KR20170133933A - Method for inducing conformational changes in the complementarity determining regions of antibody - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 항체의 경쇄가변영역 및/또는 중쇄가변영역의 수소이온 농도변화에 따른 상보성 결정 영역의 구조적 변화를 유도하기 위한 방법, 및 이를 위한 구조 변환 유도부에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for inducing a structural change of a complementarity determining region according to a change in hydrogen ion concentration in a light chain variable region and / or a heavy chain variable region of an antibody, and a structure conversion inducing unit therefor.
기존 항체는 큰 사이즈와 친수성 특징으로 살아있는 세포 내부로 직접 침투하지 못한다. 따라서, 기존의 대부분의 항체는 세포 외로 분비된 단백질 또는 세포막 단백질을 특이적으로 표적하고 있다. 일반적 항체와 고분자 바이오 의약품은 소수성인 세포막 통과가 불가능하여 세포질 내부의 다양한 질병관련 물질과 결합 및 저해하지 못하는 한계가 있다. 일반적으로 세포의 생장, 특이적 억제 등과 같은 기작 연구를 위한 실험에서 사용되는 세포 내부 물질과 특이적 결합하는 상업적 항체들은 살아있는 세포에 대해서 직접 처리하지 못하고, 세포 내부 물질과 결합하기 위해서는 양친매성 글리코사이드인 사포닌(saponin)을 이용한 세포막 투과화(permeabilization) 과정을 통해 세포막에 천공을 형성하기 위한 전처리 과정이 요구된다.Existing antibodies do not penetrate directly into living cells due to their large size and hydrophilic character. Thus, most existing antibodies specifically target the secreted proteins or cell membrane proteins. General antibodies and polymer biopharmaceuticals have limitations in their ability to bind and inhibit various disease-related substances inside the cytoplasm because they are unable to pass through hydrophobic membranes. In general, commercially available antibodies that specifically bind to intracellular substances used in experiments for mechanism studies such as cell growth, specific inhibition, etc., can not be directly treated on living cells, and in order to bind with intracellular substances, amphiphilic glycosides A preprocessing process is required to form perforations in the cell membrane through permeabilization of the cell membrane using saponin.
항체는 타겟 단백질에 고특이성, 고친화도를 가지며 결합하는 특징으로 세포막 또는 세포 외로 분비된 단백질에 표적으로 많은 치료용 항체가 개발되어 왔다. 세포막 단백질을 표적하는 항체는 세포막 단백질에 결합한 후, 막수용체 단백질 내재화(receptor-mediated endocytosis)를 통해 엔도좀 경로(endosomal pathway)로 세포내부로 들어갈 수 있는데, 처음에 초기 엔도좀(early endosome)으로 가서 여러 경로를 거친다. 구체적으로, 1) 대부분의 항체는 초기 엔도좀에서 말기 엔도좀(late endosome)을 거쳐, 라이소좀(lysosome)에 융합되어, 산성조건과 단백질 가수분해 효소에 의해 완전 파괴되는 경로로 가고, 2) 일부 항체는 초기 엔도좀 산성조건에서 FcRn(neonatal Fc receptor)수용체와 결합하여 재순환 엔도좀(recycling endosome)경로를 거쳐 다시 세포 밖으로 나가는 경로를 거칠 수 있다. 따라서 대부분의 항체는 타겟 막단백질과 강한 결합으로 라이소좀 경로를 거쳐서 대부분 파괴된다. 상기 엔도좀 경로에서 엔도좀이 성숙화 되면서 내부가 수소펌프(proton pump)에 의해 점차 산성화가 일어나는데, 초기 엔도좀의 pH는 5.5-6.5, 말기 엔도좀 pH는 5.0-6.0, 라이소좀의 pH는 3.5-4.5이며, 또한 엔도좀 내부에서 많은 단백질 가수분해 효소가 활성화 되어, 외부에서 내재화된 단백질들이 엔도좀 내부에서 파괴된다. 따라서 항체가 수용체에 의한 세포내 내재화 후에 엔도좀 경로를 따라 이동할 때, 라이소좀으로 가기 전에 초기 또는 말기 엔도좀에서 탈출해서 세포질로 위치하기 위해서는 타겟 막단백질과 분리되고 엔도좀에 천공을 만들어 탈출해야 한다.
Antibodies have a high specificity and high affinity for binding to target proteins, and many therapeutic antibodies have been developed to target proteins secreted into cell membranes or cells. Antibodies that target cell membrane proteins can bind to cell membrane proteins and then enter the cell through the endosomal pathway through membrane-receptor-mediated endocytosis, first to the early endosome Go through several paths. Specifically, 1) most of the antibodies are fused to lysosomes through the endo-endosomes in the endo-endosomes and go to pathways that are completely destroyed by acidic conditions and proteolytic enzymes; 2) Some antibodies bind to FcRn (neonatal Fc receptor) receptors in early endosomal conditions and may go through the recycling endosome pathway and back out of the cell. Therefore, most of the antibodies are strongly bound to the target membrane protein, and most of them are destroyed through the lysosome pathway. As the endosomes mature in the endosome pathway, acidification occurs gradually by a proton pump. The pH of the endosomes is 5.5-6.5, the endosomes are pH 5.0-6.0, the pH of the lysosomes is 3.5 -4.5, and many protein hydrolytic enzymes are activated inside the endosome, and externally internalized proteins are destroyed inside the endosome. Therefore, when the antibody moves along the endosomal pathway after intracellular internalization by the receptor, it must escape from the endo- or endo-endosome prior to lysosomes and be separated from the target membrane protein to create a perforation in the endosome do.
세포 내부에 있는 자연계에 존재하는 물질 중 바이러스 및 독소 등은 세포내재화(Endocytosis)를 통하여 능동적으로 살아있는 세포 내부로 침투한다고 알려져 있다. 세포내재화에 의해 세포 내부로 침투한 물질이 세포질에서 활성을 나타내기 위해서는 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 과정, “엔도좀 탈출 (endosomal escape)”,이 필수적이다. 아직까지 엔도좀 탈출 기작(endosomal escape mechanism)에 대한 명확히 밝혀져 있지 않지만 현재까지 엔도좀 탈출 기작에 대한 가설로는 크게 3가지가 있다. 첫 번째 가설은 엔도좀 막에 천공을 형성하는 기작으로서 엔도좀막에 양이온 양친매성 펩타이드(Cationic amphiphilic peptides)와 같은 물질이 음전하의 세포 이중 지질막에 결합하여 내부 응력(internal stress) 또는 내막 수축을 일으켜 결과적으로 원통형의 구멍(barrel-stave pore) 또는 도넛형의 통로(toroidal channel)를 형성한다는 것이며 (Jenssen et al., 2006), 천공 형성 기작(Pore formation mechanism) 이라고 불린다. 두 번째 가설은 양성자 스펀지 효과(Proton sponge effect) 에 의하여 엔도좀이 터지는 기작으로 양성자화 아민기(protonated amine group)에 의해 아민기를 가진 물질이 높은 완충 효과를 통해 엔도좀의 삼투압 증가로 엔도좀막이 붕괴될 수 있다는 것이다 (Lin and Engbersen, 2008). 세 번째 가설은 중성에서 친수성 코일 모양 유지하지만 엔도좀과 같은 산성에서는 소수성 나선형 구조로 변형되는 특정 모티프가 엔도좀막과의 융합을 통해, 모티프가 포함된 바이러스 및 톡신이 엔도좀을 탈출한다는 가설이 있으며, 지질막 융합 기작(Membrane fusion mechanism)이라고 명명하였다. 상기 3 가지 가설이 바이러스 단백질 및 식물/박테리아 유래 독소 단백질의 세포내재화 후, 엔도좀 탈출 기작으로 제안되어 있지만, 항체에서 이와 같은 엔도좀 탈출 기작을 구체적으로 규명한 바 없다.It is known that viruses and toxins among substances existing in nature inside the cell actively penetrate into living cells through cell internalization (endocytosis). In order for a substance that penetrates into the cell by cell internalization to become active in the cytoplasm, the process of escape from the endosomes to the cytoplasm, "endosomal escape", is essential. Although the endosomal escape mechanism has not yet been elucidated, there are three hypotheses for endosomal escape mechanism. The first hypothesis is that endomembrane-like materials such as cationic amphiphilic peptides bind to the negative dendritic cell lipid membrane, resulting in internal stress or endocytosis, Which forms a barrel-stave pore or toroidal channel (Jenssen et al., 2006) and is called the pore formation mechanism. The second hypothesis is that the protonated sponge effect causes endosomes to be released by the protonated amine group, which causes the substance with an amine group to react with the endosomal membrane (Lin and Engbersen, 2008). The third hypothesis is that a certain motif, which is retained in the form of a hydrophilic coil in neutrality but is transformed into a hydrophobic helical structure in an acid such as endosomal, fuses with endosomes, and the motif-containing virus and toxin escape the endosomes , And a membrane fusion mechanism. Although the above three hypotheses have been proposed as an endosome escape mechanism after cell internalization of viral proteins and plant / bacterial derived toxin proteins, such endosomal escape mechanisms have not been specifically identified in antibodies.
위와 같은 엔도좀 탈출 기작에서 공통적으로 관찰되는 현상은 엔도좀 및 라이소좀 환경인 pH가 낮은 산성 pH 조건에서 엔도좀 탈출이 일어난다는 점이다. pH에 따라 기능이 변화하는 단백질의 경우, pH에 따라 구조가 변화하는 특성을 가진다. 이러한 변화를 일으키는 현상은 탄포드 트랜지션(Tanford transition) 이라고 명명하였다 (Qin et al., 1998). 중성 pH 조건에서 음전하를 띠는 아미노산 (아스파라긴산(Aspartic acid, D), 글루타민산(Glutamic acid, E)) 과 소수성 아미노산 (메티오닌(Methionine, M), 류신(Leucine, L), 이소류신(Isoleucine, I)) 은 상호작용이 없으나, pH가 낮아짐에 따라 음전하를 띠는 아미노산의 곁가지 (side chain)의 카르복실산 (carboxyl acids, COO-)이 수소화되어 (protonation) 소수성을 띠고, 이어 주변의 소수성 아미노산과 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)을 할 수 있게 된다. 그 결과, 두 아미노산 간의 거리가 가까워지게 되며, 전체적인 단백질의 구조 및 기능이 변화한다. 한 예로, 질소 수송 효소인 Nitrophorin 4는 중성 수소이온 농도조건에서 개방형 구조를 갖지만, pH가 낮아짐에 따라, 아스파라긴산과 류신의 소수성 상호작용에 의해 폐쇄형 구조로 변화함에 따라 질소 수송 기능을 수행하게 된다 (Di Russo et al., 2012). 하지만 현재까지 상기 pH 의존적 구조 변화가 항체에서는 밝혀져 않다.
The common phenomenon observed in endosomal escape mechanism is that endosomal escape occurs under acidic pH conditions where endosomal and lysosomal environment pH is low. In the case of a protein whose function changes depending on pH, the structure changes in accordance with pH. The phenomenon that causes this change is called the Tanford transition (Qin et al., 1998). (Aspartic acid, Glutamic acid, E) and hydrophobic amino acids (Methionine, M, Leucine, L, Isoleucine, I) ) Have no interaction, but the carboxyl acids (COO-) of the side chain of the negatively charged amino acid become hydrogenated (protonation) and become hydrophobic as the pH becomes lower, and the hydrophobic amino acids Hydrophobic interaction can be performed. As a result, the distance between two amino acids becomes closer, and the structure and function of the whole protein changes. For example, Nitrophorin 4, which is a nitrogen-transporting enzyme, has an open structure at the neutral hydrogen ion concentration, but as the pH is lowered, the nitrogen transport function is performed as the hydrophobic interaction of aspartic acid and leucine changes into a closed structure (Di Russo et al., 2012). However, to date, the pH-dependent structural changes are not known in antibodies.
선행문헌Precedent literature
1. 대한민국 공개특허 10-2012-0026408
1. Korean Patent Publication No. 10-2012-0026408
이에 본 발명자들은 세포내부로 침투 및 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 세포질 침투 항체(Cytotransmab)의 엔도좀 탈출 기작에 대하여 연구하던 중, 항체 내에 위치하여 상기 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는데 결정적인 역할을 하는 특정 영역이 존재함을 규명하였으며, 이를 바탕으로 항체의 엔도좀 탈출 구조 모티프(Endosomal escape motif)의 구조변화를 유도하는 항체의 구조변환 결정부위를 규명하여 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors investigated the endosomal elimination mechanism of a complete immunoglobulin-type cytotransmucible antibody (Cytotransmab) distributed in the cytoplasm and penetration into the cell, and found that the endosomal escape mechanism Of the present invention, and based on this, the structural transformation site of the antibody that induces the structural change of the endosomal escape motif of the antibody is identified and the present invention is completed Respectively.
따라서, 본 발명은 항체가 세포내로 내재한 후에 엔도좀 내부의 수소이온 농도변화에 따라 항체의 경쇄가변영역 및/또는 중쇄가변영역 내의 두 아미노산 잔기간의 상호작용이 유도되고, 이에 따른 결과로 항체의 중쇄가변영역 및/또는 경쇄가변영역의 상보성 결정영역의 구조적 변화를 유도하는, 구조변환 유도부 및 구조변환 유도부의 설계 및 개량을 제공하는 것을 목적으로 한다.
Therefore, the present invention is based on the finding that the interaction of the two amino acid residues in the light chain variable region and / or the heavy chain variable region of the antibody is induced according to the change of the hydrogen ion concentration in the endosome after the antibody is introduced into the cell, And a structural change inducing unit that induces a structural change of a complementarity determining region of a light chain variable region and / or a light chain variable region of the light chain variable region.
본 명세서에서 사용된 용어 “엔도좀 탈출능”은 세포내재화를 통해서 능동적으로 살아있는 세포에 침투한 후 세포질에 위치하기 위하여 엔도좀을 벗어나는 능력을 의미하고, 용어 “엔도좀 탈출 구조 모티프(Endosomal escape motif)”는 산성 수소이온농도에 반응하여 구조 변화가 일어남으로써 내재화된 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 영역을 의미한다. The term " endosomal escape ability ", as used herein, refers to the ability to penetrate living cells actively through cell internalization and to leave the endosomes to be located in the cytoplasm, and the term " endosomal escape motif ) Refers to a region which imparts endosomal elimination capability to a cytoplasmic penetration antibody of a complete immunoglobulin type which is internalized by structural change in response to an acidic hydrogen ion concentration.
