KR20170138158A - Composition for detecting hydrogen sulfide and method for detecting hydrogen sulfide using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 황화수소 검출용 조성물 및 이를 이용한 황화수소 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting hydrogen sulfide and a method for detecting hydrogen sulfide using the same.
최근 연구 결과에 따르면 황화수소 (H2S)는 산화질소 (nitric oxide)와 일산화탄소 (carbon monoxide)와 더불어 3차 기체신호전달물질 (3rd gasotransmitter) 및 기체매개체 (gasomediator)로서 다양한 생리현상에 참여하는 것으로 알려져 있다. 혈액 내 플라즈마의 황화수소 농도는 50-100 μM 수준으로 알려져 있는데, 황화수소는 다양한 염증반응, 심혈관 질환, 혈관확장, 포도당 대사, 신생혈관형성 등 다양한 생리작용에 있어 중요한 신호전달 물질로 작용하고 있음이 최근연구 결과 등을 통해 보고되고 있으며, 이 황화수소 농도 수준을 검출하는 것만으로도 다운 증후군, 알츠하이머 병, 당뇨병, 간경변증 등의 질병 진단도 가능한 것으로 알려져 있다.Recent research has shown that hydrogen sulfide (H 2 S) participates in a variety of physiological phenomena as nitric oxide and carbon monoxide as well as a third gas transporter and gasomediator It is known. The concentration of hydrogen sulfide in blood plasma is known to be in the range of 50-100 μM. Hydrogen sulfide acts as an important signal transmitter for various physiological actions such as various inflammatory reactions, cardiovascular diseases, vasodilation, glucose metabolism and neovascularization And it is known that it is possible to diagnose diseases such as Down syndrome, Alzheimer's disease, diabetes and cirrhosis by detecting the concentration of hydrogen sulfide.
특히, 황화수소는 K-ATP 채널의 개시자 (opener)역할을 하여 심혈관 시스템의 항상성에 기여하며, 손상된 심혈관 근육의 치유 역할로 각광받고 있고, 이와 관련하여 종래에 황화수소 농도를 실시간으로 검출하는 황화수소 센서를 구비하는 심장 허혈 및 재관류에 대한 실시간 생체신호 측정 장치가 개시된 바 있다 (특허문헌 1).In particular, hydrogen sulfide serves as an opener of the K-ATP channel, contributing to the homeostasis of the cardiovascular system, and has been attracting attention as a healing function of damaged cardiovascular muscles. In this connection, a hydrogen sulfide sensor A real-time bio-signal measuring device for cardiac ischemia and reperfusion has been disclosed (Patent Document 1).
또한, 생체 내 황화수소는 시스타티오닌 β-신타아제 (CBS), 시스타티오닌 γ-리아제 (CSE), 3-메르타토피루베이트 설퍼트랜스페라제 (3-MST)의 3가지 효소를 통해서 생성되고, 세포 면역 시스템과 항산화 작용으로 세포를 보호하는 역할을 하는 글루타친 (GSH)을 유도하여 세포 내 산화 작용을 억제하는데, CSE에 의해 생성된 세포질 내 황화수소는 세포 내 산화 스트레스가 커지면 Katp 채널을 통해 미토콘드리아로 유입되고, 3-MST와 CAT 효소에 의해 생성된 미토콘드리아 내 존재하는 황화수소와 함께 GSH를 유도하여 세포를 보호한다. 이와 같이 황화수소가 GSH의 농도 변화를 유도함으로서 실질적인 세포 보호를 함에 따라 세포의 기능 저하를 막고, 세포자살 (apoptosis)을 억제하는 중재자 역할을 하므로, 미토콘드리아 내 황화수소 검출 및 농도를 알 수 있다면 다양한 생명 현상을 연구하는데 기여할 것으로 보고 있다. 이에, 황화수소를 검출하고 정량할 수 있는 다양한 기술이 경쟁적으로 개발되고 있으며, 특히 체내에서 황화수소를 비침습적인 영상을 이용한 검출방법의 개발의 중요성이 대두되고 있다.In vivo hydrogen sulfide is produced through three enzymes, cystathionine β-synthase (CBS), cystathionine γ-lyase (CSE) and 3-mercaptopurine sulpertransferase (3-MST) (GSH), which protects cells by the cellular immune system and antioxidant activity, inhibits the intracellular oxidizing action. The cytoplasmic hydrogen sulfide produced by CSE causes K atp Channel to the mitochondria and protects cells by inducing GSH with the hydrogen sulfide present in the mitochondria produced by 3-MST and CAT enzymes. Thus, when hydrogen sulfide induces changes in GSH concentration, it acts as a mediator to inhibit cell apoptosis by inhibiting cellular function by virtue of substantial cell protection. Therefore, if the detection and concentration of hydrogen sulfide in mitochondria is known, Which will contribute to research. Accordingly, various techniques for detecting and quantifying hydrogen sulfide have been developed in a competitive manner, and development of a detection method using non-invasive images of hydrogen sulfide in the body is becoming more important.
관련하여, 황화수소의 질병 진단 및 생리 현상 참여에 주목하여 현재 다양한 형태의 표지자가 소개되고 있으나, 황화수소를 검출하고, 정확히 정량하기 위해서는 액체 상태에서 H2S를 측정할 수 있어야 하고, 다른 음이온종 사이에 선택성을 보유해야 하며, 환원형 글루타치온 (GSH)과 선택성을 가지는 등의 조건이 요구되어 매우 어렵고 복잡한 것으로 알려져 있다.However, in order to detect and accurately quantify hydrogen sulfide, it is necessary to be able to measure H 2 S in the liquid state, and to measure the amount of H 2 S And it is known that it is very difficult and complicated because conditions such as reduced glutathione (GSH) and selectivity are required.
이에, 현재까지는 대부분 세포 내 사이토솔 (Cytosol) 및 혈액의 플라즈마 내 황화수소의 화학적 특성을 이용하는 발색단을 이용한 검출 방법, 황화이온에 특이적인 전극을 통과시켜 검출하는 방법, 가스 크로마토그래피를 이용하는 검출 방법들이 사용되었고, 최근 들어 다양한 형광탐침법 (fluorescent probe) 들이 개발되고 있으나, 형광탐침법의 한계성 등으로 인해, 소동물 수준에서 매우 제한적으로 영상을 통한 황화수소 검출이 이루어지고 있는 상황이므로 실제 생체 영상 및 생명 현상 연구에는 극히 제한적일 수밖에 없다.Therefore, up to now, there have been many attempts to use a detection method using a chromophore that utilizes most of the intracellular cytosol and the chemical properties of hydrogen sulfide in a plasma of blood, a method of detecting through a specific electrode for sulfide ions, and a detection method using gas chromatography In recent years, a variety of fluorescent probes have been developed. However, due to limitations of the fluorescence probe method, hydrogen sulfide is detected in a very limited manner at a small animal level. Therefore, Research on the phenomenon is extremely limited.
