KR20170120991A - Biomaterial for medical use comprising sulfated-hyaluronic acid - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 황화된 히알루론산을 포함하는 의료용 생체 소재에 관한 것이다.
The present invention relates to a medical biomaterial including sulfated hyaluronic acid.
히알루론산(HA) 또는 히알루로난(hyaluronan)은 비황화 글리코사미노글리칸으로서, D-글루쿠론산(GlcUA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)이 반복된 서열로 결합되어 있는 천연 다당류이다. 상기 히알루론산은 동물의 안구 유리체, 연골, 활액, 태반 및 피부 등 여러 부위에 존재하며, 점액성 다당류의 형태이다.Hyaluronic acid (HA) or hyaluronan is a non-sulfated glycosaminoglycan which is a natural non-sulfated glycosaminoglycan in which D-glucuronic acid (GlcUA) and N- acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) It is a polysaccharide. The hyaluronic acid exists in various parts such as vitreous humor, cartilage, synovial fluid, placenta and skin of an animal and is in the form of a mucous polysaccharide.
히알루론산은 세포외 기질이 수분을 흡수하거나 세포 간의 유연성을 부여하는데 관여하고, 세포의 신호전달, 상처 치유, 형태 형성에 관여한다. 특히, 히알루론산은 대식세포의 식세포 작용을 억제하여 항염증 활성을 나타낸다. 그러나, 고분자 히알루론산이 분해된 저분자성 히알루론산 분해 산물은 대식세포의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라, 상처 치유에 관여하는 콜라겐 및 섬유화를 증가시킨다(Girish K. S. et al., Life Sci ., 2007 May 1;80(21):1921-43).Hyaluronic acid is involved in the extracellular matrix that is responsible for absorbing moisture or imparting intercellular flexibility and signaling, wound healing, and morphogenesis of cells. In particular, hyaluronic acid inhibits phagocytic action of macrophages and exhibits anti-inflammatory activity. However, low-molecular-weight hyaluronic acid degradation products in which polymer hyaluronic acid is degraded not only promote the inflammatory response of macrophages, but also increase the collagen and fibrosis involved in wound healing (Girish KS et al. , Life Sci . , 2007 May 1: 80 (21): 1921-43).
이러한 활성 때문에 히알루론산은 관절염 치료제, 상처 치유, 눈 및 중이 수술의 보조제로서 사용되고 있다. 또한, 히알루론산이 생체 적합성이 우수하여 조직공학 및 재생의학에서 그 활용이 점차 증가하고 있다. 그에 따라, 최근에는 천연 히알루론산보다 용해도가 우수하고, 항원성이 없으며 생체 내에서 효소에 의해 분해되는 시간이 연장된 다양한 히알루론산 유도체가 연구되고 있다.
Because of this activity, hyaluronic acid has been used as an adjuvant in the treatment of arthritis, wound healing, and eye and middle ear surgery. In addition, hyaluronic acid is excellent in biocompatibility and its application in tissue engineering and regenerative medicine is increasing. Accordingly, recently, various hyaluronic acid derivatives having superior solubility than natural hyaluronic acid, having no antigenicity, and prolonging the time of decomposition by enzymes in vivo have been studied.
한편, 히알루론산은 동물조직, 세균 또는 미생물 효소를 이용한 시험관 내 합성을 통해 생산된다. 산업적으로는 닭 볏 또는 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 미생물로부터 히알루론산을 생산하였다. 과거에는 히알루론산을 닭 볏에서 추출하는 방법이 주로 사용되었으나, 생산수율이 낮고 불순물이 많아 정제에 있어 비용 및 시간이 오래 걸리는 단점이 있었다. 현재에는 미생물 배양을 통해 히알루론산을 생산하는데, 이는 비용이 적게 들고 생산 수율이 높은 장점이 있다.
On the other hand, hyaluronic acid is produced through in vitro synthesis using animal tissues, bacteria or microbial enzymes. Industrially produced hyaluronic acid from chicken crest or Streptococcus genus microorganisms. In the past, a method of extracting hyaluronic acid from chicken crests has been mainly used, but it has a disadvantage in that it takes a long time and cost in purification because of low production yield and a large amount of impurities. Currently, hyaluronic acid is produced through cultivation of microorganisms, which is advantageous in terms of low cost and high production yield.
본 발명의 목적은 황화된 히알루론산을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a medical biomaterial including sulfated hyaluronic acid.
또한, 본 발명의 다른 목적은 황화된 히알루론산을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory diseases comprising sulfated hyaluronic acid.
또한, 본 발명의 다른 목적은 황화된 히알루론산을 포함하는 염증성 질환 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving inflammatory diseases, which comprises sulfated hyaluronic acid.
나아가, 본 발명의 다른 목적은 황화된 히알루론산의 제조방법을 제공하는 것이다.
Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for producing sulfated hyaluronic acid.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황화된 히알루론산을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a medical material for medical use comprising sulfated hyaluronic acid.
또한, 본 발명은 황화된 히알루론산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory diseases containing sulfated hyaluronic acid as an active ingredient.
또한, 본 발명은 황화된 히알루론산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for the treatment of inflammatory diseases containing sulfated hyaluronic acid as an active ingredient.
또한, 본 발명은 미생물로부터 히알루론산을 분리하는 단계; 황화합물이 포함된 용액을 제조하는 단계; 상기 용액에 분리된 히알루론산을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물에 황을 함유하는 유기용매를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 황화된 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
Further, the present invention provides a method for producing a microorganism, comprising: separating hyaluronic acid from a microorganism; Preparing a solution containing sulfur compounds; Adding the separated hyaluronic acid to the solution to prepare a mixture; And a step of reacting the mixture with an organic solvent containing sulfur and reacting the sulfurized hyaluronic acid.
