KR20180006402A

KR20180006402A - 항원 제공 단백질에 관련된 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20180006402A
Application number: KR1020177035134A
Authority: KR
Inventors: 카이반 알. 니아지; 로버트 엘. 모드린; 샤루즈 라비자데
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2018-01-17
Also published as: US20190202890A1; CA2986767A1; JP2018515126A; WO2016191262A1; AU2016268079A1; EP3298035A4; CN107849115A; EP3298035A1

Abstract

일부 양상에서, 본 발명은 프로테아제에 의해 막투과성 도메인으로부터 절단될 수 있는 세포외 도메인을 포함하는 막투과성 단백질에 관한 것이다. 세포외 도메인은 CD1a와 같은 항원-제시 단백질의 세포외 도메인일 수 있다.

Description

항원 제공 단백질에 관련된 방법 및 조성물

정부 이권

본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 수여하는 AR40312 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

관련 출원

본 특허 출원은 2015년 5월 22일자로 출원된 미국 가출원 제62/165349호의 우선권을 주장하며 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.

인간 CD1 단백질은 T 세포에 리포글리칸/당지질 항원을 제공하는 주요 조직적합성 복합체-(MHC)-관련된 단백질이다. 인간 CD1 계열은 다양한 내포작용 격실 (예를 들어, 엔도좀, 식포, 리소좀)로부터 수거된 상이한 부류의 소수성 항원을 제공할 수 있게 하는 독특한 구조적 및 세포내 트래피킹 (trafficking) 특성을 발달시킨 5개의 이소형 (CD1a-e)으로 구성된다. 지금까지, CD1/항원 상호작용에 관한 대부분의 지식은 다음 중 하나에 의존했다: 1) 세포-부재 시스템에서 정제된 가용성 재조합 단백질의 인위직 로딩, 2) 이전에 동정된 단일 항원 또는 관련된 구조의 그룹을 이용하는 세포 배양 시스템, 또는 3) 상기의 일부 조합. 이러한 접근법은 다른 많은 분자를 함유할 가능성이 있는 환경으로부터 유래된 개별 항원의 사용과 같은 고유한 작동기-기반의 성향에 의해 CD1 리간드 동정을 엄격하게 제한한다.

일부 양상에서, 본 발명은 프로테아제에 의해 막투과성 도메인으로부터 절단될 수 있는 세포외 도메인을 포함하는 막투과성 단백질에 관한 것이다. 상기 세포외 도메인은 CD1a와 같은 항원-제시 단백질의 세포외 도메인일 수 있다. 본 발명의 일부 양상은 본원에 기재된 단백질을 암호화하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양상은 단백질 및/또는 항원을 정제 및/또는 단리시키는 방법에 관한 것이다.

도 1은 β-2m 세포외 도메인 (β2M), 글리신-세린 링커 (GS), CD1a 세포외 도메인 (CD1a EC), 스트렙타비딘 친화성 태그 (스트렙: Strep), 히스티딘 친화성 태그 (8 His), 3C 프로테아제 절단 부위 (클리브: Cleave), FLAG 친화성 태그 (플래그: Flag), 막투과성 도메인 (TM), 및 세포질 도메인 (CT)을 포함하는 단백질의 디자인 및 아미노산 서열 (서열번호 25)을 나타낸다.
도 2는 CD1a 및 β-2m에 형광 표지를 사용하여, 3C 프로테아제로 절단하기 전후에 마우스 B16 세포에서 발현된 β-2m 세포외 도메인, CD1a 세포외 도메인, 및 3C 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질에 대한 유동 세포계측 결과를 나타낸다. "모의 (mock)"는 형질감염되지 않은 대조군 세포를 나타내고, "cCD1a1" 및 "cCD1a2"는 β-2m 및 CD1a 세포외 도메인을 포함하는 절단가능한 단백질로 형질감염된 세포를 나타내고, "WT CD1a"는 β-2m 세포외 도메인 및 3C 프로테아제 절단 서열이 결핍된 야생형 인간 CD1a로 형질감염된 세포를 나타낸다.
도 3은 패널 (A)와 패널 (B)로 표시된 2개의 패널로 구성된다. 패널 (A)는 3C 프로테아제로 절단하기 전후에 (각각 CD1a 및 CD1a+3C) 진핵 세포에서 발현된 CD1a 세포외 도메인 및 3C 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질에 대한 유동 세포계측 결과를 나타낸다. 패널 (B)는 3C 프로테아제로 세포로부터 절단되고 히스티딘 태그가 결합된 Ni-NTA를 사용하여 정제된 단백질의 폴리아크릴아미드 겔을 나타낸다. "용출" 레인 (lane)은 Ni-NTA를 사용하여 정제된 단백질에 상응하며, 주요 밴드의 분자량은 절단된 세포외 도메인의 분자량에 상응한다.
도 4는 (A), (B) 및 (C)로 표시된 3개의 패널로 구성된다. C-CD1a에 결합 된 분자는 N-프로판올 (A), 클로로포름-메탄올-물 (B; 10:10:3) 및 클로로포름-메탄올 (C; 2:1)을 사용하여 Ni-NTA 수지로부터 용출되었으며 이들의 분자량은 질량 분광법을 사용하여 측정하였다. 흰색 다이아몬드는 cCD1a-발현 세포를 엠. 튜버클로시스 (M. tuberculosis)로부터의 용해물로 항온처리한 후 cCD1a로부터 용출된 분자에 상응한다. 검은색 다이아몬드는 미처리된 cCD1a-발현 세포에 대한 대조군에 상응한다.
도 5는 다양한 농도의 지질단백질 LppX (LppX; x-축)에 의해 유도된 인터페론 γ(INF-γ) 농도 (y-축)를 나타내는 그래프이다. 야생형 CD1a (wtCD1A)로 형질감염된 HeLa 세포, 절단가능한 CD1a 세포외 도메인 (cCDA1)을 포함하는 가공된 단백질 및 형질감염되지 않은 HeLa 세포는 LppX 항원을 인지하는 CD1A-제한된 T 세포 클론인 LppX 및 LCD4.G T 세포로 항온처리하였다. T 세포에 의한 INF-γ 생산은 ELISA로 측정하였다. cCD1A-형질감염된 세포는 wtCD1A-형질감염된 세포로서 INF-γ 생산을 유도하는 유사한 능력을 나타내며, 이는 cCD1A 작제물이 T 세포에 항원을 제공할 수 있는 능력을 유지함을 시사한다.