또한, 종래 H2S 검출을 위한 형광 프로브로서 2,4,6-트리아릴피리디움 양이온 화합물이 개시된 바 있으나 (비특허문헌 1), 상기 화합물의 경우 GSH와의 반응 경합을 피할 수 없다는 문제가 있고, 또한, 형광 증대형 프로브로서 2,4-디니트로벤젠 설포닐 플루오로세인을 이용하는 방법도 제안되었으나 (비특허문헌 2), 시간이 지남에 따라 술폰산 에스테르가 가수 분해하여 형광 강도가 변화한다는 문제점이 있다.In addition, although a 2,4,6-triarylpyridinium cation compound has been disclosed as a fluorescence probe for conventional H 2 S detection (Non-Patent Document 1), there is a problem in that a reaction competition with GSH can not be avoided , A method using 2,4-dinitrobenzenesulfonyl fluorosane as a fluorescence-amplifying probe has also been proposed (Non-patent document 2), but it has been proposed that the fluorescence intensity changes due to hydrolysis of the sulfonate ester over time .
이외에도, 2가 구리 이온 (Cu2 +)을 포함하는 2,2-디피콜릴아민기를 가지는 아미노플루오레세인 화합물 (DPA-4-AF)가 공개된 바 있고 (비특허문헌 3), 형광물질이 사이클렌, 사이클람 및 TACN 등에 부착되어 있는 형태의 화합물 (특허문헌 2)도 보고된 바 있다. 구체적으로, 상기 화합물은 화합물 자체로 형광을 띄고 있다가 구리와 결합하여 착화합물이 형성되면서, 구리 이온에 의해 소광 (quenching)이 일어나 더 이상 형광을 띄지 않는 물질로서, 황화수소가 상기 착화합물과 반응하게 되면, CuS 형태로 상기 구리 착물이 떨어져 나오게 되는데, 그 정도에 따라 복원되는 형광의 정도에 차이가 생기게 되는 원리를 이용하여 황화수소의 양을 정량하게 된다. 그러나, 상기 화합물은 세포수준에서 영상을 획득하는 것으로서, 동물 수준에서 선택적으로 황화수소를 검출하기까지는 아직 여러 문제점이 있는 바, 여전히 기존 검출 방법을 대체할 수 있는 새로운 기술 개발이 요구되고 있다.In addition, an aminofluorescein compound (DPA-4-AF) having a 2,2-dipicolylamine group containing a divalent copper ion (Cu 2 + ) has been disclosed (Non-Patent Document 3) Cyclam, cyclam, and TACN (Patent Document 2) have also been reported. Specifically, the compound fluoresces with the compound itself, and forms a complex with the copper to form quenching due to copper ions, and is no longer fluorescent. When hydrogen sulfide reacts with the complex compound , The copper complex is released in the form of CuS, and the amount of hydrogen sulfide is quantified by using the principle that the degree of fluorescence restored varies according to the degree of the copper complex. However, since these compounds acquire images at the cell level, there are still various problems until the detection of hydrogen sulfide selectively at an animal level. Therefore, it is still required to develop a new technique that can replace the conventional detection method.
한편, 64CuCl2 화합물은 방사성 동위원소 구리로부터 방출되는 방사능을 활용하여 양전자 방출 단층 촬영술 (positron emission tomography, PET)을 통해서 각종 질병을 비침습적으로 연구하는데 널리 사용되고 있는 화합물이며 (비특허문헌 4), 뇌종양, 저산소 종양 영상 등과 같은 다양한 질병들의 진단에 유용하게 사용되고 있는 화합물이다.On the other hand, the 64 CuCl 2 compound is widely used for non-invasive study of various diseases through positron emission tomography (PET) using radioactivity released from radioisotope copper (Non-Patent Document 4) , Brain tumor, hypoxia tumor imaging, and the like.
그러나, 상기 64CuCl2 화합물이 다양한 질병들의 진단에 사용되는 것이, 상기 64CuCl2 화합물이 황화수소와 반응하여 64CuS가 생성 및 축적됨으로써 이루어질 것이라는 가능성이 있으며, 더 나아가 64Cu를 함유하는 방사성 화합물을 활용하여 황화수소를 정량적으로 검출할 수 있는 가능성이 있는가에 대해서 보고한 종래문헌은 전무하다.However, it is likely that the 64 CuCl 2 compound is used for the diagnosis of various diseases because the 64 CuCl 2 compound reacts with hydrogen sulfide to produce and accumulate 64 CuS, and furthermore, the radioactive compound containing 64 Cu There is no conventional literature on the possibility of quantitatively detecting hydrogen sulfide.
이에, 본 발명에서는, 종래에 64CuCl2와 같은 화합물들이 다양한 질병의 진단에 활용되고 있지만, 그 정확한 진단 메커니즘을 제시한 바는 없으며, 또한 실제로는 64Cu 이온을 포함하는 화합물들이 질병 관련 부위에서 생성된 황화수소와 반응하여 64CuS를 생성 및 축적하고, 이와 같이 축적된 64CuS를 핵의학 영상을 통해서 진단할 수 있는 점에 착안하여, 다양한 질병에 관여하는 것으로 알려진 바 있는 황화수소를 생체 내외에서 용이하고, 민감도 높으면서도, 매우 선택적으로 검출할 수 있는 황화수소 검출용 조성물 및 황화수소 검출방법을 제공하고자 한다.Thus, in the present invention, but is utilized in the diagnosis of various diseases compounds such as 64 CuCl 2 in the conventional, there is no bar suggested that diagnosis mechanism, and actually a compound containing 64 Cu ions in disease-related parts generating and storing a 64 CuS by the reaction with the resulting hydrogen sulfide and, in view of the 64 CuS accumulated in this manner to a point that can be diagnosed through a nuclear medicine imaging, facilitates bar hydrogen sulfide which is known to be involved in various diseases in vivo and out And a hydrogen sulfide detection method and a hydrogen sulfide detection composition capable of highly selective detection with high sensitivity.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,In order to solve the above problems,
64Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 제공한다. 64 Cu < / RTI >
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 64Cu 이온은 상기 조성물 중 64CuCl2, 64Cu(ClO4)2, 64Cu(CH3COO)2, 64Cu(NO3)2, 64Cu2(OH)2CO3, 64CuSO4, 64CuO, 64CuCO3, 64Cu-글루코네이트, 64Cu(BF4)2, 또는 64CuBr2의 양이온 형태로 존재할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the 64 Cu ions are included in the composition as 64 CuCl 2 , 64 Cu (ClO 4 ) 2 , 64 Cu (CH 3 COO) 2 , 64 Cu (NO 3 ) 2 , 64 Cu 2 OH) 2 CO 3 , 64 CuSO 4 , 64 CuO, 64 CuCO 3 , 64 Cu-gluconate, 64 Cu (BF 4 ) 2 , or 64 CuBr 2 .
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 64Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 가질 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the 64 Cu ion may have a radioactivity of 3.7 MBq to 3.7 GBq (100 μCi to 100 mCi).
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물을 더 포함할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the composition may further include physiological saline, phosphate buffer solution, purified water, and mixtures thereof.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 64Cu 이온은 생체 내외의 황화수소와 반응하여 64CuS를 생성할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the 64 Cu ions may react with hydrogen sulfide in vitro or in vivo to produce 64 CuS.
