KR20170113609A - 가스트린에 대한 루테늄 및 인듐 결합 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이제까지 실현되지 않은, 가스트린에 대한 루테늄 및 인듐의 고친화도 결합에 의존한다. 특히, 이러한 금속들은 온건한 조건 하에서 가스트린에 직접 결합할 수 있으며, 따라서 상승된 가스트린 수준과 관련된 상태의 치료 및 CCK 수용체가 과발현되는 종양 및 다른 상태의 검출에 사용될 수 있다.

Description

가스트린에 대한 루테늄 및 인듐 결합

본 발명은 치료 및 검출 방법에서 루테늄 또는 인듐의 가스트린에 대한 고친화도 결합의 사용 및 상기 가스트린과 상기 결합된 루테늄 또는 인듐에 의해서 형성된 복합체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니지만, 루테늄 및 인듐 결합의 사용을 통해서, 상승된 농도의 가스트린 또는 가스트린 수용체와 관련된 상태의 치료 또는 진단에 관한 것이다.

본원의 배경기술에 대한 임의의 참조는 그러한 기술이 호주 또는 다른 곳에서 일반적인 지식을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

가스트린 (gastrin), 또는 G아미드 (Gamide)는 잘 알려진 소화관 펩티드 호르몬이며, 원래는 위산 분비 자극제로서 밝혀졌다 (Dockray, 2001). 이는 날문방 (gastric antrum)의 G 세포에 의해 주로 생산되며, 상부 소장에서는 가변적인 정도로 생산되고, 결장과 췌장에서는 훨씬 적은 양으로 생산된다. CCK1 수용체와의 결합을 통해 췌장 효소 분비를 자극하는 관련 호르몬인 콜레시스토키닌 (cholecystokinin, CCK)은 가스트린과 동일한 C-말단 테트라펩티드 아미드를 갖는다. G아미드에 의해 자극된 위산 분비는 콜레시스토키닌-2 (CCK-2) 수용체에 의해 매개된다.

인간 CCK-2R (447 아미노산)은 아미노산 서열 면에서 인간 콜레시스토키닌 1 수용체 (CCK1R) (428 아미노산)와 46 %의 동일성을 공유하며, 둘 다 전형적인 7-막횡단 도메인 수용체이다. CCK1R 및 CCK2R 모두에 대한 고-친화성 결합에 대한 최소 서열 요건은 아미드화된 C-말단 테트라펩티드 Trp-Met-Asp-Phe이다. 두 수용체는 CCK1R이 황산화되지 않은 CCK8보다 500 배 더 큰 친화력으로 황산화된 CCK8에 결합한다는 사실에 의해 쉽게 구별될 수 있는 반면, CCK2R에 대한 차이는 단지 10 배이다.

인간에서 가스트린의 활성 형태의 생산은 큰 전구체 분자인 프리프로가스트린 (preprogastrin) (101 아미노산)인, 가스트린 유전자의 초기 번역 산물로부터 시작된다. 프리프로가스트린은 N-말단 신호 펩티드의 절단에 의해 프로가스트린 (80 아미노산)으로 전환되고, 프로가스트린은 엔도- 및 카르복시-펩티다아제에 의해서 분비된 소포 내에서 추가로 가공되어 글리신-연장된 가스트린을 생성한다. 이어서, 글리신-연장된 가스트린 (Ggly)의 C-말단은 펩티드 α-아미드화 모노-옥시게나아제에 의해서 아미드화 되고, 추가적인 단백질가수분해적 절단으로 인해 성숙한 아미드화 된 가스트린 (ZGPWLEEEEEAYGWMDF아미드, G아미드)이 생성된다. 건강한 인간에서, 프로가스트린 및 글리신-연장된 가스트린은 순환 가스트린의 10% 미만을 구성한다.

G아미드/가스트린은 위 상피에 대한 중요한 성장 인자이며, 위 및 근위 소장의 ECL 세포의 증식, 및 위 벽 세포 이동을 자극하는 것으로 알려져 있다. 이러한 증식 효과는 졸링거-엘리슨 증후군 (Zollinger-Ellison syndrome)과 같은 질병에서의 연장된 고가스트린혈증 (hypergastrinaemia)에 이차적인 유암종 종양을 야기할 수 있다. 인간 위 선암의 80 %가 G아미드와 CCK2 수용체를 동시에 발현한다는 최근의 보고는, 많은 위암이 자가분비 성장 인자로서 G아미드를 활용한다는 것을 암시한다 (Goetze JP, 2013).

전구체, 프로가스트린 및 그 글리신-연장된 유도체 (Ggly)는 이전에는 생리 학적으로 비활성인 것으로 간주되어 왔다. 그러나, Ggly와 같은 이러한 가스트린 전구체가 여러 암 세포주에서 증식을 촉진한다는 자료가 축적되고 있다 (Aly A, 2004) (Ferrand A, 2006).

프로가스트린 및 Ggly의 중요한 생리적 역할은 결장 내에서인 바, 이는 프로가스트린 및 Ggly가 시험관 내에서 결장 세포주의 증식 (Hollande F, 1997) 및 생체 내에서 정상 점막의 증식 (Wang TC, 1996)(Koh TJ, 1999)을 자극하기 때문이다. 이러한 비-아미드화 된 가스트린은 또한 대장암에서 성장 인자로서 작용한다 (Aly A, 2004). Wang 등은 (Wang TC, 1996) 생체 내 정상적인 결장 조직에서 전구체 비-아미드화 된 가스트린의 성장 효과를 입증하였다. 예를 들어, 가스트린-결핍된 마우스에 Ggly를 주입하면 결장 증식 지수가 80% 증가하지만, 가스트린/G아미드를 주입한 경우에는 결장의 증식 지수에 아무런 영향이 없었다. 간에서 인간 프로게스틴을 과발현하는 유전자이식 마우스는 순환 프로가스트린의 농도가 높지만, 정상적인 가스트린/G아미드 농도를 갖는다. 이러한 마우스는 두터워진 결장 점막을 가지며, 야생형 마우스에 비해서 근위 및 원위 결장 모두에서 더 깊은 와 (crypts) 및 증가된 증식 지수를 갖는다. Ggly를 과발현하는 유전자이식 마우스에 대해서도 유사한 결과가 보고되었다.

가스트린 유전자 발현의 상향 조절은 결장 직장암 (colorectal cancer, CRC) 종양 형성에 기여할 수 있다. 불완전하게 가공된 가스트린의 증가된 농도가 결장 폴립 (polyps) 및 선암 및 CRC 환자의 순환에 존재하고, 정상 대장 점막 및 시험 관 내 및 생체 내 CRC 세포주에서 유사분열촉진성 효과 (mitogenic effects)를 발휘하는 것으로 나타났다. 가스트린은 또한 친혈관형성 (proangiogenic) 특성을 갖는다. 인간 혈관 내피 세포에 의한 세관 (tubule) 형성은 G아미드와 Ggly 모두에 의해 강화된다. 인간 CRC 세포주를 Ggly로 처리하면 주요 혈관형성 인자 혈관 내피세포 성장 인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 촉진시키고, Ggly를 과발현하는 유전자이식 마우스로부터의 결장은 대조군 마우스에 비해서 VEGF 발현 수준이 더 높고 미세혈관 밀도가 더 높은 것으로 나타났다.

이러한 가스트린 전구체 분자가 대장암의 발생과 관련되어 있는 반면, CCK-2 수용체 또한 종양 유형이 CCK-2 수용체를 빈번하게 발현하는 것으로 밝혀진 별도의 암 그룹과 관련되어 있다. 특히 Reubi와 연구진들은 (Reubi JC, 1997)는 갑상선 수질암 (medullary thyroid carcinomas)과 난소 기질 암 (ovarian stromal carcinomas)의 90% 이상, 성상세포종 (astrocytomas)과 소세포 폐암의 50% 이상이 CCK-2 수용체 양성인 것을 입증하였다 (하기 표 참조).

종양 유형 빈도 CCK2R+ve/총 (32)

갑상선 수질암 4% 22/24 (92%)

성상세포종 50% 11/17 (65%)

소세포 폐암 15% 8/14 (57%)

난소 기질암 8% 3/3 (100%)

* 해당 조직에서 발생하는 모든 종양의 % (예를 들어, 모든 뇌종양의 %로서 성상 세포종).

CCK2R-양성 종양의 진단을 위해 금속 킬레이트-접합된 가스트린 유도체의 사용에 관심이 있어왔다 (Roosenburg S, 2011). 예를 들어, 킬레이트 기 1,4,7,10-테트라아자시클로데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)은 미니가스트린₁₁ (D-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp -Phe-NH₂) 및 ¹¹¹In 또는 ⁶⁸Ga로 방사성표지된 미니가스트린 (von Guggenberg E, 2012)과 결합되었다. 이러한 접근법의 단점들 중 하나는 금속 이온의 도입이 가혹한 조건을 필요로 하고 (pH 4.5, 98 ℃, 15 분), 이는 펩티드에 산화적 손상 또는 변형을 잠재적으로 야기하는 것으로 밝혀졌다는 점이다.

미국 특허 제6,180,082호는 진단 및 치료 모두를 위해 수용체 의존 방사성표지된 화합물의 사용 및 종양 조직에서 이들의 축적에 대해서 서술하고 있다. 적절한 수용체-의존 펩티드로서 콜레시스토키닌 (CCK) 및 소마토스타틴 (somatostatin)이 개시되어 있다. CCK는 가스트린에 관련된 펩티드이지만, 가스트린 펜타글루타메이트 서열이 결여되어 있다. ¹¹¹In-펜테트레오티드 (¹¹¹In-Pentetreotide)와 다양한 DOTA 및 DPTA 유도체 (유기 킬레이트 기)와 같은 이미 이용가능한 다양한 금속-킬레이트-펩티드 복합체가 방사성 금속에 결합하는 것으로 명시되어 있다. 더 긴 주입 (infusion) 기간에 걸쳐 결합된 금속 방사능 핵종을 갖는 그러한 펩티드 킬레이트를 전달하는 것이 볼러스 주사 (bolus injection)를 통한 것보다 종양 조직에 개선된 축적 면에서 장점을 제공한다고 주장되어 있다.

Roosenburg S, (2011)는, 다른 사항들 중에서도, CCK-2R을 발현하는 암의, 방사성표지된 화합물의 사용을 통한 시각화에서, CCK 및 가스트린 펩티드의 사용을 서술하고 있다. 킬레이터와 펩티드의 접합은 방사성 금속으로 방사성표지를 가능하게 하는데 있어서 필수 단계로 검토되지만, 일부 기존의 펩티드-킬레이트-금속 복합체의 단점들이 서술되어 있다. 특히, 특정 복합체는, 생성물을 형성하기 위한 단계로서, 가열과 같이 잠재적으로 펩티드 구조를 손상시키는 단계를 필요로 하고, 다른 것들은 열악한 생체 내 안정성 및/또는 바람직하지 않은 신장 축적으로 인해서 신장 손상을 야기하는 것으로 나타났다. 다시 한번, DOTA, DTPA 및 또한 HYNIC은 유기 금속 킬레이트 기으로 서술된다. 테트라아민 사슬이 펩티드 서열에 접합된 금속 킬레이터기로서 기능하는 데모가스트린 1 및 2, 미니 가스트린 유사체 또한 금속 방사성 핵종으로서 테크네튬 (Tc) 결합과 관련하여 검토되고 있다.