일부 양상에서, 본 발명은 CD1 당단백질로부터의 세포외 도메인을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 상기 단백질은 CD1 당단백질로부터의 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 이전 연구에서는 유전적으로 융합된 단백질 파트너를 별개의 세포내 및 세포외 위치로 차별적으로 분배할 수 있는 능력을 갖는 다양한 단백질 도메인을 기술했는데, 생성된 기능에 극적인 차이가 있는 경우가 종종 있다. 보다 구체적으로, 인간 CD1 단백질로부터 유래된 서열을 포함하는 발현 카세트는 유전적으로-융합된 이종 단백질을 상이한 세포내 위치로 트래피킹하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, Niazi, K.R. et al., Immunology 122 (4) : 522-31 (2007) 참조). 대부분의 1형 막 단백질과 마찬가지로, CD1 유전자는 독특한 서브도메인을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하며, 각각은 관련된 기능을 갖는다. CD1의 경우, 4개의 도메인이 있으며, CD1 전령 RNA 및 나머지 단백질을 이의 루멘 내로 이동시키기 위한 소포체와 연합된 리보좀을 표적화하는 서열인 리더 펩타이드를 암호화하는 단백질의 N-말단 (즉, "도메인 1")을 갖는다. 본질적으로, 리더 펩타이드의 합성은 세포질보다는 분비 시스템 및 세포외 공간을 위한 1형 막 단백질을 표적화하는 첫 번째 단계이다. 리더 펩타이드 서열 후, 제2 CD1 서브도메인 ("도메인 2")은 MHC I에 대한 서열 및 구조 상동성을 갖는 세포외 도메인이고 이는 T 림프구에 제공하기 위한 리포글리칸 항원에 결합한다. 이 세포외 도메인을 세포막에 고정시키기 위해, 야생형 CD1 서열에서 그 다음 모듈 ("도메인 3")은 세포질막의 폭을 가로지르는 15개 이상의 소수성 또는 비극성 아미노산 잔기의 스트레치인 막투과성 도메인이다. CD1의 최종 도메인 ("도메인 4")은 CD1을 막으로부터 별개의 세포내 엔도좀 소포로 트래피킹하기 위한 세포내 어댑터 단백질에 의한 포획 서열로서 작용하는 세포질 테일 서열이다. 이들 도메인 각각을 독립적인 기능성 단위로 사용하여 CD1 단백질의 세포외 도메인은 GFP, 마이코박테리아 GroES 및 이들이 야생형 CD1이 트래픽하는 격실로 표적화되도록 하는 다른 것들과 같은 융합 단백질로 대체될 수 있고 이에 의해 표적 카세트의 패널을 생성한다 (예를 들어, Niazi, KR et al., Immunology 122(4): 522-31 (2007) 참조).

본 발명의 일부 양상은, 예를 들어, 피코르나바이러스 3C 프로테아제의 인지 서열을 포함하는 세포외 막 근위 단백질분해 절단 부위 및 예를 들어, 6 내지 8 개의 히스티딘 (8 His)의 스트레치 또는 스트렙-태그 서열과 같은 하나 이상의 "친화성 태그"를 포함하는 정제 도메인과 같은 추가의 신규한 특징을 포함한다. 3C 인지 부위는 3C 프로테아제가 생리적 pH 및 염 농도에서 기질을 절단함으로써 세포 용해 및 세포내 단백질에 의한 표적 단백질 풀 (pool)의 연속적인 오염을 방지하기 때문에 부분적으로 선택될 수 있다. 친화성 태그의 위치는 단백질 파트너의 기능적 관용성의 정도에 따라 N-말단, C-말단 또는 내부에서 변할수 있으며, 절단 서열은 이상적으로 1형 막 단백질에 대해 막에 더 가깝게 위치한다. 이들 모듈은 또한 2형 통합 막 단백질과 함께 사용될 수 있다.

I. 재조합 단백질

일부 양상에서, 본 발명은 세포외 도메인, 막투과성 도메인, 및 상기 세포외 도메인과 상기 막투과성 도메인 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 상기 세포외 도메인은 항원-제시 단백질의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 상기 프로테아제 절단 부위는 막투과성 도메인에 근접하여 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 프로테아제 절단 부위는 막투과성 도메인으로부터 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 내에 위치할 수 있다.