또한, 본 발명은 상기 다른 과제를 해결하기 위해서,Further, in order to solve the above-mentioned other problems,
64Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 생체 내에 투여하는 단계;Administering a composition for detecting hydrogen sulfide containing 64 Cu ions in vivo;
상기 64Cu 이온과 상기 생체 내의 황화수소가 반응하여 생성된 64CuS로부터의 방사선량을 핵의학 영상법을 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 생체 내 황화수소 검출방법을 제공한다.And measuring the radiation dose from 64 CuS produced by reacting the 64 Cu ions with the hydrogen sulfide in vivo using nuclear medicine imaging.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 64Cu 이온은 상기 조성물 중 64CuCl2, 64Cu(ClO4)2, 64Cu(CH3COO)2, 64Cu(NO3)2, 64Cu2(OH)2CO3, 64CuSO4, 64CuO, 64CuCO3, 64Cu-글루코네이트, 64Cu(BF4)2, 또는 64CuBr2의 양이온 형태로 존재할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the 64 Cu ions are included in the composition as 64 CuCl 2 , 64 Cu (ClO 4 ) 2 , 64 Cu (CH 3 COO) 2 , 64 Cu (NO 3 ) 2 , 64 Cu 2 OH) 2 CO 3 , 64 CuSO 4 , 64 CuO, 64 CuCO 3 , 64 Cu-gluconate, 64 Cu (BF 4 ) 2 , or 64 CuBr 2 .
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 64Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq의 방사능 세기를 가질 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the 64 Cu ions may have a radioactivity of 3.7 MBq to 3.7 GBq.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물을 더 포함할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the composition may further include physiological saline, phosphate buffer solution, purified water, and mixtures thereof.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방사선량의 측정 단계는 Radio-TLC, 감마 카운터, 생체광학영상장치 또는 PET에 의해서 수행될 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the step of measuring the amount of radiation may be performed by Radio-TLC, a gamma counter, a bio-optical imaging device, or PET.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방사선량의 측정은 상기 조성물을 상기 생체 내에 투여하고, 1분 내지 48시간 경과 후에 수행될 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the measurement of the radiation dose may be performed after 1 to 48 hours after the administration of the composition in the living body.
본 발명에 따르면, 생체 내외의 황화수소를 핵의학 영상법에 의해서, 고민감도 및 고선택성으로 검출할 수 있기 때문에, 황화수소의 농도변화가 질병 진전과 높은 연관성을 갖는 종양, 저산소증, 각종 염증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간경화, 천식, 패혈증, 심근경색, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 내장통, 화상, 만성신부전, 열성 경련, 부종, 다운증후군 등과 같은 다양한 질병을 핵의학 영상법을 통하여 효과적으로 진단하는 것이 가능하다.According to the present invention, it is possible to detect hydrogen sulfide in vivo and in vitro with high sensitivity and high selectivity by the nuclear medicine imaging method, so that the concentration change of hydrogen sulfide can be used for tumor having high correlation with disease progression, hypoxia, various inflammation, The effective diagnosis of various diseases such as Parkinson's disease, cirrhosis, asthma, sepsis, myocardial infarction, diabetes, arteriosclerosis, hypertension, visceral pain, burns, chronic renal failure, febrile seizure, edema, Down syndrome, It is possible.
도 1 및 2는 다양한 농도의 NaHS를 포함하는 시료를 본 발명에 따른 조성물과 반응시킨 후, 생성되는 64CuS 정도를 Radio-TLC로 확인한 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 다황화물을 포함하는 시료를 본 발명에 따른 조성물과 반응시킨 후, 생성되는 64CuS/64CuSn 정도를 Radio-TLC로 확인한 그래프이다.
도 4는 다양한 화합물들을 포함하는 시료를 본 발명에 따른 조성물과 반응시킨 후, 생성되는 64CuS 정도를 Radio-TLC로 확인한 그래프이다.
도 5는 황화수소를 방출하는 NaHS와 GYY4137을 사용하여 SD-rat 등에 주사 후, 본 발명에 따른 조성물을 꼬리 정맥에 주사하고 소정 시간이 경과한 다음, IVIS (생체광학영상장치)로 체렌코프 영상 기법을 이용하여 촬영한 영상들을 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물을 SD rat에 꼬리정맥으로 주사한 후, 5시간 경과 후에 장기를 적출한 다음, 각 장기 별로 64CuS의 생성 정도를 확인 및 비교하여 정리한 도표이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 생체 내의 여러 장기들에서 시간 경과에 따라서 생성되는 64CuS 양을, 감마카운터를 사용하여 방사선량 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 8a는 정상 BALB/c 마우스에 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, microPET 영상을 촬영한 도면이고, 도 8b는 정상 BALB/c 마우스에 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 소정 시간 경과 후, 간, 신장, 위, 대장 및 소장과 같은 다양한 장기를 적출하여 제거한 뒤 microPET 영상을 촬영한 도면이다.
도 9는 마우스 유방암 모델 (EMT6 tumor model)에 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 5시간 경과 후에 microPET 영상을 촬영한 결과를 도시한 도면이다.
도 10은 BALB/c 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 3시간, 9시간 및 31시간 경과 후에 microPET 영상을 촬영한 결과를 도시한 도면이다.
도 11은 C57BL/6J 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 1 시간 경과 후에 microPET 영상을 촬영한 결과를 도시한 도면이다.
도 12는 C57BL/6J 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 1 시간 경과 후에 오른쪽과 왼쪽 뒷발을 포함한 다양한 장기들을 적출하여 감마카운터를 사용하여 각 장기들의 방사선량을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.FIGS. 1 and 2 are graphs showing a result of reacting a sample containing various concentrations of NaHS with a composition according to the present invention, and then measuring 64 CuS produced by radio-TLC.
FIG. 3 is a graph showing a result of reacting a sample containing polysulfides of various concentrations with a composition according to the present invention, and then measuring 64 CuS / 64 CuS n produced by radio-TLC.
FIG. 4 is a graph showing a result of reacting a sample containing various compounds with a composition according to the present invention and then measuring the degree of 64 CuS produced by radio-TLC.
FIG. 5 is a graph showing the results obtained by injecting a composition according to the present invention into a tail vein after injecting NaHS and GYY4137, which emit hydrogen sulfide, into SD-rats and the like. After a predetermined time has elapsed, FIG. 2 is a view showing images taken by using the camera.
FIG. 6 is a chart summarizing the production of 64 CuS by each organ, after extracting the organ according to the present invention in the tail vein after 5 hours, and comparing the results.
FIG. 7 is a graph showing a result of radiation dose measurement using a gamma counter of an amount of 64 CuS produced over time in various organs in vivo after the composition according to the present invention was injected.
FIG. 8A is a microPET image of a normal BALB / c mouse after injecting a composition according to the present invention. FIG. 8B is a graph illustrating the results of scanning a composition according to the present invention with normal BALB / c mice, , Liver, kidney, stomach, large intestine and small intestine are removed and then microPET images are taken.
FIG. 9 is a view showing a result of photographing a micro PET image after 5 hours after injecting a composition according to the present invention into a mouse breast cancer model (EMT6 tumor model).
FIG. 10 shows microPET images taken at 3 hours, 9 hours, and 31 hours after injection of the composition according to the present invention into an inflammation-induced inflammation model by injecting CFA into the right hind paw of BALB / c mouse. Fig.
FIG. 11 is a view showing the result of photographing a microPET image after 1 hour after injecting a composition according to the present invention into an inflammation-induced inflammation model by injecting CFA into the right hind paw of C57BL / 6J mouse.