유사하게, Fani M 2012는 방사성표지된 펩티드가 종양 수용체 영상화 및 표적화된 핵종 치료에 유용한 생물학적 도구가 될 수 있음을 보여 주었다. CCK 및 가스트린 펩티드 유사체가 검토되고, In-DOTA 미니 가스트린뿐만 아니라 Tc-데모가스트린이 보편적으로 사용되는 후보물로서 서술되어 있으며, 그러한 적당한 방사성표지된 펩티드를 개발하는 주된 단계들 중 하나가 금속에 결합하는 킬레이팅제 또는 보결기 (prosthetic group)를 공유적으로 부착시키는 것으로 서술되어 있다. 따라서, 적당한 킬레이팅제를 개발하는 것은 적합한 효능 및 생체 내 안정성을 갖는 수용체 표적화된 방사성표지된 펩티드를 제조하는 분야에서 중요한 구성 요소이다.

Tc 및 In은 펩티드 복합체에 대한 킬레이트 기에의 부착을 위한 방사성 핵종으로 사용되었지만, 금속은 일반적으로 다양한 항암제에서 당분간 사용되어 왔다는 점을 알 수 있다. WO 2007/101997은 암의 치료에 사용하기 위한 새로운 루테늄 (Ru) 샌드위치 복합체의 개발을 서술하고 있다. 관련 Ru 샌드위치 복합체는 상기 복합체 상의 할로 원자의 가수 분해를 통해서 DNA에 직접 결합함으로써 인터컬레이션 (intercalation) 및 결합을 위해 화합물을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. WO 2007/101997의 화합물은 이전 화합물의 할로 원자에 상응하는 모이어티가 쉽게 가수 분해되지 않으며 그 자체로 활성 종인 온전한 샌드위치 복합체인 것으로 추측되는 점에서 다르게 작용한다. 그러한 종의 Ru 원자는 완전히 착화되므로 다른 기에 직접 결합할 수 없다. 따라서 Ru 샌드위치 복합체는 활성화된 복합체 자체가 무엇이건 간에 DNA 결합을 통해서 대부분 온전하고 유지되고 작용의 직접 방식을 따른다.

가스트린은 2 개의 제2 철 이온 (ferric ions)을 결합하는데, 첫 번째는 Glu7에, 두 번째는 Glu8 및 Glu9에 결합한다. 제2 철 이온은 세포 증식 및 이동의 자극제로서, Ggly와 같은 펩티드의 비-아미드화된 형태의 생물학적 활성에 필수적이다. 따라서, Glu7을 Ala로 치환하거나, 철 킬레이터인 데스페리옥사민 (desferrioxamine)으로 처리하여, Ggly의 생물학적 활성을 완전히 차단한다. 대조적으로, 제2 철 이온은 G아미드의 생물학적 활성에 필요하지 않다. Bi^{3 +} 이온은 Ggly의 제2 철 이온 결합 사이트에 대해서 경쟁함으로써, 시험관 내에서 생물학적 활성을 차단하고, 마우스 및 래트 모두에서 정상 대장 점막에서 생체 내 활성을 차단한다.

첨가된 금속 이온들의 존재 하에서 Ggly 형광을 측정함으로써 검출한 바와 같이, Baldwin은 Ggly가 Co(II), Cu(II), Mn(II) 또는 Cr(III) 이온에 결합하지 않는다는 것을 밝힌 바, Ggly 금속 결합 부위는 매우 선택적이다 (Baldwin GS, 2001). 또한, 프로가스트린은, 방사성 ⁵⁹Fe^{3 +} 이온과의 경쟁에 의해서 검출한 바와 같이, Ca(II), Co(II), Cu(II), Fe(II), Mn(II) 또는 Zn(II), 또는 Al(III), Cr(III) 또는 Eu (III) 이온과 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다 (Baldwin G, 2004).

WO 2004/089976은 Ggly 수용체에 대한 천연 리간드가, Ggly 자체라기보다는 제2 철 이온이 Ggly에 결합할 때 형성되는 복합체일 수 있다고 개시하고 있다. 이러한 사실 및 Ggly가 CCK-2 수용체와 독립적으로 작용한다는 사실을 토대로, G아미드가 그 효과를 갖는 경우, Ggly의 생물학적 활성을 차단하기 위해서 3가 금속 이온을 사용하는 것에 기초한 선택적 치료법을 제안하였다. Bi^{3 +} 및 Ga^{3 +}에 대해서 데이터가 제공되며, Co^{2 +}, Cr^{3 +}, Cu^{2 +} 및 Mn^{2 +} 이온은 형광을 소광시키지 않는 것으로 밝혀졌고, 20 당량의 Al^{3 +}도 Ggly NMR 신호에서 유의미한 변화를 일으키지 않는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 심지어 삼가 이온 부류 중에서도 Ggly 금속 이온 결합의 특성이 예측가능하지 않다는 것을 확인했다. 검토된 데이터는, Ggly가 pH 4에서 5.8 uM의 친화도로 2개의 Bi^{3 +} 이온과 결합한다는 것을 나타내며, 이는 제2가 철 이온에 비해서 10배 낮은 것이다.

본 발명은, 적어도 부분적으로는, 루테늄 및/또는 인듐 금속 이온이, Fe^{3 +} 이온, 심지어 Bi^{3 +} 및 Ga^{3 +} 이온에 대해서 실험적으로 측정된 것보다도, 10의 수 제곱 배만큼 더 작은 결합 상수로 가스트린에 결합한다는 놀라운 발견을 전제로 한 것이다. 루테늄 및 인듐 모두는 유사하게 효과적인 결합성으로 아미드화 및 비-아미드화된 가스트린에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 가스트린에 의한 금속 이온의 결합의 예측할 수없는 성질을 고려할 때, 루테늄 및 인듐이 결합한다는 사실과 그 현저하게 더 강한 결합 정도는 종래기술로부터 예측될 수 없었다.

고친화성 결합은 루테늄 또는 인듐이 상대적으로 온건한 조건 하에서 가스트린에 직접 결합되도록 함으로써, 결합된 루테늄 또는 인듐과 함께 가스트린을 치료 방법에서 또는 비-아미드화된 가스트린 수용체의 탐구 및 확인을 위한 도구로서 사용될 수 있도록 한다. 이는 킬레이화된 펩티드에 방사성 표지를 도입하기 위해 종종 가혹한 조건을 사용해야 하는 종래기술의 펩티드 킬레이트 화합물에 비해 현저한 장점을 제공한다. 특히, 루테늄 또는 인듐과 가스트린의 결합은 아미드화 또는 비아미드화된 가스트린과 관련 또는 이에 의해서 야기된 다양한 상태의 치료를 가능하게 한다.

방사성 표지된 루테늄 또는 인듐이 사용되는 경우, 루테늄 또는 인듐과 가스트린으로부터 형성된 복합체는, 가스트린이 결합하는 수용체를 확인하기 위한 프로브로서 이용될 수 있으므로, 특정 상태를 확인하는데 진단 도구로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 접근법을 이용함으로써, 루테늄 및 인듐의 고친화도 결합은, 금속이 펜타글루타메이트 서열에 직접 결합하므로, 가스트린 펩티드에 대한 금속 킬레이트의 접합 필요성이 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 이는 프로브/치료제의 합성을 용이하게 하고, 가스트린에 대한 손상을 최소화하며, 생체 내 안정성에 대한 염려를 감소시킨다.

본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

본 발명이 용이하게 이해될 수 있고 실제적인 효과를 나타낼 수 있도록, 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예를 예를 들어 설명한다:
도 1은 가스트린 결합의 2 부위 모델을 나타낸 것이다;
도 2는 Fe^III ₂Ggly의 에지 스펙트럼 근방의 XAS K-에지이다;
도 3 A-H는 Ggly로 테스트된 금속 복합체들의 일련의 EXAFS 스펙트럼 (A, C, E 및 G) 및 그 대응되는 푸리에 변환 (B, D, F 및 H)이며, 여기에서 A 및 B는 Fe^{3 +} 이온에 대해서, B 및 C는 Ga^{3 +} 이온에 대해서, E 및 F는 In^{3 +}에 대해서, 또한 G 및 H는 Ru³⁺에 대해서 얻어졌다;
도 4A는 Fe^III ₂Ggly에 대한 제안된 구조 모델이다;
도 4B는 Ru^III ₂Ggly에 대한 제안된 구조 모델이다;
도 5는 Ga^{3 +} 이온의 첨가에 따라 기록된 가스트린 G아미드 및 Ggly의 흡수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 다양한 농도의 In^{3 +} 이온의 존재 하에서, Fe^{3 +} 이온의 첨가에 따라 기록된 가스트린 G아미드 및 Ggly의 흡수 변화를 나타내는 그래프이다;
도 7은 다양한 농도의 Ru^{3 +} 이온의 존재 하에서, Fe^{3 +} 이온의 첨가에 따라 기록된 가스트린 G아미드 및 Ggly의 흡수 변화를 나타낸 그래프이다; 또한
도 8은 Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체의 정제를 나타내며, 여기에서 A는 Sep-Pak 분리 후의 다양한 분획에서 관찰된 방사능을 나타내고, B는 음이온 교환 HPLC에 의한 복합체의 추가 정제를 나타내며, 여기에서 각 1 mL 분획의 방사능은 바로 표시된다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "가스트린" 및 "가스트린들"은 아미드화된 가스트린 (G아미드) 및 비-아미드화된 가스트린 (글리신-연장된 가스트린) 뿐만 아니라 프로가스트린을 의미한다. 일 구현예에서, 상기 용어는 특징적인 펜타글루타메이트 서열 잔기 중 일부 또는 전부를 포함하지 않는 가스트린 및 가스트린-유사 펩티드를 제외할 수도 있다.

본원에 사용된 용어 "아미드화된 가스트린"은 프로가스트린으로부터 유래되고, 그 펜타글루타메이트 서열을 함유하며, 부가적으로, C-말단에 서열 trp-met-asp-페닐알라닌-아미드를 포함하는 가스트린을 의미한다. 상기 아미드화된 가스트린의 예는, 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만, 아미드화된 가스트린₃₄ 및 아미드화된 가스트린₁₇ (G아미드)을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "비-아미드화된 가스트린"은 프로가스트린이거나 또는 그로부터 유래되고, 그 펜타글루타메이트 서열을 포함하지만, 페닐알라닌-아미드를 C-말단에 포함하지 않는 가스트린을 의미하며, 그 범위 내에 글리신-연장된 가스트린을 포함한다. 상기 비-아미드화된 가스트린의 예는, 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만, 프로가스트린 그 자체 뿐만 아니라, 글리신-연장된 가스트린₁₇ (Ggly) 및 글리신-연장된 가스트린의 N- 및 C-말단 연장된 형태 뿐만 아니라, 잔기 55 내지 72 사이의 프로가스트린 서열로부터 유래된 더 짧은 펩티드를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "CCK 수용체", "CCK-1 수용체" 및 "CCK-2 수용체"는 일반적으로 콜레시스토키닌 수용체 패밀리 또는 특정 서브타입을 의미한다.

본 발명의 제1 양태에 따르면, 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 비-아미드화된 가스트린의 상승된 농도와 관련된 환자에서 상태의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

상기 금속은 상기 금속이 상기 비-아미드화된 가스트린의 제2 철 결합 부위에 결합하도록 상기 환자에 투여된다.

일 구현예에서, 상기 방법은 비-아미드화된 가스트린에 결합시키기 위해서 루테늄 및 인듐으로부터 선택된 금속의 상기 투여를 필요로 하는 것을 포함하는, 상기 처리를 필요로 하는 환자를 선택하는 단계를 더 포함한다.