프로테아제 절단 부위는 적어도 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산을 인지하는 프로테아제와 같은 적어도 4개의 아미노산을 인지하는 프로테아제에 의해 인지될 수 있다. 상기 프로테아제 절단 부위는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산일 수 있는데, 즉, 프로테아제 절단 부위는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산의 서열을 인지하는 프로테아제에 의해 인지될 수 있다. 상기 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 트롬빈, 인자 Xa, TEV 프로테아제, 엔테로펩티다제, 또는 리노바이러스 3C 프로테아제에 의해 인지될 수 있는데, 즉, 프로테아제 절단 부위는 트롬빈, 인자 Xa, TEV 프로테아제, 엔테로펩티다제, 또는 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 절단 부위는 3C 프로테아제에 의해 인지되고, 즉, 프로테아제 절단 부위는 3C 프로테아제 절단 부위일 수 있다. 그러나, 상기 프로테아제 절단 부위의 성질은 프로테아제가 특이적인 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, LEVLFQGP (서열번호 1; 리노바이러스 3C 프로테아제에 의해 절단됨); DDDDK (서열번호 2; 엔테로펩티다제에 의해 절단됨); IEGR (서열번호 3; 인자 Xa에 의해 절단됨); ENLYFQG (서열번호 4; TEV 프로테아제에 의해 절단됨); 또는 LVPRGS (서열번호 5; 트롬빈 프로테아제에 의해 절단됨)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제 절단 부위는 서열번호 1을 포함한다.

세포외 도메인은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, 또는 CD1e의 세포외 도메인과 같은 CD1 단백질의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 CD1a의 세포외 도메인을 포함한다. 상기 CD1 단백질은 인간 CD1일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 β-2 마이크로글로불린 (β-2M)으로부터의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 MHC 부류 I 알파 쇄로부터의 세포외 도메인을 포함한다.

상기 세포외 도메인은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 또는 CD1e의 세포외 도메인의 일부와 같은 CD1 단백질의 세포외 도메인의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 CD1a의 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 상기 CD1 단백질은 인간 CD1일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 β-2M으로부터의 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 MHC 부류 I 알파 쇄로부터의 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 단백질의 항원-제시 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 막투과성 도메인은 단일 알파 나선이다. 단백질은 1형 막 단백질일 수 있으며, 즉 단백질은 세포외 도메인이 단백질의 N-말단이고 세포질 도메인이 C-말단이 되도록 배향될 수 있다.

일부 구현예에서, 단백질은 단백질의 N-말단과 프로테아제 절단 부위 사이에 위치한 제 1 친화성 태그를 추가로 포함한다. 상기 제 1 친화성 태그는 세포외 도메인과 프로테아제 절단 부위 사이에 위치할 수 있다.

일부 구현예에서, 단백질은 단백질의 C-말단과 프로테아제 절단 부위 사이에 위치한 제 2 친화성 태그를 추가로 포함한다. 상기 제 2 친화성 태그는 막투과성 도메인과 프로테아제 절단 부위 사이에 위치할 수 있다.

제 1 친화성 태그 및 제 2 친화성 태그의 성질은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 제 1 친화성 태그 및 제 2 친화성 태그 중 적어도 하나는 애비태그 (AviTag) (서열번호 6 GLNDIFEAQKIEWHE), 칼모듈린-태그 (서열번호 7 KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), 폴리글루타메이트 태그 (서열번호 8 EEEEEE), E-태그 (서열번호 9 GAPVPYPDPLEPR), FLAG-태그 (서열번호 10 DYKDDDDK), HA-태그 (서열번호 11 YPYDVPDYA), His-태그 (서열번호 12 HHHHHH), Myc-태그 (서열번호 13 EQKLISEEDL), S-태그 (서열번호 14 KETAAAKFERQHMDS), SBP-태그 (서열번호 15 MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), 소프태그 (Softag) 1 (서열번호 16 SLAELLNAGLGGS), 소프태그 3 (서열번호 17 TQDPSRVG), 스트렙-태그 (서열번호 18 WSHPQFEK), TC 태그 (서열번호 19 CCPGCC), V5 태그 (서열번호 20 GKPIPNPLLGLDST), VSV-태그 (서열번호 21 YTDIEMNRLGK), 엑스프레스 태그 (Xpress tag) (서열번호 22 DLYDDDDK), 이소펩태그 (서열번호 23 TDKDMTITFTNKKDAE), 및 스파이태그 (Spytag) (서열번호 24 AHIVMVDAYKPTK)로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 친화성 태그는 스트렙-태그 (서열번호 18) 및/또는 his-태그 (서열번호 12)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 친화성 태그는 FLAG-태그 (서열번호 10)를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질은, 예를 들어, 막을 가로질러 세포외 도메인을 전좌시키기 위한 N-말단 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은, 예를 들어, 세포 내에서 단백질을 트래피킹하기 위한 세포질 도메인을 포함한다. 상기 세포질 도메인은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 또는 CD1e와 같은 CD1 단백질의 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포질 도메인은 인간 CD1a 세포질 도메인의 일부를 포함할 수 있다.

단백질은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 %의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

II. 재조합 핵산

일부 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 본원에서 "유전자"로 언급된다. 핵산은 본원에 기재된 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 항생제 내성 유전자와 같은 선별용 마커를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 이. 콜리 (E. coli)와 같은 세포 내에서 핵산을 클로닝하기 위한 복제 오리진을 추가로 포함할 수 있다.