FIG. 12 is a graph showing the results of the injection of the composition according to the present invention for an inflammation-induced inflammation model by injecting CFA into the right hind paw of C57BL / 6J mouse. After 1 hour, various organs including the right and left hind limbs were extracted, And the radiation dose of each organ is measured.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명자들은 양전자 방출 단층 촬영술 (positron emission tomography, PET) 등에서 널리 이용되는 64Cu가 기존에 다양한 질병의 진단에 활용되고 있었으나, 구체적으로 상기 64Cu가 생체 내 어떠한 물질과 특이적으로 결합하는가에 대한 연구를 진행하였으며, 그 결과, 64Cu가 생체 내의 질병에 관련된 부분에서 생성된 황화수소와 높은 민감도를 가지며 선택적으로 반응하여 64CuS가 생성 및 축적되고 해당 부분에 축적된 64CuS를 핵의학 영상을 통해서 확인이 가능하다는 사실을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors of how widely but 64 Cu that is used is utilized for the diagnosis of various diseases to the existing, more specifically the 64 Cu is binding specifically and in vivo any material enemy etc. positron emission tomography (positron emission tomography, PET) was conducted a study and as a result, 64 Cu that has a hydrogen sulfide and high sensitivity produced in part related to the disease in the living body by selective reaction with 64 CuS is generated and accumulated and through the the 64 CuS nuclear medical image stored in the appropriate section And confirmed that the present invention is possible.
구체적으로, 본 발명에서는 64Cu를 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 제공한다.Specifically, the present invention provides a composition for detecting hydrogen sulfide containing 64 Cu.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 상기 64Cu 이온은 64CuCl2, 64Cu(ClO4)2, 64Cu(CH3COO)2, 64Cu(NO3)2, 64Cu2(OH)2CO3, 64CuSO4, 64CuO, 64CuCO3, 64Cu-글루코네이트, 64Cu(BF4)2, 또는 64CuBr2 등과 같은 다양한 64Cu 이온 함유 화합물 중 양이온으로서 존재할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물 중 황화수소와 높은 민감도 및 선택성을 가지고 결합하는 물질은 64Cu 이온인 바, 반대 음이온으로서 상기 열거한 음이온 이외에도 다양한 음이온들이 사용될 수 있다.The 64 included in the compositions according to the present invention Cu ions 64 CuCl 2, 64 Cu (ClO 4) 2, 64 Cu (
또한, 상기 64Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 가질 수 있는데, 방사능 세기가 3.7 MBq 미만인 경우 핵의학 영상 획득에 소요되는 시간이 지나치게 길어지고, 신호의 세기가 충분하지 않은 문제점이 있고, 3.7GBq를 초과하는 경우에는 진단 대상이 되는 개체에 방사능 과다노출을 야기하는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.In addition, the 64 Cu ion may have a radioactivity of 3.7 MBq to 3.7 GBq (100 μCi to 100 mCi). When the radioactivity is less than 3.7 MBq, the time required to acquire the nuclear medicine image becomes excessively long, There is a problem that it is not enough, and in the case of exceeding 3.7 GBq, there is a problem of causing overexposure of radioactivity to the subject to be diagnosed, which is not preferable.
본 발명에 따른 조성물은 상기 64Cu 이온 이외에도, 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물 등과 같은 다양한 부가 성분들을 더 포함할 수도 있다.The composition according to the present invention may further include various additional components such as physiological saline, phosphate buffer solution, purified water and a mixture thereof in addition to the 64 Cu ions.
본 발명에 따른 조성물이 생체 내외의 시료에 투여되면 조성물 중 64Cu 이온이 시료 중에 존재하는 황화수소와 반응하여 64CuS를 생성하게 되며, 이를 후술하는 다양한 핵의학적 검출 방법에 의해서 검출함으로써 황화수소의 정확한 검출 및 정량이 가능해지게 된다.When a composition according to the present invention is administered to a sample in vitro or in vivo, 64 Cu ions in the composition react with hydrogen sulfide present in the sample to produce 64 CuS. By detecting the Cu CuS by various nuclear medicine detection methods described below, And quantification becomes possible.
이에, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물을 이용한 생체 내 황화수소를 핵의학적 영상을 통해서 검출하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 방법은,Accordingly, the present invention also provides a method for detecting in vivo hydrogen sulfide using a composition according to the present invention through nuclear medicine imaging,
64Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 생체 내에 투여하는 단계;Administering a composition for detecting hydrogen sulfide containing 64 Cu ions in vivo;
상기 64Cu 이온과 상기 생체 내의 황화수소가 반응하여 생성된 64CuS로부터의 방사선량을 핵의학 영상법을 이용하여 측정하는 단계를 포함한다.And measuring the radiation dose from the 64 CuS produced by reacting the 64 Cu ions with the hydrogen sulfide in vivo using the nuclear medicine imaging method.
상기 64Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물은 전술한 바와 같으며, 상기 방사선량의 측정 단계는 Radio-TLC, 감마 카운터, 생체광학영상장치 또는 PET 등과 같은 다양한 방사능 검출장치에 의해서 수행될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.The composition for detecting hydrogen sulfide containing 64 Cu ions is as described above, and the step of measuring the amount of radiation may be performed by various radioactive detection devices such as Radio-TLC, a gamma counter, a bio-optical imaging device or PET , But is not limited thereto.
또한, 후술하는 실시예에서도 상세히 서술된 바와 같이, 상기 방사선량의 측정은 상기 조성물을 상기 생체 내에 투여하고, 1분 내지 48시간 경과 후에 수행될 수 있다. 이때, 투여된 64Cu 이온은 시료에 투여되자마자 바로 황화수소와 빠르게 반응하고, 64Cu가 대략 12 시간 정도의 반감기를 갖기 때문에, 4 반감기 이상, 즉 48시간 이상이 경과하게 되면 방사선량의 감소 (decay)가 과다하게 진행되어 (대략, 초기 방사선량의 16배 정도 감소) 측정에 문제가 발생할 수 있으므로 바람직하지 않다.Further, as described in detail in the following embodiments, the measurement of the radiation dose can be performed after 1 to 48 hours after the composition is administered into the living body. At this time, since 64 Cu ions are rapidly reacted with hydrogen sulfide as soon as they are administered to the sample, and 64 Cu has a half-life of about 12 hours, the decrease of the radiation dose after 4 half- decay is progressed excessively (approximately 16 times as much as the initial radiation dose), which is not preferable.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following Examples are intended to assist the understanding of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.
황화수소에 대한 For hydrogen sulphide 6464 CuClCuCl 22 의of 민감도 측정 Sensitivity measurement
64CuCl2 (1.7-2.0 MBq)를 여러 농도의 NaHS (0-12 μM, 500 μL)와 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰을 때 형성되는 64CuS 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다.The degree to 64 CuS formed 64 CuCl 2 (1.7-2.0 MBq) when reacted for 15 minutes at various concentrations of NaHS (0-12 μM, 500 μL) and 37 ℃ by Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA] Respectively.
도 1에는 NaHS의 농도에 따른 64CuS 생성 백분율을 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 1을 참조하면, NaHS의 농도가 증가함에 따라 형성되는 64CuS의 정도 역시 증가함을 확인할 수 있었다. FIG. 1 is a graph showing the percentage of 64 CuS formation according to the concentration of NaHS. As shown in FIG. 1, the amount of 64 CuS formed as the concentration of NaHS increases is also increased.
6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 황화수소 측정 최소 농도 확인 Determination of the minimum concentration of hydrogen sulfide used
64CuCl2을 이용한 황화수소 측정 최소 농도 (limit-of-detection / LOD)를 확인하기 위하여 64CuCl2 (1.7 - 2.0 MBq)을 여러 농도의 NaHS (500 μL in PBS)와 37 ℃ 에서 15분 동안 반응시켰을 때, 형성되는 64CuS 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다. 64 CuCl 2 a with hydrogen sulfide measured the minimum concentration (limit-of-detection / LOD ) 64 CuCl to identify 2 (1.7 - 2.0 MBq) to various concentrations of NaHS (500 μL in PBS) and reacted at 37 ℃ for 15 minutes , The degree of 64 CuS formed was confirmed by Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA].