아미드화 및 비-아미드화된 가스트린은 다른 조직에서 별개의 수용체를 통해 다른 생물학적 효과를 유도한다. 아미드화된 가스트린 (G아미드)은 위산 분비 및 위 유암종의 발달을 자극하는 반면, 전구체인 글리신-연장된 가스트린은 결장 점막의 증식 및 대장암의 진행을 자극한다.

전술한 바와 같이, Baldwin (Baldwin, 2001)은 글리신-연장된 가스트린 (Ggly)이 2 개의 제2 철 이온을 높은 친화도로 결합시킨다는 점을 밝혔다. 철 리간드의 정체, 그 결합 부위 및 생물학적 활성에서 제2 철 이온의 역할을 연구한 결과, Glu7이 첫 번째 제2 철 이온 결합에 중요하며, Glu8 및 Glu9는 두 번째 제2 철 이온 결합에 관여한다는 것이 밝혀졌다. Glu7이 Ala로 대체된 Ggly 돌연변이 (GglyE7A)의 활성이 완전히 제거된다는 점, 및 철 킬레이터 데스페리옥사민 (DFO)에 의해서 Ggly 활성이 억제된다는 점은, Ggly의 생물학적 활성에 제2 철 이온 결합이 필수적이라는 점을 나타낸다.

실험 섹션에서 제시된 결과는 인듐 및 루테늄 이온이 예기치 않게 높은 친화도로 비-아미드화된 가스트린에 결합한다는 점을 입증한다. Ggly의 첫 번째 철 결합 부위에 대해서, In^{3 +}는 2.1 x 10^-13 M의 Kd 값을 가짐에 반해서, Fe^{3 +}의 경우는 5.7 x 10^-9 M의 K_d 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. Ru^{3 +}는 Ggly의 첫 번째 철 결합 부위에 대해 5.3 x 10^-15 M의 K_d 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, In에 대한 친 화도는 10의 수 제곱 배 더 크다. 다양한 금속의 결합 친화도는 매우 가변적인 결과 (비소 및 안티몬과 같은 다른 15 족 이온들은 고친화성 결합을 보이지 않았음)로 테스트되었기 때문에, 합리적인 수준의 예측 가능성을 배제하고, 따라서 In^{3 +} 및 Ru³⁺ 이온의 놀라울 정도로 높은 친화도 결합은 비-아미드화된 가스트린을 포함하는 가스트린과 관련된 다양한 상태의 검출 및 치료에 유용한 도구를 제공한다.

일 구현예에서, 상기 인듐 및 루테늄은 ^{+ 3} 형태, 즉 In^{3 +} 및 Ru^{3 +} 형태이다.

일 구현예에서, 상기 인듐 및 루테늄은 인듐 및 루테늄의 방사성 동위원소일 수 있다.

상기 금속은 유리 이온을 함유하는 용액의 일부로서 투여될 수 있거나, 또는 상기 금속은 화합물 또는 염의 성분일 수 있다. 상기 화합물은 금속을 해리할 수 있거나 또는 상기 금속이 상기 가스트린에 결합되도록 이용가능하게 할 수 있는 것이어야 한다.

상기 금속을 함유하는 상기 화합물은, 상기 금속을 방출하거나, 그렇지 않은 경우에는 비-아미드화된 가스트린의 상기 제2 철 이온 결합 부위 또는 부위들을 상기 금속이 점유할 수 있도록 이용가능하게 함으로써 그 생물학적 활성을 차단할 수 있는, 단순, 복합 또는 유기-금속성 염 또는 복합체 또는 킬레이트, 다형체, 공-결정 또는 그 복합체일 수 있다. 유기금속성 복합체는 편리한 담체, 예를 들어 시클로덱스트린, 또는 항체와 같은 표적화 분자에 결합된 3가 금속 이온을 포함할 수 있거나, 또는 양이온이 킬레이터 내로 또는 비피리딘 및 터피리딘의 루테늄 유도체와 같은 유기 "감싸는 (wrapping)" 분자 내로 결합될 수 있다. 적당한 약학적으로 허용가능한 단순 염은 무기 또는 미네랄 산 또는 암모니아와 같은 알칼리로부터 유래될 수 있다.

인듐 및/또는 루테늄의 단순 복합체 또는 염은 독립적으로 옥시드, 카르보네이트, 셀레니드, 술페이트, 술파이트, 니트레이트, 니트라이트, 트리브로미드, 트리클로리드, 아세테이트, 시트레이트, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시니케이트, 타르트레이트, 살리실레이트, 갈레이트, 글리시네이트, 글루타메이트, 메실레이트, 피콜리네이트 및 토실레이트로부터 선택될 수 있다.

더 큰 복합체들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 헥사아민루테늄(II) 클로리드 [Ru(NH₃)₆]Cl₂와 같은 인듐 또는 루테늄 이염을 포함할 수 있다.

다른 형태에서, 상기 인듐 또는 루테늄 양이온은 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 또는 또는 폴리락테이트와 같은 다양한 폴리머 분자에 결합 및/또는 부착되어 인체로부터 제거율을 낮추거나 또는 기질 (substrate)로부터 양이온의 서방출을 제공할 수 있다.

상승된 농도의 비-아미드화 가스트린과 관련된 상태는, Ggly의 증가된 혈액 농도, 분비 속도 또는 활성이 상기 상태의 하나 이상의 증상의 원인이 되는 임의의 병리학적 상태일 수 있다. 상기 상태는 세포 증식, 세포 이동, 또는 산 분비를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 상태는 대장암과 같은 가스트린-생성 종양; 가스트리노마 (gastrinoma); 섬 세포 암종 (islet cell carcinomas); 기질 난소 종양 (stromal ovarian tumors)을 포함하는 난소 종양; 뇌하수체 종양; 또는 갑상선 수질 암종, 성상 세포종, 소세포 폐암, 수막종, 자궁내막 및 난소 선암, 유방 암종, 위장관 기질 종양 및 위 소장췌장 종양 (gastro enteropancreatic tumors)와 같은 CCK-2 수용체 발현 종양; 위축성 위염 (atrophic gastritis)과 같이, 혈청 가스트린 또는 그 전구체가 상승되는 상태; G 세포 과형성; 악성 빈혈; 및 신부전; 궤양성 대장염과 같은 위장 점막에 영향을 미치는 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.

비-아미드화된 가스트린 전구체가 결장 점막에서 성장 인자로서 작용하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 상기 가스트린 전구체의 특이적 억제제는 궤양성 대장염 및 위장관 암과 같은 위장관 증식의 질환의 치료에 유용하다. 특히, 가스트린 농도가 장기간 상승하면 대장암 또는 췌장암의 위험성을 증가시킨다는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 상태의 치료 또는 예방에 적용 가능하다. 대장 암의 위험도는 또한 지방 또는 육류가 많은 식이를 하는 개인, 또는 가족성 선종성 용종증 (familial adenomatous polyposis)과 같은 결장암 가족력을 갖는 개인에서 상승되며, 따라서 그들도 본 발명에 따른 예방적 치료에 적합한 후보자들이다.

비-아미드화된 가스트린은 또한 아미드화된 가스트린에 의한 산 분비 자극을 가능하게 하므로, 특정 억제제 역시 위장관 궤양, 식도 역류, 위 암종, 또는 양성자 펌프 억제제 또는 H₂ 차단제로 치료받는 사람들을 포함하는 졸링거-엘리슨 증후군과 같은 상태를 앓는 환자들에서 과도한 산 생산을 치료하는데 유용하다.

본 발명은 비-아미드화된 가스트린의 생물학적 작용을 차단하는 신규하고 예기치 않은 방법을 제공한다. 인듐 또는 루테늄 이온에 의한 비-아미드화된 가스트린의 금속 이온-결합 부위의 점유는 제2 철 이온의 결합을 방지하고, 따라서 펩티드를 불활성화한다. 이러한 접근법의 주된 장점은 불활성화의 특이성이다. Ggly/G아미드 결합 부위를 포화시키는데 필요한 루테늄 또는 인듐 양이온의 낮은 농도에서는, 미결합된 금속 이온들에 의해서 다른 생물학적 과정과의 간섭이 거의 발생하지 않는다.

환자는 포유동물, 특히 인간 또는 가축 동물 또는 반려 동물일 수 있다. 본 발명의 화합물이 인간의 의학적 치료에 사용하기에 적합하다고 특히 의도되지만, 이는 또한 개와 고양이와 같은 반려 동물, 말, 소 및 양과 같은 가축 동물, 또는 고양이과 (felids), 개과 (canids), 소과 (bovids) 및 유제류 (ungulates)와 같은 동물원 동물을 포함하는 수의학적 치료에도 적용가능하다.

상기 금속을 함유하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 및 약학적 담체는 Remington 's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000), Williams & Williams, USA와 같은 문헌에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 공지되어 있다.

본 발명의 화합물 및 조성물은 임의의 적합한 경로 또는 투여 형태 (서방 형 투여 형태 포함)로 투여될 수 있으며, 통상의 기술자라면 치료될 상태에 대한 가장 적합한 경로 및 투여량을 용이하게 결정할 수 있다. 투여량은 담당 의사 또는 수의사의 재량에 달려 있으며, 치료될 상태의 성질 및 단계, 치료될 대상의 연령 및 일반적인 건강 상태, 투여 경로 및 투여되었을 수도 있는 이전의 임의의 치료에 의존한다. 볼러스 주사와 IV 주입은 유용할 수 있는 단지 두 가지 접근법이다.

담체 또는 희석제, 및 다른 부형제는 투여 경로 또는 투여 형태에 의존하며, 이 또한 통상의 기술자가 각각의 특정 경우에 대해서 가장 적합한 제제를 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

본 발명은 질병을 개선하는데 유용한 다양한 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 일구현예에 따른 약학적 조성물은, 본 발명의 금속 또는 금속-함유 화합물 또는 그 유도체, 복합체, 킬레이트 또는 염, 그 공중합체, 또는 본 발명의 화합물과 하나 이상의 다른 약학적으로-활성인 제제의 조합을, 담체, 부형제 및 첨가제 또는 보조제를 사용하여 환자에게 투여하기에 적합한 형태로 되도록 함으로써 제조된다.

종종 사용되는 담체 또는 보조제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 마그네슘 카르보네이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 티타늄 디옥시드, 실리콘 디옥시드, 락토오스, 만니톨 및 다른 당, 활석, 우유 단백질, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 동물성 및 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 용매, 예컨대 멸균수, 알콜, 글리세롤 및 다가 알콜을 포함한다. 정맥 비이클 (vehicle)은 유체 및 영양 보충제를 포함한다. 방부제는 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체를 포함한다. 다른 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어 참조에 의해서 그 내용이 본 명세서에 통합되는, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed. Williams & Wilkins (2000) 및 The British National Formulary 43rd ed. (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)에 기재된 바와 같은 수용액, 염, 방부제, 완충제 등을 포함하는 비-독성 부형제를 포함한다. 약학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 당업계의 통상적인 기술에 따라 조절된다. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed., 1985) 참조.

