 해석되어야만 하고 이는 참조된 요소, 성분 또는 단계가 명백히 언급되지 않는 다른 요소, 성분 또는 단계와 함께 존재하거나 사용되거나 조합될 수 있음을 지적한다. 더욱이, 본원의 개시내용 및 후속적 청구항 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수형("a," "an," 및 "the")의 의미는 달리 명백히 지시되지 않는 경우 복수형 언급을 포함한다. 또한, 본원의 기재에 사용된 바와 같이, "내에(in)"의 의미는 달리 명백히 지시되지 않는 경우 "내에(in)" 및 "상에(on)"을 포함한다. 최종적으로, 본원의 청구항이 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어떠한 것 중 하나 이상을 언급하는 경우, 상기 텍스트는 A + N 또는 B + N 등이 아닌 그룹으로부터의 단지 하나의 요소를 요구하는 바와 같이 해석되어야만 한다.

Claims

2개의 불특정된 병원체의 구별을 위한 프라이머 세트를 수득하는 방법으로서, 상기 불특정된 병원체 각각은 독특한 바이러스 과(family)에 속하고 여기서, 각각의 바이러스 과는 다중의 독특한 바이러스 종(species) 및 혈청형(serotype)을 포함하고, 상기 방법은:
상기 각각의 독특한 바이러스 과의 바이러스 종 및 혈청형의 다수의 게놈에 대한 각각의 다중 서열 정렬을 수행하여 상기 독특한 바이러스 과 각각에 대한 정렬 산출을 생성시키는 단계;
상기 각각의 정렬 산출에서
(i) 최소 역치 초과의 상동성,
(ii) 최소 역치 초과의 길이, 및
(iii) 최소 역치 초과의 용융 온도
를 갖는 각각의 컨센서스 서열을 확인하는 단계;
상기 확인된 컨센서스 서열을 상기 독특한 바이러스 과에 대해 각각 조정된 정렬 산출로 수집하는 단계;
상기 각각의 조정된 정렬 산출로부터 인간 및 인간-숙주 서열과 최소의 상동성을 갖는 서열을 제거하여 각각의 바이러스-특이적 정렬 산출을 형성하는 단계;
상기 바이러스-특이적 정렬 산출에 대해 세트 차이 분석을 수행하여 상기 불특정된 병원체에 대한 컨센서스 서열의 각각의 세트를 수득하는 단계; 및
상기 컨센서스 서열 각각의 세트로부터 프라이머 서열을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 다중 서열 정렬이 Clustal X, Clustal W, 또는 Clustal Omega를 사용하여 수행되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 상동성에 대한 상기 최소 역치가 적어도 97%인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 상동성에 대한 상기 최소 역치가 100%인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 길이에 대한 상기 최소 역치가 적어도 15개 염기인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 길이에 대한 상기 최소 역치가 적어도 25개 염기인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 용융 온도에 대한 상기 최소 역치가 적어도 60℃인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 용융 온도에 대한 상기 최소 역치가 적어도 65℃인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 길이에 대한 상기 최소 역치가 적어도 20개 염기이고, 상기 상동성에 대한 최소 역치가 적어도 97%이고, 상기 용융 온도에 대한 상기 최소 역치가 적어도 60℃인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 컨센서스 서열 중 상기 상동성이 염기편(base-wise) 증가분(increment)에 의해 결정되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 컨센서스 서열의 상기 길이가 가변성이고 상기 목적하는 용융 온도를 성취하기 위해 최소 역치 초과로 선택되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 서열을 선택하는 단계가 독특한 과에 대한 앰플리콘이 적어도 100개 염기의 길이 차이를 갖도록 수행되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 제거하는 단계가 BlastN을 사용하여 수행되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 인간 및 인간 숙주 서열에 대한 상기 최소 상동성이 적어도 90%인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 인간 숙주 서열이 인간에 존재하는 것으로 공지되거나 존재할 것으로 의심되는 바이러스 서열인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 세트 차이 분석이 세트 차이(Set Difference) 및 세트 유니온 작동(Set Union operations)을 사용하여 수행되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 서열이 100개 내지 800개 염기 사이의 길이를 갖는 앰플리콘을 생성하도록 선택되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 비특이적 바이러스가 2개의 독특한 계통발생 목(order)에 속하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 바이러스 RNA로부터 cDNA를 생성하기 위해 프라이머 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 세트가 상기 불특정된 병원체 각각에 대해 1개 내지 5개 프라이머 쌍을 포함하는, 방법.