본 발명의 황화된 히알루론산은 세포독성이 없고, 조직 내로 주입하였을 때, 염증반응 및 항원항체반응을 감소시키며, 천연 히알루론산보다 가용성이 높아 이물질로 작용하지 않는다. 또한, 상기 황화된 히알루론산은 염증관련 인자 및 염증성 사이토카인의 활성을 억제한다. 따라서, 상기 황화된 히알루론산은 조직공학 및 재생 의학용 소재뿐만 아니라, 항염증용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
The sulfated hyaluronic acid of the present invention has no cytotoxicity, and when injected into tissues, it reduces the inflammatory reaction and the antigen-antibody reaction, and does not act as a foreign substance because it is more soluble than natural hyaluronic acid. In addition, the sulfated hyaluronic acid inhibits the activity of inflammation-related factors and inflammatory cytokines. Therefore, the sulfated hyaluronic acid can be used not only as a material for tissue engineering and regenerative medicine but also as a composition for anti-inflammation.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 정제된 수용성 히알루론산(HA-WS), 비수용성 히알루론산(HA-WI) 및 황화된 히알루론산(S-HA)의 구조를 FT-IR 분광광도계로 분석한 그래프이다.
도 2는 HA-WS, HA-WI 및 S-HA를 정제하는 단계를 순차적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 HA, HA-WS 및 S-HA의 구조를 NMR 분광광도계로 분석한 그래프이다.
도 4는 HA-WS, HA-WI 및 S-HA가 세포독성을 나타내는지 확인하기 위한 MTT 분석 결과 그래프이다.
도 5는 HA-WS, HA-WI 및 S-HA가 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 증가한 일산화질소(NO)를 억제하는지 확인하기 위한 ELISA 결과 그래프이다.
도 6은 HA-WS, HA-WI 및 S-HA가 LPS에 의해 증가한 TNF-α를 억제하는지 확인하기 위한 ELISA 결과 그래프이다.
도 7은 HA-WS, HA-WI 및 S-HA가 LPS에 의해 증가한 IL-6를 억제하는지 확인하기 위한 ELISA 결과 그래프이다.
도 8은 HA-WS, HA-WI 및 S-HA가 LPS에 의해 증가한 유도형 일산화질소 합성효소(iNOS) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 mRNA 발현 수준을 억제하는지 확인한 실시간 PCR 결과 그래프이다.Figure 1 illustrates the structure of purified water-soluble hyaluronic acid (HA-WS), water-insoluble hyaluronic acid (HA-WI) and sulfated hyaluronic acid (S-HA) in one embodiment of the present invention by FT-IR spectrophotometer It is a graph.
FIG. 2 is a flowchart sequentially showing the steps of purifying HA-WS, HA-WI and S-HA.
FIG. 3 is a graph showing the structures of HA, HA-WS, and S-HA by an NMR spectrophotometer.
FIG. 4 is a graph of MTT analysis results for confirming whether HA-WS, HA-WI and S-HA show cytotoxicity.
Figure 5 is a graph of ELISA results to confirm that HA-WS, HA-WI and S-HA inhibit nitrogen monoxide (NO) increased by lipopolysaccharide (LPS).
6 is an ELISA result graph for confirming whether HA-WS, HA-WI, and S-HA suppress TNF-? Increased by LPS.
FIG. 7 is an ELISA result graph for confirming whether HA-WS, HA-WI, and S-HA inhibit IL-6 increased by LPS.
FIG. 8 is a graph showing real-time PCR results confirming that HA-WS, HA-WI and S-HA inhibit the levels of mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and COX-2 (cyclooxygenase-2) .
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 황화된 히알루론산을 포함하는 의료용 생체 소재를 제공한다.The present invention provides a medical material for medical use comprising sulfated hyaluronic acid.
상기 황화된 히알루론산은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:The sulfated hyaluronic acid may be a compound represented by the following Formula 1:
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명의 황화된 히알루론산은 비수용성 히알루론산으로부터 제조될 수 있다. 상기 황화된 히알루론산은 당 잔기에 황산염기(sulfate group)가 결합된 것일 수 있다. 또한, 상기 황화된 히알루론산은 메틸기가 황산염기로 치환된 것일 수 있다.The sulfated hyaluronic acid of the present invention can be prepared from water-insoluble hyaluronic acid. The sulfated hyaluronic acid may have a sulfate group bound to the sugar residue. The sulfated hyaluronic acid may be one in which the methyl group is substituted with a sulfate group.
본 발명의 히알루론산은 동물조직, 세균 또는 미생물 효소를 이용한 시험관 내 합성이나, 화학적 합성으로 제조될 수 있다. 상기 시험관 내 합성은 닭 볏 또는 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 미생물을 사용하는 방법일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 의하면 스트렙토코커스 디스갈락티아 균주로부터 수득할 수 있다.The hyaluronic acid of the present invention can be produced by in vitro synthesis using an animal tissue, a bacterium or a microbial enzyme, or by chemical synthesis. The in vitro synthesis may be a method using a chicken crest or a microorganism belonging to the genus Streptococcus , and may be obtained from a Streptococcus dysgalactia strain according to an embodiment of the present invention.
본 발명의 황화된 히알루론산은 공지된 조직공학 및 재생 의학용 생체 소재로 사용될 수 있다.The sulfated hyaluronic acid of the present invention can be used as a known biomaterial for tissue engineering and regenerative medicine.
본 명세서에 사용된 용어 "생체 소재"란, 질병을 진단 또는 치료하는데 사용되는 의료용 재로의 일종으로, 의약품을 제외한 합성, 천연 또는 그들의 복합체 형태로 일정기간 인체의 조직 또는 기관을 대신하여 그 기능의 일부 또는 전부를 대체할 수 있는 소재를 의미한다.As used herein, the term "biomaterial" is a type of medical material used to diagnose or treat a disease, and includes, in the form of synthetic, natural, or complexes thereof excluding medicines, Means a material that can replace some or all of it.
상기 생체 소재의 예로는 필러, 코팅제, 점안액, 슬관절 주사제 및 유착방지제 등이 있다.Examples of the biomaterial include fillers, coating agents, eye drops, injections for knee joints, and anti-adhesion agents.
상기 용어 "필러"는 피부조직의 특정 부위에 삽입되어 연부조직(sofe tissue)을 확장시킴으로써 주름개선이나 윤곽고정 등에 사용되는 물질을 의미한다.The term "filler" refers to a material that is inserted into a specific area of skin tissue to expand soapy tissue and thereby used for wrinkle correction or contour fixation.
상기 용어 "코팅제"는 임플란트, 나사, 골 대체물 등의 의료용 이식물이 체내에 삽입되었을 때, 이로 인한 면역, 염증반응을 일으키지 않고 안정적으로 위치할 수 있도록 생체 친화성을 증진시키는 물질을 의미한다.