본 명세서에서 사용된 용어 “구조변환 유도부”는 1) 수소이온 농도변화에 따라 항체의 경쇄가변영역 및/또는 중쇄가변영역 내의 두 아미노산 잔기간의 상호작용이 유도되는 그 두 잔기와 2) 이에 따른 구조변화가 초래되는 상보성 결정영역, 2 가지를 의미한다. 상기 “구조변환 유도부”는 항체의 경쇄가변영역, 중쇄가변영역, 또는 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 동시에 존재할 수 있다.As used herein, the term " structural transformation inducing moiety " refers to: 1) two residues in which the interaction of two amino acid residues in the light chain variable region and / or the heavy chain variable region of the antibody is induced, And a complementarity determining region where structural change occurs. The "structural transformation inducing moiety" may be present in the light chain variable region, the heavy chain variable region, or the light chain variable region and the heavy chain variable region of the antibody at the same time.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 광의적인 개념에서 자연적으로 발생하는 L α-아미노산 또는 그것의 잔기(residue)뿐만 아니라, 더불어 D-아미노산 및 화학적으로 변형된(chemically modified) 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 상기한 아미노산 모방체 및 유사물을 포함하며, 본 발명에서 상기 모방체 및 유사물은 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 모든 아미노산 서열은 카바트(Kabat) 번호를 이용하여 나타내었다. As used herein, the term "amino acid" encompasses L-amino acids or residues thereof that occur naturally in the broad concept, as well as D-amino acids and chemically modified amino acids. For example, the above-mentioned amino acid mimetics and the like are included, and the mimetics and the like in the present invention may include functional equivalents. All amino acid sequences provided in the present invention are shown using Kabat numbers.
본 명세서에서 사용된 용어 “완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체”는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조를 가지는 것으로, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. As used herein, the term " complete immunoglobulin type antibody " has a structure with two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain having a disulfide bond (SS- The constant region of the antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region. The heavy chain constant region has gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) and epsilon The subclasses have gamma 1 (gamma 1), gamma 2 (gamma 2), gamma 3 (gamma 3), gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1) and alpha 2 (alpha 2). The constant region of the light chain has kappa (kappa) and lambda (lambda) types.
본 명세서에서 사용된 용어 "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함한다. As used herein, the term "heavy chain" includes a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3 It includes both full-length heavy chains and fragments thereof.
본 명세서에서 사용된 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함한다.
The term "light chain" as used herein refers to a light chain light chain comprising a variable region domain VL comprising the amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer antigen specificity and a constant region domain CL, All included.
1. One. 엔도좀Endo 탈출 구조 모티프 Escape structure motif
본 발명의 일 구현예에 따르면, According to an embodiment of the present invention,
항체의 경쇄가변영역, 중쇄가변영역, 또는 경쇄 및 중쇄가변영역의 CDR3(Complementarity determining region-3)에 위치하여 항체가 세포내로 내재한 후에 엔도좀 탈출능을 부여하기 위한 하기의 아미노산 서열을 포함하는 엔도좀 탈출 구조 모티프(Endosomal escape motif)가 개시된다. (CDR3) of the light chain variable region, the heavy chain variable region, or the light chain and heavy chain variable region of the antibody, and includes the following amino acid sequence for imparting endosomal elimination ability after the antibody is intracellularly introduced An endosomal escape motif is initiated.
-X1-X2-X3--X1-X2-X3-
(상기 식에서, (Wherein,
X1, X2 및 X3는 독립적으로 Phenylalanine(F), Tyrosine(Y), Histidine(H), 또는 Tryptophan(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 Tryptophan(W)을 포함한다) X1, X2 and X3 are independently selected from the group consisting of Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Histidine (H) or Tryptophan (W), wherein at least one of X1, X2 and X3 is Tryptophan Included)
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 엔도좀 탈출 구조 모티프는 경쇄가변영역, 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 위치할 수 있다. 본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 WWH, WYW, YWW, WYH 또는 YWH 아미노산으로 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 X1-X2-X3는 경쇄가변영역의 N 말단으로부터 92, 93 및 94 번째 아미노산에 위치할 수 있다. 상기 X1-X2-X3는 중쇄가변영역의 N 말단으로부터 96, 97 및 98 번째 아미노산에 위치할 수 있다. 또한, 상기 X1-X2-X3는 경쇄가변영역의 N 말단으로부터 92, 93 및 94 번째 아미노산, 및 중쇄가변영역의 N 말단으로부터 96, 97 및 98 번째 아미노산에 위치할 수 있다.In the endosome escape sequence motif according to the present invention, the endosome escape sequence motif may be located in the light chain variable region, the heavy chain variable region or the light chain variable region and the heavy chain variable region. The X1-X2-X3 may be composed of WWH, WYW, YWW, WYH, or YWH amino acid, in the endosomal structure motif according to the present invention. More specifically, X1-X2-X3 may be located at amino acids 92, 93 and 94 from the N-terminus of the light chain variable region. X1-X2-X3 may be located at the 96th, 97th and 98th amino acids from the N-terminus of the heavy chain variable region. The X1-X2-X3 may also be located at positions 96, 97 and 98 from the N-terminus of the light chain variable region, and from the N-terminus of the heavy chain variable region.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 엔도좀 탈출 구조 모티프는 경쇄가변영역에 위치하고, 상기 CDR3는 QQYWWHMYT(서열번호 1), QQYWYWMYT(서열번호 2), QQYYWWMYT(서열번호 3), QQYWYHMYT(서열번호 4) ? QQYYWHMYT(서열번호 5) 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the endosomal escape structure motif according to the present invention, the endosomal escape structure motif is located in the light chain variable region, and the CDR3 is QQYWWHMYT (SEQ ID NO: 1), QQYWYWMYT (SEQ ID NO: 2), QQYYWWMYT (SEQ ID NO: 4)? QQYYWHMYT (SEQ ID NO: 5).
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 엔도좀 탈출 구조 모티프는 중쇄가변영역에 위치하고, 상기 CDR3는 GWYWMDL(서열번호 6), GWYWFDL(서열번호 7), GWYWGFDL(서열번호 8) 및 YWYWMDL(서열번호 9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the endosomal escape structure motif according to the present invention, the endosomal cleavage structural motif is located in the heavy chain variable region, and the CDR3 is GWYWMDL (SEQ ID NO: 6), GWYWFDL (SEQ ID NO: 7), GWYWGFDL (SEQ ID NO: 9).
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 구조 모티프에 있어서, 상기 엔도좀 탈출 구조 모티프는 산성 수소이온농도에서 세포질 침투 항체의 표면으로 돌출됨으로써 엔도좀 세포막에 천공, 보다 구체적으로 일시적이고 가역적인 천공을 형성할 수 있다.
In the endosomal escape structure motif according to the present invention, the endosomal escape structure motif may protrude from the acidic hydrogen ion concentration to the surface of the cytoplasmic penetration antibody to form perforations, more specifically, temporary and reversible perforations in the endosomal membrane have.
2. 2. 경쇄가변영역Light chain variable region 및/또는 And / or 중쇄가변영역Heavy chain variable region
(1) 경쇄가변영역(1) light chain variable region
본 발명의 다른 구현예에 따르면, According to another embodiment of the present invention,
CDR3(Complementarity determining region-3)에 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하여 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 경쇄가변영역이 개시된다. 상기 경쇄가변영역은:CDR3 (Complementarity determining region-3) discloses a light chain variable region that confer endosomal escape ability to an antibody, including an endosomal cleavage motif. Wherein the light chain variable region comprises:
i) 서열번호 10의 CDR1, i) CDR1 of SEQ ID NO: 10,
ii) 서열번호 11의 CDR2, 및 ii) CDR2 of SEQ ID NO: 11, and
iii) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하는 CDR3를 포함할 수 있다. iii) CDR3 comprising an endosomal escape structural motif comprising the amino acid sequence shown below.
-X1-X2-X3--X1-X2-X3-
(상기 식에서, (Wherein,
X1, X2 및 X3는 독립적으로 Phenylalanine(F), Tyrosine(Y), Histidine(H), 또는 Tryptophan(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 Tryptophan(W)을 포함한다) X1, X2 and X3 are independently selected from the group consisting of Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Histidine (H) or Tryptophan (W), wherein at least one of X1, X2 and X3 is Tryptophan Included)
본 발명에 따른 경쇄가변영역에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 WWH, WYW, YWW, WYH 또는 YWH 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 X1-X2-X3는 경쇄가변영역의 N 말단으로부터 92, 93 및 94 번째 아미노산에 위치할 수 있다. In the light chain variable region according to the present invention, X1-X2-X3 may be composed of WWH, WYW, YWW, WYH or YWH amino acids. X1-X2-X3 may be located at amino acids 92, 93 and 94 from the N-terminus of the light chain variable region.
본 발명에 따른 경쇄가변영역에 있어서, 상기 CDR3는 QQYWWHMYT(서열번호 1), QQYWYWMYT(서열번호 2), QQYYWWMYT(서열번호 3), QQYWYHMYT(서열번호 4) 및 QQYYWHMYT(서열번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the light chain variable region according to the present invention, the CDR3 is a group consisting of QQYWWHMYT (SEQ ID NO: 1), QQYWYWMYT (SEQ ID NO: 2), QQYYWWMYT (SEQ ID NO: 3), QQYWYHMYT (SEQ ID NO: 4) and QQYYWHMYT , ≪ / RTI >
본 발명에 따른 경쇄가변영역에 있어서, 상기 경쇄가변영역은 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조 변화를 유도하는 구조 변환 유도부로서, N 말단으로부터 1번째 아미노산(a1) 및 상기 1번째 아미노산과 상호작용하는 95번째 아미노산(a95)를 더욱 포함할 수 있다. 상기 a1은 Aspartate(D) 또는 Glutamate(E)이고, 상기 a95는 Methionine(M), Leucine(L) 또는 Isoleucine(I)일 수 있다. 상기 구조 변환 유도부에서 상기 a1과 a95의 거리는 엔도좀 내부 수소이온농도에 따라 변화하고, 그에 따라 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조를 변화시킬 수 있다. In the light chain variable region according to the present invention, the light chain variable region is a structural transformation inducing portion inducing a structural change of an endosomal cleavage structure motif. The light chain variable region includes a first amino acid (a1) from the N terminus and a 95th amino acid Th amino acid (a95). The a1 may be Aspartate (D) or Glutamate (E), and the a95 may be Methionine (M), Leucine (L), or Isoleucine (I). The distance between the a1 and the a95 in the structure conversion inducing portion changes according to the endosomal inner hydrogen ion concentration, thereby changing the structure of the endosome escape structure motif.
본 발명에 따른 경쇄가변영역에 있어서, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 14 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
In the light chain variable region according to the present invention, the light chain variable region may include an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 14 to 18.
(2) 중쇄가변영역(2) heavy chain variable region
본 발명의 다른 구현예에 따르면, According to another embodiment of the present invention,
CDR3(Complementarity determining region-3)에 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하여 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 중쇄가변영역이 개시된다. 상기 경쇄가변영역은:CDR3 (Complementarity determining region-3) discloses a heavy chain variable region that encompasses endosomal escape structural motifs and confer endosomal escape ability to the antibody. Wherein the light chain variable region comprises:
i) 서열번호 12의 CDR1, i) CDR1 of SEQ ID NO: 12,
ii) 서열번호 13의 CDR2, 및 ii) CDR2 of SEQ ID NO: 13, and
iii) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함할 수 있다. iii) an endosome escape structural motif comprising the amino acid sequence shown below.
-X1-X2-X3--X1-X2-X3-
(상기 식에서, (Wherein,
X1, X2 및 X3는 독립적으로 Phenylalanine(F), Tyrosine(Y), Histidine(H), 또는 Tryptophan(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 Tryptophan(W)을 포함한다) X1, X2 and X3 are independently selected from the group consisting of Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Histidine (H) or Tryptophan (W), wherein at least one of X1, X2 and X3 is Tryptophan Included)
본 발명에 따른 중쇄가변영역에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 WWH, WYW, YWW, WYH 또는 YWH 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 X1-X2-X3는 중쇄가변영역의 N 말단으로부터 96, 97 및 98 번째 아미노산에 위치할 수 있다. In the heavy chain variable region according to the present invention, X1-X2-X3 may be composed of WWH, WYW, YWW, WYH or YWH amino acids. X1-X2-X3 may be located at the 96th, 97th and 98th amino acids from the N-terminus of the heavy chain variable region.
본 발명에 따른 중쇄가변영역에 있어서, 상기 CDR3는 GWYWMDL(서열번호 6), GWYWFDL(서열번호 7), GWYWGFDL(서열번호 8) 및 YWYWMDL(서열번호 9)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In a heavy chain variable region according to the invention, said CDR3 comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of GWYWMDL (SEQ ID NO: 6), GWYWFDL (SEQ ID NO: 7), GWYWGFDL (SEQ ID NO: 8) and YWYWMDL can do.
본 발명에 따른 중쇄가변영역에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조 변화를 유도하는 구조 변환 유도부로서, N 말단으로부터 1번째 아미노산(a1) 및 상기 1번째 아미노산과 상호작용하는 102번째 아미노산(a102)를 더욱 포함할 수 있다. 상기 a1은 Aspartate(D) 또는 Glutamate(E)이고, 상기 a102는 Methionine(M), Leucine(L) 또는 Isoleucine(I)일 수 있다. 상기 구조 변환 유도부에서 상기 a1과 a102의 거리는 엔도좀 내부 수소이온농도에 따라 변화하고, 그에 따라 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조를 변화시킬 수 있다. In the heavy chain variable region according to the present invention, the heavy chain variable region is a structural transformation inducing portion that induces a structural change of the endosome-excretory structural motif. The heavy chain variable region has a first amino acid (a1) from the N- Th amino acid (a102). The a1 may be Aspartate (D) or Glutamate (E), and the a102 may be Methionine (M), Leucine (L), or Isoleucine (I). The distance between a1 and a102 in the structure conversion inducing portion changes according to the endosomal inner hydrogen ion concentration, thereby changing the structure of the endosome escape structure motif.
본 발명에 따른 중쇄가변영역에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 19 내지 22으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
In the heavy chain variable region according to the present invention, the heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 19 to 22.
(3) 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역(3) light chain variable region and heavy chain variable region
CDR3(Complementarity determining region-3)에 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하여 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 개시된다. A light chain variable region and a heavy chain variable region are disclosed that include an endosomal cleavage structural motif in CDR3 (Complementarity determining region-3) to confer endosomal elimination capability to the antibody.