약학적 조성물은 바람직하게는 투여 단위로 제조되고 투여된다. 고체 투여 단위는 정제, 캡슐 및 좌제를 포함한다. 대상의 치료를 위해서, 화합물의 활성, 투여 방식, 질환의 성질 및 중증도, 대상의 연령 및 체중에 따라서, 상이한 일일 투여량을 사용할 수 있다. 그러나, 특정 상황에서는 더 높거나 또는 더 낮은 일일 투여량이 적절할 수 있다. 일일 투여량의 투여는 개별 투여량 단위 또는 몇몇 더 작은 투여량 단위의 형태로 단일 투여에 의해서 수행되고, 또한 특정 간격에서 분할된 투여량의 다중 투여에 의해서 수행되거나, 또는 연장된, 데포 (depot) 또는 서방형으로 주어질 수도 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 치료적으로 유효한 투여량으로 국소적으로, 또는 바람직하게는 전신적으로 투여될 수있 다. 물론, 이러한 사용에 효과적인 양은 질병의 심각성과 환자의 체중 및 일반적인 상태에 의존한다. 전형적으로, 시험 관 내에서 사용되는 투여량은 약학적 조성물의 인 시투 (in situ) 투여에 유용한 양에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있으며, 동물 모델은, 만약 세포 독성 부작용이 존재한다면, 그 치료를 위한 유효 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다. 경구용 제제는 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다. 이들은 또한 활성 성분이 물, 또는 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다.

수성 현탁액은 일반적으로 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 크산탄 검, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 마그네슘 실리케이트와 같은 현탁제; 분산제 또는 습윤제로서, (a) 레시틴과 같은 천연 발생 포스파티드; (b) 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; (c) 에틸렌옥시드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타 놀; (d) 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노 올레에이트, 또는 (e) 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다.

약학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 상기 언급한 바와 같은 현탁제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 비독성 비경구적으로-허용가능한 희석제 중에서 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올 중에서 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균의 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해서, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 블랜드 오일 (bland oil)이 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 금속은 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 작은 단일 라멜라 소포 (unilamellar vesicles), 큰 단일 라멜라 소포, 및 다중 라멜라 소포 (multilamellar vesicles)와 같은 리포좀 전달 시스템을 포함하는, 다양한 단순 또는 복합 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 다양한 인지질; 주사가능한 마이크로입자; 나노입자; 매트릭스 임플란트 및 장치 및/또는 비드 코팅으로부터 형성될 수 있다. 이러한 전달 시스템은 본 발명의 금속의 농도를 일정한 방출, 지연 방출, 펄스 방출 또는 순차 방출 제공하도록 고안될 수 있다. 담체 또는 금속은; 시클로덱스트린, 폴리(락틱-코-글리콜릭)산, 폴리안히드리드, 폴리락티드, 폴리-오르토-에스테르 및 HPMC 또는 다른 셀룰로오스 유도체를 포함하는 수화겔을 포함할 수 있다. 금속 도는 이를 포함하는 화합물은 항체 또는 수용체 분자와 같은 표적화 분자에 부착될 수도 있다.

금속, 즉 화합물, 복합 염 등의 전달 형태는 금속이 가스트린에 결합시킬 수 있도록 가수 분해 또는 다른 해리가 가능한 것이어야 한다.

본 발명의 금속의 투여량은 일반적으로 체중 1kg 당 약 0.001mg 내지 약 250mg이며, 체중 1kg 당 1일 당 약 0.1mg 내지 약 10mg (1일 당 평균 환자 당 약 0.1g 내지 약 3g)인 투여량이 바람직하다. 단일 투여를 제조하기 위해서 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 금속 이온의 양은, 치료되는 호스트 및 투여의 특정 모드에 따라서 달라진다. 예를 들어, 인간에 경구 투여용으로 의도된 제제는 약 1mg 내지 1g의 활성 금속 및 적절하고 편리한 양의 담체 물질을 함유할 수 있으며, 이는 전체 조성물의 약 5 내지 95%로 다양할 수 있다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 1mg 내지 500mg의 활성 성분을 함유할 것이다.

그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 수준은, 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 식이, 투여의 시간, 투여의 경로, 배설 속도, 등을 포함하는 다양한 인자에 좌우 될 것이라는 것을 이해할 것이다. 투여 경로, 배설 속도, 약물 조합 및 치료를 받는 특정 질병의 중증도를 포함하는 다양한 인자들에 의존할 것이다.

또한, 본 발명의 화합물 중 일부는 물 또는 일반적인 유기 용매와의 용매화물을 형성할 수 있다. 이러한 용매화물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 화합물은 추가로 다른 화합물과 조합되어 수술적 조합 또는 병용 치료를 제공할 수 있다. 조합물이 본 발명의 금속의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는 한, 약학적 활성제의 임의의 화학적으로 양립가능한 조합을 포함하는 것으로 의도된다.

본 발명의 두 번째 양태에 따르면, 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속을 비-아미드화된 가스트린에 결합시키는 단계를 포함하는, 비-아미드화된 가스트린의 활성을 조절하는 방법이 제공된다.

첫 번째 양태와 관련하여 이루어진 모든 설명은 두 번째 양태에 동일하게 적용된다.

비-아미드화된 가스트린의 조절은 그것의 정상적인 생물학적 활성의 감소일 것이다. 이는 제2 철 결합 부위를 차단하는 루테늄 또는 인듐에 의해 발생되며, 제2 철 결합은 정상적인 활성에 필요하다.

본 발명의 세 번재 양태에 따르면, 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, CCK 수용체의 과발현과 관련된 환자의 상태의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

상기 금속은 상기 환자에 투여됨으로써, 상기 금속이 아미드화된 가스트린의 제2 철 결합 부위에 결합하고, 상기 아미드화된 가스트린이 CCK 수용체의 가스트린에 결합될 때, 상기 금속이 상기 수용체를 갖는 세포 내로 내부화 (internalised)된다.

일 구현예에서, 상기 CCK 수용체는 CCK-1 또는 CCK-2 수용체이다.

바람직하게는 상기 CCK 수용체는 CCK-2 수용체이다.

Ggly와 관련하여 상기 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 인듐 또는 루테늄 이온이 또한 예기치 않게 높은 친화도로 아미드화된 가스트린에 결합한다는 것을 발견하였다. In^{3 +}는 G아미드의 첫 번째 철 결합 부위에 대해 Kd 값이 6.5 x 10^-15 M 인 반면, Fe^{3 +}에 대해서는 3.0 x 10^-10 M인 것으로 밝혀졌다. Ru^{3 +}는 상기 G아미드의 첫 번째 철 결합 부위에 대해 2.6 x 10^-13 M의 Kd 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 두 금속은 모두 철보다 10의 수 제곱만큼 더 높은 친화력으로 결합한다.

본 명세서에 개략된 구현예들의 이점은 G아미드 자체의 펜타글루타메이트 서열에 대한 Ru 또는 In의 결합의 높은 특이성 및 친화성을 이용하는데 있다. 또한, 높은 친화도는 금속-가스트린 복합체의 안정성을 증가시킨다.

CCK 수용체의 역할은 종양과 관련하여 이미 논의되었고, 따라서 본 발명은 세포 독성제로서 루테늄 또는 인듐 양이온의 이용을 가능하게 한다. 종양이 CCK-1 또는 CCK-2 수용체 양성인 경우, 임의의 결합된 금속 이온과 함께 일단 Gastrin/G아미드가 결합되면 CCK2R이 내부화된다는 지식에 기초하여 치료할 수 있다. 인듐 및 루테늄 이온들의 경우에서 입증된 바와 같이, 금속 이온이 강하고 비가역적으로 결합되고, 충분히 높은 특이적 활성으로 방사성 표지되면, 세포 내용물에 대한 방사능 손상은 세포 사멸을 야기할 수 있다. 이러한 "트로이 목사" 접근법에서는, 중간 정도 반감기를 갖는 β-입자 방출물이 효과적이다. 가스트린/G아미드에 부착된 루테늄 또는 인듐 및 CCK2R-발현 종양 세포들에 대한 복합체는 이온의 세포내 농도를 증가시키고, 이는 많은 중요한 Fe-함유 단백질 및 효소들에서 Fe를 대체하며, 따라서 세포 생존성에 필수적인 다양한 세포내 과정들을 파괴하게 된다.

인듐 또는 루테늄의 방사성 동위 원소가 이러한 치료에서 바람직할 수 있지만 필수적이지는 않다. 루테늄은 주기율표에서 철 바로 아래에 있으므로, 이용가능한 가장 가까운 철 동족체 (homologue)가 될 것으로 예상된다. 따라서, CCK2R-발현 종양 세포에 대한 Ru-G아미드의 결합은 루테늄의 세포내 농도를 증가시키고, 이는 많은 중요한 철-함유 단백질 및 효소들에서 철을 대체하며, 따라서 세포 생존성에 필수적인 다양한 세포내 과정들을 파괴하게 된다. 동일한 간섭 효과가 인듐 이온으로부터도 얻어질 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 상기 인듐 및 루테늄은 방사성 동위 원소이다.

치료되는 상태는 CCK 수용체와 관련된 임의의 상태일 수 있으며, CCK 수용체 발현과 관련해서 첫 번째 양태에서 언급된 상태들을 포함한다. 조성물, 투여량 및 전달 형태 또한 첫 번째 양태에서 서술된 바와 같을 수 있다.

일 구현예에서, 상기 금속은 상기 아미드화된 가스트린과 접촉하게 될 때 킬레이트 기에 결합되지 않는다. 즉, 상기 금속은 펩티드-킬레이트 접합체 또는 복합체의 성분으로서 전달되지 않는다. DOTA, DTPA, HYNIC 및 테트라아민을 포함하는 이러한 킬레이트 기가 본원에서 논의된다.

본 발명의 네 번째 양태는, 아미드화된 가스트린을 금속과 접촉시킴으로써 상기 금속이 상기 아미드화된 가스트린에 결합하도록 하는 단계 및 상기 아미드화된 가스트린이, 결합된 금속과 함께, CCK 수용체와 접촉하고 세포 내로 내부화되는 단계를 포함하는, 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속을 CCK 수용체를 발현하는 세포 내로 내부적으로 전달하는 방법에 관한 것이다.

상기 네 번째 양태는 상기 세 번째 양태에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있으며, 따라서 언급된 모든 요소들은 네 번째 양태에 대해서 명시적으로 반복되는 것으로 고려된다.

본 발명의 다섯 번째 양태에 따르면, 가스트린을 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속과 접촉시키는 단계를 포함하는, 가스트린-금속 복합체를 형성하는 방법이 제공된다.

본 발명의 여섯 번째 양태는 가스트린 및 상기 가스트린의 제2 철 결합 부위에 결합된 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속을 포함하는 복합체에 관한 것이다.

상기 다섯 번째 및 여섯 번째 양태의 일 구현예에서, 상기 가스트린은 아미드화된 가스트린이다.

상기 다섯 번째 및 여섯 번째 양태의 또 다른 구현예에서, 상기 가스트린은 비-아미드화된 가스트린이다.

본 발명의 가스트린-루테늄 및 가스트린-인듐 복합체는 그 높은 친화도 결합으로 인해서 놀랍게 안정적인 것으로 밝혀졌다. 3가 금속 이온과 글리신-연장된 가스트린₁₇의 복합체에 대한 구조는 X-선 흡수 미세 구조 분광법에 의해 결정되었으며 실험 섹션에서 논의된다. 이러한 높은 친화도는 가스트린에 금속을 결합시키기 위해 온화한 조건을 사용할 수 있음을 의미하므로 펩티드에 대한 손상이 훨씬 적다.