The term "coating agent" refers to a substance that improves biocompatibility so that when a medical implant such as an implant, a screw, or a bone substitute is inserted into the body, the implant is stably positioned without causing an immune or inflammatory reaction.
또한, 본 발명은 황화된 히알루론산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory diseases containing sulfated hyaluronic acid as an active ingredient.
상기 황화된 히알루론산은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.The sulfated hyaluronic acid may be a compound represented by the general formula (1).
상기 염증성 질환은 퇴행성 관절염, 다발성 경화증, 패혈증, 쇼크, 기관지염, 피부염, 알러지, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The inflammatory disease may be selected from the group consisting of degenerative arthritis, multiple sclerosis, sepsis, shock, bronchitis, dermatitis, allergy, retinitis, gastritis, hepatitis, enteritis, pancreatitis and nephritis.
본 발명의 약학 조성물은, 본 발명의 조성물에 염증성 질환 치료 효과가 있음이 공지된 물질을 하나 이상 추가로 함유할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more substances known to have an effect of treating inflammatory diseases in the composition of the present invention.
또한, 본 발명의 조성물에는 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제가 추가로 함유될 수 있다.In addition, the composition of the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives.
본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 특히 포유동물에 투여된 후 유효성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 상기 제형에 따라 본 발명의 조성물은 개체에 적절하게 투여될 수 있다. 상기 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있고, 그 예로는 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 코안, 경막외 및 구강경로 등이 포함될 수 있다.The composition of the present invention can be formulated according to a conventional method. And may be formulated employing methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient, especially after administration to a mammal. According to the formulation, the composition of the present invention can be administered to an individual as appropriate. Such administration may be oral or parenteral administration, and examples thereof include intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, and oral routes and the like.
경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 알약, 연질 또는 경질 캅셀제, 환제, 산제 또는 과립제일 수 있다. 한편, 비경구 투여를 위한 형태는 크림, 로션제, 연고제, 경고제, 액제, 패취제 또는 주사제 등이 포함될 수 있다.Solid form preparations for oral administration may be tablets, pills, soft or hard capsules, pills, powders or granules. On the other hand, forms for parenteral administration may include creams, lotions, ointments, alerts, solutions, patches or injections.
본 발명의 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 투여될 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 1일 수회일 수 있다.
The composition of the present invention can be suitably administered by a person skilled in the art according to the age, sex, weight, degree of pathology and administration route of the patient. The administration may be once a day or several times a day.
또한, 본 발명은 황화된 히알루론산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 개선용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for the treatment of inflammatory diseases containing sulfated hyaluronic acid as an active ingredient.
상기 황화된 히알루론산은 상기와 같은 특징을 갖는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.The sulfated hyaluronic acid may be a compound represented by the above formula (1) having the above characteristics.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 황화된 히알루론산을 포함할 수 있으며, 염증성 질환 개선 효과가 있음이 공지된 물질을 추가로 함유할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may contain sulfated hyaluronic acid having the above-mentioned characteristics, and may further contain substances known to have an inflammatory disease-improving effect.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제조될 수 있다. 상기 화장료 제형의 예로는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 파운데이션 및 스프레이 등이 포함될 수 있다. 상기 제형은, 제형에 따라 화장품 제제에 포함될 수 있는 적절한 담체 성분을 포함할 수 있다.The cosmetic composition may be prepared into cosmetic formulations conventionally produced in the art. Examples of the cosmetic formulations may include solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, oils, foundations and sprays. The formulations may contain suitable carrier ingredients which may be included in the cosmetic preparations according to the formulation.
본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 보조제라면 사용에 제한이 없다.
The cosmetic composition of the present invention may further comprise, in addition to the carrier component, an adjuvant selected from the group consisting of an antioxidant, a stabilizer, a solubilizer, a moisturizer, a pigment, a perfume, a sunscreen, a colorant, a surfactant and a combination thereof. The adjuvant is not limited as long as it is an adjuvant commonly used in the production of a cosmetic composition.
또한, 본 발명은 1) 미생물로부터 히알루론산을 분리하는 단계; 2) 황화합물이 포함된 용액을 제조하는 단계; 3) 상기 용액에 분리된 히알루론산을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 4) 상기 혼합물에 황을 함유하는 유기용매를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 황화된 히알루론산의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a microorganism, comprising: 1) separating hyaluronic acid from a microorganism; 2) preparing a solution containing sulfur compounds; 3) adding the separated hyaluronic acid to the solution to prepare a mixture; And 4) adding an organic solvent containing sulfur to the mixture and reacting the sulfurized hyaluronic acid.
상기 미생물은 스트렙토코커스 속일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 의하면 스트렙토코커스 디스갈락티아(Streptococcus dysgalactiae)일 수 있다.The microorganism may be a Streptococcus sp., And according to one embodiment of the present invention, Streptococcus dysgalactiae .
상기 히알루론산은 상기와 같은 특징을 갖는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.The hyaluronic acid may be a compound represented by the above formula (1) having the above-mentioned characteristics.
상기 황화합물은 황을 포함하는 화합물이면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 황화합물은 다이메틸설폭시화물일 수 있다. 상기 황화합물은 우레아를 녹인 용액에 첨가하여 반응에 사용될 수 있다.The sulfur compound can be used without limitation as long as it is a compound containing sulfur. Specifically, the sulfur compound may be dimethyl sulfoxide. The sulfur compound may be added to a solution in which urea is dissolved to be used for the reaction.
상기 단계 3)의 히알루론산은 1 내지 10 중량%, 2 내지 8 중량% 또는 3 내지 5 중량%로 첨가될 수 있다.The hyaluronic acid in step 3) may be added in an amount of 1 to 10 wt%, 2 to 8 wt%, or 3 to 5 wt%.
상기 황을 함유하는 유기용매는 황산일 수 있다. 상기 황을 함유하는 유기용매는 다이메틸설폭시화물과 혼합하여 사용될 수 있고, 황을 함유하는 유기용매 및 다이메틸설폭시화물의 혼합비율은 1:5 내지 1:20, 1:7 내지 1:15 또는 1:9 내지 1:12일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 황을 함유하는 유기용매 및 다이메틸설폭시화물의 혼합비율은 1:10일 수 있다.The sulfur-containing organic solvent may be sulfuric acid. The sulfur-containing organic solvent may be used in admixture with dimethyl sulfoxide and the mixing ratio of sulfur-containing organic solvent and dimethyl sulfoxide may be 1: 5 to 1:20, 1: 7 to 1: 15 or 1: 9 to 1: 12. According to one embodiment of the present invention, the mixing ratio of the sulfur-containing organic solvent and dimethyl sulfoxide may be 1:10.