상기 경쇄가변영역은 서열번호 10의 CDR1, 서열번호 11의 CDR2, 및 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3를 포함하고, Wherein the light chain variable region comprises CDR1 of SEQ ID NO: 10, CDR2 of SEQ ID NO: 11, and CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-5,
상기 중쇄가변영역은 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2, 및 서열번호 6 내지 9으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3를 포함할 수 있다. The heavy chain variable region may comprise CDR1 of SEQ ID NO: 12, CDR2 of SEQ ID NO: 13, and CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-9.
본 발명에 따른 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 있어서, 상기 경쇄가변영역은 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조 변화를 유도하는 구조 변환 유도부로서, N 말단으로부터 1번째 아미노산(a1) 및 상기 1번째 아미노산과 상호작용하는 95번째 아미노산(a95)를 더욱 포함할 수 있다. 상기 a1은 Aspartate(D) 또는 Glutamate(E)이고, 상기 a95는 Methionine(M), Leucine(L) 또는 Isoleucine(I)일 수 있다. 상기 구조 변환 유도부에서 상기 a1과 a95의 거리는 엔도좀 내부 수소이온농도에 따라 변화하고, 그에 따라 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조를 변화시킬 수 있다. 상기 경쇄가변영역은 서열번호 14 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the light chain variable region and the heavy chain variable region according to the present invention, the light chain variable region is a structural transformation inducing portion inducing a structural change of an endosomal cleavage structure motif, wherein the light chain variable region comprises a first amino acid (a1) And may further include an interacting 95th amino acid (a95). The a1 may be Aspartate (D) or Glutamate (E), and the a95 may be Methionine (M), Leucine (L), or Isoleucine (I). The distance between the a1 and the a95 in the structure conversion inducing portion changes according to the endosomal inner hydrogen ion concentration, thereby changing the structure of the endosome escape structure motif. The light chain variable region may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 14 to 18.
본 발명에 따른 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조 변화를 유도하는 구조 변환 유도부로서, N 말단으로부터 1번째 아미노산(a1) 및 상기 1번째 아미노산과 상호작용하는 102번째 아미노산(a102)를 더욱 포함할 수 있다. 상기 a1은 Aspartate(D) 또는 Glutamate(E)이고, 상기 a102는 Methionine(M), Leucine(L) 또는 Isoleucine(I)일 수 있다. 상기 구조 변환 유도부에서 상기 a1과 a102의 거리는 엔도좀 내부 수소이온농도에 따라 변화하고, 그에 따라 엔도좀 탈출 구조 모티프의 구조를 변화시킬 수 있다. 상기 중쇄가변영역은 서열번호 19 내지 22으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
In the light chain variable region and the heavy chain variable region according to the present invention, the heavy chain variable region is a structural transformation inducing portion that induces a structural change of an endosomal escape structural motif. The structural change inducing portion includes a first amino acid (a1) And may further comprise an interacting 102nd amino acid (a102). The a1 may be Aspartate (D) or Glutamate (E), and the a102 may be Methionine (M), Leucine (L), or Isoleucine (I). The distance between a1 and a102 in the structure conversion inducing portion changes according to the endosomal inner hydrogen ion concentration, thereby changing the structure of the endosome escape structure motif. The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 19 to 22.
3. 3. 엔도좀Endo 탈출능이Ability to escape 향상된 항체 Improved Antibodies
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면,According to another embodiment of the present invention,
CDR3(Complementarity determining region-3)에 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하여 항체에 엔도좀 탈출능을 부여하는 경쇄가변영역, 중쇄가변영역, 또는 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역이 포함된 항체가 개시된다. An antibody is disclosed that comprises a light chain variable region, a heavy chain variable region, or a light chain variable region and a heavy chain variable region, wherein the complementarity determining region (CDR3) comprises an endosomal cleavage structural motif to confer endosomal elimination capability to the antibody.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체에 있어서, 상기 항체는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체 또는 이의 절편일 수 있다. 상기 항체는 마우스, 키메릭, 인간, 또는 인간화된 항체일 수 있다. 또한, 상기 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있으며, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있으며, 가장 바람직하게는 IgG 타입의 단일클론항체일 수 있다.In the antibody with improved endosomal eliminability according to the present invention, the antibody may be a complete immunoglobulin type antibody or a fragment thereof. The antibody may be a mouse, chimeric, human, or humanized antibody. The antibody may also be of the IgG, IgM, IgA, IgD or IgE type and may be of the IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5 or IgD type, Lt; / RTI > type monoclonal antibody.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체에 있어서, 상기 항체는 세포 내재화를 통해 침투한 후 엔도좀 탈출에 의해 세포질에 위치하는 것일 수 있다. 상기 항체는 세포질, 핵, 미토콘드리아, 소포체 또는 세포내 고분자를 표적으로 할 수 있다. 상기 세포내 고분자는 단백질, 기질, DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 단백질은 세포 성장, 세포 증식, 세포 주기, DNA 수리, DAN 보전, 전사, 복제, 번역 또는 세포내 이동의 제어와 관련된 것일 수 있다. 상기 단백질은 인산기, 카르복실산기, 메틸기, 설페이트기, 지질, 수산기 또는 아미드기로 변형 또는 활성화될 수 있다.
In the antibody having enhanced endo-escape ability according to the present invention, the antibody may be located in the cytoplasm by intrusion of the endosome after intracellularization. The antibody can target the cytoplasm, nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, or intracellular polymer. The intracellular polymer may be a protein, a substrate, DNA or RNA. The protein may be related to cell growth, cell proliferation, cell cycle, DNA repair, DAN conservation, transcription, replication, translation or control of intracellular migration. The protein may be modified or activated with a phosphate group, a carboxylic acid group, a methyl group, a sulfate group, a lipid, a hydroxyl group or an amide group.
4. 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물4. Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, According to another embodiment of the present invention,
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체; 및An antibody having enhanced endo-escape ability according to the present invention; And
상기 항체에 융합된 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 나노입자 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체활성분자를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 개시된다. Disclosed are pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of cancer comprising a bioactive molecule selected from the group consisting of peptides, proteins, small molecule drugs, nanoparticles and liposomes fused to the antibody.
본 발명에서 사용된 용어 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다. The term " fusion ", as used herein, refers to the integration of two molecules of different function or structure, including but not limited to any physical, chemical, or biological Fusion method. The fusion may preferably be with a linker peptide, which can relay the fusion with the bioactive molecule at various positions of the antibody light chain variable region, antibody, or fragment thereof of the invention.
본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
The pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the cancer is squamous cell carcinoma, small cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, skin cancer, The present invention relates to the use of a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof for the treatment or prophylaxis of a cancer selected from the group consisting of a malignant tumor, a rectum, a rectum, an anal canal, an esophagus cancer, a small intestine cancer, an endocrine cancer adenocarcinoma, And may be selected from the group consisting of cancer, liver cancer, bladder cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, colon cancer, endometrial or uterine cancer, salivary cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, mucin cancer, thyroid cancer, liver cancer and head and neck cancer .
5. 암의 진단용 약제학적 조성물5. Diagnostic pharmaceutical composition of cancer
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, According to another embodiment of the present invention,
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체; 및An antibody having enhanced endo-escape ability according to the present invention; And
상기 항체에 융합된 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 나노입자 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체활성분자를 포함하는 암의 진단용 약제학적 조성물이 개시된다. Disclosed are diagnostic pharmaceutical compositions comprising a bioactive molecule selected from the group consisting of peptides, proteins, small molecule drugs, nanoparticles and liposomes fused to the antibody.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 암의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.As used herein, the term "diagnosis" means identifying the presence or characteristic of pathophysiology. The diagnosis in the present invention is to confirm the onset and progress of cancer.
본 발명에 따른 암의 진단용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 세포질 침투 항체는 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질과 결합할 수 있다. 상기 형광체는 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (allopicocyanine) 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질은 Dronpa 단백질, 형광 발색 유전자(EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, DsRFP) 또는 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 기타 영상용 물질은 산화철 또는 방사성 동위원소를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
In the pharmaceutical composition for diagnosing cancer according to the present invention, the cytoplasmic penetration antibody can be combined with a fluorescent material for a molecular imaging, a fluorescent protein or other imaging substance to diagnose cancer through imaging. The fluorescent material may include fluorescein, BODYPY, Trtramethylrhodamine, Alexa, Cyanine, allopicocyanine, or derivatives thereof, , But is not limited thereto. The fluorescent protein may include, but is not limited to, a Dronpa protein, a fluorescent coloring gene (EGFP), a red fluorescent protein (DsRFP), or a cyanine fluorescent material Cy5.5 that exhibits near infrared fluorescence. The other imaging material may include, but is not limited to, iron oxide or radioactive isotopes.
6. 6. 엔도좀Endo 탈출능이Ability to escape 향상된 항체의 제조 방법 Method for producing improved antibodies
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, According to another embodiment of the present invention,
항체의 CDR3에 하기의 아미노산 서열을 포함하는 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하는 CDR3를 이식(grafting)하는 단계를 포함하는, 엔도좀 탈출능이 향상된 항체의 제조 방법이 개시된다. A method for producing an antibody having enhanced endosomal escape ability, comprising the step of grafting CDR3 comprising an endosomal escape structural motif comprising the amino acid sequence shown below in the CDR3 of the antibody.
-X1-X2-X3--X1-X2-X3-
(상기 식에서, (Wherein,
X1, X2 및 X3는 독립적으로 Phenylalanine(F), Tyrosine(Y), Histidine(H), 또는 Tryptophan(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 Tryptophan(W)을 포함한다) X1, X2 and X3 are independently selected from the group consisting of Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Histidine (H) or Tryptophan (W), wherein at least one of X1, X2 and X3 is Tryptophan Included)
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 WWH, WYW, YWW, WYH 또는 YWH 아미노산으로 이루어질 수 있다. In the method of the present invention, X1-X2-X3 may be composed of WWH, WYW, YWW, WYH or YWH amino acids.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 경쇄가변영역의 N 말단으로부터 92, 93 및 94 번째 아미노산에 위치할 수 있다. 상기 CDR3는 QQYWWHMYT(서열번호 1), QQYWYWMYT(서열번호 2), QQYYWWMYT(서열번호 3), QQYWYHMYT(서열번호 4) 및 QQYYWHMYT(서열번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the method for producing an antibody having enhanced endosomal eliminability according to the present invention, X1-X2-X3 may be located at amino acids 92, 93 and 94 from the N-terminus of the light chain variable region. The CDR3 may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of QQYWWHMYT (SEQ ID NO: 1), QQYWYWMYT (SEQ ID NO: 2), QQYYWWMYT (SEQ ID NO: 3), QQYWYHMYT (SEQ ID NO: 4) and QQYYWHMYT .
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 X1-X2-X3는 중쇄가변영역의 N 말단으로부터 96, 97 및 98 번째 아미노산에 위치할 수 있다. 상기 CDR3는 GWYWMDL(서열번호 6), GWYWFDL(서열번호 7), GWYWGFDL(서열번호 8) 및 YWYWMDL(서열번호 9)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. In the method of the present invention, X1-X2-X3 may be located at the 96th, 97th and 98th amino acids from the N-terminal of the heavy chain variable region. The CDR3 may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of GWYWMDL (SEQ ID NO: 6), GWYWFDL (SEQ ID NO: 7), GWYWGFDL (SEQ ID NO: 8) and YWYWMDL (SEQ ID NO: 9).
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체의 제조 방법에 있어서, 상기 엔도좀 탈출능이 향상된 항체는 서열번호 23 내지 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
In the method for producing an antibody having improved endosomal eliminability according to the present invention, the antibody having improved endosomal eliminability may include a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 23 to 28.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체는 생체활성분자를 특별한 외부 단백질 전달 시스템을 사용함이 없이 높은 효율로 특정 세포내부로 침투시켜 세포질에 분포시킴으로써 의약품 개발 및 제조뿐만 아니라 기초 의과학 연구 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 엔도좀 탈출능이 향상된 항체는 현재 소분자 약물을 이용한 질병 치료에 표적물질로 분류되고 있는 세포질 내에 존재하면서 단백질과 단백질 사이에 넓고 평평한 표면을 통해 구조복합성 상호작용을 이루는 종양 및 질환 관련 인자에 대한 치료 및 진단에 높은 효과를 기대할 수 있다.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The antibody having enhanced endo-escape ability according to the present invention is useful for medical drug development and manufacturing as well as basic medical research fields by infiltrating a bioactive molecule into a specific cell with high efficiency without using a special external protein delivery system Can be used. More specifically, the antibody having improved endo-escape ability according to the present invention is a tumor which is present in the cytoplasm classified as a target substance for the treatment of diseases using a small molecule drug, and has a structure complex interaction through a wide flat surface between protein and protein And high efficacy in the treatment and diagnosis of disease-related factors can be expected.
도 1은 세포 안으로 유입된 cytransmab TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 수송과정과 안정도를 관찰하기 위해 펄스 추적 실험(pulse-chase)을 진행하여 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
도 2는 pH에 따라 세포막을 통과하여 Cytotransmab이 유입될 수 있는지, 또한,다른 물질의 세포막 통과를 유도할 수 있는지 항체를 직접 형광표지하여 Ramos 세포주에서 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 3a는 pH에 따른 Cytotransmab에 의해 막투과능이 없는 트립판 블루(trypan blue)를 천공으로 획득 가능한지 Ramos 세포주에서 광학현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 3b는 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 4a는 pH 5.5 조건에서 Cytotransmab 에 의해 생성된 세포막 천공이 일시적이며, 가역적인 현상인지 광학현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 4b는 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 5는 pH에 따른 Cytotransmab과 대조군 항체 adalimumab의 세포막 결합을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
도 6은 pH에 따른 Cytotransmab과 대조군 항체 adalimumab의 세포막 지질 플립-플랍 유도능을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
도 7은 상기 실험들을 통하여 예상한 Cytotransmab 의 천공 형성 모델을 나타낸 모식도이다.
도 8은 Cytotransmab의 경쇄가변영역(VL) 의 WAM 모델링 구조를 기반으로 pH에 따른 Cytotransmab의 구조적 변화를 예측하여 구조적 변화에 관여하는 아미노산 및 구조적 변화에 의해 노출되는 아미노산을 나타낸 도이다.