III. 세포

일부 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 유전자 (즉, 재조합 유전자)를 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는, 예를 들어, 유전자를 암호화하기 위한 원핵 세포일 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어, 단백질을 발현하기 위한 진핵 세포일 수 있다. 상기 유전자는 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유전자는, 예를 들어, 발현 세포의 안정한 형질감염 후 플라스미드 상에 존재하지 않는다. 유전자는 세포의 게놈에, 즉 유전자를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질전환 또는 형질감염시킨 후에 통합될 수 있다. 상기 세포는 단백질을 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 세포를 선별하기 위한 선별용 마커, 예를 들어, 유전자와 관련된 선별용 마커를 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 세포는 진핵 세포일 수 있으며, 유전자는 세포의 게놈에 통합될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 클로닝 세포이고, 예를 들어, 세포는 이. 콜리 (E. coli) 및 에스 세레비지애 (S. cerevisiae)로부터 선택될 수 있다.

세포는 C6/36, S2, Sf21, Sf9, 및 하이 파이브 세포 (High Five cell)로부터 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이며 세포는 단백질을 발현한다. 상기 세포는 마우스 세포 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 세포는 721, 293T, A172, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, A-549, BCP-1, BEAS-2B, BR 293, BT-20, BxPC3, Cal-27, CML T1, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COV-434, DU145, DuCaP, EM2, EM3, FM3, H1299, H69, HCA2, HEK-293, HeLa, HL-60, HMEpC, HT-29, HUVEC, 주르카트 (Jurkat), JY, K562, KBM-7, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, 피어 (Peer), 라지 (Raji), Saos-2, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T2, T-47D, T84, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, 및 YAR 세포로부터 선택될 수 있다. 상기 세포는 3T3, 4T1, A20, ALC, B16, bEnd.3, C2C12, C3H-10T1/2, CGR8, CT26, E14Tg2a, EL4, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, Hepa1c1c7, J558L, MC-38, MTD-1A, MyEnd, NIH-3T3, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, X63, 및 YAC-1 세포로부터 선택될 수 있다. 상기 세포는 9L, B35, BHK-21, C6, CHO, CMT, COS-7, D17, DH82, MDCK II, RBL, 및 베로 (Vero) 세포로부터 선택될 수 있다. 상기 세포는 불멸화된 세포주, 말초 혈액 단핵 세포, 또는 섬유아세포의 세포일 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 프로테아제 절단 부위에서 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하지 않는 유기체로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 항원-제시 단백질을 발현하는 유기체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 세포의 막을 가로질러 세포외 도메인을 전좌시키기 위한 N-말단 리더 서열을 포함하고; 상기 세포는 천연 단백질 상에서 N-말단 리더 서열을 발현하는 유기체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 세포 내에서 단백질을 트래피킹하기 위한 세포질 도메인을 포함하고; 상기 세포는 세포질 도메인을 발현하는 유기체로부터 유래된다.

세포는 CD1 단백질을 내인성으로 발현할 수 있거나 발현할 수 없다. 본원에 기재된 "내인성 발현"은 본원에 기재된 유전자로의 형질감염에 관계없이 단백질의 발현을 언급하는데, 즉, 단백질은 형질감염에 의해 도입된 유전자보다는 세포 내에서 천연 유전자로부터 전사되는 mRNA로부터 발현된다. 상기 세포는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 및/또는 CD1e를 내인성으로 발현할 수 있거나 발현할 수 없다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 CD1 (예를 들어, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 및/또는 CD1e)을 내인성으로 발현하지 않으며, 상기 세포는 본원에 기재된 바와 같은 항원-제시 단백질 CD1a의 세포외 도메인을 포함하는 단백질을 발현한다.

세포는 부류 I 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 I)를 내인성으로 발현할 수 있거나 발현할 수 없다. 세포는 부류 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 II)를 내인성으로 발현할 수 있거나 발현할 수 없다. 세포는 항원-제시 세포일 수 있거나 아닐 수 있다.

IV. 항원을 단리시키는 방법

일부 양상에서, 본 발명은 항원을 단리시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 본원에 기재된 바와 같은 세포를 항원을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계; 상기 세포를 세포에 의해 발현된 단백질 (본원에 기재된 바와 같음)의 프로테아제 절단 서열을 인지하는 프로테아제로 항온처리함으로써 상기 세포로부터 단백질의 세포외 도메인을 절단하는 단계; 및 상기 세포외 도메인을 상기 혼합물로부터 단리시킴으로써 세포의 도메인에 결합된 항원을 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 본원에 기재된 바와 같은 세포를 항원을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계; 상기 세포를 상기 혼합물로부터 단리시키는 단계; 상기 세포를 세포에 의해 발현된 단백질 (본원에 기재된 바와 같음)의 프로테아제 절단 서열을 인지하는 프로테아제로 항온처리함으로써 상기 세포로부터 단백질의 세포외 도메인을 절단하는 단계; 및 상기 세포외 도메인을 상기 세포로부터 단리시킴으로써 상기 항원을 단리시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 마우스 세포 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포이다. 단백질은 친화성 태그를 포함할 수 있다. 혼합물로부터 세포를 단리시키는 것은 혼합물을 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자로 항온처리하는 단계를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 세포를 단리시키는 것은 세포를 펠렛화하고 상등액, 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 자기-활성화 세포 분류 (MACS)를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 단백질은 세포외 도메인과 프로테아제 절단 부위 사이에 친화성 태그를 포함할 수 있다. 따라서, 세포외 도메인을 단리시키는 것은 세포외 도메인 (예를 들어, 혼합물)을 포함하는 조성물을 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자로 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 세포외 도메인을 단리시키는 것은, 예를 들어, 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 정지상을 갖는 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포외 도메인으로부터 항원을 단리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 항원, 세포외 도메인, 및 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자를 포함하는 복합체를 우레아 또는 구아니딘과 같은 화학적 변성제와 접촉시키는 단계 (상기 세포외 도메인은 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자에 결합한다) 및 복합체로부터 항원을 분리하는 단계 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 원심분리, 여과 또는 자기 분리에 의해)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포외 도메인으로부터 항원을 단리시키는 것은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 같은 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 방법은 항원을 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 질량 분광법 (예를 들어, HPLC-MS, LC-MS, 단일 사중극, 삼중 사중극, 이온 트랩, 비행 시간, 비행중 사중극-시간 및/또는 직렬 (tandem) MS)을 포함할 수 있다.