상기 단계 4)에서 황을 함유하는 유기용매 및 혼합물은 부피비로 0.1:1 내지 10:1, 0.5:1 내지 5:1 또는 0.8:1 내지 3:1로 혼합될 수 있다.The sulfur-containing organic solvent and the mixture in the step 4) may be mixed in a volume ratio of 0.1: 1 to 10: 1, 0.5: 1 to 5: 1 or 0.8: 1 to 3: 1.
본 발명의 황화된 히알루론산의 제조방법은 투석 단계를 더 포함할 수 있다.
The method of producing sulfated hyaluronic acid of the present invention may further comprise a dialysis step.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, but the present invention is not limited thereto.
실시예Example 1. 수용성 히알루론산의 분리 정제 1. Separation and purification of water-soluble hyaluronic acid
수용성 히알루론산을 분리하기 위하여 스트렙토코커스 디스갈락티아(Streptococcus dysgalactiae, KCTC11818BP, KCTC, 한국) 균주를 뇌심장침출액(brain heart infusion, BHI, Difco, 미국) 배지에 접종하여 2x107 cells/㎖이 될 때까지 배양하여 준비하였다. 준비된 균주를 BHI 배지에 접종하고, 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 배양된 균주를 8,000x g로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득한 상층액에 트리클로로아세트산(TCA)를 최종 농도가 4.0%(v/v)가 되도록 첨가한 후, 여기에 99% 에탄올을 최종 농도가 70%(v/v)가 되도록 첨가하고 4℃에서 하루 동안 냉침하였다. 냉침한 혼합물을 다시 9,600x g로 10분 동안 원심분리하여 침전된 조히알루론산(crude HA)을 수득하였다. 조히알루론산에 300 ㎖의 1M NaOH를 첨가하고, 초음파분쇄기를 사용하여 용해시켰다. 용해된 조히알루론산을 25 ㎖의 멸균수에 희석하고, 투석막(분획분자량: 10,000 Da)에 넣어 흐르는 물에서 5일 동안 투석시켜 저분자 물질을 제거하였다. 최종적으로 수득한 수용성 히알루론산(HA-WS)을 동결건조하여 보관하였다.
To isolate water-soluble hyaluronic acid, Streptococcus dysgalactiae (KCTC11818BP, KCTC, Korea) was inoculated into the brain heart infusion (BHI, Difco, USA) medium to obtain 2 x 10 7 cells / . The prepared strains were inoculated into BHI medium and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 . The cultured strain was centrifuged at 8,000 x g for 10 minutes to obtain a supernatant. Trichloroacetic acid (TCA) was added to the obtained supernatant to a final concentration of 4.0% (v / v), 99% ethanol was added thereto to a final concentration of 70% (v / v) For a day. The cold mixture was centrifuged again at 9,600 x g for 10 minutes to obtain precipitated crude hyaluronic acid (crude HA). 300 ml of 1 M NaOH was added to the crude hyaluronic acid and dissolved using an ultrasonic mill. The dissolved crude hyaluronic acid was diluted in 25 ml of sterilized water and dialysed for 5 days in running water by placing it in a dialysis membrane (cut-off molecular weight: 10,000 Da) to remove low-molecular substances. The finally obtained water-soluble hyaluronic acid (HA-WS) was stored by freeze drying.
실시예Example 2. 비수용성 히알루론산의 분리 정제 2. Separation and purification of non-aqueous hyaluronic acid
비수용성 히알루론산을 분리하기 위하여 실시예 1과 동일한 방법으로 스트렙토코커스 디스갈락티아 균주를 배양하였다. 배양된 균주를 8,000x g로 10동안 원심분리하여 펠렛(pellet)을 수득하였다. 수득한 펠렛에 300 ㎖의 1M NaOH를 첨가하고, 95℃에서 2시간 이상 반응시킨 후, 이를 상온에서 냉각시켰다. 그 후 15분 동안 볼텍싱한 뒤, 이를 2,500x g로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득한 상층액의 부피에 3배의 95% 에탄올을 첨가하고, 4℃에서 하루 동안 반응시키고 2,500x, 4℃의 조건에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 20 ㎖의 멸균 증류수를 첨가하고, 투석막(분획분자량: 10,000 Da)에 넣어 흐르는 물에서 5일 동안 투석시켜 저분자 물질을 제거하였다. 최종적으로 수득한 비수용성 히알루론산(HA-WI)을 동결건조하여 보관하였다.
To isolate the water-insoluble hyaluronic acid, Streptococcus dysgalactia strain was cultured in the same manner as in Example 1. The cultured strain was centrifuged at 8,000 x g for 10 to obtain a pellet. 300 ml of 1M NaOH was added to the obtained pellet, and reacted at 95 캜 for 2 hours or longer, and then cooled at room temperature. Thereafter, after vortexing for 15 minutes, it was centrifuged at 2,500 x g for 20 minutes to obtain supernatant. Three
실시예Example 3. 황화된 히알루론산의 분리 정제 3. Isolation and purification of sulfated hyaluronic acid
실시예 2에서 제조된 HA-WI를 사용하여 다음과 같은 방법으로 황화된 히알루론산(S-HA)을 합성 및 분리 정제 하였다.Sulfated hyaluronic acid (S-HA) was synthesized and separated and purified using HA-WI prepared in Example 2 as follows.