도 9a는 산성 pH에서 Cytotransmab의 구조적 변화를 유도에 관여하는 경쇄가변영역(VL) 1번째 아미노산 아스파라긴산, 95번째 아미노산 메티오닌을 각각 알라닌, 글루탐산, 류신으로 치환한 돌연변이들의 세포질 침투능을 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 9b는 산성 pH에서 Cytotransmab의 구조적 변화를 유도에 관여하는 경쇄가변영역(VL) 1번째 아미노산 아스파라긴산, 95번째 아미노산 메티오닌을 각각 알라닌, 글루탐산, 류신으로 치환한 돌연변이들에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 10은 경쇄가변영역(VL) 의 CDR3 의 아미노산들 중 엔도좀 탈출에 관여할 가능성이 있는 아미노산들을 각각 알라닌으로 치환한 돌연변이들에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 11a는 Cytotransmab 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 11b는 Cytotransmab 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 세포질 침투능이 유지되는지 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 12는 pH에 따른 Cytotransmab 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 13a는 Cytotransmab 야생형 또는 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이TMab4-WYW의 세포질로의 이동을 calcein을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 13b는 도 12a 의 공초점 현미경 사진의 calcein 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 14a는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포막 결합을 유세포분석기(FACS)로 분석한 그래프이다.
도 14b는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 14c는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포질로의 이동을 calcein을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 calcein 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 15a는 엔도좀 탈출능을 제거한 경쇄가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄가변영역을 가진 Cytotransmab 구축을 설명한 모식도이다.
도 15b는 엔도좀 탈출능을 제거한 경쇄가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄가변영역을 가진 Cytotransmab에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 16은 cytotransmab 이 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광split 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
도 16은 GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 17a는 GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 17b는 도 20a 의 공초점 현미경 사진의 GFP 형광을 정량한 그래프이다.
도 18a는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포막 결합을 유세포분석기(FACS)로 분석한 그래프이다.
도 19a은 엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이의 활성을 확인하기 위해, 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab 구축을 설명한 모식도이다.
도 19b은 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab 의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 19c은 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab 과 세포질에 위치한 세포골격인 튜블린과의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 20a은 엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이의 활성을 확인하기 위해, 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 구축을 설명한 모식도이다.
도 20b는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 20c는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 와 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 21a는 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 구축을 설명한 모식도이다.
도 21b는 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지 형광 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 21c는 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 22a는 K-RAS 돌연변이체 K-RAS G12D의 GTP가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태에서의 친화도를 측정하기 위한 ELISA를 수행한 결과이다.
도 22b는 RGD10 펩타이드 융합한 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 구축을 설명한 모식도이다.
도 22c는 RGD10 펩타이드 융합한 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab와 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 23a는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 23b는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 23c는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.FIG. 1 shows the result of observing the transport process and stability of cytransmab TMab4 or TAT infiltrated into cells by a pulse-chase and confocal microscopy.
FIG. 2 shows the result of confirming the antibody directly through fluorescence labeling in a Ramos cell line through a confocal microscope to determine whether a cytotransmab can be introduced through the cell membrane according to pH and induce cell membrane passage of another substance.
FIG. 3A shows results obtained by perforating trypan blue without membrane permeability by Cytotransmab according to pH or by optical microscope in Ramos cell line.
FIG. 3B is a graph showing a quantitative comparison of the number of cells acquiring trypan blue.
FIG. 4A is a result obtained by observing the cell membrane perforation produced by Cytotransmab under the condition of pH 5.5, which is transient and reversible, through an optical microscope.
FIG. 4B is a graph showing a quantitative comparison of the number of cells acquiring the trypan blue.
FIG. 5 shows the results of analysis of cell membrane binding of cytotransmab and control antibody adalimumab by pH with a flow cytometer (FACS).
FIG. 6 shows the results of analysis of cell membrane lipid flip-flop induction ability of Cytotransmab and control antibody adalimumab by pH using a flow cytometer (FACS).
FIG. 7 is a schematic diagram showing a perforation formation model of Cytotransmab predicted through the above experiments.
FIG. 8 is a diagram showing amino acids exposed to structural changes and structural changes due to structural change of Cytotransmab according to pH, based on WAM modeling structure of light chain variable region (VL) of Cytotransmab.
9A is a graph showing the cytoplasmic infiltration ability of mutants in which light chain variable region (VL) first amino acid aspartic acid, 95th amino acid methionine substituted with alanine, glutamic acid and leucine, respectively, involved in induction of structural change of Cytotransmab at acidic pH, The result is confirmed.
FIG. 9b shows the results of a comparison between the first amino acid aspartic acid, the 95th amino acid methionine of light chain variable region (VL) involved in inducing a structural change of Cytotransmab at acidic pH, The number of cells obtained was quantitatively compared.
FIG. 10 is a graph showing the quantitative comparison of the number of cells acquiring trypan blue according to pH by mutations in which amino acids that are likely to be involved in endosomal elimination among the amino acids of CDR3 in the light chain variable region (VL) It is a graph.
Figure 11a shows the results of 12% SDS-PAGE analysis under reducing or nonreducing conditions after purification of expected mutations that improved the cytotransmab endosomal export.
Fig. 11B shows the result of observing through the confocal microscope whether cytoplasmic infiltration ability of expected mutation enhancing ability of Cytotransmab endosomal exudation is maintained.
FIG. 12 is a graph showing quantitative comparison of the number of cells acquiring the trypan blue according to the pH by the Cytotransmab wild type and the endosomal enhancing ability expected mutation according to the pH.
FIG. 13A shows the results of observing the migration of cytotransmab wild type or endosomal escape enhancing mutant TMab4-WYW into the cytoplasm using a calcein using a confocal microscope.
FIG. 13B is a bar graph quantifying calcein fluorescence of the confocal microscope photograph of FIG. 12A. FIG.
FIG. 14A is a graph showing the cell membrane binding of a mutant substituted with arginine, isoleucine, and glycine, which are amino acids having opposite properties to tryptophan, using a flow cytometer (FACS).
FIG. 14B is a graph comparing quantitative comparison of the number of cells acquiring trypan blue according to pH by mutation substituted with arginine, isoleucine and glycine, which are amino acids having opposite properties to tryptophan.
FIG. 14C is a graph showing the movement of a mutant substituted with arginine, isoleucine, and glycine, which are amino acids having opposite properties to tryptophan, to the cytoplasm of a cytoplasm using a calcein and a bar graph plotting the calcein fluorescence of a confocal microscope photograph to be.
15A is a schematic diagram illustrating the construction of a Cytotransmab construct having a light chain variable region eliminating endosomal elimination ability and an improved endosomal exporting motif introduced heavy chain variable region.
15B is a graph comparing quantitatively the number of cells acquiring trypan blue depending on the pH by the Cytotransmab having the light chain variable region from which endosomal elimination ability was removed and the heavy chain variable region containing the improved endosomal elimination ability motif.
FIG. 16 is a schematic diagram illustrating a process in which GFP fluorescence is observed by complementary binding of an improved segmented green fluorescent split protein when the cytotransmab is located in the cytoplasm.
Figure 16 shows the results of 12% SDS-PAGE analysis under reducing or nonreducing conditions after purification of GFP11-SBP2 fused cytotransmab.
FIG. 17A shows the result of observing GFP fluorescence through a confocal microscope due to the complementary binding of the improved segmented green fluorescent protein of the GFP11-SBP2-fused cytotransmab wild type and endosomal escape enhancing mutation.
FIG. 17B is a graph quantifying GFP fluorescence in the confocal microscope photograph of FIG. 20A. FIG.
FIG. 18A is a graph showing the cell membrane binding of a mutant substituted with arginine, isoleucine, and glycine, which are amino acids having opposite properties to tryptophan, using a flow cytometer (FACS).
FIG. 19A is a schematic diagram illustrating the construction of an anti-tubulin Cytotransmab in the form of a complete IgG to confirm the activity of endosomal enhancing mutations.
Figure 19b shows the result of 12% SDS-PAGE analysis under reducing or nonreducing conditions after purification of anti-tubulin Cytotransmab in the form of complete IgG.
FIG. 19C shows the result of confocal microscopy to determine whether the anti-tubulin Cytotransmab in the form of a complete IgG overlaps with tubulin, a cytoskeleton located in the cytoplasm.
20A is a schematic diagram illustrating the construction of an anti-RAS iMab in the form of a complete IgG to confirm the activity of an endosomal enhancing mutation.
Figure 20b shows the results of 12% SDS-PAGE analysis under reducing or nonreducing conditions after purification of anti-RAS iMab in the form of complete IgG.
FIG. 20C shows the confluence of a complete IgG-type anti-RAS iMab and an intracellularly activated H-RAS G12V mutation by a confocal microscope.
21A is a schematic diagram illustrating the construction of an anti-RAS iMab in the form of a full IgG containing a monoclonal antibody backbone that provides improved endosomal eliminability.
FIG. 21B shows fluorescence microscopic observation of the HSPG binding capacity and cytoplasmic permeability of the anti-RAS iMab of the complete IgG form including the monoclonal antibody backbone with improved endosomal elimination ability reduced or eliminated.
FIG. 21C is a graph comparing quantitatively the number of cells acquiring the trypan blue according to the pH by the anti-RAS iMab of the complete IgG form including the monoclonal antibody backbone with improved endosomal elimination ability.
22A is a result of performing an ELISA for measuring the affinity of the K-RAS mutant K-RAS G12D in a form in which GTP is bound and GDP is combined.
22B is a schematic diagram illustrating the construction of an anti-RAS iMab in the form of a full IgG comprising a monoclonal antibody backbone with RGD10 peptide fused enhanced endosomal elimination capability.
FIG. 22C shows the confluency of an intracellularly-activated H-RAS G12V mutation with an anti-RAS iMab in the form of a complete IgG including a monoclonal antibody backbone having an improved endosomal elimination ability fused with an RGD10 peptide to be.
23A is a schematic diagram illustrating construction of a cytoplasmic penetration antibody in the form of a complete IgG comprising a light chain variable region having an improved endosomal introduction heavy chain variable region and a monoclonal antibody framework imparting improved endosomal elimination ability.
FIG. 23B shows the migration of the intact cytoplasmic penetration antibody into the cytoplasm of a full IgG form containing a light chain variable region having an improved endosome-introduced motif-introduced heavy chain variable region and a monoclonal antibody framework imparting improved endosomal elimination ability, , And the calcein fluorescence of the confocal microscope photograph is quantified.
FIG. 23C shows the effect of pH of the complete IgG-type cytoplasmic penetration antibody containing the modified endosome-derived motif-introduced heavy chain variable region and the light chain variable region having the monoclonal antibody framework imparted with improved endosomal elimination ability, This is a graph comparing quantitatively the number of cells obtained.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
<< 실시예Example >>
실시예Example 1. One. CytotransmabCytotransmab TMab4TMab4 의 발현 및 정제≪ / RTI >
완전 IgG 형태의 단일클론항체 형태로 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄가변영역(인간화 hT0 VH)과 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4(Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 또한 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 세포질 침투 경쇄가변영역(hT4 VL)과 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.In order to construct a heavy chain expression vector for production in the form of a monoclonal antibody in the form of a complete IgG, a heavy chain variable region (humanized hT0 VH) and a heavy chain constant region (CH1-VH) of the antibody fused with a DNA encoding a secretion signal peptide at the 5 ' hinge-CH2-CH3) was cloned into pcDNA3.4 (Invitrogen) vector, NotI / HindIII, respectively. Further, in order to construct a vector expressing a light chain, a DNA encoding a light chain comprising a cytoplasmic penetration light chain variable region (hT4 VL) and a light chain constant region (CL) fused with a DNA encoding a secretion signal peptide at the 5 ' Cloned into pcDNA3.4 (Invitrogen) vector with NotI / HindIII.
상기 경쇄 및 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제를 수행하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크(Corning)에 200mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2 × 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 150 rpm, 8 % CO2에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 중쇄 125μg, 경쇄 125μg 총 250μg (2.5 μg/ml)으로 희석하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일동안 배양하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행했다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량화하였다.
The light and heavy chain expression vectors were transiently transfected to express and purify the protein. In a shake flask, HEK293-F cells (Invitrogen) growing in suspension in serum-free FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen) were transfected with a mixture of plasmid and Polyethylenimine (PEI) (Polyscience). A 200mL transfection when, HEK293-F cells in shake flasks (Corning) 2 × 10 6 to sowing in 100ml culture medium at a density of cells / ml, were incubated at 150 rpm, 8% CO 2. The appropriate heavy and light chain plasmids were diluted to a total of 250 μg (2.5 μg / ml) with 125 μg heavy chain and 125 μg light chain in 10 ml FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen) to produce each monoclonal antibody and 750 μg PEI (7.5 μg / ml) Mixed with 10 ml of diluted culture medium and reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the reaction mixture was added to the cells inoculated with 100 ml of the previously cultured medium and cultured at 150 rpm and 8% CO 2 for 4 hours. The remaining 100 ml of FreeStyle 293 expression medium was further added for 6 days. The protein was purified from the cell culture supernatant collected with reference to a standard protocol. Antibodies were applied to Protein A Sepharose column (GE healthcare) and washed with PBS (pH 7.4). The antibody was eluted at pH 3.0 with 0.1 M glycine buffer and the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer. The eluted antibody fractions were concentrated by dialysis and the buffer was exchanged with PBS (pH 7.4). Purified protein was quantified using absorbance and extinction coefficient at 280 nm wavelength.
실시예Example 2. 2. CytotransmabCytotransmab TMab4TMab4 의 세포내재화 후 After cell internalization 트래피킹Trafficking 확인 Confirm
24 웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 2.5 x 104개의 HeLa 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 되면, pcDNA3.4-flag-rab11를 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 일시적 트랜스펙션의 효율을 최대화하기 위하여 Opti-MEM media(Gibco)을 사용하였다. 일시적 트랜스펙션할 500 ng의 pcDNA3.4-flag-rab11를 튜브 상에서 Opti-MEM media 50 ㎕, Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 2㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM media 450㎕ 을 넣고 6시간 동안 37도, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 500 ㎕로 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각 웰에 새로운 배지 0.5 ml에 TMab4 3 μM을 37 도에서 30분 처리 후, 빠르게 PBS로 세 번 세척하고 배지를 첨가하여 0시간, 2시간, 6시간 37 도 조건에서 배양하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200mM glycine, 150mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하였다. PBS 세척 후, 4% 파라포름알데히드 첨가 후 25 도 조건으로 10분간 세포를 고정하였다. 이후 PBS로 세척하고, PBS에 0.1% 사포닌, 0.1% 아지드화 나트륨, 1% BSA가 첨가되어있는 완충액으로 25 도, 10분간 배양하여 세포막에 구멍을 형성하는 과정을 거쳤다. 다시 PBS로 세척 후, 비특이적 결합을 억제하기 위해 PBS에 2% BSA가 첨가된 완충액으로 25 도에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, FITC(녹색형광) 또는 TRITC(적색형광)이 결합되어있는 인간 Fc를 특이적으로 인지하는 항체 (Sigma)로 염색하였다. Rab5은 초기 엔도좀의 마커인 rab5을 표지하는 anti-rab5. 리사이클링 엔도좀의 마커인 rab11의 flag-tag을 표지하는 anti-flag 항체들을 25 도에서 1시간 반응시키고, TRITC(적색형광) 또는 FITC(녹색형광)이 연결된 이차 항체를 25도에서 1시간 반응시켰다. 말기 엔도좀과 라이소좀은 세포 고정하기 30분전에, LysoTracker® Red DND-99 1mM을 배양중인 세포에 직접 처리하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TMab4는 TAT과 달리, 2시간까지 초기 엔도좀에 위치한 다음, 라이소좀 또는 리사이클링 엔도좀으로 수송되지 않는다는 것이 확인되었다(도 1).