본 발명의 일곱 번째 양태는 CCK 수용체 양성 암을 진단하는 방법에 관한 것으로서:

(i) 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속 방사성 동위원소와 복합체화된 아미드화된 가스트린을 포함하는 아미드화된 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체를 환자에게 투여하는 단계;

(ii) 상기 아미드화된 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체가 CCK 수용체에 결합되게 하는 단계; 및

(iii) 상기 아미드화된 가스트린-금속 동위원소 복합체에서 상기 금속 방사성 동위원소의 존재를 검출하는 단계를 포함함으로써,

상기 CCK 수용체 양성 암을 진단하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 여덟 번째 양태는 비아미드화 가스트린에 대한 수용체의 검출 방법에 관한 것으로서:

(i) 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속 방사성 동위원소와 복합체화된 비-아미드화 가스트린을 포함하는 비-아미드화 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체를 환자에게 투여하는 단계;

(ii) 상기 비-아미드화된 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체가 상기 수용체에 결합되게 하는 단계; 및

(iii) 상기 비-아미드화 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체에서 상기 금속 방사성 동위원소의 존재를 검출하는 단계를 포함함으로써,

비아미드화된 가스트린 수용체를 검출하는 것에 관한 것이다.

상기 일곱 번째 및 여덟 번째 양태와 관련하여, CCK 수용체 양성 암 또는 비-아미드화 가스트린에 대한 수용체의 검출은 가스트린에 대한 Ru 또는 In의 높은 특이성 및 친화도를 통해 달성된다.

상기 결합은 미니가스트린11에 존재하지 않는 가스트린의 펜타글루타메이트 서열에 대한 것이며, 따라서 상기 8 가지 양태 중 어느 하나의 일 구현예에서, 상기 가스트린은 미니가스트린 11 또는 미니가스트린 11 유사체가 아니다. 유리하게는, 표지화는 실온에서 빠르게 발생되며, 따라서 펩티드는 손상될 여지가 없다. 특히, 고친화도는 상기 금속-가스트린 복합체의 증가된 안정성을 야기함으로써, 종래기술의 금속 킬레이트 기와 접합된 가스트린의 단점 중 하나를 피할 수 있다. 적어도 하기 열거된 Ru 및 In 동위원소가, 단일광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT) 또는 양전자 방출 단층촬영 (Positron Emission Tomography, PET)에 의해서, 가스트린-결합 수용체 및 이를 제공하는 세포, 예컨대 CCK2R-양성 종양의 위치에 잘 맞을 것으로 예상된다.

SPECT: ¹¹¹In-G아미드 (γ 에미터, t_1/2 = 67 시간),

⁹⁷Ru-G아미드 (γ 에미터, t_1/2 = 65 시간).

PET: ¹⁰⁹In-G아미드 (β 에미터, t_1/2 = 4.3 시간).

따라서, 종양이 CCK-1 또는 CCK-2 수용체 양성인 경우, 루테늄 또는 인듐의 적합한 방사성 동위원소와의 G아미드의 복합체는 PET 또는 SPECT에 의해 원래의 종양 또는 그의 전이체의 위치를 결정하는데 진단학적으로 사용될 수 있다.

따라서, 상기 방사성 동위원소는 ¹⁰⁹In, ¹¹⁰In, ¹¹¹In, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Ru 및 ¹⁰⁶Ru로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에 제시된 데이터는 Ru 또는 In의 방사성 동위 원소가 단일광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT, ⁹⁷Ru, ¹¹¹In) 및 양전자 방출 단층촬영 (PET, ¹⁰⁹In)에서 CCK 수용체 프로브로서 사용하기 위해, 아미드화된 가스트린과 직접 복합체화 될 수 있음을 보여준다. 당업계에 공지된 휴대용 발전기의 사용은 이러한 접근법을 보다 실현가능하게 만든다. 이러한 접근법의 한 가지 장점은, 복합체 형성이 실온에서 빠르게 진행되기 때문에, 펩티드에 대한 산화적 손상을 피할 수 있다는 점이다.

CCK2R에 대해 이용가능한 풍부한 구조-기능 정보와는 대조적으로, 프로가스트린 및 Ggly와 같은 비-아미드화된 가스트린에 대한 수용체의 동정에 대해서는 여전히 논란의 여지가 있다. Ggly 및 프로가스트린이 Ru 및 In 금속 모두와 고친화도로 결합한다는 인식은 비아미드화 된 가스트린에 대한 수용체를 동정하는 새로운 도구를 제공한다. 상기 나열된 Ru 및 In 동위원소는, SPECT 또는 PET에 의해서, 상기 수용체를 발현하는 종양 및 다른 질병 상태의 위치 및 그에 따른 동정에 매우 적합할 것으로 기대된다.

상기 8 개 양태 중 임의의 하나 이상의 구현예에서, 상기 아미드화 또는 비-아미드화 된 가스트린은, 특징적인 가스트린 펜타글루타메이트 서열의 5개 글루타메이트 잔기들 중 적어도 3개를 포함하는 것이다.

상기 8 개 양태 중 임의의 하나 이상의 구현예에서, 상기 아미드화 또는 비-아미드화 된 가스트린은, 특징적인 가스트린 펜타글루타메이트 서열의 5개 글루타메이트 잔기들 중 적어도 4개를 포함하는 것이다.

상기 8 개 양태 중 임의의 하나 이상의 구현예에서, 상기 아미드화 또는 비-아미드화 된 가스트린은, 펜타글루타메이트 서열을 포함하는 것이다.

관심대상이 되는 가스트린 내의 펜타글루타메이트 서열, 및 실제 그 안에 포함되는 글루타메이트 잔기의 개수에 대한 전술한 3가지 서술은, 특히 결합된 방사성 금속을 갖는 가스트린이, 환자에 투여되는 것과 같은 사용 이전에 실제로 생성되는 경우의 구현예들에 적용가능하다. 이러한 관점에서, 복합체 중에 사용된 가스트린 및 본 발명의 방법은, 펜타글루타메이트 서열을 함유하지 않는 미니가스트린 11과 같은 가스트린 유도체와는 명확하게 구별된다.

펜타글루타메이트 서열의 글루타메이트 잔기 중 5개 모두가 존재하는 것이 필수적이지 않을 수 있다. 예를 들어, glu6가 ala로 치환된 Ggly는 모 펩티드와 유사한 친화도로 2개의 Fe에 여전히 결합한다. 본 발명의 실험에서 특정 잔기들은 특히 중요한 것으로서 관찰되었지만, 특징적인 펜타글루타메이트 서열의 천연 글루타메이트 잔기 중 3개가 복합체 및 본 발명의 방법 중에 사용되는 가스트린 중에 존재하는 한, 우수한 결과가 얻어진다. 그러나, 바람직하게는 적어도 4개, 또한 더욱 바람직하게는 천연 글루타메이트 잔기의 5개 모두가 천연 글루타메이트 서열의 형태로 존재한다.

상기 8 개 양태 중 임의의 하나 이상에서, 아미드화 또는 비-아미드화된 가스트린은 킬레이트가 존재하지 않는다. 즉, 가스트린은 루테늄 또는 인듐이 결합하거나 또는 결합하도록 의도된 킬레이트 또는 보결기에 접합하거나, 복합체화되거나, 또는 달리 결합되지 (associated) 않는다. 다시 한번, 이는 본 발명에 사용된 메카니즘과는 근본적으로 다른 메카니즘에 의해서 금속을 결합 및 전달하는 종래기술의 미니가스트린11-DOTA 및 유사 접근법과 구별되는 것이다.

따라서, 특정 구현예에서, 상기 8 개 양태 중 임의의 하나 이상의 가스트린은 DOTA, DTPA, HYNIC 또는 테트라아민 킬레이트 기를 포함하지 않는다.

특정 구현예에서, 상기 8 개 양태 중 임의의 하나 이상의 가스트린은 미니 가스트린 11 또는 미니 가스트린 11 유사체, 데모가스트린 또는 데모가스트린 유사체, 및 DTPA, DOTA 또는 HYNIC 접합 미니가스트린 또는 데모가스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 가스트린이 아니다.

본 발명이 루테늄 또는 인듐의 '비변형된' 가스트린으로의 직접 결합을 이용하고 금속 결합을 허용하도록 특이적으로 첨가된 임의의 기의 접합을 필요로 하지 않는다는 점은 중대한 장점이다. 이는 가스트린 자체가 가스트린/금속 복합체의 제조 도중에 손상될 염려가 적고 현저한 생체 내 안정성을 가질 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예 및 도면만을 참조하여 상세히 설명될 것이다.

상기 개별 섹션들에서 언급된 본 발명의 다양한 특징 및 구현예는, 필요에 따라, 다른 섹션들에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다. 따라서, 한 섹션에서 특정된 특징들은 적절하게 다른 섹션들에서 특정된 특징들과 조합될 수 있다.

하기 실시예는 설명을 위해 제공되며 본 발명의 범위를 결코 제한하지 않는다.

실시예

재료 및 방법

펩티드 및 금속 이온

G아미드 및 Ggly (각각 88 및 93% 순도)를 Auspep (Clayton, 호주)로부터 구입하였다. 불순물은 물과 염으로 구성되어있다. 금속 이온 용액 (Aldrich, St.Louis, MO)은 10 mM HCl 중에서 제조되었으며, 그들의 농도는 National Measurement Institute (Pymble, 호주)에서 유도 결합 플라즈마-원자 방출 분광법 (inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy)에 의해 결정되었다. Ru¹⁰⁶ (6M HCl 중의 2mCi/ml)은 Eckert & Ziegler Isotope Products (Valencia, CA)로부터 구입하였다.

흡수 분광학

증가하는 농도의 금속 이온의 존재하에서, 펩티드 (10 mM 소듐 아세테이트 중 10 μM, pH 4.0, 100 mM NaCl 및 0.005 % Tween 20 함유)의 280 nm 흡수를 완충제 블랭크에 대해서, Cary 5 분광 광도계 (Varian, Mulgrave, 호주)를 사용하여, 298K로 항온처리한 1 ml 석영 큐벳 중에서 측정하였다.

X-선 흡수 샘플 준비, 분광학 및 분석

X-선 흡수 분광법 (XAS)을 위한 샘플은 1 mM 펩티드, 50 mM MOPS, 10 % DMSO 및 동결방지제로서 20 % 글리세롤로 제조하였다. 금속 스톡 용액을 상응하는 나이트레이트 염으로부터 제조하고 최종 농도 2 mM로 적정하였다. 데이터 수집 후, 2 mM Ga 또는 In을 함유하는 샘플을, 비교를 위해서 1 mM Fe로 더욱 적정하였다. 모든 샘플은 데이터 수집 전에 액체 질소 중에서 동결시켰다. XAS 측정은 데이터 수집 프로그램 XAS Collect (29)를 사용하여, 3.0 GeV에서 대략 450 mA를 포함하는 SPEAR 저장 링으로, Stanford Synchrotron Radiation Laboratory에서 수행하였다. 철, 갈륨 및 인듐 K-에지 데이터는, 20-극 2 테슬라 위글러 소스 (wigler source)로 동작하고, Si (220) 이중-결정 단색화 장치 (monochromator)를 이용하는, 구조적 분자 생물학 XAS 빔라인 7-3 상에서 수집하였다. Fe 및 Ga 분광법의 경우, 고조파 제거 (harmonic rejection)를 위해서, 하류 수직 시준 Rh-코팅된 미러 (downstream vertically collimating Rh-coated mirror)를 사용함으로써, 고조파가 컷-오프 위로 떨어지도록 하였다. 입사 X-선 강도는 질소-충진된 이온화 챔버를 사용하여 모니터링하였고, X-선 흡수는 30 개 게르마늄 검출기의 어레이를 사용하여 X-선 Kα 형광 여기 스펙트럼으로서 측정하였다. 솔러 슬릿 어셈블리 (soller slit assembly)를 통해 X-선 형광을 수집하고, 검출기에 등록된 고유 샘플 형광을, 6 또는 9 흡수 단위 두께의 필터 (Fe의 경우 Mn, Ga의 경우 Zn, In의 경우 Ag)를 사용하여 제거하였다. 데이터 수집 도중에, 시료는 액체 헬륨 흐름 크라이오스태트 (cryostat) (Oxford Instruments)를 사용하여 약 10K의 온도에서 유지하였다. 각 데이터 세트에 대해서, 각 샘플에 대해 6-9 스캔을 축적하고, 에너지는 각 스캔과 동시에 측정된 동일한 원소의 참고 호일의 흡수를 참조하여 보정하였다 (철에 대해서 7,111.3, Ga에 대해서는 10,368.2, In에 대해서는 27,940.0eV의 최저 에너지 변곡점을 가정).