도 2에는 NaHS 농도에 따른 64CuS 생성 백분율을 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 2를 참조하면, NaHS의 농도가 증가함에 따라 형성되는 64CuS 정도가 일정한 선형의 기울기를 나타내고, 비례하며 증가함을 확인할 수 있었고, 측정 최소 농도 (limit-of-detection / LOD)를 3 σ/m을 기준으로 계산하였다. 여기서 σ는 세 번의 측정에서 나온 값이고, m은 NaHS 농도 (x축)와 탈착물화 % (y축)간의 기울기를 나타낸다. 상기 과정에 의해서 계산된 64CuCl2을 이용한 황화수소 측정 최소 농도는 0.02 μM 내지 0.002 μM인 것으로 확인되었다.FIG. 2 is a graph showing the percentage of 64 CuS formation according to the concentration of NaHS. Referring to FIG. 2, 64 CuS formed as the concentration of NaHS increases linearly with a constant slope and increases proportionally And the limit-of-detection (LOD) was calculated based on 3 σ / m. Where σ is the value from three measurements and m is the slope between the NaHS concentration (x-axis) and the% desorption (y-axis). It was confirmed that the minimum concentration of hydrogen sulfide measured using 64 CuCl 2 calculated from the above procedure was 0.02 μM to 0.002 μM.
다황화물Polysulfide ( ( polysulfidespolysulfides )에 대한 ) For 6464 CuClCuCl 22 민감도 측정Sensitivity measurement
64CuCl2 (1.7-2.0 MBq)를 여러 농도의 다황화물 (polysulfides) (0-10 μM, 500 μL)과 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰을 때 형성되는 64CuS/64CuSn 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다. 64 CuCl 2 (1.7-2.0 MBq) of the various concentrations of sulfides (polysulfides) (0-10 μM, 500 μL) and 64 CuS / 64 CuS n about a Radio-TLC formed when reacted for 15 minutes at 37 ℃ [ITLC, 50 mM EDTA].
3가지 종류의 다황화물 (K2Sn, Na2S2, Na2S4)을 사용하여 실험을 진행하였으며, 도 3에는 각각의 다황화물 농도에 따른 64CuS 생성 백분율을 도시한 그래프를 나타내었다. 도 3을 참조하면, 각각의 다황화물의 농도가 증가함에 따라 형성되는 64CuS/64CuSn 정도가 증가하는 사실을 확인할 수 있다.Experiments were conducted using three kinds of polysulfides (K 2 S n , Na 2 S 2 and Na 2 S 4 ), and FIG. 3 shows a graph showing the percentage of 64 CuS formation according to the respective polysulfide concentrations . Referring to FIG. 3, it can be seen that the amount of 64 CuS / 64 CuS n formed increases as the concentration of each polysulfide increases.
6464 CuClCuCl 22 의of 황화수소 선택성 확인 Determination of hydrogen sulfide selectivity
64CuCl2 (1.7-2.0 MBq)를 여러 종류의 바이오티올 (biothiols), 음이온, 산화제 [NaHS (12 μM), H2S 용존 용액 (12 μM), L-Cys (1 mM); L-Hcys (1 mM); GSH (10 mM); DL-디티오쓰레이톨 (DTT, 100 μM); L-아스코르빅산 (L-AsA, 10 mM); 2-머캡토에탄올 (2-ME, 10 mM); NaCl (10 mm); KI (1 mM); Na2S2O3 (1 mM); Na2S2O5 (1 mM); NaOAc (1 mM); H2O2 (100 μM); NaClO4 (100 μM); NaHCO3 (100 μM); NaNO2 (100 μM); NaN3 (100 μM)]들과 37 ℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 형성되는 64CuS 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다. 도 4에는 각 화합물에 대한 탈안정화도 (destabilization, %)를 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 4를 참조하면, 64CuCl2가 다른 화합물들에 비해서 NaHS 및 황화수소와 높은 선택성을 가지고 반응함을 확인할 수 있다. 64 CuCl 2 (1.7 μg / ml) of various biothiols, anions, oxidants (NaHS (12 μM), H 2 S dissolved solution (12 μM) and L-Cys (1 mM); L-Hcys (1 mM); GSH (10 mM); DL-dithiothreitol (DTT, 100 [mu] M); L-ascorbic acid (L-AsA, 10 mM); 2-mercaptoethanol (2-ME, 10 mM); NaCl (10 mM); KI (1 mM); Na 2 S 2 O 3 (1 mM); Na 2 S 2 O 5 (1 mM); NaOAc (1 mM); H 2 O 2 (100 μM); NaClO 4 (100 μM); NaHCO 3 (100 μM); NaNO 2 (100 μM); NaN 3 (100 μM)] at 37 ° C for 15 minutes, and then about 64 CuS was formed by radio-TLC (ITLC, 50 mM EDTA). FIG. 4 shows a graph showing destabilization (%) for each compound. Referring to FIG. 4, it is confirmed that 64 CuCl 2 reacts with NaHS and hydrogen sulfide with high selectivity compared with other compounds .
6464 CuClCuCl 22 와Wow GYY4137GYY4137 , , NaHS를NaHS 이용한 생체내의 황화수소 측정 Measurement of hydrogen sulfide in vivo IVISIVIS 영상 실험 Imaging experiment
64CuCl2가 생체 내에서 방출되는 황화수소를 실제로 잘 측정할 수 있는지를 확인해보는 실험을 진행하였는 바, 본 실험에서는 생체 내에서 황화수소를 발생시켜주기 위하여 황화수소를 빠른 속도로 방출하는 NaHS와 황화수소를 느린 속도로 방출하는 GYY4137를 사용하였다. 64 CuCl 2 can actually measure hydrogen sulfide released in vivo. In this experiment, NaHS and hydrogen sulfide, which release hydrogen sulfide at a high rate in order to generate hydrogen sulfide in vivo, Gt; GYY4137 < / RTI >
구체적으로, SD-rat (수컷/ 7주령)의 등 털을 깨끗이 제거해준 후, (1) 100μL의 Matrigel (Matrigel은 등 쪽에 함께 넣어주는 물질이 그 위치에 그대로 잘 머무를 수 있도록 해주기 위하여 사용함), (2) 100μL의 Matrigel + 5 mg NaCl, (3) 100μL의 Matrigel + 5 mg GYY4137, (4) 100μL의 Matrigel + 10 μg NaHS를 2 cm의 간격으로 순서대로 빠르게 주사한 후, 꼬리 정맥으로 64CuCl2 (57.7 MBq)를 주사하여, 각각 주사 직후 (0 min), 5분 후, 10분 후, 1시간 후, 2시간 후, 및 4 시간 후에 IVIS (생체광학영상장치)로 체렌코프 영상 기법을 이용한 영상을 얻었다.Specifically, after removing the dorsal surface of SD-rat (male / 7 weeks old), (1) 100 μL of Matrigel (Matrigel is used to allow the substance to be placed in the dorsal side to stay in place) 2 of 100μL Matrigel + 5 mg NaCl, (3), 100μL of Matrigel + 5 mg GYY4137, (4) after the injection quickly Matrigel + 10 μg NaHS of 100μL at intervals of 2 cm in order, to the tail vein 64 CuCl 2 (57.7 MBq) were injected and injected with IVC (Bio-Optic Imaging) immediately after injection (0 min), 5 minutes, 10 minutes, 1 hour, 2 hours and 4 hours respectively using Cherenkov imaging I got a video.