먼저, 3.6 g의 우레아(8 M)를 10 ㎖의 다이메틸설폭시화물(Me2SO)에 녹여 Me2SO-우레아 용액을 제조하였다. 또한, 5 ㎖의 Me2SO 및 500 ㎕의 H2SO4를 반응시켜 Me2SO4 용액을 제조하였다. 5 ㎖의 Me2SO-우레아 용액에 0.2 g의 HA-WI를 첨가하고, 여기에 8 ㎖의 Me2SO4 용액을 첨가한 뒤, 항온수조를 사용하여 100 ℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응물을 상온에서 냉각시키고, 여기에 200 ㎖의 3 차 증류수를 첨가하고, 투석막(분획분자량: 10,000 Da)에 넣어 흐르는 물에서 5일 동안 투석시켜 저분자 물질을 제거하였다. 최종적으로 수득된 황화된 히알루론산(HA-WI)은 동결건조하여 보관하였다.First, 3.6 g of urea (8 M) was dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO) to prepare a Me 2 SO-urea solution. In addition, Me 2 SO 4 solution was prepared by reacting 5 mL of Me 2 SO and 500 μL of H 2 SO 4 . To 5 ml of Me 2 SO-urea solution, 0.2 g of HA-WI was added, and 8 ml of Me 2 SO 4 solution was added thereto, followed by reaction at 100 ° C for 4 hours using a constant temperature water bath. After completion of the reaction, the reaction product was cooled at room temperature, 200 ml of tertiary distilled water was added thereto, and the low molecular weight material was removed by dialyzing for 5 days in flowing water in a dialysis membrane (fractional molecular weight: 10,000 Da). The finally obtained sulfated hyaluronic acid (HA-WI) was stored by lyophilization.
그 결과, 0.32 g의 HA-WI로부터 0.288 g의 S-HA를 수득하였고, 하기 수학식 1을 사용하여 계산한 결과, 수득된 S-HA의 수율이 90%였다.As a result, 0.288 g of S-HA was obtained from 0.32 g of HA-WI, and the yield of the obtained S-HA was calculated to be 90% using the following equation (1).
실시예Example
4. 히알루론산의 구조 분석 4. Structural analysis of hyaluronic acid
4-1. FT-IR을 사용한 구조 분석4-1. Structural analysis using FT-IR
분자간 화학적 결합 상태를 진동을 통해 동정하는 FT-IR(fourier transform infrared spectroscopy) 분석을 통해, 상기 실시예 1 내지 3에서 분리 정제한 HA-WS, HA-WI 및 S-HA의 구조를 분석하였다.The structures of HA-WS, HA-WI and S-HA isolated and purified in the above Examples 1 to 3 were analyzed through Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) analysis in which the intermolecular chemical bonding state was identified through vibration.
구체적으로, 수득된 HA-WS, HA-WI 및 S-HA를 FT-IR 분광광도계(FTIR-4100, PerkinElmer, 영국)를 이용하여 공지된 방법으로 350 내지 4,500 ㎝-1에서 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다. 이때, 표준물질로서 히알루론산(HA, 일동제약(주), 중앙연구소, 한국)을 사용하였다.Specifically, the obtained HA-WS, HA-WI and S-HA were measured at 350-4,500 cm -1 by a known method using an FT-IR spectrophotometer (FTIR-4100, PerkinElmer, UK) Are shown in Table 1 and Fig. At this time, hyaluronic acid (HA, Ildong Pharmaceutical Co., Ltd., Central Research Laboratory, Korea) was used as a standard substance.
표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, S-HA의 FT-IR 양상은 HA, HA-WS 및 HA-WI와 유사한 패턴을 나타내었다. HA와 S-HA의 구조적 차이는 당 잔기에 황산염기(sulfate group)의 결합 여부이며, FT-IR 결과 S-HA에는 황산염기가 결합되어 있음을 확인하였다.As shown in Table 1 and Fig. 1, the FT-IR pattern of S-HA showed a pattern similar to that of HA, HA-WS and HA-WI. The structural difference between HA and S-HA indicates that sulfate groups are bound to sugar residues, and that S-HA is bound to sulfate groups by FT-IR.
구체적으로, 모든 히알루론산에서는 공통적으로 C-O-C 스트레칭, C-O, C=O 기(group), 아미드 II 기(amid II group) 및 OH 스트레칭 피크가 확인되었으며, S-HA에서는 S-O-C 기의 피크가 확인되었다. 또한, 모든 히알루론산은 전형적인 당고리 결합구조를 갖고 있었다.
Specifically, COC stretching, CO, C = O group, amide II group and OH stretching peak were confirmed in all hyaluronic acids, and SOC group peaks were confirmed in S-HA. In addition, all hyaluronic acid had a typical ring-and-groove bonding structure.
4-2. NMR 구조 분석4-2. NMR structure analysis
히알루론산의 형태 및 구조적 특성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1 내지 3에서 분리 정제한 HA-WS, HA-WI 및 S-HA를 NMR 분석하였다.HA-WS, HA-WI and S-HA isolated and purified in the above Examples 1 to 3 were analyzed by NMR to confirm the morphology and structural properties of hyaluronic acid.
구체적으로, 수득된 HA-WS, HA-WI 및 S-HA를 400 ㎒ 분광광도계(Bruker, AM-200, 독일)를 이용하여 공지된 방법으로 1H/13C-NMR 스펙트럼을 분석하였다. 이때, 용매로는 100 ㎎의 HA를 1 ㎖의 D2O에 용해시킨 용액을 사용하였다. 그 결과, HA, HA-WS 및 S-HA의 1H/13C NMR 스펙트럼 결과를 도 3에 나타내었다.Specifically, we analyzed the 1 H / 13 C-NMR spectrum of the resulting HA-WS, WI-HA and HA-S by a known method using a 400 ㎒ spectrophotometer (Bruker, AM-200, Germany). At this time, as a solvent, a solution in which 100 mg of HA was dissolved in 1 ml of D 2 O was used. As a result, the results of 1 H / 13 C NMR spectra of HA, HA-WS and S-HA are shown in Fig.
도 3에 나타난 바와 같이, HA 및 HA-SW와 비교하여 S-HA의 특정 피크 위치가 이동한 것으로 황화가 이루어졌음을 알 수 있었다. 구체적으로, 1H NMR 스펙트럼에서 2.0 ppm에 위치하는 피크가 1.4 ppm의 위치로 이동하였다. 이로부터 HA의 메틸기가 황산염기로 치환되었음을 확인하였고, 이는 종래의 연구결과와 유사하였다.
As shown in FIG. 3, it was found that sulfation occurred as the specific peak position of S-HA shifted compared to HA and HA-SW. Specifically, the peak located at 2.0 ppm shifted to a position of 1.4 ppm in the 1 H NMR spectrum. From this, it was confirmed that the methyl group of HA was replaced with a sulfate group, which was similar to the results of the conventional studies.
시험예Test Example 1. S-HA의 세포독성 확인 1. Cytotoxicity of S-HA
상기 실시예 1 내지 3에서 분리 정제한 HA-WS, HA-WI 및 S-HA, 및 HA가 세포독성을 나타내는지 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다.MTT analysis was performed to confirm that the HA-WS, HA-WI, and S-HA separated and purified in Examples 1 to 3 and HA showed cytotoxicity.