EXAFS 진동은 χ(k)를 공지된 방법에 따라서 (George, 1996), 컴퓨터 프로그램의 EXAFSPAK 스위트 (suite)를 사용하여 (http://www-ssrl.slac.stanford.edu/exafspak.html) 곡선-피팅에 의해서 정량적으로 분석하였으며, FEFF v 8.20x5 (Rehr 1991)로 계산된 처음의 이론적 상 및 진폭 함수를 사용하였다. 연장된 X-선 흡수 미세 구조 (EXAFS) 진동 (k = 0 Å^{- 1})의 에너지 문턱값은, Fe의 경우 7,130, Ga의 경우 10,385, In의 경우 27,960 eV로 가정되었다. 철 데이터는 14.2 Å^-1의 k-범위로, Ga는 14.0 Å^-1의 k로, In은 16.2 Å^-1의 k로 수집되었다.

Sep -Pak 정제

Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체는 실온, 1 시간, pH 4.0, 50 mM 소듐 아세테이트 중에서, 250 pmol의 Ru¹⁰⁶ 및 250 pmol의 G아미드를 인큐베이션함으로써 제조하였고, 역상 C18 Sep-Pak 카트리지 (Waters Corporation , Milford, MA) 상에서 정제하였다. Sep-Pak 카트리지는 10 mL의 완충액 A (100 mM 소듐 아세테이트, pH 4), 10 mL의 완충액 B (100 mM 소듐 아세테이트, pH 4, 50 % 아세토니트릴) 및 10 mL의 완충액 A를 통과시킴으로써 먼저 활성화시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 통과시키고, 카트리지를 10 mL의 완충액 A로 세척하여 미결합된 Ru¹⁰⁶을 제거하였다. Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체를 완충액 B로 용출시키고 β-계수기 (Packard, Meriden, CT)로 연속 분획물 (각각 1 mL 씩)의 방사능을 검출하였다. 분획 1 및 2는 Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체를 함유하였고, 완충액 A 중에서 희석하고 HPLC로 주입하기 전에 두 번 여과하거나, 또는 결합 분석을 위해서 결합 완충액 (하기 참조) 중에 재현탁시키기 이전에 2 mL로부터 100 μL 근방까지 Speed Vac (Savant, Hicksville, NY) 중에서 조합 및 건조시켰다.에서 2 mL 내지 약 100 μL로 건조시켰다.

HPLC 정제

Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체 (하기에 추가로 논의)는, 완충액 A 중에서 55 분에 걸쳐서 0 부터 1 M NaCl까지의 구배로, 1 mL/분의 흐름 속도에서, Protein-Pak Q 8HR (5 x 50 mm, Waters Corporation) 상의 음이온 교환 HPLC에 의해서 정제하였다. 1 mL 분획 중의 방사능은 β-계수기 (Packard, Meriden, CT)로 측정하였다.

곡선 피팅 및 통계

프로그램 BioEqs로 데이터 (평균 ± S.E.M.으로 표현)를 1-부위 또는 2-부위 정렬된 모델 (도 1에 따라서)에 피팅시켰다. G아미드 및 Ggly와 제2 철 이온의 상호작용에 대해서 표 1에 주어진 실험적으로 결정된 평형 상수 및 흡수 비율은, 제2 철 이온의 존재 하에서 다른 금속 이온들과 G아미드 및 Ggly와의 상호작용에 대한 데이터를 피팅하는 동안 일정하게 유지되었다.

결과

금속 이온의 가스트린에 대한 결합

철 결합: pH 4.0에서 G아미드 및 Ggly의 흡수 스펙트럼 및 형광에 대한 Fe^{3 +} 이온의 첨가 효과는 이전에 보고된 바 있다 (Baldwin, 2001). 형광 데이터의 선형 변환의 피팅은 도 1에 표시된 바와 같이, μM 친화도로 2 개의 결합 부위들과 일치하였다. 새로운 흡수 데이테 세트를 얻었으며, 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 Bioeqs 프로그램으로 피팅시켰다. G아미드의 경우 3.0 x 10^-10 및 8.5 x 10^-11 M, Ggly의 경우 5.7 x 10^-9 및 7.0 x 10^-9 M의 친화도로, 합리적인 피팅이 얻어졌다 (표 1). 도 1에 도시된 바와 같이, 2 부위 모델에서 가스트린은 해리 상수 K_d1M 및 K_d2M으로 2 개의 금속 이온과 결합한다. 2 부위 경쟁 모델에서 가스트린은 해리 상수 K_d1Fe와 K_d2Fe로 두 개의 제2 철 이온과 결합하고, 두 개의 금속 이온 M은 해리 상수 K_d1M과 K_d2M로 동일한 두 부위에 결합한다. 해리 상수 K_d3M은 혼합된 Fe가스트린M 복합체의 형성을 서술한다.

Fe2Ggly의 EXAFS 특성

Fe^III ₂Ggly의 XAS K-에지 니어 에지 스펙트럼 (도 2)은 1s → 3d (t_2g) 및 1s → 3d (e_g) 전이로부터 발생하는, 7,114 eV에 중심을 둔 프리-에지 피크를 나타낸다. 이들 피크 사이의 상대적으로 큰 분리 (Δ = 1.2eV)는 더 낮은 t_2g 수준에 상대적인 e_g 수준의 상승으로부터 야기되며, 저 스핀 제2 철을 나타내는 것이다. 이러한 큰 스플리팅은 또한 제2 철 이온이 글루타메이트 곁 사슬의 카르복실레이트 도너에 의해서 주로 배위결합한다는 예상과도 일치하는 것이다.

Fe^III ₂Ggly EXAFS 데이터 (도 3A- K-에지 연장된 X-선 흡수 미세 구조 (EXAFS) 스펙트럼 (A, C, E, G, 실선 흑색 굵은 선) 및 Ggly와 Fe^{3 +} 이온 (A, B), Ga³⁺ 이온 (C, D), In^{3 +} 이온 (E, F) 또는 Ru^{3 +} 이온 (G, H)과의 복합체에 대한 대응하는 푸리에 변환 (B, D F, H)이 표 2에 열거된 단일 산란 경로 파라미터들을 사용하여 계산된 최적 피트 (적색/옅은 색 및 더 얇은 선)과 함께 도시됨)는 2 Å 바로 아래의 Fe-O 후방산란 상호작용 및 ~3.3 Å에서의 외부 외피 후방산란 Fe…Fe 상호작용에 의해 지배된다. 데이터에 대한 최적 피트는 단일 산란 경로를 사용하여 획득되었으며, 이는 1.90 Å에서 2개의 짧은 Fe-O 후방 산란 상호 작용, 2.03 Å에서 4Fe-O, 2.57 Å에서 1 Fe…C 상호 작용, 2.96 Å에서 2 Fe…C 상호 작용 및 3.33 Å에서 단일 Fe…Fe 상호 작용을 포함한다 (표 2). 구조적 파라미터들은, 메탄 모노옥시게나아제 및 유사 이-철 복합체와 같은 이철 비-헴 철 결합 단백질들 (diferric non-heme iron binding proteins)을 연상시키는데, 여기에서 철 원자들은 상대적으로 서로 가까우며, 금속 중심들 사이의 가교화 카르복실레이트들을 포함하는 복수의 카르복실레이트들에 의해서 결합된다. 배위결합 리간드의 개수 및 EXAFS 데이터 중 두드러지게 나타나는 더 긴 범위의 Fe…C 산란 상호작용에 기초할 때, 두 개의 제2 철 이온들은 적어도 하나의 가교화 카르복실레이트와 카르복실레이트 공여체에 의해서 주로 결합된다. 또한 피트 중의 더 짧은 Fe-O 결합 길이 (1.90 Å)의 포함에 대해서 명백한 선호성이 존재하는데, 비록 Fe^{3 +}에 대한 모노-덴테이트 카르복실레이트 공여체가 또한 유사한 복합체 중에서 원자간 거리의 이러한 범위에도 들어갈 수 있기 때문에 핵간 분리가 이러한 경우 특히 진단적이지는 않다고 하더라도, 이는 가교화 산소 원자들, 아마도 O^2- 또는 OH^-를 나타내는 것일 수 있다.

EXAFS 데이터는 단일 Fe…Fe 산란 상호 작용에 가장 잘 맞았다. 이러한 관찰은 Ggly가, 도 4에 나타낸 바와 같이, 이-철 배위결합 환경에서 Fe^{3 +}를 결합한다는 것을 나타내는 바, 이는 도 3에 제시된 EXAFS 데이터에 기초한 Fe^III ₂Ggly 구조의 제안된 모델이지만, Ggly 및 돌연변이 펩티드에 대한 이전 NMR 및 가시 분광학 연구와도 일치하는 것이다. 도 4의 모델 중 2개의 Fe^III 이온들은 글루타메이트 6, 7, 8, 9 및 10의 카르복실레이트 곁사슬에 의해서 배위결합되며, 이때 글루타메이트 7은 두 개의 Fe^III 이온들 모두에 대한 리간드로 작용한다. 두 개의 산소들은 또한 두 개의 Fe^III 이온들 사이의 가교로서도 작용한다. 간편성을 위해서 펩티드 백본 및 비-배위결합 곁사슬들은 생략되었다. 이-철 배위결합 환경 중에서 Fe^{3 +}의 Ggly 결합은 어떠한 부가적인 제2 철 이온들의 눈에 띄는 모집 없이도 발생되는데, 이는 철-카르복실레이트 복합체의 다핵 소분자 결정구조 중에서 종종 직면하는 것이다. Fe…C 상호작용은 각각의 철 중심이 가교화 상호작용에 관여하지 않는 적어도 하나의 부가적인 카르복실레이트 뿐만 아니라, 최대 두 개의 가교화 카르복실레이트와 상호작용한다는 것을 의미한다.

갈륨 결합: 도 5에 도시된 바와 같이, Ga^{3 +} 이온의 첨가는 pH 4.0에서 G아미드 및 Ggly 모두에 대해 280 nm에서 흡광도의 증가를 야기하였다. 도 5에서, pH 4.0에서 페릭 클로리드 (▲) 또는 갈륨 나이트레이트 (▼)의 분획을, 10 mM Na⁺ 아세테이트, 100 mM NaCl, 0.005% Tween 20 중 10 μM G아미드 또는 Ggly에 298K에서 첨가하는 것은, 2.0의 몰 비율까지 280 NM에서 흡광도를 증가시키는 것으로 관찰되었고, 프로그램 Bioeqs로 피팅은 G아미드에 대해 3.3 x 10^-7 및 1.1 x 10^-6 M 또한 Ggly에 대해 1.7 x 10^-8 및 2.3 x 10^-6 M의 Ga^{3 +}에 대한 친화도를 산출하였다 (표 1). 도 5에서 점들은 적어도 3 개의 개별 실험을 의미하고; 막대는 SEM을 나타낸다. 선은 프로그램 BioEqs로 도 1에 도시된 2 가지 부위 모델에 대한 최적 피트를 나타내며, 적절한 K_d 및 최대 흡광도 값은 표 1에 주어진다.