도 5에는 주사 프로토콜 및 각 시간대에서 실제 촬영된 영상들을 도시하였다. 도 5를 참조하면, 주사 직후, 5분 후, 10분 후 영상에서는 황화수소를 빠른 속도로 방출하는 NaHS (4)를 주사한 부위에만 높은 신호가 보임을 확인할 수 있었지만, 1시간부터 4시간 후의 영상에서는 황화수소를 느린 속도로 방출하는 GYY4137 (3)에 대한 신호가 점점 더 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. 물론, 비교군으로 주사한 Matrigel (1)과 Matrigel+ NaCl (2)에서는 신호가 나타나지 않았다.FIG. 5 shows the scan protocol and images actually photographed at each time zone. Referring to FIG. 5, it can be seen that a high signal is observed only in the region injected with NaHS (4) which emits hydrogen sulfide at a high rate in the image immediately after the injection, 5 minutes and 10 minutes, Showed that the signal for GYY4137 (3), which releases hydrogen sulfide at a slow rate, is increasing more and more. Of course, no signals were seen in Matrigel (1) and Matrigel + NaCl (2) injected with the comparative group.
상기 결과를 통해서, 생체 내에 주사된 NaHS와 GYY4137로부터 방출되어지는 황화수소와 꼬리 정맥으로 주사된 64CuCl2가 만나서 반응함으로써 64CuS가 형성되며, 그 신호가 오랜 시간 유지된다는 사실을 알 수 있다. 따라서, 64CuCl2가 생체 내에서 생성되는 황화수소를 실제로 잘 측정하고 모니터링 할 수 있는 능력을 지닌다는 사실을 알 수 있다.From these results, it can be seen that 64 CuS is formed by reacting with NaHS injected in vivo and 64 CuCl 2 injected with hydrogen sulfide released from GYY4137 and tail vein, and the signal is maintained for a long time. Thus, it can be seen that 64 CuCl 2 has the ability to actually measure and monitor the hydrogen sulfide produced in vivo.
SD rat에서 In SD rats 6464 CuClCuCl 22 를To 이용한 여러 장기에서의 Used in many organs 6464 CuSCuS 형성 확인 Confirm formation (주사 후, 5시(After injection, 5 o'clock 간)liver)
64CuCl2 (740 MBq, 200 μL saline)를 SD rat (수컷/6주령)에 꼬리정맥으로 주사한 후, 5시간 경과 후에, 1-2% 이소플루란을 사용하여 동물을 마취 및 희생시킨 다음 여러 장기를 적출하였다. 혈액의 경우, 심장으로부터 적출하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담아주었고, 적출된 다른 장기들은 먼저 액체 질소를 이용하여 얼린 후 막대사발을 이용하여 분쇄하였으며, 분쇄된 샘플에 차가운 PBS를 넣고 분석을 진행하였다. 대략 1-2 μL의 조직샘플을 사용하였고, Radio-TLC [ITLC, 2% SDS]를 통해서 주사된 64CuCl2에 의해 각각의 장기들의 황화수소와 반응하여 형성된 64CuS의 생성 정도를 확인 및 비교하였는 바, 도 6에는 각 장기별로 64CuS 생성 정도를 정리한 표를 도시하였다. 64 CuCl 2 (740 MBq, 200 μL saline) was injected into SD rats (male / 6 weeks old) by the tail vein. After 5 hours, the animals were anesthetized and sacrificed using 1-2% isoflurane, Respectively. In the case of blood, it was extracted from the heart and placed in a heparin-coated tube. The other organs were first frozen using liquid nitrogen, then pulverized using a rod bowl, cold PBS was added to the pulverized sample, and analysis . Approximately 1-2 μL of tissue samples were used and 64 CuS produced via radio-TLC [ITLC, 2% SDS] was reacted with hydrogen sulfide by each of the organs by 64 CuCl 2 . FIG. 6 is a table summarizing the degree of 64 CuS formation for each organ.
정상 normal BALBBALB /c 마우스에서의 / c on the mouse 6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 생체분포 확인 실험 Bio-distribution confirmation experiment using
생체 내의 여러 장기들에서 생성되는 64CuS 양을, 직접 적출된 장기들의 방사선량을 통해서 측정해보는 방식으로 확인하는 실험을 진행하였는 바, 6주령의 BALB/c 수컷 마우스에 64CuCl2 (0.74-1.3 MBq)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사 후 1시간, 6시간, 24시간 경과 후 (각 그룹별 5마리), 여러 장기들을 적출하여 감마카운터를 사용하여 각 장기들의 방사선량을 측정하였다.A 64- week-old male BALB / c mice were treated with 64 CuCl 2 (0.74-1.3) in a dose-dependent manner to determine the amount of 64 CuS produced in various organs in vivo by measuring the radiation dose of directly extracted organs. MBq) were injected through the tail vein. After 1 hour, 6 hours, and 24 hours after injection (5 mice per group), various organs were extracted and the radiation dose of each organ was measured using a gamma counter.
도 7에는 각 장기별로 측정된 방사선량을 도시한 그래프를 나타내었다. 도 7을 참조하면, 1시간, 6시간, 24 시간 모두에서 간에 가장 높은 섭취가 이루어지는 결과를 확인해볼 수 있었으며, 그 이외에 소장, 대장, 폐, 신장 등 다른 장기들에 대한 섭취가 높은 수치를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 혀에서는 안쪽 위쪽 부위에 상대적으로 높은 섭취가 이루어지는 것을 확인할 수 있었고, 갈색지방과 턱밑 큰침샘에도 비교적 높은 섭취가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.FIG. 7 is a graph showing the radiation dose measured for each organ. Referring to FIG. 7, the highest intake was observed at 1 hour, 6 hours, and 24 hours, and the intake of other organs such as small intestine, large intestine, lung, and kidney was high . In addition, it was confirmed that the tongue was relatively high in the upper part of the tongue, and the tongue was relatively high in the brown fat and the submandibular gland.
정상 normal BALBBALB /c 마우스에서의 / c on the mouse 6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 Used microPETmicroPET 영상 실험 Imaging experiment
정상 BALB/c 마우스에 64CuCl2를 주사한 후, microPET 영상을 통하여 생체 내의 여러 장기들에서 형성되는 64CuS 확인 및 시간에 따른 차이를 비교해보는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 6주령의 BALB/c 수컷 마우스에 64CuCl2 (18.5 MBq in 110 μL PBS)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사 후 1시간, 6시간, 28시간 경과 후 microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 8a에 도시하였다.Via after the injection of 64 CuCl 2 in normal BALB / c mouse, microPET imaging was performed an experiment to compare the difference in the 64 CuS confirmation and time to be formed in various organs in a living body. Specifically, in a 6-week-old BALB / c male mouse, 64 CuCl 2 (18.5 MBq in 110 μL PBS) was injected through the tail vein. After 1 hour, 6 hours, and 28 hours after injection, microPET images were confirmed. The results are shown in FIG. 8A.
