KR20170102253A - 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법, 더욱 구체적으로 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ) 및 장내독소생성 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)(ETEC)와 같은 다양한 박테리아에 의해 유발되는 설사에 대해 상승작용적 보호를 야기하는 불활성화된 박테리아 전체 세포와 산 안정화된 rCTB(재조합 콜레라 독소 B)의 배합물에 관한 것이다.

Description

산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법{PROCESS FOR FORMULATING ACID STABILIZED ORAL BACTERIAL VACCINE}

본 발명은 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법, 더욱 구체적으로 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ) 및 장내독소생성 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli )(ETEC)와 같은 다양한 박테리아에 의해 유발되는 설사에 대해 상승작용적 보호를 야기하는 불활성화된 박테리아 전체 세포와 산 안정화된 rCTB(재조합 콜레라 독소 B)의 배합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 쉽고 고도로 수용 가능한 투여 방식을 야기하는 투약 형태의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.

설사는 공중보건에서 세계적인 위협으로 남아있다. 설사의 주요 원인은 특정 박테리아, 바이러스 또는 기생충, 식품 불내성 등을 포함한다. 콜레라에 의한 사망률(mortality)은 매년 28000-142000명이고, 이환율(morbidity)은 매년 1,400,000-4,300,000명으로 추정된다(Cholera 2013: Weekly epidemiological record. WHO 2014, 89, 345-356).

일반적으로, 많은 양의 물이 소장 내강으로 분비되지만, 대장에 도달하기 전에 이 물의 상당 부분이 효율적으로 흡수된다. 소강 내강으로의 물 분비가 흡수를 초과하는 상태는 설사라고 불린다. 그것은 사람이 복부 경련, 팽만감, 메스꺼움 및 느슨하고 물기가 많은 변으로 고통받는 상태이다. 대부분의 경우, 설사의 징후 및 증상은 보통 이틀 정도 지속될 수 있다. 그러나 때때로 설사가 수주 동안 지속될 수 있으며 이러한 상황에서 이것은 심각한 장애의 징후이므로 조기 치료가 필요하다.

설사의 주요 원인은 소화계 및 사람의 장운동에 영향을 미치는 특정 박테리아, 바이러스 또는 기생충, 음식 불내성 등을 포함한다.　 장내독소생성 에쉐리키아 콜라이의 감염(이하 'ETEC')은 여행자성 설사의 주된 원인이며 개발도상국에서, 특히 어린이들 사이에서 설사 질환의 주요 원인이다. ETEC는 동물이나 인간의 배설물로 오염된 음식이나 물에 의해 전염된다. 쉬겔라(Shigella)라고 불리는 다른 박테리아는, 박테리아에 노출된 후 (종종 피가 섞인) 설사, 열, 및 위 경련을 수반하는 세균성 이질 질환을 유발한다. 비록 비브리오 콜레라 및 ETEC과 같은 다른 장내독소생성 박테리아는 정확히 동일한 메커니즘으로 분비 설사를 일으키지만 콜레라는 훨씬 더 심각한 형태의 설사이다.

콜레라는 비브리오 콜레라에 의해 분비된 장독소에 의해 유발되는 잠재적으로 전염성인 생명을 위협하는 분비 설사이고, 종종 구토가 동반되는, 다수의 다량의 물기가 많은 대변으로 특징지어지며, 저혈량성 쇼크 및 산성혈증을 유발하여 치료하지 않으면 치명적이다. 비록 콜레라 증상을 유발할 수 있는 많은 브이. 콜레라(V. cholera) 혈청군이 있지만, 99%의 경우에서 콜레라의 가장 심각한 증상은 O1 혈청군 및 O139 혈청군에 의해 유발되는 것으로 밝혀졌다.

콜레라로 인한 설사는 위생상태가 좋지 않고 부적합한 환경 관리 지역에 살고 있는 인구에서 가장 흔하다. 개발 도상국 및 후진국에서는 더 큰 위험에 처해있다. 전형적인 위험 지역은, 기본적인 기반 시설을 이용할 수 없고 깨끗한 물과 위생 시설의 최소 필요요건이 충족되지 않는 근교 도시의 빈민가를 포함한다.

설사 및 콜레라 및 다른 장내 감염을 일으키는 요인은 현재 통제가 불가능하며, 이러한 맥락에서, 백신은 매우 중요한 역할을 한다. 지난 몇 년 동안, 전체 비브리오 콜레라의 불활성화된 세포 또는 약독화된 세포로부터 유래된 다른 유형의 경구용 콜레라 백신(이하 'OCV')을 개발하려는 시도가 있어 왔다. 세계보건기구(WHO)는 콜레라 전염병 예방하기 위해 OCV 사용을 권고한다.