먼저, RAW 264.7 세포(한국세포주은행, 한국)를 10% 소태아혈청, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 첨가된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Medium, Life Technologies, 미국) 배지로 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 웰 당 2x105 cells/㎖이 되도록 96-웰 플레이트에 분주하고 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상등액을 제거하고, 12.5, 50 또는 200 ㎍/㎖ 농도가 되도록 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 플레이트에 첨가하여 동일한 조건에서 24시간을 더 배양하였다. 이때, 대조군으로서 생리식염수를 사용하였다. 배양 후, 100 ㎕의 상등액을 제거하고, 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 10 ㎕ 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 상등액을 제거하고 100 ㎕의 DMSO를 첨가한 뒤, ELISA 플리이트 리더기(Epoch, BioTek Instruments Inc., 미국)를 이용하여 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 대조군의 세포 분화율을 기준으로 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA의 세포 분화율을 계산하여 도 4에 나타내었다.First, RAW 264.7 cells (Korean Cell Line Bank, Korea) were inoculated in DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium, Life Technologies, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 μg / ml streptomycin and 100 U / , And 5% CO 2 . Prepared cells were plated in 96-well plates at 2xlO < 5 > cells / ml per well and cultured for 24 hours under the same conditions. The supernatant was then removed and HA, HA-WS, HA-WI or S-HA were added to the plates to a concentration of 12.5, 50 or 200 ug / ml and further incubated for 24 hours under the same conditions. At this time, physiological saline was used as a control group. After the incubation, 100 μl of the supernatant was removed, 10 μl of the MTT solution of 5 mg / ml was added, and the reaction was allowed to proceed at 37 ° C and 5% CO 2 for 4 hours. After the reaction, the supernatant was removed, and 100 μl of DMSO was added. Then, the absorbance was measured at 540 nm wavelength using an ELISA flit reader (Epoch, BioTek Instruments Inc., USA). As a result, cell differentiation ratios of HA, HA-WS, HA-WI, or S-HA were calculated based on the cell differentiation rate of the control group and shown in FIG.
도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 첨가한 군은 세포독성 없이 정상적으로 증식하였다.
As shown in Fig. 4, HA, HA-WS, HA-WI, or S-HA added groups did not show cytotoxicity as compared with the control group.
시험예Test Example 2. S-HA에 의한 일산화질소의 억제 효과 확인 2. Identification of inhibitory effect of nitrogen monoxide by S-HA
S-HA의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 일산화질소를 억제하는 효과를 확인하였다.In order to confirm the anti-inflammatory effect of S-HA, the effect of inhibiting nitrogen monoxide was confirmed.
먼저, 상기 시험예 1과 동일한 조건 및 방법으로 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 제거하고, 1 ㎍/㎖의 LPS와 200 ㎕의 배지에 12.5, 50 또는 200 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석한 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 상기 세포에 첨가하였다. 이때, 대조군으로서 1 ㎍/㎖의 리포폴리사카라이드(LPS)만을 처리한 음성 대조군 및 무처리 대조군을 사용하였다. 24시간 배양 후, 100 ㎕의 배양액을 새로운 96-웰 플레이트에 넣고, 100 ㎕의 그리스 시약(griess reagent)[1%의 설파닐아미드(sulphanilamide) 및 0.1%의 나프틸-에틸렌디아민(naphthyl-ethylenediamine)을 포함하는 5%(v/v) 인산용액]을 첨가하고 10분 동안 실온에서 반응시킨 뒤, ELISA 플리이트 리더기를 이용하여 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준물질로서 질산나트륨(NaNO2)을 농도별로 희석하여, NO 농도에 대한 표준 검량선으로 사용하였다.First, RAW 264.7 cells were divided into 96-well plates under the same conditions and the same manner as in Test Example 1, and cultured for 24 hours. HA, HA-WS, HA-WI or S-HA diluted to a concentration of 12.5, 50 or 200 / / ml in a medium of 1 ㎍ / Lt; / RTI > At this time, as a control group, a negative control group treated with only 1 쨉 g / ml of lipopolysaccharide (LPS) and an untreated control group were used. After culturing for 24 hours, 100 占 퐇 of the culture solution was put into a new 96-well plate and 100 占 퐇 of griess reagent [1% of sulphanilamide and 0.1% of naphthyl-ethylenediamine ) Was added and reacted at room temperature for 10 minutes. Then, the absorbance was measured at 540 nm wavelength using an ELISA flit reader. At this time, sodium nitrate (NaNO 2 ) was diluted by concentration as a standard substance and used as a standard calibration curve for NO concentration.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 LPS 처리에 의해 증가한 NO의 양이 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 첨가하여 억제되는 것을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the amount of NO increased by the LPS treatment was suppressed by adding HA, HA-WS, HA-WI or S-HA as shown in FIG.
시험예Test Example 3. S-HA에 의한 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과 확인 3. Inhibitory effect of S-HA on the expression of inflammatory cytokines
인체에서 염증 반응에 관여하는 인자로는, NO 및 PGE2와 같은 염증 매개성 물질 이외에도, TNF-α 및 IL-6 등과 같은 염증성 사이토카인이 있다. 상기 염증성 사이토카인은 NO를 생성하는 매개 물질로써 국소 염증을 발생시켜 T 세포의 활성화, B 세포성숙 및 자연살해세포의 활성화 등에 관여한다. 이에, S-HA가 이들의 발현에 관여하는지 여부를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.In addition to inflammatory mediators such as NO and PGE 2 , inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-6 are involved in the inflammatory response in the human body. The inflammatory cytokine is a mediator of NO production, which causes local inflammation to activate T cells, B cell maturation, and activation of natural killer cells. Thus, ELISA was performed to confirm whether S-HA was involved in their expression.