도 8a를 참조하면, 주사 후 대부분의 방사선량이 체외로 배출되지 않고 머물러 있음을 확인할 수 있었고, 특히 주사 후 6 시간이 지난 이후에도 주사한 방사선량 (반감기 고려)이 99% 체내에 남아있음을 확인할 수 있었다. 생체분포 확인 실험에서의 결과와 동일하게 간 (하늘색 화살표)에 가장 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었고, 소장과 대장에도 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 8A, it was confirmed that most of the radiation dose after injection was not discharged to the outside of the body. In particular, even after 6 hours from the injection, 99% of the radiation dose (considering half-life) remained in the body there was. It was confirmed that the highest intake was observed in the liver (light blue arrow) as in the results of the biodistribution confirmation experiment, and it was confirmed that the intestine and colon were also highly ingested.
이어서, 64CuCl2를 주사하였을 때 체내에 높은 섭취를 보이는 간, 소장, 대장, 신장, 위와 같은 장기를 적출한 후 microPET 영상을 촬영하였는 바, 이러한 실험을 통하여 그 이외의 다른 장기들의 섭취 정도를 확인 및 비교해보는 실험을 진행하였다. 정상 BALB/c 마우스에 64CuCl2 (22.2 MBq in 110 μL PBS)를 주사한 후 대략 6시간이 경과한 후 간, 소장, 대장, 신장, 및 위와 같은 장기를 적출하여 microPET 영상을 촬영하였다. Then, when 64 CuCl 2 was injected, microPET images were taken after organs such as liver, small intestine, small intestine, kidney, and stomach which were taken high in the body were taken and these experiments were performed to determine the degree of intake of other organs The experiment was confirmed and compared. To normal BALB / c mice, 64 CuCl 2 (22.2 MBq in 110 μL PBS). After about 6 hours, the liver, small intestine, colon, kidney, and organs were extracted and microPET images were taken.
도 8b에는 상기 과정에 의해서 촬영된 microPET 영상을 도시하였으며, 도 8b를 참조하면, 이전 간과 소장/대장에서의 높은 섭취로 인해 잘 보이지 않던 폐와 혀 안쪽부분에 대하여 높은 신호가 보이는 것을 확인할 수 있고, 그 이외에 관절, 척추에도 신호가 보이는 것을 확인하였는 바, 여러 장기들에서 생성되는 황화수소들을 64CuCl2를 이용하여 검출할 수 있음을 확인하였다.FIG. 8B shows microPET images taken by the above procedure. Referring to FIG. 8B, it can be seen that a high signal is seen in the lungs and the inner part of the tongue which are not visible due to high intake in the liver and small intestine / large intestine In addition, the presence of signals in the joints and vertebrae also confirmed that hydrogen sulfide produced in various organs could be detected using 64 CuCl 2 .
마우스 종양 모델에서의 In a mouse tumor model 6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 Used microPETmicroPET 영상 실험 Imaging experiment
마우스 유방암 모델 (EMT6 tumor model)에 64CuCl2를 주사한 후, microPET 영상을 통하여 종양과 황화수소 간에 어떠한 관계가 있는지를 확인해보는 실험을 진행하였는 바, 구체적으로, 마우스 유방암 모델 (EMT6 tumor model / BALB/c 마우스 / 암컷)에 64CuCl2 (9.5-10.6 MBq in 110 μL PBS)를 꼬리정맥을 통하여 주사한 지 5 시간 경과 후, microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 도시하였다.In this study, we investigated the relationship between tumor and hydrogen sulphide through microPET imaging after injecting 64 CuCl 2 into a mouse breast model (EMT6 tumor model). Specifically, / c mouse / female) with 64 CuCl 2 (9.5-10.6 MBq in 110 μL PBS) was injected through the tail vein. After 5 hours, microPET images were confirmed. The results are shown in FIG.
도 9를 참조하면, 종양의 안쪽 부위에 대한 신호는 없고 종양의 바깥 윤곽 부위에만 신호가 보이는 결과를 확인할 수 있었는 바, 종양의 바깥 윤곽 부위에 황화수소가 좀 더 다량으로 발생될 수도 있음을 추측하게 하였다.Referring to FIG. 9, there is no signal on the inner part of the tumor, and the signal is visible only in the outer contour of the tumor, suggesting that hydrogen sulfide may be generated in the outer contour part of the tumor more Respectively.
마우스 염증 모델에서의 In the mouse inflammation model 6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 Used microPETmicroPET 영상 실험 (3h, 9h, 31h) Imaging experiments (3h, 9h, 31h)
BALB/c 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA (complete Freund's Adjuvant / 치사된 결핵균, 파라핀, 모노올레이트 성분이 포함)를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 64CuCl2를 주사한 후, microPET 영상을 통하여 염증과 황화수소 간에 어떠한 관계가 있는지를 확인해보는 실험을 진행해보았는 바, 구체적으로, 마우스 염증 모델 (실험 하루 전 30μL CFA 주사 / BALB/c 마우스 / 수컷)에 64CuCl2 (15.5 MBq in 110 μL PBS)를 꼬리정맥을 통하여 주사하고, 3시간, 9시간 및 31시간 경과 후에 microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 도시하였다.After injection of 64 CuCl 2 for inflammation induced inflammation by injecting CFA (complete Freund's Adjuvant / lethal Mycobacterium tuberculosis, paraffin, monooleate) into the right hind leg of BALB / c mouse, microPET imaging (CFA injection / BALB / c mouse / male 30 μL / day before the experiment), 64 CuCl 2 was added to the mouse inflammation model (15.5 MBq in 110 μL PBS) was injected through the tail vein, and microPET images were observed after 3 hours, 9 hours, and 31 hours. The results are shown in FIG.
도 10을 참조하면, 주사한 지 3시간 후의 영상에서 염증이 유발된 오른쪽 뒷발의 신호가 정상인 왼쪽 뒷발의 신호보다 높음을 확인할 수 있었고, 그러한 차이가 31시간 후의 영상에서까지 유지됨을 확인하였다. 이는, 염증이 유발되며 황화수소가 좀 더 다량으로 발생되고, 그에 따라 주사된 64CuCl2가 염증이 유발된 부위에서 발생된 황화수소와 만나서 반응함으로써 64CuS가 형성되며, 오른쪽 뒷발의 신호가 오랜 시간 유지되는 결과를 얻을 수 있었다.Referring to FIG. 10, it was confirmed that the signal of the right hind paw that was inflamed was higher than that of the normal left hind paw in the
마우스 염증 모델에서의 In the mouse inflammation model 6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 Used microPETmicroPET 영상 실험 (1 h) Image Experiment (1 h)
정상 마우스 (C57BL/6J)를 이용하여 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증 모델을 만들어 실험을 진행하였다. 두 그룹의 염증 모델에 64CuCl2 (6.4 - 7.0 MBq)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사하고 1 시간 경과 후에 microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 11에 도시하였다.CFA was injected into the right hind paw using a normal mouse (C57BL / 6J) to prepare an inflammatory model. In the two groups of inflammation models, 64 CuCl 2 (6.4 - 7.0 MBq) was injected through the tail vein, microPET images were observed after 1 hour of injection, and the results are shown in FIG.
도 11을 참조하면, 앞선 다른 시간에서의 결과와 동일하게 주사한지 1 시간 후의 영상 결과에서도 왼쪽 뒷발보다 염증이 유발된 오른쪽 뒷발의 신호 세기가 더 높음을 확인할 수 있었다. Referring to FIG. 11, it was confirmed that the signal intensity of the right hind paw, which was inflamed more than the left hind paw, was higher than that of the left hind paw even in the image obtained one hour after the injection.