Ga₂Ggly의 EXAFS 특성화

Ga^III ₂Ggly EXAFS 푸리에 변환 (도 3d)의 주요 후방 산란 피크가 더욱 대칭으로 나타나지만, 2 개의 분리된 Ga-O 후방 산란 상호작용, 1.88 Å에서 2 개 및 1.99 Å에서 3 개를 포함시킴으로써 현저하게 개선된 피트들이 얻어졌다. 1.88 Å에서 세 번째 Ga-O 후방 산란자를 포함시키는 것이 피트에서 거의 변화를 야기하지 않았다는 사실은, 비록 혼합물도 배제될 수는 없지만, Ga^{3 +} 중심이 5-또는 6-배위일 수 있다는 것을 의미한다. EXAFS 데이터 (도 3C)는 또한 3.05 Å에서의 Ga…Ga 후방 산란 상호작용을 명확하게 나타내고, Ga^III ₂Ggly 데이터 (표 2)에 사용된 단일 산란 경로 모델로부터의 결과는 이-철 EXAFS 모델과 잘 일치한다. 구조적 의미는 Ga³⁺가 Ggly를와 배위결합할 때 이-핵 배위결합 부위의 지역적 배위결합 환경에 최소한의 구조적 변화를 야기하면서 Fe³⁺를 대체하는 것으로 보인다는 점이다.

인듐 결합:도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, In^{3 +} 이온의 첨가는 pH 4.0에서 G아미드 또는 Ggly에 대한 280 nm에서의 흡광도의 증가를 거의 야기하지 않았다. 도 6의 그래프는 완충액 중 10 μM G아미드 또는 Ggly에 인듐 나이트레이트 (▼)의 분취량을 첨가함으로써 얻어진 것이며, 페릭 클로리드 (▲)의 분취량 첨가에서 관찰되는 변화와 비교할 때, 280 nm에서의 흡광도 변화를 거의 야기하지 않았다. 그러나, 3.99 (■) 또는 39.85 μM (●) 인듐 나이트레이트의 존재 하에서, 페릭 클로리드의 분취량 첨가시 관찰되는 흡광도 변화는 인듐 나이트레이트 부존재시에 관찰되는 변화와는 상당히 다른 것이었다. 점들은 3회의 개별적인 실험들의 평균이며; 막대는 SEM을 나타낸다. 선들은 데이터를 프로그램 BioEqs로 도 1에 도시된 2 부위 경쟁 모델에 피팅시킴으로써 얻어진 해리 상수 및 최대 흡광도 수치 (표 1)로 구축하였다.

39.85 μM In3+ 이온의 존재 하에서, Fe^{3 +} 이온의 첨가시 G아미드 및 Ggly 모두에 대한 280 nm에서 흡광도는 빠르게 증가하였으며, 단일 부위 결합에 대해서 예상되는 곡선에 근사하고, 최대 흡광도는 몰 비율 1 근방에서 도달하였음이 명백하다. 이러한 관찰들은 In^{3 +} 이온이 Fe^{3 +} 이온보다 큰 친화도로 첫 번째 Fe^{3 +} 이온 결합 부위에 결합할 수 있지만, 흡광도에 아무런 변화를 야기하지 않는다는 가설과 부합되는 것이다. 실제로, In^{3 +} 이온은 Fe^{3 +} 이온 결합 부위들 모두에 대해서 경쟁하는 것으로 보이는데, 이는 In^{3 +} 이온 농도가 증가함에 따라 얻어지는 곡선들의 패밀리가 프로그램 Bioeqs로 도 1에 제시된 경쟁적 2 부위 모델에 합리적으로 잘 피팅되기 때문이다. 첫 번째 Fe^{3 +} 이온 결합 부위에 대한 이온들의 최선의 피트 친화도는 Fe^{3 +} 이온에 대한 것보다 상당히 높았으며, 각각 In^{3 +}에 대해서 6.5 x 10^-15이고, G아미드 및 Ggly에 대해서 2.1 x 10^-13 M의 K_d 값을 보였다 (표 1).

In ₂ Ggly의 EXAFS 특성화

In^III ₂Ggly에 대한 EXAFS 푸리에 변환 (도 3F)은 2.1 Å을 중심으로 하는 주요 후방 산란 피크의 짧은 거리 측면 상에서 쇼울더 (shoulder)를 나타내며, 짧은 In-O 후방 산란 상호작용의 포함은 피팅을 현저하게 향상시켰다. EXAFS 데이터의 k-범위 (도 3E)를 14 Å로 줄이면, 푸리에 변환에서의 이러한 명백한 피크가 낮은 k-범위 데이터에서 합리적으로 잘 표현된다는 것을 확인해주며, 그렇지 않으면 가벼운 원자들, 예를 들어 산소와의 후방 산란 상호작용에 대해 예상되고, 노이즈 또는 다른 인공물에 기인하지는 않는다. 전체적으로 EXAFS 데이터에 대한 최선의 피트는 2.13 Å에서 5 개의 등가 In-O 후방 산란 상호작용뿐만 아니라, 1.98 Å에서 단일 짧은 금속-O 원자 경로를 포함시킴으로써 얻어졌다. In…In 후방 산란 상호작용은 3.26 Å에서 관찰되었다. In^III ₂Ggly에 대한 피트 파라미터가 모 Fe^III ₂Ggly 복합체에 대해 사용된 것과 합리적으로 잘 일치한다는 사실은, Ga^{3 +}와 마찬가지로, In³⁺가 이-인듐 결합 환경 내에서 Fe^{3 +} 복합체와 유사한 구조로 Ggly에 배위결합한다는 것을 암시한다.

루테늄 결합: 도 7에 나타낸 바와 같이, 결합 실험이 In^{3 +} 이온 대신에 Ru^{3 +} 이온으로 반복될 때 유사한 곡선 패밀리가 얻어졌다. 도 7의 그래프는 완충액 중 10 μM G아미드 또는 Ggly에 루테늄 클로리드 분취량이 첨가되는 것 (▼)으로부터 얻어진 것이며, 이는 280 nm에서 흡광도 증가를 야기하였고, 이는 페릭 클로리드의 분취량을 첨가함으로써 관찰된 것 (▲)보다는 상당히 작은 것이다. 그러나, 5.30 (■) 또는 26.48 μM (●)의 루테늄 클로리드가 존재할 경우, 페릭 클로리드 분취량을 첨가했을 때의 흡광도 변화는 루테늄 클로리드가 존재하지 않을 경우에 관찰되는 것과는 상당히 달랐다. 점들은 3 회의 개별적인 실험들로부터의 평균이고; 막대는 SEM을 나타낸다. 선들은 데이터를 프로그램 BioEqs로 도 1에 도시된 2 부위 경쟁 모델에 피팅시킴으로써 얻어진 해리 상수 및 최대 흡광도 수치 (표 1)로 구축하였다.

루테늄 및 인듐 관찰된 결과들 사이의 주된 차이는, Ru^{3 +} 이온 자체의 첨가는 pH 4.0에서 G아미드 및 Ggly 모두에 대해서 280 nm에서 흡광도를 주목할 만하게 증가시켰다는 점이다. 그럼에도 불구하고, Ru^{3 +} 이온의 농도를 증가시키면서 얻어진 곡선들의 패밀리는 도 1에 제시된 경쟁적 2 부위 모델에 대한 프로그램 Bioeqs와 잘 피팅되었다. 첫 번째 Fe^{3 +} 이온 결합 부위에 대한 Ru^{3 +} 이온의 최선 피트 친화도는 다시 한번 Fe^{3 +} 이온에 대한 것보다 훨씬 더 높았으며, Ru^{3 +}에 대한 K_d 수치는 G아미드 및 Ggly에 대해서 각각 2.6 x 10^-13 및 5.3 x 10^-15 M이었다 (표 1).

Ru₂Ggly의 EXAFS 특성

디-Ru³⁺ 복합체 (도 3H)의 EXAFS 푸리에 변환은 조사된 다른 복합체의 EXAFS 푸리에 변환과 크게 다르며, ~ 2.1 Å 및 ~ 2.4 Å에 중심을 둔 2 개의 강한 후방 산란 피크를 나타낸다. 도 3H의 푸리에 변환 피크의 크기는 도 3B, D 및 F에 도시된 다른 복합체의 푸리에 변환 피크의 크기에 비해 크게 감소하고, 개별적인 Ru 산란 경로 사이의 현저한 상쇄의 결과이다. 데이터에 대한 최선의 피트는 RuRu 코어, 가교화 카보네이트 및 O-원자 및 Ru 중심들 중 하나에 결합된 단일 클로리드로 완성된 나머지 배위결합을 함유하는 이핵성 Ru^III 복합체를 사용하여 얻어졌다 (도 4B). EXAFS (데이터 FIG 3G) 실험이 Ru 중심 주위의 모든 배위결합 환경의 중첩을 동시에 제공하기 때문에, 피트 파라미터 (fit parameter) (표 2)는 비-균등 배위결합 환경을 나타내기 위해서, ~2.4 Å에서 O-원자의 분획 점유 뿐만 아니라 Cl의 분획 점유도 필요로 하였다. 이러한 혼합된 이핵 배위결합 환경은 또한 실험 데이터에 의해서 나타내지는 최대 EXAFS 상쇄를 제공하였다. Ru 중심들 사이의 짧은 핵간 분리 (2.4 Å)는 직접 금속-금속 결합을 나타낸다.

요약하면, 자외선 흡수 분광법에 의한 상당수의 금속 양이온의 체계적인 스크리닝은 Ggly 및 G아미드 모두가 Fe^{3 +} 이외에도 Ga^{3 +}, In^{3 +} 또는 Ru^{3 +}를 결합한 것으로 나타났다. 3가 갈륨 양이온을 사용하면 증가하는 농도의 Ga^{3 +} 존재 하에서 가스트린의 흡수 변화가, 가스트린/G아미드에 대한 해리 상수 (K_d) 0.33 및 1.1 μM 또는 3.3 x 10^-7 및 1.1 x 10^-6 M과, Ggly에 대한 1.7 x 10^-8 및 2.3 x 10^-6 M로 2 부위 모델에 의해서 피팅되었다. 비록 가스트린의 흡수는 In^{3 +} 이온의 첨가에 따라 변하지 않았지만, 인듐 이온의 존재 하에서의 Fe^{3 +} 이온 결합에 대한 흡광도의 변화는, In³⁺에 대한 K_d 값이 6.5 x 10^-15 및 1.7 x 10^{- 7}으로 2 부위 경쟁적 모델에 의해서 피팅되었다. 유사한 결과가 Ru^{3 +} 이온에 대해서 얻어졌으며, Ru^{3 +}에 대한 K_d 값은 2.6 x 10^-13 및 1.2 x 10^-5 M이었다 (표 1). 상기 결과는 가스트린/G아미드 및 Ggly 모두가 제2 철 또는 갈륨 이온보다 훨씬 더 높은 친화도로 3 가의 인듐 또는 루테늄 이온에 선택적으로 결합함을 보여준다.

표 1. G아미드 및 Ggly에 의한 금속 이온들의 결합 - 제2 철 이온이 G아미드 또는 Ggly에 결합하는 친화도, 및 280 nm에서의 백분율 흡광도 변화는, 프로그램 BioEqs로, 이전에 논의된 적당한 도면들 중 서술된 흡광도 실험들에서 얻어진 평균 데이터들을 피팅함으로써 결정되었다.