상기 주제를 다루는 다수의 특허 및 비-특허 문헌이 있다. 비-특허 문헌으로 논문(Stertman, L. 2004, 'Starch Microparticles as an Oral Vaccine Adjuvant with emphasis on the Differentiation of the Immune response' Faculty of Pharmacy 317.56pp Uppsala. ISBN 91-554-6101-8)은, rCTB의 구강활성이 입자를 장용성 코팅함으로써 위장관을 통한 이동을 견딜 수 있어 개선될 수 있다고는 기재하였으나, 장용성 코팅된 rCTB 및 브이. 콜레라 박테리아의 전체 세포의 상승작용적 활성을 제시하지는 않는다. 또 다른 비-특허 문헌('Travel Medicine and Infectious Disease' Volume 11, Issue 2, Pages 103-109, March-April, 2013)은 전체 세포의 장용성 코팅의 효과를 밝혔다. 동물 연구에 관한 실험 데이터는 정제의 코팅 공정이 브이. 콜레라-불활성화된 세포의 면역원성에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 또한 장용성-코팅 또는 비-코팅 정제에 의해 유도된 면역반응에는 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 비-특허 문헌은 본 발명을 배제한다.

상기 선행기술에 비추어 볼 때, 콜레라 및 ETEC에서 기인한 생명을 위협하는 설사를 치료하기 위해서는 유효하고, 수용 가능하고, 용이하게 투여할 수 있으며, 저비용인 OCV를 제형화할 필요가 있다. 하나의 접근법은 경구용의 사멸된 전체 세포 백신의 개발이었다. 허가된 OCV 백신은 비브리오 콜레라 균주의 불활성화된 전체 세포만으로 구성된 샨콜[Shanchol™(Sanofi Shantha)]이라는 이름으로 판매되며 액체 제형으로 투여된다. rCTB 성분이 없기 때문에 단기간 ETEC 교차 보호, 상승작용적 보호 효과 (항균 + 항독성 면역), 조기 및 장기간 보호 등과 같은 이점이 부족하다.

듀코랄(Dukoral®)은, 콜레라에 대한 높은 효능과 ETEC-유도 설사에 대해서도 유의미한 효능이 입증된, rCTB 및 비브리오 콜레라의 불활성화된 전체 세포의 배합물이다. 그것은 네 가지 다른 제형(열-사멸된 제형 2개 및 포르말린-사멸된 제형 2개)에서 3가지의 다른 브이. 콜레라 균주 및 또한 재조합적으로 생산된 콜레라 독소 B 서브유닛(rCTB)을 포함한다. rCTB 성분은 콜레라에 대한 효능에 크게 기여하며, 콜레라 독소(CT)-유사 이.콜라이의 열-불안정 독소(LT)에 대한 교차-중화 항체를 유도하는 능력으로 인해 ETEC 설사에 대한 관찰된 보호에 전적인 책임이 있다. 그러나 rCTB는 산에 불안정하기 때문에 백신 투여 전에 75-150 mL의 중탄산염 완충액과 함께 투여해야 하므로 5세 이하의 어린이와 깨끗한 식수의 이용이 어려운 전염성 환경에서는 성인의 경우에도 투여가 논리적으로 어렵다.

백신을 투여하기 전에 완충 제제를 준비하기 위해서는, 샤셋(shchet)을 열어두어야 하며, 유리병으로부터의 백신을 첨가하고 혼합한 후 내용물을 필요한 양의 물에 녹여야 한다. 이런 추가 복용 준비 단계는 백신을 사용하기에 불편하고 성가시게 한다.

이 분야에서 실제 기여는 브이. 콜레라의 불활성화된 전체 세포 및 rCTB 모두의 이점을 이끌어내는 산 안정화된 OCV를 제형화하는 것이다. 따라서, 제형화된 백신은 투여의 용이성, 로지스틱(logistic) 생존력 및 경제성 측면에서 이점을 가질 것이다.