The cover slip was placed in a 24-well plate, and 2.5 x 10 4 HeLa cells per well were added to 0.5 ml of medium containing 10% FBS and cultured for 12 hours at 5% CO 2 and 37 ° C. Once the cells were stabilized, pcDNA3.4-flag-rab11 was transiently transfected. Opti-MEM media (Gibco) was used to maximize transient transfection efficiency. 500 ng of transiently transfected pcDNA3.4-flag-rab11 were incubated with 2 μl of Opti-MEM media (50 μl) and Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) for 20 min at room temperature and added to each well. In addition, 450 μl of DMEM media without antibiotics was added and cultured at 37 ° C and 5
실시예Example 3. pH에 따른 3. pH dependent CytotransmabCytotransmab TMab4TMab4 의 of 엔도좀Endo 탈출에 의한 항체 유입 확인 Confirmation of antibody entry by excretion
초기 엔도좀의 내부 인지질층과 유사하다고 알려져 있는 Ramos 세포주의 세포막 외부 인지질층을 이용하여 Cytotransmab TMab4의 엔도좀 탈출에 의한 세포질로의 유입을 확인하였다. 24 웰 플레이트에, 커버슬립을 넣고 부유세포인 Ramos를 플레이트에 부착시키기 위해 0.01% poly-L-lysine 용액을 200 ㎕ 넣고 25 도 조건에서 20분 반응시킨다. PBS 로 세척 후, 각 웰 당 5 x 104개의 Ramos 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 37 도 조건에서 30분 배양하였다. 세포 부착을 확인하고 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 PBS 및 형광 시약인 DyLight-488으로 직접 표지한 TMab4 10 μM 및 표지하지 않은 TMab4 10 μM 와 DyLight-488으로 직접 표지한 대조군 항체 adalimumab 2 μM 을 넣어 37 도 조건에서 2시간 배양한 후, 실시예 2와 마찬가지의 방법을 사용하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, pH 5.5 조건에서 DyLight-488으로 직접 표지한 TMab4의 형광이 관찰되었으며, pH 5.5 조건에서 TMab4와 DyLight-488으로 직접 표지한 adalimumab을 처리한 세포에서 녹색 FITC 형광이 관찰됨을 확인하였다. 또한, TMab4가 산성 pH에서 세포막을 통과하여 유입되며, 자기 자신이 아니라 다른 물질 역시 같이 유입시킬 수 있음을 확인하였다(도 2).
The intracytoplasmic layer of the Ramos cell line known to resemble the inner phospholipid layer of early endosomes was used to confirm cytoplasmic entry into the cytoplasm by endosomal escape of Cytotransmab TMab4. In a 24-well plate, 200 μl of a 0.01% poly-L-lysine solution is added to the plate to attach Ramos, a floating cell, to the plate and allowed to react for 20 minutes at 25 ° C. After washing with PBS, 5 × 10 4 Ramos cells per well were added to 0.5 ml of medium containing 10% FBS and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Cell adhesion was confirmed and 200 μl of pH 7.4 buffer (HBSS (Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), pH 5.5 buffer (HBSS (Welgene), 50 mM MES pH 5.5) was directly labeled with PBS and fluorescent reagent DyLight- 10 μM of TMab4, 10 μM of unlabeled TMab4, and 2 μM of control antibody adalimumab directly labeled with DyLight-488 were added and cultured at 37 ° C. for 2 hours. Then, using a confocal microscope using the same method as in Example 2 Respectively. As a result, fluorescence of TMab4 directly labeled with DyLight-488 was observed at pH 5.5, and green FITC fluorescence was observed in cells treated with adalimumab directly labeled with TMab4 and DyLight-488 at pH 5.5. Also, it was confirmed that TMab4 flows through the cell membrane at an acidic pH, and that not only itself but also other substances can be introduced (FIG. 2).
실시예Example 4. pH에 따른 4. pH dependent CytotransmabCytotransmab TMab4TMab4 의 통과에 의한 세포막 형태 확인Identification of cell membrane morphology by passage of
상기 실시예 3과 마찬가지의 방법을 이용하여 pH에 따른 Cytotransmab에 의해 막투과능이 없는 트립판 블루(trypan blue) 확인 실험을 진행하여, 이를 광학현미경으로 관찰하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량화하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄). 그 결과, pH 5.5 조건에서만, TMab4를 첨가한 세포에서 농도에 비례하여 트립판 블루가 획득됨으로써 TMab4가 세포막을 통과하는 경우 천공이 형성됨이 확인되었다(도 3).Using the same method as in Example 3, trypan blue confirmation experiment without membrane permeability was carried out by Cytotransmab according to pH, and the result was observed with an optical microscope, and the number of cells obtained with trypan blue (Representing a mean value by counting more than 400 cells in total). As a result, it was confirmed that the trypan blue was obtained in proportion to the concentration in the TMab4-added cells only in the pH 5.5 condition, so that perforation was formed when the TMab4 passed through the cell membrane (FIG. 3).
상기 TMab4에 의해 형성된 천공이 일시적이며, 가역적인 현상 인지 여부를 확인하기 위하여 상기 세포를 회복시간을 갖도록 한 후, 이를 광학현미경으로 관찰하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량화하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄). 그 결과, pH 5.5 조건에서 TMab4를 첨가한 세포에서 트립판 블루 획득이 관찰되었지만 배지에서 회복시간을 가진 세포의 경우, 트립판 블루 획득이 일어나지 않았다. 이로써, TMab4에 의한 천공 형성은 일시적이며, 가역적인 현상임이 확인되었다(도 4). In order to confirm whether the puncture formed by TMab4 was transient and reversible, the cells were allowed to have recovery time and observed with an optical microscope to quantify the number of cells obtained with trypan blue (total of 400 Number of cells or more). As a result, trypan blue accumulation was observed in TMab4-added cells at pH 5.5, but no recovery of trypan blue was observed in cells with recovery time in the medium. As a result, it was confirmed that the perforation by TMab4 was transient and reversible (Fig. 4).
또한, 상기 TMab4의 막 결합 및 지질막 플립-플랍 기작을 확인하기 위하여, TMab4와 대조군 항체 adalimumab를 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체 및 FITC(녹색형광)이 연결된 Annexin-V와 반응시킨 후, 유세포분석기(FACS)로 분석하였다. 그 결과, pH 5.5 조건에서 TMab4 만 세포막에 결합하였으며(도 5), pH 5.5 조건에서 TMab4 만 Annexin-V가 결합함으로써 세포막 지질 플립-플랍이 일어났음이 확인되었다(도 6). In order to confirm the membrane binding and lipid membrane flip-flop mechanism of TMab4, TMab4 and control antibody adalimumab were incubated with an antibody that specifically recognizes human Fc to which FITC (green fluorescence) is linked and an Annexin-V And analyzed by flow cytometry (FACS). As a result, it was confirmed that only TMab4 was bound to the cell membrane at pH 5.5 (FIG. 5), and membrane lipid flip-flop occurred due to binding of Annexin-V only to TMab4 at pH 5.5 (FIG. 6).
본 실시예를 통해 예상되는 Cytotransmab TMab4의 천공 형성 모델을 도 7에 나타내었다.
The perforation model of Cytotransmab TMab4 expected through this example is shown in Fig.
실시예Example 5. pH 의존적 5. pH dependent CytotransmabCytotransmab TMab4TMab4 의 구조 변화 확인Confirmation of structural change of
(1) pH에 따른 Cytotransmab TMab4의 구조 변화 예측 모델(1) Prediction model of structural change of Cytotransmab TMab4 by pH
상기 실시예 4에 따른 pH에 따른 Cytotransmab의 세포막 통과 여부가 탄포드 트랜지션(Tanford transition)에 의한 pH 의존적인 Cytotransmab의 구조의 변화로 야기된 것인지 여부를 알아보았다. 아스파라긴산(D) 및 글루타민산(E)과 같은 아미노산은 pH가 감소함에 따라 양성자 첨가되어 음전하를 잃고 소수성을 띠게 되며, 소수성을 띠게 된 아스파라긴산(D) 및 글루타민산(E)은 본래 소수성을 띠고 있는 아미노산과의 상호작용이 증가하게 되는데 이러한 현상을 탄포드 트랜지션이라 한다(Qin et al., 1998). Whether the passage of the cytotransmab through the membrane according to the pH according to Example 4 was caused by the change in the pH dependent Cytotransmab structure due to the Tanford transition was examined. Amino acids such as asparaginic acid (D) and glutamic acid (E) are added protonically as the pH decreases, resulting in loss of negative charge and hydrophobicity. Hydrophobic aspartic acid (D) and glutamic acid (E) This phenomenon is referred to as a tan-transition (Qin et al., 1998).
세포질 침투 경쇄가변영역인 hT4 VL 구조를 통해서 탄포드 트랜지션를 나타낼 수 있는 아미노산을 조사한 후, 그 중에서 두 아미노산의 곁사슬 간 거리가 7~8 Å 미만인 N 말단으로부터 1 번째, 95 번째 아미노산 쌍이 탄포드 트랜지션 효과를 나타낼 수 있는 후보로 선정하였다. 상기 95 번째 아미노산은 세포질 침투 경쇄가변영역인 hT4 VL 고유의 서열인 CDR-L3에 존재하는 아미노산이며, 1 번째 아미노산과 상호작용에 의해 CDR-L3 고리 구조의 변화를 유도할 수 있는 가능성을 확인하였다. 상기 Cytotransmab의 경쇄가변영역(VL) 의 WAM 모델링 구조를 기반으로 pH에 따른 Cytotransmab의 구조적 변화를 예측하여 구조적 변화에 관여하는 아미노산 및 구조적 변화에 의해 노출되는 아미노산을 도 8에 나타내었다. The hT4 VL structure, which is a cytoplasmic penetration light chain variable region, was used to investigate amino acids capable of exhibiting a carbon transition, and the first and 95th amino acid pairs from the N-terminus having a side-chain distance of less than 7 ~ As the candidates to represent. The 95th amino acid is an amino acid existing in CDR-L3 which is a unique sequence of hT4 VL which is a cytoplasmic penetration light chain variable region, and it is confirmed that it is possible to induce the change of CDR-L3 ring structure by interaction with the first amino acid . FIG. 8 shows the amino acids that are involved in the structural changes and the amino acids exposed by the structural changes by predicting the structural change of the Cytotransmab according to the pH based on the WAM modeling structure of the light chain variable region (VL) of the Cytotransmab.
(2) 탄포드 트랜지션 효과를 나타내는 아미노산 쌍에 의한 엔도좀 탈출 확인(2) Confirmation of endosomal escape by amino acid pair showing the effect of the tan-pod transition
상기 1 번째 및 95 번째 아미노산 쌍에 의한 pH 의존적 구조 변화 유도 및 그로 인한 엔도좀 탈출 여부를 확인하기 위하여 알라닌(A), 및 상기 아미노산과 유사한 성질을 가지는 글루타민산(E) 또는 류신(L)과 치환한 돌연변이를 하기의 표 1과 같이 구축하였다. (A) and glutamic acid (E) or leucine (L) having properties similar to those of the amino acid are substituted for the first and the 95th amino acid pair to induce the pH-dependent structural change and thereby the endosomal escape. One mutation was constructed as shown in Table 1 below.
[표 1][Table 1]
그 다음, 상기 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제한 후, pH에 따른 세포막 통과에 의한 상기 돌연변이를 갖는 항체의 유입 여부를 트립판 블루 확인 실험을 통해 관찰하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량화하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄). 그 결과, TMab4-D1A 및 TMab4-M95A 돌연변이는 TMab4와 달리 트립판 블루 획득이 거의 일어나지 않았으며, TMab4-D1E 및 TMab4-M95L 돌연변이는 TMab4와 유사한 정도의 트립판 블루 획득이 관찰되었다. 이로써, 엔도좀 탈출에 1 번째 아미노산과 95 번째 아미노산이 중요한 역할을 하고 있음이 확인되었다(도 9). Then, in the same manner as in Example 1, expression and purification were carried out in HEK293F cell line. Then, the presence or absence of the mutated antibody due to passage of the cell membrane through the pH was observed through a trypan blue confirmation experiment, The number of cells obtained was quantitated (averaging over 400 cells total). As a result, the TMab4-D1A and TMab4-M95A mutations showed little trypan blue acquisition unlike TMab4, while the TMab4-D1E and TMab4-M95L mutations showed similar trypan blue acquisitions to TMab4. As a result, it was confirmed that the first amino acid and the 95th amino acid play an important role in endo escape (FIG. 9).
(3) (3) Cytotransmab 의Of Cytotransmab 엔도좀Endo 탈출능에Ability to escape 기여하는 아미노산 및 모티프 탐색 Exploring contributing amino acids and motifs
상기 CDR3 고리 구조의 변화에 따른 엔도좀 탈출을 확인하기 위해 CDR3를 구성하는 아미노산 중 표면으로 노출될 가능성을 보이는 아미노산을 선별하여 이를 각각 알라닌(A) 치환한 하기의 표 2와 같이 구축하고 상기와 동일한 방법을 이용하여 돌연변이를 갖는 항체의 유입을 트립판 블루 확인 실험을 통해 관찰하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량화하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄).In order to confirm the endosomal escape according to the change of the CDR3 loop structure, amino acids showing possibility of being exposed to the surface among the amino acids constituting CDR3 were selected and constructed as shown in Table 2 below in which alanine (A) Using the same method, the influx of the mutant antibody was observed through the trypan blue confirmation experiment and the number of cells that obtained the trypan blue was quantified (a total of 400 or more cells was counted to represent the average value).
[표 2][Table 2]
그 결과, TMab4-Y92A, TMab4-Y93A 및 TMab4-H94A 돌연변이는 TMab4와 비교하여 트립판 블루 획득이 유의적으로 감소하였으며 특히, TMab4-AAA 돌연변이는 트립판 블루 획득이 거의 일어나지 않았다. 반면, TMab4-Y91A 및 TMab4-Y96A은 TMab4와 유사한 정도의 트립판 블루 획득이 관찰되었다. 이로써, 엔도좀 탈출에 92, 93, 및 94 번째 아미노산가 크게 기여하고 있음이 확인되었다(도 10).