마우스 염증 모델에서의 In the mouse inflammation model 6464 CuClCuCl 22 을of 이용한 생체분포 확인 실험 Bio-distribution confirmation experiment using
정상 마우스 (C57BL/6J)를 이용하여 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증 모델을 만들어 실험을 진행하였다. 두 그룹의 염증 모델에 64CuCl2 (0.74 MBq)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사하고 1 시간 경과 후 (5마리)에 오른쪽과 왼쪽 뒷발을 포함한 여러 장기들을 적출하여 감마카운터를 사용하여 각 장기들의 방사선량을 측정하였으며, 각 장기별로 측정된 방사선량을 도 12에 도시하였다.CFA was injected into the right hind paw using a normal mouse (C57BL / 6J) to prepare an inflammatory model. Six groups of inflammatory models were injected with 64 CuCl 2 (0.74 MBq) through the tail vein. After 1 hour, 5 organs were injected with various organs including right and left hind paw, And the amount of radiation measured for each organ is shown in FIG.
도 12를 참조하면, 왼쪽 뒷발보다 염증이 있는 오른쪽 뒷발에서 1.6배 정도로 더 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었고, 그 이외의 다른 장기들에 대한 결과는 염증 모델이 아닌 정상 마우스를 사용하였을 때의 결과와 거의 유사함을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 12, it was confirmed that the ingestion was 1.6 times higher than that in the right hind paw, which is more inflammatory than the left hind paw, and the results of other organs were obtained by using the normal mouse rather than the inflammation model Which is almost similar to that of.
종합하면, 본 발명에서는 질병에 관련된 부분에서 64CuS가 생성되고, 그 부분에 축적된 64CuS를 핵의학 영상상법을 사용하여 확인이 가능하므로, 생체 내외의 황화수소를 핵의학 영상법에 의해서, 고민감도 및 고선택성으로 검출할 수 있는 황화수소 검출용 조성물 및 검출방법을 제공하기 때문에, 황화수소의 농도변화가 질병 진전과 높은 연관성을 갖는 종양, 저산소증, 각종 염증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간경화, 천식, 패혈증, 심근경색, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 내장통, 화상, 만성신부전, 열성 경련, 부종, 다운증후군 등과 같은 다양한 질병을 효과적으로 진단하는 것이 가능하다.In summary, the present invention is 64 CuS is generated in the portion related to the disease, since the 64 CuS accumulated in that portion can be seen using a nuclear medicine imaging the conventional method, by the hydrogen sulfide of the living body around the nuclear medicine imaging, distressed The present invention provides a composition and method for detecting hydrogen sulfide that can be detected with high sensitivity and high selectivity. Therefore, it is an object of the present invention to provide a composition for detecting hydrogen sulfide, It is possible to effectively diagnose various diseases such as sepsis, myocardial infarction, diabetes, arteriosclerosis, hypertension, visceral pain, burns, chronic renal failure, febrile seizure, edema, Down syndrome and the like.
Claims (11)
상기 64Cu 이온은 상기 조성물 중 64CuCl2, 64Cu(ClO4)2, 64Cu(CH3COO)2, 64Cu(NO3)2, 64Cu2(OH)2CO3, 64CuSO4, 64CuO, 64CuCO3, 64Cu-글루코네이트, 64Cu(BF4)2, 또는 64CuBr2의 양이온 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 조성물.The method according to claim 1,
The 64 Cu ions in the composition 64 CuCl 2, 64 Cu (ClO 4) 2, 64 Cu (CH 3 COO) 2, 64 Cu (NO 3) 2, 64 Cu 2 (OH) 2 CO 3, 64 CuSO 4 , 64 CuO, 64 CuCO 3 , 64 Cu-gluconate, 64 Cu (BF 4 ) 2 , or 64 CuBr 2 in the form of a cation.
상기 64Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 갖는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the 64 Cu ions have a radioactivity of 3.7 MBq to 3.7 GBq (100 μCi to 100 mCi).
상기 조성물은 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein said composition further comprises physiological saline, phosphate buffer solution, purified water and mixtures thereof.
상기 64Cu 이온은 생체 내외의 황화수소와 반응하여 64CuS를 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the 64 Cu ions are capable of reacting with hydrogen sulfide in vitro and in vivo to produce 64 CuS.
상기 64Cu 이온과 상기 생체 내의 황화수소가 반응하여 생성된 64CuS로부터의 방사선량을 핵의학 영상법을 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 생체 내 황화수소 검출방법.Administering a composition for detecting hydrogen sulfide containing 64 Cu ions in vivo;
And measuring the radiation dose from 64 CuS produced by reacting the 64 Cu ions with the hydrogen sulfide in vivo using nuclear medicine imaging.
상기 64Cu 이온은 상기 조성물 중 64CuCl2, 64Cu(ClO4)2, 64Cu(CH3COO)2, 64Cu(NO3)2, 64Cu2(OH)2CO3, 64CuSO4, 64CuO, 64CuCO3, 64Cu-글루코네이트, 64Cu(BF4)2, 또는 64CuBr2의 양이온 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출방법.The method according to claim 6,
The 64 Cu ions in the composition 64 CuCl 2, 64 Cu (ClO 4) 2, 64 Cu (CH 3 COO) 2, 64 Cu (NO 3) 2, 64 Cu 2 (OH) 2 CO 3, 64 CuSO 4 , 64 CuO, 64 CuCO 3 , 64 Cu-gluconate, 64 Cu (BF 4 ) 2 , or 64 CuBr 2 in the form of a cation.
상기 64Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 갖는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출방법.The method according to claim 6,
Wherein the 64 Cu ions have a radioactivity of 3.7 MBq to 3.7 GBq (100 μCi to 100 mCi).
상기 조성물은 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출방법.The method according to claim 6,
Wherein the composition further comprises physiological saline, phosphate buffer solution, purified water, and mixtures thereof.
상기 방사선량의 측정 단계는 Radio-TLC, 감마 카운터, 생체광학영상장치 또는 PET에 의해서 수행되는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출방법.The method according to claim 6,
Wherein the step of measuring the amount of radiation is performed by Radio-TLC, a gamma counter, a bio-optical imaging device, or PET.
상기 방사선량의 측정은 상기 조성물을 상기 생체 내에 투여하고, 1분 내지 48시간 경과 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출방법.The method according to claim 6,
Wherein the measurement of the radiation dose is performed after 1 to 48 hours from the administration of the composition into the living body.
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|---|---|---|---|---|
| US20210190759A1 (en) * | 2018-09-11 | 2021-06-24 | Seoul National University R&Db Foundation | Composition for detecting hydrogen sulfide or measuring hydrogen sulfide concentration and composition comprising same as effective ingredient for diagnosing or imaging in vivo inflammation, tissues having hypoxic damage, or cancer |
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| WO2012144654A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-10-26 | 国立大学法人 東京大学 | Fluorescent probe for measuring hydrogen sulfide |
| WO2014027820A1 (en) | 2012-08-14 | 2014-02-20 | 경희대학교 산학협력단 | Real-time biosignal measurement apparatus for cardiac ischemia and reperfusion |
| KR20150116421A (en) * | 2014-04-07 | 2015-10-15 | 경북대학교 산학협력단 | Radioactive probe for detecting hydrogen sulfide |
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