본 발명의 주요 목적은 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산 안정화된 경구용 박테리아 백신, 보다 구체적으로 전체 세포 및 산성화된 rCTB를 포함하는 경구용 콜레라 백신의 제형화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 코팅 공정에 의해 생산된 산 안정화된 rCTB를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 허용가능한 투여 방식을 갖는 신규 투여 형태를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개선된 상승작용적 효과를 제공하는 저렴한 비용의 경구용 콜레라 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보호 면역을 이상적으로 생성하는 단순화된 제형을 갖는, 콜레라, ETEC 설사에 대한 효과적인 백신을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법에 관한 것이다. 산에 불안정한 rCTB는 특히 위장관(소장)의 산성이 적은 부위에서 rCTB를 용해 및 방출하는 보호적 내산성 중합체로 장용성 코팅된다. 이는 급식 또는 공복 상태와 관계 없이 위의 산성 환경으로부터 보호하면서 소장에서 rCTB의 방출을 허용한다. 이 방법은 불활성 슈가 펠렛에 rCTB 적층 후 밀봉 코팅하고 최종적으로 rCTB에 장용성 중합체를 코팅하여 위산 보호를 제공하는 단계를 포함한다.

본 발명은 타겟 환자군에 따라 상기 제형에 대해 여러 가지 방식의 약제학적 프리젠테이션을 제공한다. 상기 약제학적 프리젠테이션은 브이. 콜레라의 불활성화된 전체 세포의 소정의 부피에 현탁시킨 후 투여 가능한 rCTB의 장용성 코팅을 포함한다. 상기 제형은 여행자 또는 5세 이상의 환자를 위해 깨지기 쉬운 밀봉 파우치 또는 2개 구획 포장에 포장되어 판매되거나 경구용 주사기로서 또는 블리스터/스트립 포장의 고형 투여 형태로 포장된다.

따라서, 본 발명은 향상된 수용가능성, 감소된 복용 요건, 감소된 풋프린트, 낮은 제조 비용, 향상된 안정성, 위장 상태와 무관한 투여를 갖는, 따라서 매우 비용 효과적인 경구용 콜레라 백신의 제형화 방법을 기술한다.

도 1: 1(A) rCTB rCTB 코팅 및 밀봉 코팅 후 rCTB의 SDS-PAGE.
1(B) 40% 및 50% 장용성 코팅 후 rCTB의 SDS-PAGE.
1(C) 60% 장용성 코팅 후 rCTB의 SDS-PAGE.
도 2: 다른 코팅 단계 별 rCTB 양.

기존의 선행 기술에서 전술한 단점에서 벗어나기 위해, 본 발명은 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 비브리오 콜레라 전체 세포 및 산 안정화된 rCTB를 포함하는 경구용 콜레라 백신에 관한 것이다.

전체 세포는 Hikojima MS1568 균주의 불활성화된 비브리오 콜레라 박테리아이다. 이 균주는 스웨덴의 Gotovax AB에서 얻은 것이다.

따라서, 본 발명은 밀봉 코팅 및 장용성 코팅을 포함하는 코팅 공정에 의해 얻어지는 산 안정화 된 rCTB를 제공한다.

상기 약제학적 프리젠테이션은, 브이. 콜레라의 불활성화된 전체 세포의 소정의 부피에 현탁시킨 후 투여 가능한 rCTB의 장용성 코팅, 물로 함께 투여 가능한 rCTB 및 전체 세포의 장용성 코팅, 함께 정제로 압축된 전체 세포 및 rCTB의 장용성 코팅, 정제로 압축된 rCTB의 장용성 코팅 및 압축된 정제 상의 전체 세포의 코팅을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

장용성 코팅은 위장의 산성 pH에 의한 약물 분해를 방지하기 위해 경구로 복용하는 약물/백신에 대해 수행되는 중합체 장벽 코팅이다. 장용성 중합체는 위장에서 주로 발견되는 산성 pH(pH 약 3-4)에서 안정한 성질을 가지며, 그 후 소장에서 발견되는 알칼리성 pH(pH 7-9)에서 분해/용해된다. 장용성 코팅의 이러한 성질은 위장의 산성 pH로부터 약물 또는 백신의 분해를 방지하고 소장에서 약물의 최대 흡수를 가능하게 한다. 상기 최대 흡수는 급식 또는 공복 상태에 관계없이 달성된다. 이러한 코팅 전체 공정은 아래에 언급된 3가지 단계를 포함하며 유동층/글랫/우스터(Fluid bed/Glatt/Wuster) 코팅기에서 유동층 기술을 사용하여 수행된다.