As a result, mutations of TMab4-Y92A, TMab4-Y93A, and TMab4-H94A significantly reduced trypan blue acquisition compared to TMab4. In particular, mutations of TMab4-AAA rarely produced trypan blue accumulation. On the other hand, TMab4-Y91A and TMab4-Y96A showed similar trypan blue acquisitions as TMab4. As a result, it was confirmed that amino acids 92, 93, and 94 greatly contribute to endosomal escape (FIG. 10).
실시예Example 6. 6. 엔도좀Endo 탈출능이Ability to escape 향상된 Improved 경쇄가변영역을Light chain variable region 갖는 Have CytotransmabCytotransmab 의 제조Manufacturing
상기 실시예 4를 통해 확인된 92 번째 타이로신(Y), 93 번째 타이로신(Y) 및 94 번째 히스티딘(H) 아미노산에 대한 TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH, TMab4-YWH, TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG 돌연변이를 제작하고, 상기 실시예 4와 마찬가지의 방법을 이용하여 상기 돌연변이를 포함하는 항체의 엔도좀 탈출 여부를 확인하였다. TMAB4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH, TMab4-YWH (TM), and TMab4-YWH for the 92nd tyrosine (Y), 93rd tyrosine (Y) and 94th histidine (H) amino acid confirmed through Example 4, , TMab4-RYR, TMab4-IYI and TMab4-GYG mutants were prepared, and the same method as in Example 4 was used to confirm the endosomal escape of the mutant-containing antibody.
(1) TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH 돌연변이(1) TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH mutants
[표 3][Table 3]
상기 TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 결과, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 가졌으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타났다(도 11a). 이로써, 상기 TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab가 용액 상태에서 단일체 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음이 확인되었다.After the purification of Cytotransmab including TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH mutations, analysis by 12% SDS-PAGE under reducing or nonreducing conditions revealed that Had a molecular weight of 150 kDa and had a molecular weight of the heavy chain of 50 kDa and light chain of 25 kDa under reducing conditions (FIG. 11A). Thus, the Cytotransmab including TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH mutations are present in a single state in solution and do not form duplexes or oligomers through non- .
상기 TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 세포질 침투능을 실시예 2와 마찬가지의 방법을 이용하여 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과, 상기 5가지 돌연변이에서 모두 세포질 침투능이 유지되는 것으로 확인되었다(도 11b).The cytoplasmic permeability of Cytotransmab including TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH mutations was observed through a confocal microscope using the same method as in Example 2, It was confirmed that cytoplasmic permeability was maintained in all the mutants (Fig. 11B).
상기 TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 pH 의존성 엔도좀 탈출능을 확인하기 위하여 실시예 5와 마찬가지의 방법을 이용하여 트립판 블루 확인 실험을 수행하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량화하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄). 그 결과, 5 가지 돌연변이 중 TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH은 트립판 블루 획득 비율이 증가하였으며, 그 중 TMab4-WYW는 pH 의존적인 트립판 블루 획득이 일어남을 확인하였다(도 12). 따라서, 야생형의 세포질 침투능이 유지되면서, pH 의존적 트립판 블루 획득이 증가한 TMab4-WYW를 최종 클론으로 선정하였다.In order to confirm the pH-dependent endosomal elimination ability of Cytotransmab including TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH mutations, Experiments were performed and the number of cells harvested from Trypan blue was quantified (averaging over 400 cells total). As a result, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH increased the trypan blue acquisition ratio among the five mutants, and it was confirmed that TMab4-WYW had a pH-dependent trypan blue acquisition (Fig. 12). Thus, TMab4-WYW with increased pH-dependent trypan blue capture was selected as the final clone, while retaining the cytoplasmic permeability of the wild-type.
또한, 상기 최종 클론으로 선정된 TMab4-WYW의 세포질로의 이동을 실시예 2와 마찬가지의 방법을 이용하여 calcein을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 Image J sofrtware(National Institutes of Health, USA)를 이용하여 정량화하였다(각 조건에서 세포 20개를 각각 지정한 후 얻은 형광의 평균값을 나타냄). 그 결과, 상기 TMab4-WYW는 TMab4 에 비해 더 낮은 농도에서도 강한 강도의 녹색 calcein 형광이 관찰됨을 확인하였다(도 13). The movement of TMab4-WYW selected as the final clone into the cytoplasm was observed with a confocal microscope using a calcein using the same method as in Example 2, and the image was analyzed using Image J software (National Institutes of Health, USA) (Representing the average value of fluorescence obtained after 20 cells were designated in each condition). As a result, it was confirmed that the above-mentioned TMab4-WYW showed strong intensity of green calcein fluorescence even at a lower concentration than that of TMab4 (FIG. 13).
(2) TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG 돌연변이(2) TMab4-RYR, TMab4-IYI and TMab4-GYG mutations
[표 4][Table 4]
상기 TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 세포막 결합이 pH에 따라 발생하는지 여부를 확인하기 위하여 실시예 3과 마찬가지의 방법을 이용하여 수행한 후 유세포분석기(FACS)로 관찰하였다. 그 결과, pH 5.5 조건에서 TMab4만 세포막에 결합한다는 것이 확인되었다(도 14a).To confirm whether cell membrane binding of Cytotransmab including the TMab4-RYR, TMab4-IYI and TMab4-GYG mutations occurred according to pH, the same method as in Example 3 was used and then analyzed by flow cytometry (FACS) Respectively. As a result, it was confirmed that only TMab4 binds to the cell membrane at pH 5.5 (Fig. 14A).
상기 TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 pH 의존성 엔도좀 탈출능을 확인하기 위하여 실시예 5와 마찬가지의 방법을 이용하여 트립판 블루 확인 실험을 수행하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량화하고 TMab4-WYW와 비교하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄). 그 결과, TMab4-WYW에 비해 TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG는 트립판 블루 획득이 감소하는 것으로 확인되었다(도 14b). In order to confirm the pH-dependent endosomal elimination ability of Cytotransmab including TMab4-RYR, TMab4-IYI and TMab4-GYG mutations, a trypan blue confirmation experiment was performed using the same method as in Example 5, The number of cells obtained was quantified and compared to TMab4-WYW (representing a mean of more than 400 cells total). As a result, compared to TMab4-WYW, TMab4-RYR, TMab4-IYI and TMab4-GYG were found to decrease the trypan blue acquisition (Fig. 14B).
또한, 상기 TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 세포질로의 이동을 실시예 2와 마찬가지의 방법을 이용하여 calcein을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 이를 TMab4-WYW와 비교하였다. 그 결과, TMab4-RYR, TMab4-IYI 및 TMab4-GYG를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 calcein 형광의 세기가 TMab4-WYW를 처리한 세포에 비하여 약한 것으로 확인되었다(도 14c). 이로써, 92, 93 및 94 번째 아미노산을 트립토판(W)으로 치환하는 경우 엔도좀 탈출능이 향상될 수 있음이 입증되었다. 상기 TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH 및 TMab4-YWH 돌연변이를 포함하는 Cytotransmab의 아미노산 서열을 서열번호 14 내지 18에 나타내었다.
In addition, the migration of the cytotransmab including the TMab4-RYR, TMab4-IYI, and TMab4-GYG mutations to the cytoplasm was observed using a confocal microscope using calcein using the same method as in Example 2, Respectively. As a result, in the cells treated with TMab4-RYR, TMab4-IYI and TMab4-GYG, the intensity of the green calcein fluorescence scattered in the cytoplasm was weaker than that of the cells treated with TMab4-WYW (FIG. Thus, it has been proved that endosomal escape ability can be improved by substituting tryptophan (W) at amino acids 92, 93 and 94. The amino acid sequences of Cytotransmab including TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH and TMab4-YWH mutations are shown in SEQ ID NOS: 14-18.
실시예Example 7. 7. 엔도좀Endo 탈출능이Ability to escape 향상된 Improved 중쇄가변영역을The heavy chain variable region 갖는 Have CytotransmabCytotransmab 의 제조Manufacturing
(1) 엔도좀 탈출 구조 모티프 영역의 확인(1) Confirmation of the motif area
상기 실시예 5와 마찬가지로 중쇄가변영역의 서열 및 구조를 통해서 탄포드 트랜지션를 나타낼 수 있는 아미노산을 조사하고, N 말단으로부터 1 번째 아미노산 및 CDR3에 위치하는 102 번째 아미노산 쌍이 탄포드 트랜지션 효과를 나타낼 수 있는 후보로 선정한 후, 상기 실시예 6과 마찬가지의 방법을 이용하여 96 번째, 97 번째 및 98 번째 아미노산이 엔도좀 탈출 구조 모티프 영역임을 확인하였다. 한편, 야생형 중쇄가변영역의 CDR3 의 아미노산 개수는 11개이며, 구조 상 표면 쪽으로 고리의 중심부가 많이 노출되어 있어, pH 의존적인 현상의 발생이 용이하도록 CDR3의 아미노산 개수를 7 또는 8개로 실험을 진행하였다. As in the case of Example 5, the amino acid capable of exhibiting the carbon transition was examined through the sequence and structure of the heavy chain variable region, and the first amino acid from the N-terminus and the 102nd amino acid pair located at CDR3 were selected as candidates capable of exhibiting the carbon- And the 96th, 97th and 98th amino acids were confirmed to be the endothermic escape structure motif region using the same method as in Example 6 above. On the other hand, the number of amino acids in CDR3 of the wild type heavy chain variable region is 11, and the center portion of the ring is exposed to the surface of the structure, so that the number of amino acids of CDR3 is 7 or 8 to facilitate the pH- Respectively.
(2) Cytotransmab의 엔도좀 탈출능 확인(2) Confirming endotoxin excretion of Cytotransmab
상기 실시예 6에서 최종 선정한 TMab4-WYW의 중쇄가변영역에서의 엔도좀 탈출능을 확인하기 위하여, 경쇄가변영역에서 엔도좀 탈출 구조 모티프가 제거된 TMab4-AAA를 제조하고, 중쇄가변영역의 96 번째, 97 번째 및 98 번째 아미노산을 WYW로 치환하여 치환하여 Cytotransmab TMab4-HW1-AAA, TMab4-HW2-AAA, TMab4-HW3-AAA및 TMab4-HW4-AAA를 제작하였다(도 15a). In order to confirm the endosomal elimination ability of the TMAB4-WYW selected in Example 6 above, TMab4-AAA in which the endosomal cleavage motif was removed from the light chain variable region was prepared, and the 96th , 97th and 98th amino acids were substituted with WYW to prepare Cytotransmab TMab4-HW1-AAA, TMab4-HW2-AAA, TMab4-HW3-AAA and TMab4-HW4-AAA (FIG.
[표 5][Table 5]
상기 TMab4-HW1-AAA(HT0-HW1 VH), TMab4-HW2-AAA(HT0-HW2 VH), TMab4-HW3-AAA(HT0-HW3 VH), 및 TMab4-HW4-AAA(HT0-HW4 VH)의 세포질 침투능을 트립판 블루 확인 실험을 수행하고 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 (총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값을 나타냄). 그 결과, TMab4-HW1-AAA, TMab4-HW2-AAA, TMab4-HW3-AAA, 및 TMab4-HW4-AAA 돌연변이 모두 pH 5.5에서 트립판 블루 획득이 관찰되었다(도 15b). 따라서, 개선된 엔도좀 탈출 구조 모티프를 중쇄가변영역에 부여하여도 엔도좀 탈출이 가능하며, 최종적으로 세포질 내부에 위치할 수 있음이 입증되었다.
HW1-AAA (HT0-HW1 VH), TMab4-HW2-AAA (HT0-HW2 VH), TMab4-HW1-AAA (HT0-HW3 VH), and TMab4- Cell permeability is determined by the number of cells that have undergone the trippin blue confirmation experiment and acquired trypan blue (representing averages by counting more than 400 cells total). As a result, trypan blue acquisition was observed at pH 5.5 in both TMab4-HW1-AAA, TMab4-HW2-AAA, TMab4-HW3-AAA and TMab4-HW4-AAA mutants (FIG. Thus, it has been proved that endosomal escape is possible even when the improved endosomal structural motif is given to the heavy chain variable region, and finally it can be located inside the cytoplasm.
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실험예Experimental Example 1. One. GFP11GFP11 -- SBP2SBP2 융합된 Fused CytotransmabCytotransmab 의 세포질 위치에 따른 Of the cytoplasm GFPGFP 형광 확인 Fluorescence confirmation
Cytotransmab 이 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도를 도 16에 나타내었다. 구체적으로는, cytotransmab 이 세포질에 위치한다는 것을 직접적으로 확인하기 위해 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적 시스템을 사용하였다. 녹색형광단백질인 GFP를 1-10번, 11번 조각으로 나누게 되면 형광을 띠는 특성이 제거되고, 만약 두 조각의 거리가 가까워져 결합한다면, 형광을 띠는 특성을 회복할 수 있다(Cabantous et al., 2005). 이러한 특성을 이용하여 GFP 1-10번 조각은 세포질에 발현시키고, GFP 11번 조각은 cytotransmab 의 중쇄 C-말단에 융합시켰다. 또한, GFP 단편간의 상보적인 결합을 보완하기 위하여, 높은 친화도를 가지는 스트렙타비딘(Streptavidin) 과 스트렙타비딘-결합 펩타이드 2 (SBP2)를 각각 GFP 단편에 융합하였다. 따라서, GFP 형광이 관찰된다는 것은 cytotransmab 이 세포질에 위치한다는 것을 반증한다.FIG. 16 is a schematic diagram showing a process in which GFP fluorescence due to complementary binding of an improved segmented green fluorescent protein is observed when Cytotransmab is located in the cytoplasm. Specifically, we used a complementary system of improved segmented green fluorescent proteins to directly confirm that the cytotransmab is located in the cytoplasm. If the green fluorescent protein GFP is divided into fragments of 1-10 and 11 fragments, the fluorescent character is removed and if the two fragments are close together, fluorescence can be recovered (Cabantous et al ., 2005). Using these properties, GFP fragments 1-10 were expressed in the cytoplasm and GFP fragment 11 was fused to the heavy chain C-terminus of the cytotransmab. Streptavidin and streptavidin-binding peptide 2 (SBP2) having high affinity were fused to GFP fragments, respectively, in order to complement complementary binding between GFP fragments. Thus, the observation of GFP fluorescence disproves that the cytotransmab is located in the cytoplasm.