친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자는 입자, 비드, 수지 또는 다른 고체 지지체 구조 (예를 들어, 공유 결합)에 부착될 수 있다. 상기 입자, 비드, 수지 또는 다른 고체 지지체 구조는 원심분리, 여과, 친화성 크로마토 그래피 또는 자기 분리에 의한 정제를 허용할 수 있다. 분자는 형광단 (예를 들어, 공유 결합)에 부착될 수 있다.

V. T 세포를 단리시키는 방법

일부 양상에서, 본 발명은 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단백질을 발현하는)를 항원과 접촉시키는 단계; 상기 세포를 복수의 T 세포로 항온처리하는 단계; 상기 세포에 결합하는 T 세포를 단리시킴으로써 상기 T 세포를 단리시키는 단계; 및 상기 세포를 상기 단백질의 프로테아제 절단 서열을 인지하는 프로테아제로 항온처리함으로써 상기 T 세포를 상기 세포로부터 절단하는 단계를 포함하는, T 세포를 단리시키는 방법에 관한 것이다. 복수의 T 세포의 적어도 일부는 바람직하게는, 세포외 도메인이 T 세포에 의해 인지되는 항원을 제공한다면, 복수의 일부 T 세포가 세포 상에 발현된 단백질의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있도록 항원/항원-제시 단백질 복합체에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 세포 상에 발현되는 단백질의 세포외 도메인은 바람직하게는 복수의 T 세포와 동일한 종이다. 세포는 복수의 T 세포와 동일한 종이 바람직하다.

세포를 항원과 접촉시키는 단계는, 상기 세포를 포함하는 조성물에 상기 항원을 첨가함으로서 상기 세포와 상기 항원을 포함하는 조성물을 수득하는 단계; 또는 상기 항원을 포함하는 혼합물에 상기 세포를 첨가함으로써 상기 세포와 상기 항원을 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 항원을 포함하는 혼합물은 복수의 T 세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포를 포함하는 조성물은 복수의 T 세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 세포와 항원을 포함하는 조성물에 복수의 T 세포를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

복수의 T 세포는, 예를 들어, 단백질이 CD1a와 같은 CD1 계열 구성원의 세포외 도메인을 포함하는 경우, CD1-제한된 T 세포를 포함할 수 있다 (또는 본질적으로 이로 구성될 수 있다). 복수의 T 세포는, 예를 들어, 단백질이 상응하는 CD1 계열 구성원의 세포외 도메인을 포함하는 경우, CD1a, CD1b, CD1c 및/또는 CD1d-제한된 T 세포를 포함할 수 있다 (또는 본질적으로 이로 구성될 수 있다).

상기 방법은 세포로부터 T 세포를 단리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

세포에 결합하는 T 세포를 단리시키는 것 및/또는 세포로부터 T 세포를 단리시키는 것은 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 자기-활성화 세포 분류 (MACS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 세포를 세포에 의해 발현된 단백질의 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 분자는 형광단 또는 자기, 상자성 또는 초상자성 입자에 부착됨으로써 세포에 결합된 T 세포를 단리시키거나 (즉, 프로테아제로 항온처리하기 전에) 또는 세포로부터 T 세포를 단리시킬 수 있다 (즉, 프로테아제로 항온처리한 후에).

T 세포를 복수의 다른 T 세포 및 세포로부터 단리시킨 후, T 세포는 확대 및/또는 특성확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 T 세포의 T 세포 수용체의 상보성 결정 영역을 서열화하여, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열을 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은, αβT 세포 수용체 (αβTCR) 및/또는 γδ T세포 수용체 (γδTCR)의 상보성 결정 영역을 서열화하는 단계를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질은 CD1 계열 구성원의 세포외 도메인을 포함한다.

상기 개시는 이후의 실험의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자는 논의된 특정 방법 및 결과가 그 이후에 이어지는 구현예에서 보다 충분히 기재된 바와 같은 개시의 예시일 뿐임을 쉽게 인식할 것이다.