구체적으로, 상기 시험예 1과 동일한 조건 및 방법으로 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고, 4시간 동안 배양하여 세포를 플레이트에 부착시켰다. 배양된 세포의 상등액을 제거하고, 1 ㎍/㎖의 LPS와 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 상기 세포에 첨가하여 이를 24시간 동안 배양한 뒤, 상등액을 수득하여 염증성 사이토카인을 측정하였다. 이때, TNF-α의 발현량을 측정하기 위해 200 ㎕의 배지에 각 시료를 10, 100 또는 1,000 ㎍/㎖ 농도가 되도록 준비하였고, IL-6의 발현량 측정을 위해서는 각 시료가 12.5, 50 또는 200 ㎍/㎖ 농도가 되도록 준비하였다. TNF-α 및 IL-6의 측정은 ELISA 키트(Minneapolis, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 이때, 대조군으로서 1 ㎍/㎖의 LPS만을 처리한 음성 대조군 및 무처리 대조군을 사용하였다. 그 결과, TNF-α 및 IL-6의 생성량을 각각 도 6 및 7에 나타내었다.Specifically, RAW 264.7 cells were divided into 96-well plates under the same conditions and the same manner as in Test Example 1, and cultured for 4 hours to attach the cells to the plates. The supernatant of the cultured cells was removed and 1 μg / ml of LPS and HA, HA-WS, HA-WI or S-HA were added to the cells and cultured for 24 hours. Then, supernatant was obtained to obtain an inflammatory cytokine Were measured. In order to measure the expression level of TNF-α, each sample was prepared to a concentration of 10, 100 or 1,000 μg / ml in 200 μl of medium. For the measurement of the expression level of IL-6, 200 占 퐂 / ml. Measurement of TNF-a and IL-6 was performed according to the manufacturer's protocol using an ELISA kit (Minneapolis, USA). At this time, as a control group, a negative control group treated with only 1 μg / ml of LPS and an untreated control group were used. As a result, the amounts of TNF-α and IL-6 produced are shown in FIGS. 6 and 7, respectively.
도 6에 나타난 바와 같이, TNF-α의 생성은 LPS에 의해 2,584 pg/㎖까지 증가하였으나, HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 처리하였을 때 150 pg/㎖ 이하로 감소하였다. 특히, S-HA를 10, 100 또는 1,000 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 각각 60.64, 73.31 또는 80.64 pg/㎖로 감소하였다. 이는 HA와 비교하여 각각 54.13%, 49.97% 또는 45.59% 감소한 것이고, HA-WI와 비교하여 28.86%, 18.72% 또는 14.69% 감소한 것이다.As shown in FIG. 6, the production of TNF-α was increased to 2,584 pg / ml by LPS, but decreased to 150 pg / ml when HA, HA-WS, HA-WI or S-HA was treated. In particular, treatment with S-HA at a concentration of 10, 100, or 1,000 占 퐂 / ml resulted in reduction to 60.64, 73.31, or 80.64 pg / ml, respectively. This is 54.13%, 49.97% or 45.59% reduction compared to HA and 28.86%, 18.72% or 14.69% reduction compared to HA-WI, respectively.
한편, 도 7에 나타난 바와 같이, IL-6의 생성은 S-HA를 12.5, 50 또는 200 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였을 때, 각각 62.20, 69.18 또는 90.69 pg/㎖로 감소하였다. 이는 HA와 비교하여 각각 52.02%, 49.92% 또는 40.88% 감소한 것이고, HA-WI와 비교하여 각각 9.51%, 7.88% 또는 11.02% 감소한 것이다.7, the production of IL-6 decreased to 62.20, 69.18, or 90.69 pg / ml, respectively, when S-HA was added at a concentration of 12.5, 50 or 200 占 퐂 / ml. This was 52.02%, 49.92%, or 40.88% reduction compared to HA and 9.51%, 7.88% or 11.02%, respectively, as compared to HA-WI.
상기로부터 S-HA는 RAW 264.7 대식세포에서 염증성 사이토카인의 발현을 HA 또는 HA-WI보다 유의적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
From the above, it was found that S-HA significantly inhibited the expression of inflammatory cytokines in RAW 264.7 macrophages than HA or HA-WI.
시험예Test Example 4. S-HA에 의한 4. By S-HA iNOSiNOS 및 COX-2 And COX-2 mRNAmRNA 의 발현 억제 효과 확인Confirming the inhibitory effect of
일반적으로, 염증 반응이 시작되면 유도형 일산화질소 합성효소(iNOS)에 의해 일산화질소 합성효소(NOS)가 발현되고, 상기 NOS는 L-아르기닌을 L-시트룰린(L-citrullin)으로 전환시켜 NO를 생성하면서 염증 반응을 촉진시킨다. 한편, COX-2(cyclooxygenase-2)는 PGE2의 형성을 촉진시킨다. 이에, S-HA에 의한 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현량 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.Generally, when an inflammatory reaction is initiated, NOS is expressed by an inducible nitric oxide synthase (iNOS), which transforms L-arginine into L-citrullin to produce NO It promotes the inflammatory reaction while generating. On the other hand, COX-2 (cyclooxygenase-2) promotes the formation of PGE 2 . Thus, changes in gene expression levels of iNOS and COX-2 by S-HA were confirmed by the following method.
먼저, 상기 시험예 1과 동일한 조건 및 방법으로 RAW 264.7 세포를 100 ㎜ 배양 디쉬에 분주하고, 4시간 동안 배양하여 세포를 플레이트에 부착시켰다. 배양된 세포의 상등액을 제거하고, 1 ㎍/㎖의 LPS와 10 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석한 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 상기 세포에 각각 첨가하였다. 이때, 대조군으로서 1 ㎍/㎖의 LPS만을 처리한 음성 대조군 및 무처리 대조군을 사용하였다. 이를 24시간 동안 배양한 뒤, 세포를 모아 RNeasy MiniKit(Qiagen, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 RNA nano kit(2100 Bioanalyser system, Agilent technologies, 미국)를 사용하여 정량한 뒤, 전체 RNA가 500 ng/㎕의 농도가 되도록 RNase-free water로 희석하였다. iScript™ Selectc DNA synthesis kit(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 사용하여, 상기 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하여 -70℃에서 보관하였다.First, RAW 264.7 cells were placed in a 100 mm culture dish under the same conditions and in the same manner as in Test Example 1, and cultured for 4 hours to attach the cells to the plate. The supernatants of the cultured cells were removed and HA, HA-WS, HA-WI or S-HA diluted to a concentration of 1 / / ml of LPS and 10 / / ml were added to the cells, respectively. At this time, as a control group, a negative control group treated with only 1 μg / ml of LPS and an untreated control group were used. After culturing for 24 hours, the cells were collected and total RNA was isolated according to the manufacturer's protocol using RNeasy MiniKit (Qiagen, USA). The isolated RNA was quantitated using an RNA nano kit (2100 Bioanalyser system, Agilent Technologies, USA) and diluted with RNase-free water to a total RNA concentration of 500 ng / μl. cDNA was synthesized from the isolated RNA using iScript ™ Selectc DNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, USA) and stored at -70 ° C.