(1) GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 의 발현 및 정제(1) Expression and purification of GFP11-SBP2 fused cytotransmab
GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 의 동물세포 발현을 위해 GFP11-SBP2를 중쇄 C-말단에 GGGGS 3개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하였다. 그 다음 상기 세포질 침투 경쇄와 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 경쇄를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 GFP11-SBP2가 융합된 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 의 정제는 상기 실시예 1와 동일하게 진행하고, 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE 결과를 도 17에 나타내었다. GFP11-SBP2 GFP11-SBP2 was fused genetically to the heavy chain C-
그 결과, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 나타내었다. 이는 발현 정제된 GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 이 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.As a result, a molecular weight of about 150 kDa was confirmed under non-reducing conditions, and a molecular weight of a heavy chain of 50 kDa and a light chain of 25 kDa were shown under reducing conditions. This indicates that the purified purified GFP11-SBP2 fused cytotransmab is present as a single entity in solution and does not form a duplex or an oligomer through an unnatural disulfide bond.
(2) GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab의 세포질 위치에 따른 GFP 형광 확인(2) Confirmation of GFP fluorescence by cytoplasmic location of GFP11-SBP2 fused cytotransmab
상기 실시예 2와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, TMab4-GFP11-SBP2, TMab4-WYW-GFP11-SBP2 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.6, 3.2 μM을 37 도에서 6시간 동안 배양하였다. 상기 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하고, 이를 정량화하였다(각 조건에서 세포 20개를 각각 지정한 후 얻은 형광의 평균값을 나타냄). 그 결과, TMab4-WYW는 TMab4 에 비해 더 낮은 농도에서도 강한 강도의 녹색 GFP 형광이 관찰됨을 확인하였다(도 18).When the cells were stabilized, transformed HeLa cell lines stably expressing SA-GFP1-10 were prepared in the same manner as in Example 2. Cells were stained with PBS, TMab4-GFP11-SBP2, TMab4-WYW-GFP11-SBP2 0.2, 0.4, 0.6 , 0.8, 1.6, and 3.2 μM were incubated at 37 ° C for 6 hours. After washing with PBS and weakly acidic solution, cells were immobilized in the same manner as in Example 2. The nuclei were stained (blue fluorescence) using a Hoechst 33342, observed with a confocal microscope, and quantitated (representing the average value of fluorescence obtained after specifying 20 cells in each condition). As a result, it was confirmed that TMab4-WYW showed strong intensity of green GFP fluorescence even at a lower concentration than TMab4 (FIG. 18).
또한, 세포질 내부에 위치하는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab과 엔도좀 탈출능 향상된 cytotransmab 의 세포질 내 농도와 엔도좀 탈출 효율을 비교하여 하기의 표 6에 나타내었다. In addition, the intracellular concentration of endotoxin-enhanced cytotransmab and endotoxin excretion efficiency of cytotransmab of GFP11-SBP2 fused complete IgG form located in cytoplasm are compared with each other in Table 6 below.
[표 6][Table 6]
실험예Experimental Example 2. 완전 2. Complete IgGIgG 형태의 항- Lt; RTI ID = 0.0 & 튜블린Tubulin CytotransmabCytotransmab 의 세포 내부 단백질의 표적 능력 확인Of target proteins in cells
(1) 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab의 제작(1) Construction of anti-tubulin Cytotransmab in complete IgG form
도 19a에 나타낸 모식도와 같이 재조합 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하는 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab를 제작하였다. 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 단일클론항체의 동물세포 발현을 위하여 상기 실시예 1와 같이 5' 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합되며 세포골격인 튜블린에 특이적 결합하는 중쇄가변영역과 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 pcDNA3.4(Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 그 다음, 상기 TMab4-WYW를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 구축된 튜블린에 특이적 결합하는 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 그 다음, 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab 의 정제를 상기 실시예 1와 동일하게 진행하고, 정제 후 환원성 및 비환원성 조건에 12 % SDS-PAGE를 분석하였다. 그 결과, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타났으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다(도 19b). 이로써, 발현 정제된 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab 가 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음이 확인되었다. An anti-tubulin Cytotransmab in the form of a complete IgG containing a recombinant endosomal structural motif was prepared as shown in the schematic diagram shown in Fig. 19A. In order to express an animal cell of an anti-tubulin cytoplasmic penetration monoclonal antibody in a complete IgG form, a DNA encoding a secretion signal peptide is fused at the 5 'end as in Example 1, and a heavy chain that specifically binds to tubulin, The DNA encoding the heavy chain including the variable region and the heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3) was cloned into pcDNA3.4 (Invitrogen) vector as NotI / HindIII. Then, an animal expression vector in which the heavy chain encoding a heavy chain variable region that specifically binds to the constructed animal expression vector coding for TMab4-WYW and the constructed heavy chain variable region was transiently transfected into HEK293F protein expressing cells transfection). Then, purification of the anti-tubulin Cytotransmab in the form of complete IgG was carried out in the same manner as in Example 1, and 12% SDS-PAGE was analyzed on reducing and non-reducing conditions after purification. As a result, it was shown to have a molecular weight of about 150 kDa under non-reducing conditions, and it was confirmed to have a molecular weight of a heavy chain of 50 kDa and a light chain of 25 kDa in a reducing condition (Fig. 19B). As a result, it was confirmed that an anti-tubulin Cytotransmab in the form of a purified purified full IgG was present as a single substance in a solution state and did not form a dendritic cell or an oligomer through an unnatural disulfide bond.
(2) 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab 의 세포골격 튜블린과 특이적 결합 확인(2) Specific binding of the anti-tubulin Cytotransmab in complete IgG form to the cytoskeletal tubulin
완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab과 세포질에 위치한 세포골격인 튜블린과의 중첩 여부를 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 적색형광의 튜블린이 위치하는 세포질 부분에 녹색형광의 TuT4-WYW가 섬유 모양으로 중첩된 반면, TuT4는 중첩되지 않은 것으로 관찰되었다(도 19c). 이로써, 세포내의 세포골격 튜블린과 완전 IgG 형태의 항-튜블린 Cytotransmab가 특이적으로 결합하고 있음이 입증되었다.
Confocal microscopy was used to confirm the overlap between anti-tubulin Cytotransmab in the form of a complete IgG and tubulin in the cytoplasm. As a result, TuT4-WYW of green fluorescence was superimposed in a fibrous shape on the cytoplasmic part where the tubulin of red fluorescence was located, whereas TuT4 was not overlapped (Fig. 19C). This demonstrated that the intracellular cytoskeletal tubulin and the complete IgG form of the anti-tubulin Cytotransmab specifically bind.
실험예Experimental Example 3. 완전 3. Perfect IgGIgG 형태의 항-RAS Form of anti-RAS iMabiMab 의 세포 내부 단백질의 표적 능력 확인Of target proteins in cells
(1) 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 제작(1) Production of anti-RAS iMab in complete IgG form
도 20(a)에 나타낸 모식도와 같이 재조합 엔도좀 탈출 구조 모티프를 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab을 제작하였다. 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 동물세포 발현을 위해 상기 실시예 5와 같이 5' 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합되며 중쇄가변영역 의존적으로 GTP가 결합된 K-RAS에 특이적 결합하는 중쇄가변영역(RT11 VH)과 중쇄불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 이후 상기 TMab4-WYW를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 구축된 GTP가 결합된 K-RAS에 특이적 결합하는 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 그 다음, 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 정제를 상기 실시예 1와 동일하게 진행하고, 정제 후 환원성 및 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 분석하였다. 그 결과, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 갖는 것으로 나타났으나, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다. 이로써, 발현 정제된 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 이 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음이 확인되었다(도 20b). As shown in the schematic diagram shown in Fig. 20 (a), a complete IgG-type anti-RAS iMab containing a recombinant endosomal structural motif was prepared. RAS iMab of the full IgG form was fused with DNA encoding secretion signal peptide at the 5 'end as in Example 5, and specific binding to K-RAS to which GTP was coupled in a heavy chain variable region-dependent manner DNA encoding the heavy chain variable region (RT11 VH) and heavy chain constant region (CH1-hinge-CH2-CH3) was cloned into pcDNA3.4 (Invitrogen) vector, NotI / HindIII. Then, a heavy chain-encoded animal expression vector containing a heavy chain variable region that specifically binds to K-RAS in which the TMab4-WYW-encoding animal expression vector and the constructed GTP-bound K-RAS are specifically bound is transiently transfected into HEK293F protein- Transient transfection. Then, purification of the anti-RAS iMab in the form of complete IgG was carried out in the same manner as in Example 1, and 12% SDS-PAGE was analyzed under reducing and non-reducing conditions after purification. As a result, it was found to have a molecular weight of about 150 kDa under non-reducing conditions, but it was confirmed that under reducing conditions, the molecular weight of the heavy chain was 50 kDa and the light chain was 25 kDa. As a result, it was confirmed that the anti-RAS iMab in the form of fully purified IgG in the form of a purified IgG exists as a single body in a solution state, and does not form a dendritic cell or an oligomer through an unnatural disulfide bond (Fig. 20B).
(2) 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 의 세포내의 GTP가 결합된 K-RAS와 특이적 결합 확인(2) Specific binding of K-RAS to intracellular GTP-bound anti-RAS iMab in complete IgG form
완전 IgG 형태의 항-RAS iMab와 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 적색형광의 활성화된 RAS가 위치하는 세포내막 부분에 녹색형광의 RT11 및 RT11-WYW가 중첩된 반면, TMab4는 중첩되지 않았다(도 20c). 이로써, 세포내의 활성화된 RAS와 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 가 특이적으로 결합하고 있음이 입증되었다.
Confirmation of overlap between anti-RAS iMab in the form of complete IgG and intracellularly activated H-RAS G12V mutation was confirmed using confocal microscopy. As a result, green fluorescence RT11 and RT11-WYW were superimposed on the intracellular part where red fluorescence activated RAS was located, while TMab4 was not overlapped (Fig. 20C). Thus, it was demonstrated that the intracellularly activated RAS and the complete IgG form of anti-RAS iMab specifically bind to each other.
실험예Experimental Example 4. 개선된 4. Improved 엔도좀Endo 탈출 구조 모티프가 이식(grafting)된 단일클론항체의 Of the monoclonal antibody to which the excretory structural motif is grafted 엔도좀Endo 탈출능Escape ability 확인 Confirm
현재 시판되고 있는 단일클론항체 중 세포 표면 수용체, 특히 세포 내제화가 일어나는 세포 표면 수용체를 표적하는 단일클론항체의 종류는 매우 많다. 이러한 항체들은 세포 내제화된 이후, 항원과의 결합이 끊어지지 않고, 엔도좀 탈출능이 없기 때문에 세포질로 이동하지 못하고 다시 세포 밖으로 내뱉어진다. 따라서, 세포 내제화가 일어나는 수용체 표적 항체에 엔도좀 탈출능을 부여할 수 있게 되면 지금보다 더 넓은 범위로 응용이 가능하다는 장점이 있다. Among the currently available monoclonal antibodies, there are many types of monoclonal antibodies that target cell surface receptors, particularly cell surface receptors that undergo intracellular processing. Since these antibodies are not intracellularly bound, they do not lose their binding to the antigen, they do not migrate to the cytoplasm because they do not have endosomal elimination ability, and then they are released from the cells again. Therefore, when endosomal elimination ability can be given to the receptor-target antibody in which intracellular cleavage occurs, it is possible to apply it to a wider range than the present invention.
개선된 엔도좀 탈출능 모티프를 부여하기 위하여, 세포 내제화가 일어나는 수용체 표적 항체의 경쇄가변영역의 서열과 cytotransmab의 경쇄가변영역의 서열를 비교하여, 1번째 아미노산이 음전하를 띠며, CDR3 고리 구조에 영향을 줄 수 있는 골격에 위치하는 주요 아미노산이 동일한 후보 경쇄가변영역 서열을 정리하였다. 후보 경쇄가변영역의 CDR3 를 cytotransmab 의 CDR3로 이식(grafting)하는 돌연변이를 하기의 표 7과 같이 구축하였다. 본 돌연변이를 구축할 때, 개선된 엔도좀 탈출능 모티프에 의하여 감소한 단백질 발현 수율을 높이기 위하여 87 번째 아미노산 타이로신(Tyrosine)을 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 치환하였다. 페닐알라닌은 중쇄가변영역의 골격에 위치하는 아로마틱 고리를 가진 아미노산 및 소수성 아미노산과의 상호작용이 용이하여, 경쇄가변영역과 중쇄가변영역의 인터페이스를 강화할 수 있는 아미노산이다.In order to give improved endosomal motility, we compared the sequence of the light chain variable region of the receptor-target antibody with the sequence of the light chain variable region of the cytotransmab in which the intracellular cleavage occurs and found that the first amino acid is negatively charged and affects the CDR3 loop structure The major amino acid residues in the skeleton are summarized in the same candidate light chain variable region sequence. The mutations that grafted CDR3 of the candidate light chain variable region to the CDR3 of the cytotransmab were constructed as shown in Table 7 below. When constructing this mutation, the 87th amino acid tyrosine was substituted with phenylalanine to increase the protein expression yield decreased by the improved endosomal motility. Phenylalanine is an amino acid capable of enhancing the interface between a light chain variable region and a heavy chain variable region by facilitating interaction with an amino acid having an aromatic ring located in the skeleton of the heavy chain variable region and a hydrophobic amino acid.
[표 7][Table 7]
(1) 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 제작(1) Production of anti-RAS iMab in complete IgG form
개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 구축을 설명한 모식도를 도 21a에 나타내었다. 상기 실시예 1과 동일하게, 경쇄가변영역 클로닝 진행하여 GTP가 결합된 K-RAS에 특이적 결합하는 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 그 다음, 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 정제는 상기 실시예 1와 동일하게 진행하였다.A schematic diagram illustrating the construction of an anti-RAS iMab in the form of a complete IgG containing a monoclonal antibody backbone with improved endosomal eliminability is shown in Figure 21A. In the same manner as in Example 1, heavy-chain-encoded animal expression vectors containing a heavy chain variable region specifically binding to GTP-bound K-RAS undergoing light chain variable region cloning were transiently transfected into HEK293F protein expressing cells (transient transfection). Then, purification of the anti-RAS iMab in the form of complete IgG proceeded as in Example 1 above.