실시예

실시예 1: 절단가능한 세포외 도메인의 디자인

CD1a/β-2 마이크로글로불린 (β-2m) 융합 단백질을 모델 단백질로서 사용하였다. β-2m이 그 자신의 리더 펩타이드를 가지고 있기 때문에, 이 도메인은 CD1a와 기능적으로 동등한 서열로 대체되지 않았지만, 단백질을 발현 세포의 막에 표적화하는 한, 임의의 리더 펩타이드 또는 시그날 서열이 사용될 수 있다. 작제물은 리포글리칸에 결합하는 CD1a의 능력을 이용하여 개발중인 표면 발현, 절단 및 정제 시스템의 유용성에 대한 기능적 증거를 제공한다. 그 결과, CD1a 시스템은 생세포에 의한 섭취, 처리 및 제공 후에 확실하게-로딩된 CD1a-결합 항원의 풀 (pool)을 샘플링함으로써 작동기 성향을 제거하는 직접적인 수단들을 제공한다. 세포내 트래픽이 가능한 재조합 CD1a 단백질을 만들고, 세포 표면으로부터 요구즉시 절단하고, 쉽게 정제할 수 있도록 다음과 같은 작제물이 디자인되었다.

중첩 뉴클레오타이드-기반 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하는 카세트-기반 클로닝 스킴을 사용하여 인간 β-2 마이크로글로불린 (β2M), 글리신-세린 링커 (GS), 성숙한 CD1a 세포외 도메인 (CD1a EC), 스트렙-태그 서열 (스트렙), 폴리-히스티딘 친화성 태그 (8 His), 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 모티프 (클리브), 글리신-세린 링커 및 FLAG 에피토프 (FLAG), 및 야생형 CD1a 막투과성 및 세포질 도메인 (각각 TM 및 CT)을 암호화하는 키메라 유전자를 클로닝하였다 (도 1 참조). 생성된 발현된 단백질은 분비되지 않지만, 야생형 CD1a와 유사한 방식으로 트래픽하여 세포 항원 처리 및 로딩 후 절단 및 정제가 가능하다.

β-2m 리더 펩타이드를 암호화하는 서열은 도메인 1, 나머지 β-2m, 글리신-세린 링커로서 작용하고, CD1a의 세포외 도메인은 도메인 2를 나타내고, 정제 및 절단 모듈은 도메인 2 및 3 사이에 삽입되었고, FLAG-태그된 CD1a 막투과성 도메인은 도메인 3으로서 작용하고, CD1a의 세포질 도메인은 도메인 4를 나타낸다. CD1a 세포질 테일은 이의 능력에 있어 독특하지 않지만 이것은 융합된 단백질 파트너를 주로 세포 표면 또는 리사이클링 엔도좀으로 트래픽할 수 있기 때문에 이상적인 표적화 서열이다.

실시예 2: 융합 단백질의 발현 및 절단

새롭게 가공된 절단가능한 CD1a (cCD1a) 유전자가 세포 표면 상에서 발현될 수 있는지를 확인하기 위해, 마우스 B16-F10 흑색종 세포 (인간 CD1a 및 β-2m 둘 다가 결핍된)를 cCD1a 작제물 또는 야생형 CD1a의 2가지 상이한 제제로 일시적으로 형질감염시키고 3C 프로테아제 처리를 하거나 하지 않고 CD1a 및 인간 β-2m에 특이적인 항체로 표면 염색하였다 (도 2). 세포 표면 CD1a 및 인간 β-2 마이크로글로불린 발현에서의 감소는 cCD1a를 발현하고 wtCD1a를 발현하지 않은 세포에서만 관찰되었으며, 이는 세포 표면으로부터의 wtCD1a가 아닌 cCD1a의 프로테아제-기반 절단의 특이성을 입증한다. 다운스트림 예비 생화학적 정제를 위한 충분한 cCD1a 발현을 나타내는 시스템을 만들기 위해, cCD1a 전이유전자를 포유류 약물 선택으로 인간 HeLa 세포주 백그라운드에서 안정하게 cCD1a를 생성하는 2개의 클론의 생성을 가능하게 하는 플라스미드로 서브-클로닝하고, 전이유전자의 생성물은 다시 3C 프로테아제 절단에 민감한 것으로 나타났다 (도 3a). cCD1a 단백질의 SDS-PAGE 평가는 출발 물질 및 최종 용출물 둘 다에서 예상되는 크기에 상응하는 밴드를 입증한다 (도 3b).

실시예 3: 항원 단리

cCD1a 단백질의 항원 결합능을 평가하기 위해, 보다 발현이 안정한 클론 5로부터 유래된 세포를 엠. 튜버클로시스 (M. tuberculosis) 분해물로 항온처리하고, 음성 대조군으로 작용하는 미처리 세포로부터 수거한 cCD1a로 cCD1a 단백질을 절단 및 정제하였다. 점진적으로 증가하는 비극성/소수성 용매를 사용하여 이 실험으로부터 생성된 Ni-NTA-결합된 cCD1a 단백질로부터 수거된 분획물의 질량 분광학적 평가는 항원-처리된 그룹에 독특한 마이코박테리아 지질 항원의 스펙트럼의 존재를 나타내지만 대조군 샘플에서는 관찰되지 않았다 (도 4). 이러한 발견은 기존 전략보다 광범위한 항원을 탐색하는 수단으로서 cCD1a 시스템의 능력을 확인시켜 주는 "개념 증명 (proof-of-concept)" 데이터를 제공하고 포유류 세포 표면 상에 디스플레이된 단백질을 제조하는 수단으로 3C 프로테아제 시스템의 유연성을 강조한다.