표 2. EXAFS 곡선 피팅 결과 - 배위결합 숫자, N, 원자 거리 R (Å), Debye-Waller 인자 σ² (Ų) 및 임계 에너지 시프트 ΔE₀ (eV)는 EXAFS 곡선 피팅으로부터 유도되었다. 피트 오차 파라미터 F는

로 정의되고, 데이터 포인트들 이상의 가중 (summation)은 피트 중에 포함되었다. 괄호 안의 수치들은 공분산 행렬의 대각 요소 (diagonal elements of the covariance matrix)로부터 얻어진 것이며; 이들은 정밀도 (precisions)이고, 비록 상대 정확도 (예를 들어, 두 개의 다른 Fe-O 결합 길이를 비교)가 정밀도에 더 유사할 것이지만, 더 클 것으로 예측되는 정확도 (accuracies)와는 다른 것이다 (R에 대해서 약 ±0.02 Å, N 및 σ²에 대해서 ±20%).

Ru1 ⁰⁶ - G아미드 복합체의 정제 및 안정성

Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체의 정제의 첫 번째 단계는 C18 SepPak 카트리지를 사용 하였다. 미결합된 Ru¹⁰⁶은 초기 흐름을 통해서 컬럼을 통과한 반면, Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체는 분획 1 및 2 중에서 용출되었다 (도 8A). Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체를 더욱 정제하기 위해서, C18 SepPak 카트리지로부터의 분획 1 및 2를 풀링하고, 음이온-교환 HPLC로 처리하였다 (도 8B). 분획 11에서 발견된 방사능은 G아미드 흡수 피크와 명확하게 일치한다. 유사한 결과가 Ru¹⁰⁶-Ggly 복합체로 얻어졌다 (데이터는 나타내지 않음). 중요하게는, Ru¹⁰⁶-아미드화된 가스트린 복합체는 중성 pH에서 16.8 ± 3.2 일의 반감기로 매우 안정하다.

상세하게는,도 8A에 나타낸 데이터에 대하여, 100mM 소듐 아세테이트 pH 4 중의 Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체 (두 세트의 각 세트에서 가장 오른쪽에 있는 더 어두운 음영 막대)를 C18 Sep-Pak 카트리지로 결합시켜서 미결합된 Ru¹⁰⁶으로부터 분리시킨 다음, 10 mL 100 mM 소듐 아세테이트 pH 4로 세척하고, 50% 아세토니트릴을 함유하는 100 mM 소듐 아세테이트 pH 4의 1 mL 분취액으로 용출시켰다. Ru¹⁰⁶ (두 막대의 각 세트에서 가장 왼쪽에 있는 더 밝은 음영 막대)만을 카트리지에 적용하면, 대부분의 방사능이 초기 세척에서 발견되었다. 도 8B에 대하여, Ru¹⁰⁶-G아미드 복합체를 55분에 걸쳐서 10 mM 소듐 아세테이트 pH 4 중 0 내지 1M NaCl의 지시된 선형 구배를 사용하여 음이온 교환 HPLC로 추가로 정제 하였다. 각 1ml 분획의 방사능은 수직 막대로 표시된다.

본 발명의 다양한 구현예에 대한 상기 설명은 관련 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 설명을 목적으로 제공된다. 이는 본 발명만에 대한 한정적인 것이나, 본 발명을 단일 개시된 구현예로만 제한하고자 하는 것은 아니다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 대한 다수의 대안 및 변형은 상기 교시의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 몇몇 대안적인 구현예가 구체적으로 논의되었지만, 다른 구현예는 통상의 기술자에 의해 명백하거나 비교적 쉽게 개발될 것이다. 따라서, 본 특허 명세서는 본 명세서에서 논의된 본 발명의 모든 대안, 변형 및 변이, 및 전술한 발명의 사상 및 범위 내에 있는 다른 구현예들을 포함하는 것으로 의도된다.

후속 청구범위 및 전술한 발명의 설명에서, 명시적인 언어 또는 필요한 함의로 인해서 문맥이 명확하게 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하는 (comprise)", 또는 "포함하는 (comprises)" 또는 "포함하는 (comprising)"을 포함하는 그 변형은 포괄적 의미로 사용된 것으로서, 본 발명의 하나 이상의 구현예에서 추가적인 정수의 존재 또는 부가를 배제함 없이, 명시된 정수의 존재를 특정하기 위한 것이다.

참고문헌

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Claims (28)

1. 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 비-아미드화된 가스트린의 상승된 농도와 관련된 환자에서 상태의 치료 또는 예방 방법.
2. 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속을 비-아미드화된 가스트린에 결합시키는 단계를 포함하는, 비-아미드화된 가스트린의 활성을 조절하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 금속이 상기 환자에게 투여되어 상기 금속이 상기 비-아미드화된 가스트린의 제2 철 결합 부위에 결합하는 것인 방법.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인듐 및 상기 루테늄이 In^{3 +} 및 Ru³⁺ 형태인 것인 방법.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인듐 및 상기 루테늄이 인듐 및 루테늄의 방사성 동위원소인 것인 방법.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속이 유리 이온을 함유하는 용액의 일부일 수 있거나 또는 상기 금속이 화합물 또는 염의 성분일 수 있는 것인 방법.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속이 상기 비-아미드화된 가스트린과 접촉하게 될 때 킬레이트 기에 결합되지 않는 것인 방법.
8. 청구항 1 또는 청구항 3 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상태가 대장 암종, 가스트리노마 (gastrinoma), 섬 세포 암종 (islet cell carcinomas), 난소 종양 (ovarian tumors), 뇌하수체 종양, 갑상선 수질 암종, 성상 세포종, 소세포 폐암, 수막종, 자궁내막 및 난소 선암, 유방 암종, 위장관 기질 종양, 위 소장췌장 종양 (gastro enteropancreatic tumors), 위축성 위염 (atrophic gastritis), G 세포 과형성, 악성 빈혈, 신부전, 궤양성 대장염, 위장관 궤양, 식도 역류, 위 암종, 및 졸링거-엘리슨 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간 또는 가축 또는 반려 동물을 포함하는 포유류인 것인 방법.
10. 청구항 2에 있어서, 상기 비-아미드화된 가스트린의 조절이 그 정상 생물학적 활성에서의 감소인 것인 방법.
11. 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속의 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, CCK 수용체의 과발현과 관련된 환자에서 상태의 치료 또는 예방 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 금속이 상기 환자에게 투여되어 상기 금속이 아미드화된 가스트린의 제2 철 결합 부위에 결합하고, 상기 아미드화된 가스트린이 상기 CCK 수용체에 결합할 때, 상기 수용체를 제공하는 세포 내부로 내부화되는 것인 방법.
13. 아미드화된 가스트린을 금속과 접촉시킴으로써 상기 금속이 상기 아미드화된 가스트린에 결합하도록 하는 단계 및 상기 아미드화된 가스트린이, 결합된 금속과 함께, CCK 수용체와 접촉하여 세포 내로 내부화되도록 하는 단계를 포함하는, 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속을 CCK 수용체를 발현하는 세포 내로 전달하는 방법.
14. 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCK 수용체가 CCK-2 수용체인 것인 방법.
15. 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인듐 및 루테늄이 방사성 동위원소인 것인 방법.
16. 청구항 11 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 치료 또는 예방되는 상기 상태, 또는 상기 금속을 상기 세포 내로 전달하는 목적이, 대장 암종, 가스트리노마, 섬 세포 암종, 난소 종양, 뇌하수체 종양, 갑상선 수질 암종, 성상 세포종, 소세포 폐암, 수막종, 자궁내막 및 난소 선암, 유방 암종, 위장관 기질 종양, 위 소장췌장 종양, 위축성 위염, G 세포 과형성, 악성 빈혈, 신부전, 궤양성 대장염, 위장관 궤양, 식도 역류, 위 암종, 및 졸링거-엘리슨 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 상태를 치료 또는 예방하기 위한 것인 방법.
17. 가스트린을 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속과 접촉시키는 단계를 포함하는 가스트린-금속 복합체를 형성하는 방법.
18. 가스트린 및 상기 가스트린의 제2 철 결합 부위에 결합 또는 복합체화된 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속을 포함하는 복합체.
19. 청구항 17의 방법 또는 청구항 18의 복합체에 있어서, 상기 가스트린이 아미드화된 가스트린 또는 비-아미드화된 가스트린인 것인 방법 또는 복합체.
20. 청구항 11 내지 17 중 어느 한 항의 방법 또는 청구항 18 또는 19의 복합체에 있어서, 상기 금속이 상기 가스트린과 접촉하게 될 때 킬레이트 기에 결합되지 않는 것인 방법 또는 복합체.
21. CCK 수용체 양성 암을 진단하는 방법으로서,
    (i) 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속 방사성 동위원소와 복합체화된 아미드화된 가스트린을 포함하는 아미드화된 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체를 환자에게 투여하는 단계;
    (ii) 상기 아미드화된 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체가 CCK 수용체에 결합되게 하는 단계; 및
    (iii) 상기 아미드화된 가스트린-금속 동위원소 복합체에서 상기 금속 방사성 동위원소의 존재를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 금속이 결합된 상기 아미드화된 가스트린이 킬레이트 기와 접합, 복합체화 또는 달리 결합되지 (associated) 않음으로써, 상기 CCK 수용체 양성 암을 진단하는 방법.
22. 비아미드화 가스트린에 대한 수용체의 검출 방법으로서:
    (i) 인듐 및 루테늄으로부터 선택된 금속 방사성 동위원소와 복합체화된 비-아미드화 가스트린을 포함하는 비-아미드화 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체를 환자에게 투여하는 단계;
    (ii) 상기 비-아미드화된 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체가 상기 수용체에 결합되게 하는 단계; 및
    (iii) 상기 비-아미드화 가스트린-금속 방사성 동위원소 복합체에서 상기 금속 방사성 동위원소의 존재를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 금속이 결합된 상기 비-아미드화된 가스트린이 킬레이트 기와 접합, 복합체화 또는 달리 결합되지 않음으로써, 상기 비아미드화된 가스트린 수용체를 검출하는 방법.
23. 청구항 21 또는 22에 있어서, 상기 복합체가 PET 또는 SPECT에 의해서 검출되는 것인 방법.
24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 ¹⁰⁹In, ¹¹⁰In, ¹¹¹In, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Ru 및 ¹⁰⁶Ru로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
25. 청구항 1 내지 17 및 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 아미드화 또는 비-아미드화된 상기 가스트린이 특징적인 가스트린 펜타글루타메이트 서열의 5개 글루타메이트 잔기 중 적어도 3개를 포함하는 것인 방법.
26. 청구항 1 내지 17 및 청구항 19 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속이 결합되고, 아미드화 또는 비-아미드화된 상기 가스트린이, 킬레이트 기와 접합, 복합체화 또는 달리 결합되지 않는 것인 방법.
27. 청구항 1 내지 17 및 청구항 19 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속이 결합된 상기 가스트린 펩티드가, DOTA, DTPA, HYNIC 또는 테트라아민 킬레이트 기를 포함하지 않는 것인 방법.
28. 청구항 1 내지 17 및 청구항 19 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가스트린이 미니 가스트린 11 또는 미니 가스트린 11 유사체, 데모가스트린 또는 데모가스트린 유사체, 및 DTPA, DOTA 또는 HYNIC 접합 미니가스트린 또는 데모가스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 가스트린이 아닌 것인 방법.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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