(2) 단일클론항체 골격에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 확인(2) confirmation of the ability to impart improved endosomal motility motifs to the monoclonal antibody backbone
상기 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, RT11-WYW, RT11-Neci, RT11-Nimo, RT11-Pani, RT11-Pert, RT11-Lumr, RT11-Emib 1 μM을 37 도에서 6시간 동안 배양했다. 상기 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다. TMab4는 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 6가지 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab에서 모두 세포 내부에서의 형광이 관찰되지 않았다(도 21b).HeLa cell lines were prepared as described in Example 2, and when cells were stabilized, 1 μM of PBS, RT11-WYW, RT11-Neci, RT11-Nimo, RT11-Pani, RT11- Lt; / RTI > for 6 hours. The cells were washed with PBS and a weakly acidic solution and then subjected to cell fixation, cell perforation, and blocking in the same manner as in Example 2. TMab4 was stained with an antibody that specifically recognizes human Fc to which FITC (green fluorescence) is linked. The nuclei were stained (blue fluorescence) using Hoechst 33342 and observed with a confocal microscope. As a result, no fluorescence was observed in the cells in all of the anti-RAS iMabs of the complete IgG form including the monoclonal antibody backbone with six improved endosomal elimination functions (FIG. 21B).
또한, 상기 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교하였다(총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값으로 나타냄). 그 결과, RT11-Pert 를 제외한 5가지 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 의 경우 RT11-WYW 와 유사한 트립판 블루 획득이 관찰하였다(도 21c).
In addition, the number of cells acquiring trypan blue according to the pH by the anti-RAS iMab of the complete IgG form including the monoclonal antibody backbone with the improved endosomal elimination ability was quantitatively compared (total of 400 or more cells Numbered and expressed as an average value). As a result, a trypan blue acquisition similar to that of RT11-WYW was observed in the case of the complete IgG type anti-RAS iMab containing the monoclonal antibody backbone with five improved endosomal elimination functions except RT11-Pert (Fig. 21c) .
실험예Experimental Example 5. 개선된 5. Improved 엔도좀Endo 탈출능Escape ability 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 Complete with monoclonal antibody backbone IgGIgG 형태의 항-RAS Form of anti-RAS iMab 의iMab's GTPGTP 가 end 결합된Combined K-RAS와 특이적 결합 유지 확인 Confirmation of specific binding with K-RAS
(1) K-RAS 돌연변이체 K-RAS G12D의 GTP가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태에서의 친화도 측정(1) Determination of the affinity of the K-RAS mutant K-RAS G12D in the form in which GTP is combined with GDP
표적분자 K-RAS G12D의 GTP가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태를 96 웰 EIA/RIA 플레이트 (COSTAR Corning)에 1시간동안 37 도에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl) (SIGMA)로 10분간 3회 씻어낸다. 5% PBSS (5% Skim milk, pH7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl) (SIGMA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% PBST로 10분간 3회 씻어낸다. 이후 IgG 형태의 단일클론항체 RT11-WYW, RT11-Neci, RT11-Nimo, RT11-Pani, RT11-Pert, RT11-Lumr, RT11-Emib 를 결합시킨 후 0.1 % PBST로 10분간 3회 씻어낸다. 표지항체로 염소유래 AP가 접합된 항-인간 항체(alkaline phosphatase-conjugated anti-human mAb) (SIGMA)로 결합시킨다. pNPP(p-nitrophenyl palmitate) (Sigma)로 반응시켜 405 nm 흡광도를 정량하였다. K-RAS 돌연변이에 대해서 친화도 분석 결과 RT11-Nimo를 제외한 5가지 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 의 경우 RT11-WYW 와 친화도 차이를 보였고, 음성 대조군으로 사용된 GDP가 결합된 K-RAS들에는 모든 클론이 결합하지 않았다(도 22a)The GTP-bound form of the target molecule, K-RAS G12D, and the form bound to GDP were bound to 96-well EIA / RIA plates (COSTAR Corning) for 1 hour at 37 ° C and then washed with 0.1
(2) RGD10 펩타이드 융합한 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab의 제작(2) Production of full IgG type anti-RAS iMab containing monoclonal antibody backbone with RGD10 peptide fused improved endosomal elimination ability
개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab은 세포 침투능이 제거되었기 때문에 세포 침투가 가능하도록 신생혈관세포 및 다양한 종양에서 과발현되는 인테그린(Integrin αvβ3)에 특이성을 갖는 RGD10 펩타이드를 경쇄 N-말단에 GGGGS 2 개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하였다. RGD10 펩타이드의 경우, RGD4C 펩타이드와 유사한 친화도를 가지고 있지만 두 개의 시스테인에 의한 하나의 이황화결합만 존재하며, 유전공학적 융합이 가능하다는 특징이 있다. 또한, 발현 수율, 엔도좀 탈출능, Ras에 대한 친화도 분석 실험 결과를 기반으로, 우수한 후보 항체인 RT11-Pani, RT11-Neci 의 경쇄가변영역의 N-말단에 RGD10 펩타이드를 융합하였다(도 22b). The anti-RAS iMab in the form of a complete IgG containing a monoclonal antibody backbone with improved endothelial capacity has been shown to have specificity for integrin overexpressed in neovascular cells and various tumors Were genetically fused with two GGGGS linkers at the N-terminus of the light chain. In the case of the RGD10 peptide, it has an affinity similar to that of the RGD4C peptide, but only one disulfide bond is formed by two cysteines and is characterized by the possibility of genetic engineering fusion. On the basis of the expression yield, endosomal elimination ability and affinity analysis test for Ras, the RGD10 peptide was fused to the N-terminus of the light chain variable region of RT11-Pani and RT11-Neci, which are excellent candidate antibodies (Fig. 22B ).
그 다음, 24 웰 플레이트에 SW480 세포주를 각각 웰 당 2x104개를 0.5ml에 희석하여 12시간, 37도, 5% CO2 조건에서 배양한 후, RT11-i-WYW, RT11-i-Neci, RT11-i-Pani 1 μM을 처리하여 37 도, 12시간 배양하였다. 이후 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 항체와 핵을 표지하고, Ras 표지 항체를 1 시간, 37도 조건에서 반응 후, 이차 항체로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 적색형광의 활성화된 RAS가 위치하는 세포내막 부분에 녹색형광의 RT11-i-WYW, RT11-i-Neci, RT11-i-Pani 가 중첩하였다. 상기 실험 결과로 세포내의 활성화된 RAS와 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 항-RAS iMab 가 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다(도 22c).
Then, the SW480 cell line was diluted to 0.5 ml with 2x104 cells per well and cultured in a 24-well plate for 12 hours at 37 ° C in 5% CO2. RT11-i-WYW, RT11-i-Neci, RT11- i-Pani was treated with 1 μM and cultured at 37 ° C for 12 hours. Then, the antibody and the nucleus were labeled under the same conditions as in Example 2, and the Ras labeled antibody was stained with a secondary antibody after the reaction at 1 hour and 37 degrees, and observed with a confocal microscope. As a result, RT11-i-WYW, RT11-i-Neci and RT11-i-Pani of green fluorescence were superimposed on the intracellular part where the activated RAS of red fluorescence was located. As a result of the above experiment, it was confirmed that the anti-RAS iMab of the full IgG form including the monoclonal antibody backbone with the activated RAS in the cell and the improved endosomal elimination ability binds specifically (FIG. 22C).
실험예 6. 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능 향상 확인. EXPERIMENTAL EXAMPLE 6 Improved endo- escape motif introduction The heavy chain variable region and the improved endo Given the ability to escape make monoclonal antibodies endosomes escape performance improvement of the full IgG form of the cellular penetration antibody comprising a light chain variable region having the skeleton.
(1) 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 제작(1) Fabrication of complete IgG type cytoplasmic penetration antibody
개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도를 도 23a에 나타내었다. 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄와 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection) 하였다. 이후 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.FIG. 23A is a schematic diagram illustrating the construction of a complete IgG-type cytoplasmic penetration antibody including a light chain variable region having an improved endo-excretory motif-introduced variable region and a monoclonal antibody framework imparting improved endosomal elimination ability. Using the same method as in Example 1, a light chain containing the heavy chain comprising the improved endosomal exporting heavy chain variable region and the light chain variable region having the monoclonal antibody framework imparting improved endosomal elimination ability Expression vectors were simultaneously transiently transfected into HEK293F protein expressing cells. Thereafter, purification of the cytoplasmic penetration antibody in the form of complete IgG proceeded as in Example 1.
(2) 엔도좀 탈출능 확인(2) Confirmation of endo escape ability
개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량화하였다. 그 결과, TMab4-HW1-ep41를 각 농도별로 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 TMab4-ep41를 처리한 세포에 비하여 세기가 강하였다(도 23b).Introduction of the improved endogenous exocytotic motif The migration of the cytoplasmic infiltrating antibody of the full IgG form containing the light chain variable region and the light chain variable region having the monoclonal antibody backbone imparted with improved endosomal elimination ability to the cytoplasm was investigated by using calcein Focus microscopy was used to quantify the calcein fluorescence of the confocal microscope photographs. As a result, in the cells treated with each concentration of TMab4-HW1-ep41, green calcein fluorescence scattered in the cytoplasm was stronger than that of TMab4-ep41 treated cells (Fig. 23B).
개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교하였다. 그 결과, TMab4-HW1-ep41 의 경우, TMab4-ep41에 대비하여 농도 의존적으로 트립판 블루 획득이 증가하였음을 관찰하였다(도 23c).Improved endotoxin-induced motif introduction Complete-IgG-type cytoplasmic infiltration antibody containing a light chain variable region and a light chain variable region having a monoclonal antibody backbone giving improved endosomal elimination ability Were quantitatively compared. As a result, in the case of TMab4-HW1-ep41, it was observed that the trypan blue acquisition was increased in a concentration-dependent manner compared to TMab4-ep41 (FIG. 23C).
따라서, 엔도좀 탈출 모티프를 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역에 각각 도입하였을 때, 경쇄 가변영역에만 엔도좀 탈출 모티프가 존재하는 경우에 비하여 엔도좀 탈출능이 향상되었다.
Therefore, when the endosomal escape motif was introduced into the heavy chain variable region and the light chain variable region, the endosomal escape ability was improved compared to the case where the endosomal escape motif was present only in the light chain variable region.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> METHOD FOR INDUCING CONFORMATIONAL CHANGES IN THE COMPLEMENTARITY DETERMINING REGIONS OF ANTIBODY <130> 2016-PP-30932 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> VL CDR3 <400> 1 Gln Gln Tyr Trp Trp His Met Tyr Thr 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> VL CDR3 <400> 2 Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> VL CDR3 <400> 3 Gln Gln Tyr Tyr Trp Trp Met Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> VL CDR3 <400> 4 Gln Gln Tyr Trp Tyr His Met Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> VL CDR3 <400> 5 Gln Gln Tyr Tyr Trp His Met Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> VH CDR3 <400> 6 Gly Trp Tyr Trp Met Asp Leu 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> VH CDR3 <400> 7 Gly Trp Tyr Trp Phe Asp Leu 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> VH CDR3 <400> 8 Gly Trp Tyr Trp Gly Phe Asp Leu 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> VH CDR3 <400> 9 Tyr Trp Tyr Trp Met Asp Leu 1 5 <210> 10 <211> 17 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Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Trp His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> HT0-HW1 VH <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Trp Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> HT0-HW2 VH <400> 20 Glu Val 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Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Trp Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 116 <212> PRT <213> HT0-HW4 VH <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Trp Tyr Trp Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Neci-WYW VL <400> 23 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Pani-WYW VL <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 25 <211> 114 <212> PRT <213> Lumr-WYW VL <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser 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Trp Tyr Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
Claims (8)
상기 a1 과 an 의 상호 작용에 의하여 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDRs)의 구조적 변화(conformational change)를 유도하는 구조 변환 유도부.
(단, 상기 아미노산 위치는 카바트(Kabat) 번호에 따름)
A first amino acid (a1) and an nth amino acid (an, n being 80 or more and less than 140) from the N-terminus of the light chain variable region, the heavy chain variable region or the light chain variable region and the heavy chain variable region,
A structural transformation induction unit inducing a conformational change of complementarity determining regions (CDRs) by interaction of a1 and an.
(Provided that the amino acid position is according to the Kabat number)
상기 CDRs의 구조적 변화는 상기 a1 과 an 사이의 거리의 변화에 의해 유도되는 것인, 구조 변환 유도부.
The method according to claim 1,
Wherein the structural change of the CDRs is induced by a change in the distance between a1 and an.
a1 과 an 사이의 거리의 변화는 수소이온농도에 따른 두 잔기간의 상호작용 유도에 따른 결과로, 산성 이온 농도에서의 a1과 an의 거리(d1)와 중성 이온 농도에서의 a1과 an의 거리(d2)의 비인 d1/d2의 값은 0 초과 1 미만인 것인, 구조 변환 유도부.
3. The method of claim 2,
The change in the distance between a1 and an is the result of induction of interaction between two periods depending on the hydrogen ion concentration. The distance between a1 and an in an acid ion concentration (d1) and the distance between a1 and an in neutral ion concentration and the value of d1 / d2, which is the ratio of (d2), is greater than 0 and less than 1.
상기 d1/d2의 값이 1 미만인 경우, an과 인접한 CDR3의 구조적 변화(conformational change)를 유도하는 구조 변환 유도부.
The method of claim 3,
And a conformational change induction unit that induces a conformational change of an adjacent CDR3 when the value of d1 / d2 is less than 1.
상기 d1/d2의 값이 1 미만인 경우, an과 인접한 CDR3의 구조적 변화에 의해 항체가 세포내로 내재한 후에 엔도좀 막(endosomal membrane)에 가역적으로 천공을 형성하는 것인, 구조 변환 유도부.
5. The method of claim 4,
Wherein when the value of d1 / d2 is less than 1, structural change of CDR3 adjacent to an is reversibly perforated on an endosomal membrane after the antibody is intracellularly introduced.
상기 d1/d2의 값이 1 미만인 경우, an과 인접한 CDR3의 구조적 변화에 의해 수소이온농도에 따른 항체의 항원과의 결합 능에 차이를 주는 것인, 구조 변환 유도부
5. The method of claim 4,
Wherein when the value of d1 / d2 is less than 1, structural change of CDR3 adjacent to an makes a difference in the binding ability of the antibody to the antigen according to the hydrogen ion concentration,
상기 a1은 Aspartate(D) 또는 Glutamate(E)이고, 상기 an은 Methionine(M), Leucine(L) 또는 Isoleucine(I)인 것을 특징으로 하는 것인, 구조 변환 유도부.
The method of claim 3,
Wherein the a1 is Aspartate (D) or Glutamate (E), and the an is Methionine (M), Leucine (L) or Isoleucine (I).
상기 an은 경쇄가변영역은 a95이고,
중쇄가변영역은 a102인 것을 특징으로 하는 것인, 구조 변환 유도부.
8. The method of claim 7,
Wherein the an is the light chain variable region is a95,
And the heavy chain variable region is a102.
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