실시예 4 : cCD1a 기능이 보존된다

HeLa 세포는 야생형 CD1a (wtCD1A) 또는 CD1a 세포외 도메인 및 세포외 도메인과 막투과성 도메인 (cCD1A) 사이에 가공된 프로테아제 절단 부위를 포함하는 작제물로 형질감염시켰다. 20,000개의 형질감염된 HeLa 세포를 wtCD1A 형질감염된 세포 및 cCD1A 세포 각각에 대해 96 웰 플레이트에서 10,000개의 LCD4.G T 세포 및 0.001-10 ㎍/mL LppX로 항온처리하였다. LCD4.G는 지질단백질 LppX 항원을 인지할 수 있는 CD1a 제한된 T 세포 클론이다. 세포를 10 % 인간 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 항온처리하였다. LCD4.G 세포 및 LppX로 항온처리된 형질감염되지 않은 HeLa 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 인터페론 γ (INF-γ) 생산은 ELISA에 의해 모니터링되었다. cCD1A로 형질감염된 HeLa 세포는 wtCD1a로 형질감염된 HeLa 세포와 동일한 정도로 INF-γ 생산을 유도할 수 있었고, 증가하는 농도의 리포단백질 LppX는 증가하는 농도의 INF-γ를 유도하였다 (도 5). 음성 대조군은 상당한 양의 INF-γ를 유도하지 않았다. 이러한 결과는 cCD1A가 항원을 T 세포에 제공할 수 있음을 시사한다.

참조문헌 인용

본원에 인용된 모든 미국 특허, 미국 공개 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 공보 및 기타 공보는 본원에 참조로 인용된다.

등가물

당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음과 같은 특성을 가질 수 있다.