상기 합성된 cDNA를 사용하여 iNOS 및 COX-2의 발현량을 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 각각의 유전자에 대한 1 ㎕의 정방향 프라이머 및 1 ㎕의 역방향 프라이머, 2 ㎕의 cDNA, 및 16 ㎕의 SsoFast™ EvaGreen® Supermix with low ROX(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 혼합하여 PCT을 수행하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다. PCT은 95℃에서 3분, 95℃에서 10초, 55℃에서 10초, 72℃에서 30초간 반응시키는 사이클을 40회 반복하였다. 이때, 추출된 RNA를 분석한 결과는 표 3에, GAPDH 유전자를 내부 대조군으로 보정하였을 때 결과는 도 8에 각각 나타내었다.Real-time PCR was performed to confirm the expression levels of iNOS and COX-2 using the synthesized cDNA. Specifically, the PCT by mixing each 1 ㎕ of a forward primer and a reverse primer of 1 ㎕ for the gene, the 2 ㎕ cDNA, and 16 ㎕ of SsoFast ™ EvaGreen ® Supermix with low ROX (Bio-Rad Laboratories, USA) Respectively. The sequences of the primers used are shown in Table 2 below. The cycle of reacting PCT at 95 캜 for 3 minutes, at 95 캜 for 10 seconds, at 55 캜 for 10 seconds, and at 72 캜 for 30 seconds was repeated 40 times. The extracted RNA was analyzed in Table 3, and the GAPDH gene was corrected in the internal control. The results are shown in FIG.
(ng/㎖)RNA concentration
(ng / ml)
(28s/18s)rRNA ratio
(28s / 18s)
(RNA integrity number)RIN
(RNA integrity number)
표 3에 나타난 바와 같이, 추출된 모든 RNA는 RNA 비율(28s/18s) 값이 1.7 이상, RIN 값이 8.0 이상으로 확인되었다. 한편, 도 8에 나타난 바와 같이, 히알루론산을 처리한 경우에 LPS에 의해 증가된 iNOS 및 COX-2의 발현량이 현저히 감소하였다. 구체적으로, LPS에 의해 iNOS 및 COX-2의 발현량은 각각 19.3 및 7.11까지 증가하였으나, 여기에 HA, HA-WS, HA-WI 또는 S-HA를 처리하였을 때, 상기 iNOS 및 COX-2의 발현량이 각각 4.5 및 2.6 이하로 감소하였다.As shown in Table 3, all extracted RNAs were confirmed to have RNA ratio (28s / 18s) value of 1.7 or more and RIN value of 8.0 or more. On the other hand, as shown in FIG. 8, when hyaluronic acid was treated, the expression levels of iNOS and COX-2 increased by LPS were significantly decreased. Specifically, the expression levels of iNOS and COX-2 by LPS were increased to 19.3 and 7.11, respectively. However, when HA, HA-WS, HA-WI or S- And expression levels were reduced to 4.5 and 2.6, respectively.
따라서, 상기로부터 히알루론산이 항원성 물질로서 염증반응에 관여하지 않음을 알 수 있었다.Therefore, it can be seen from the above that hyaluronic acid is not involved in the inflammatory reaction as an antigenic substance.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> BIOMATERIAL FOR MEDICAL USE COMPRISING SULFATED-HYALURONIC ACID <130> FPD/201604-0019 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 cgtgccgcct ggagaaacc 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 tgctgttgaa gtcgcaggag ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 3 tggaggttct ggatgagagc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 4 aatgtccagg aagtaggtga gg 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 5 gccgactaaa tcaagcaaca gtaac 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer <400> 6 catttctagg acaatgggca taaagc 26 <110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> BIOMATERIAL FOR MEDICAL USE COMPRISING SULFATED-HYALURONIC ACID <130> FPD / 201604-0019 <160> 6 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 cgtgccgcct ggagaaacc 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 tgctgttgaa gtcgcaggag ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 3 tggaggttct ggatgagagc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 4 aatgtccagg aagtaggtga gg 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 5 gccgactaaa tcaagcaaca gtaac 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer <400> 6 catttctagg acaatgggca taaagc 26
Claims (13)
A medical biomaterial comprising sulphated hyaluronic acid.
[화학식 1]
.
2. The method of claim 1, wherein the sulfated hyaluronic acid has the structure of Formula 1:
[Chemical Formula 1]
.
The biomaterial according to claim 1, wherein the biomaterial is a filler, a coating agent, an eye drop, a knee joint injection agent, or an anti-adhesion agent.
A pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory diseases containing sulfated hyaluronic acid as an active ingredient.
5. The composition of claim 4, wherein said inflammatory disease is selected from the group consisting of degenerative arthritis, multiple sclerosis, sepsis, shock, bronchitis, dermatitis, allergy, retinitis, gastritis, hepatitis, enteritis, pancreatitis and nephritis.
A cosmetic composition for the treatment of inflammatory diseases containing sulfated hyaluronic acid as an active ingredient.
2) 황화합물이 포함된 용액을 제조하는 단계;
3) 상기 용액에 분리된 히알루론산을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
4) 상기 혼합물에 황을 함유하는 유기용매를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 황화된 히알루론산의 제조방법.
1) separating hyaluronic acid from the microorganism;
2) preparing a solution containing sulfur compounds;
3) adding the separated hyaluronic acid to the solution to prepare a mixture; And
4) adding an organic solvent containing sulfur to the mixture and reacting the resultant mixture to prepare a sulfated hyaluronic acid.
8. The method according to claim 7, wherein the hyaluronic acid is a water-insoluble hyaluronic acid.
8. The method according to claim 7, wherein the microorganism is Streptococcus dysgalactiae .
8. The process according to claim 7, wherein the sulfur compound is a dimethyl sulfoxide.
8. The method according to claim 7, wherein the hyaluronic acid of step 3) is added in an amount of 1 to 10% by weight.
8. The process according to claim 7, wherein the sulfur-containing organic solvent is sulfuric acid.
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