Claims

항원-제시 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
막투과성 도메인; 및
상기 세포외 도메인과 상기 막투과성 도메인 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질로서,
여기서:
상기 프로테아제 절단 부위는 상기 막투과성 도메인에 근접하여 위치하고;
상기 프로테아제 절단 부위를 인지하는 프로테아제는 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 인지하는, 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 항원-제시 단백질이 CD1 단백질인, 단백질.
청구항 2에 있어서, 상기 항원-제시 단백질이 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, 또는 CD1e인, 단백질.
세포외 도메인;
막투과성 도메인; 및
상기 세포외 도메인과 상기 막투과성 도메인 사이에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질로서,
여기서:
상기 프로테아제 절단 부위는 상기 막투과성 도메인에 근접하여 위치하고;
상기 프로테아제 절단 부위를 인지하는 프로테아제는 적어도 4개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 인지하는, 단백질.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막투과성 도메인이 단일 알파 나선으로 이루어진, 단백질.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위가 트롬빈, 인자 Xa, TEV 프로테아제, 엔테로펩티다제 또는 리노바이러스 3C 프로테아제에 대한 인지 서열을 포함하는, 단백질.
청구항 6에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위가 리노바이러스 3C 프로테아제에 대한 인지 서열을 포함하는, 단백질.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 프로테아제 절단 부위가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 N-말단과 상기 프로테아제 절단 부위 사이에 위치한 제 1 친화성 태그를 추가로 포함하는, 단백질.
청구항 10에 있어서, 상기 제 1 친화성 태그가 상기 세포외 도메인과 상기 프로테아제 절단 부위 사이에 위치하는, 단백질.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 C-말단과 상기 프로테아제 절단 부위 사이에 위치하는 제 2 친화성 태그를 추가로 포함하는, 단백질.
청구항 12에 있어서, 상기 제 2 친화성 태그가 상기 막투과성 도메인과 상기 프로테아제 절단 부위 사이에 위치하는, 단백질.
청구항 10 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 친화성 태그 및 상기 제 2 친화성 태그 중 적어도 하나가 애비태그 (AviTag), 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트, E-태그, FLAG-태그, HA-태그, 폴리히스티딘, Myc, S-태그, SBP-태그, 소프태그 (Softag) 1, 소프태그 3, 스트렙-태그, TC 태그, V5 태그, VSV-태그, 엑스프레스 태그 (Xpress tag), 이소펩태그, 및 스파이태그 (Spytag)로부터 선택되는, 단백질.
청구항 10 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 친화성 태그 및 상기 제 2 친화성 태그 중 적어도 하나가 서열번호 6 내지 24 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 막을 가로질러 상기 세포외 도메인을 전좌시키기 위한 N-말단 리더 서열을 추가로 포함하는, 단백질.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 상기 단백질을 트래피킹 (trafficking)하기 위한 세포질 도메인을 추가로 포함하는, 단백질.
청구항 17에 있어서, 상기 세포질 도메인이 CD1a의 세포질 도메인을 포함하는, 단백질.
청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 세포.
청구항 19에 있어서,
상기 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포이고;
상기 세포가 플라스미드를 포함하고;
상기 플라스미드가 유전자를 포함하는, 세포.
청구항 19에 있어서,
상기 세포가 진핵 세포이고;
상기 유전자가 상기 세포의 게놈에 통합되어 있는, 세포.
청구항 19 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포이고 상기 세포가 상기 단백질을 발현하는, 세포.
청구항 19 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 이. 콜리 (E. coli) 및 에스 세레비지애 (S. cerevisiae)로부터 선택되는, 세포.
청구항 19 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 프로테아제 절단 부위에서 상기 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하지 않는 유기체로부터 유래된, 세포.
청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 항원-제시 단백질을 발현하는 유기체로부터 유래된, 세포.
청구항 19 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질이 상기 세포의 막을 가로질러 상기 세포외 도메인을 전좌시키기 위한 N-말단 리더 서열을 포함하고;
상기 세포가 천연 단백질 상에서 N-말단 리더 서열을 발현하는 유기체로부터 유래된, 세포.
청구항 19 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질이 상기 세포 내에서 상기 단백질을 트래피킹하기 위한 세포질 도메인을 포함하고;
상기 세포가 상기 세포질 도메인을 발현하는 유기체로부터 유래된, 세포.
청구항 19 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인, 세포.
청구항 28에 있어서, 상기 세포가 마우스 세포 또는 인간 세포인, 세포
청구항 29에 있어서, 상기 세포가 721, 293T, A172, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, A-549, BCP-1, BEAS-2B, BR 293, BT-20, BxPC3, Cal-27, CML T1, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COV-434, DU145, DuCaP, EM2, EM3, FM3, H1299, H69, HCA2, HEK-293, HeLa, HL-60, HMEpC, HT-29, HUVEC, Jurkat, JY, K562, KBM-7, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, 피어 (Peer), 라지 (Raji), Saos-2, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T2, T-47D, T84, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, 및 YAR 세포로부터 선택되는, 세포.
청구항 29에 있어서, 상기 세포가 3T3, 4T1, A20, ALC, B16, bEnd.3, C2C12, C3H-10T1/2, CGR8, CT26, E14Tg2a, EL4, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, Hepa1c1c7, J558L, MC-38, MTD-1A, MyEnd, NIH-3T3, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, X63, 및 YAC-1 세포로부터 선택되는, 세포.
청구항 28에 있어서, 상기 세포가 9L, B35, BHK-21, C6, CHO, CMT, COS-7, D17, DH82, MDCK II, RBL, 및 Vero 세포로부터 선택되는, 세포.
청구항 19 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 불멸화 세포주, 말초 혈액 단핵 세포, 또는 섬유 아세포의 세포인, 세포.
청구항 19 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CD1 단백질을 발현하는, 세포.
청구항 19 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CD1 단백질을 발현하지 않는, 세포.
청구항 19 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-제시 단백질의 상기 세포외 도메인이 CD1a로부터 유래된, 세포.
청구항 19 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 부류 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 II)를 발현하는, 세포.
청구항 19 내지 34, 36 및 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 항원-제시 세포인, 세포.
청구항 19 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 부류 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 II)를 발현하지 않는, 세포.
청구항 19 내지 33, 35, 36, 및 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 항원-제시 세포가 아닌, 세포.
청구항 19 내지 40 중 어느 한 항의 세포를 상기 항원을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계;
상기 세포를 프로테아제 절단 서열을 인지하는 프로테아제로 항온처리함으로써 상기 세포로부터 상기 세포외 도메인을 절단하는 단계; 및
상기 세포외 도메인을 상기 혼합물로부터 단리시킴으로써 상기 항원을 단리시키는 단계를 포함하는, 항원을 단리시키는 방법.
청구항 19 내지 40 중 어느 한 항의 세포를 상기 항원을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계;
상기 세포를 상기 혼합물로부터 단리시키는 단계;
상기 세포를 프로테아제 절단 서열을 인지하는 프로테아제로 항온처리함으로써 상기 세포로부터 상기 세포외 도메인을 절단하는 단계; 및
상기 세포외 도메인을 상기 세포로부터 단리시킴으로써 상기 항원을 단리시키는 단계를 포함하는, 항원을 단리시키는 방법.
청구항 41 또는 42에 있어서,
상기 단백질이 상기 세포외 도메인과 상기 단백질의 상기 프로테아제 절단 부위 사이에 위치하는 친화성 태그를 포함하고;
상기 세포외 도메인을 단리시키는 것이 상기 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 분자에 상기 세포외 도메인을 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
청구항 19 내지 40 중 어느 한 항의 세포를 항원과 접촉시키는 단계;
상기 세포를 복수의 T 세포로 항온처리하는 단계;
상기 세포에 결합하는 T 세포를 단리시킴으로써 상기 T 세포를 단리시키는 단계; 및
상기 세포를 상기 프로테아제 절단 서열을 인지하는 프로테아제로 항온처리함으로써 상기 T 세포를 상기 세포로부터 절단하는 단계를 포함하는, T 세포를 단리시키는 방법.
청구항 44에 있어서, 상기 세포를 상기 항원과 접촉시키는 단계가
상기 세포를 포함하는 조성물에 상기 항원을 첨가함으로서 상기 세포와 상기 항원을 포함하는 조성물을 수득하는 단계; 또는
상기 항원을 포함하는 혼합물에 상기 세포를 첨가함으로써 상기 세포와 상기 항원을 포함하는 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 45에 있어서, 상기 항원을 포함하는 상기 혼합물이 상기 복수의 T 세포를 포함하거나, 또는 상기 세포를 포함하는 조성물이 상기 복수의 T 세포를 포함하는, 방법.
청구항 45에 있어서, 상기 방법이 상기 세포와 상기 항원을 포함하는 조성물에 상기 복수의 T 세포를 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 44 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포를 상기 세포로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 44 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에 결합하는 상기 T 세포를 단리시키는 것 및/또는 상기 세포로부터 상기 T 세포를 단리시키는 것이 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 자기-활성화 세포 분류 (MACS)를 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 핵산.