단계 1: rCTB의 적층

불활성 슈가 펠렛은 코팅의 제1 단계를 거친다. 상기 코팅 공정은 슈가 펠렛 위에 rCTB 및 Opadry 06A390050(colorcon)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 결합제 용액을 적층하여 수행된다. 적절한 농도의 결합제를 사용하여 불활성 슈가 펠렛 위에 용량 관련 rCTB을 적층한다. 더욱 구체적으로, 상기 용액은 2% w/w ± 1의 농도 범위이고 rCTB의 결합제에 대한 농도 비율이 1 : 2.5 ± 0.5이다. 수득한 rCTB 적층된 슈가 펠렛은 200-300 미크론 크기이다. 더욱 구체적으로, 1mg-2mg의 rCTB가 150mg-300mg의 슈가 펠렛에 적층되어 있다.

단계 2: 밀봉 코팅

밀봉 코팅 중합체의 보호층은 rCTB 적층된 슈가 펠렛 표면을 매끄럽게 하고 산성 장용성 코팅 중합체로부터 산 민감성 rCTB를 보호하기 위해 적용된다. 필수 농도를 갖는 결합제의 다른 용액, 보다 바람직하게는 Opadry 03K19229의 용액이 2% 내지 6%의 농도 범위로 제조된다.

따라서, 밀봉 코팅된 펠렛은 코팅의 마지막 단계로 진행된다.

단계 3: 장용성 코팅

장용성 중합체의 최종 기능성 코팅이 밀봉 코팅된 펠렛 위에 적용된다. 장용성 코팅은 장용성 중합체 및 가소제의 용액에 의해 수행된다. 상기 장용성 중합체 및 가소제 용액의 적절한 농도가 코팅된다. 더욱 바람직하게, Eudragit L-30D 55의 용액은 20% ± 2%의 농도 범위에서 가소제 plasacryl HTP20과 함께 사용된다. 상기 장용성 코팅의 공정은 장용성 코팅된 펠렛을 생성한다.

코팅의 각 단계에서 장용성 코팅된 펠렛은 도 1에서와 같이 SDS-PAGE에 의해 정량 분석된다.

전체 공정으로 인해 rCTB가 20%-30% 손실되었다.

또한, pH 3-4로 유지되는 0.1NHCl 5ml와 pH 6.8-7.4로 유지되는 인산염 완충액 (PBS) 5ml에 rCTB 장용성 코팅된 펠렛을 현탁시켜 용해 시험을 수행함으로써 산 보호 수준을 검사한다. 용해 매질의 샘플을 빈번한 간격으로 점검하여 상이한 코팅에 의해 제공되는 산 보호 수준을 결정한다.

정량 분석된 장용성 코팅된 펠렛은 브이. 콜레라의 불활성화된 전체 세포와 함께 다양한 방식으로 프리젠테이션될 수 있으며, 하기에 서술된 것에 제한되지 않는다:

1. rCTB의 장용성 코팅, 브이. 콜레라의 불활성화된 전체 세포 2-5 mL에 현탁한 후 투여

2. 전체 세포 및 rCTB를 함께 장용성 코팅, 물과 함께 투여

3. 전체 세포 및 rCTB를 함께 장용성 코팅하고, 정제로 압축

4. rCTB의 장용성 코팅을 정제로 압축한 후, 압축된 정제 위에 전체 세포를 추가 코팅

따라서, 산 안정화된 경구용 백신을 프리젠테이션하는 상기 언급된 방식들/옵션들이 추가로 포장된다. 포장은 하기를 포함한 여러가지 방식으로 수행될 수 있다.

· 깨지기 쉬운 밀봉 파우치 또는 2개 구획 포장에 포장한 다음 경구용 주사기를 사용하여 투여.

· 블리스터/스트립 포장의 정제 형태로 포장.

이렇게 수득된 장용성 코팅 제형은 적은 투여 부피를 가지며 제조 비용이 낮을 것이다. 상기 경구용 백신의 투여는 위장 상태(급식 또는 금식)와 무관하며 수용가능성이 개선된다.

상기 공정의 상세한 설명은 비제한적인 실시예에 의해 예시된다:

실시예 :

실시예 1: 재조합 콜레라 독소의 장용성 코팅

장용성 코팅은 경구 복용 약물/백신에 적용되는 중합체 장벽이다. 이 중합체 장벽은 위장에서 발견되는 고도로 산성(pH 3-4)에서는 안정하지만 소장에 존재하는 알칼리(pH 7-9) 환경에서는 파괴된다. rCTB는 Eudragit L-30D 55 중합체로 장용성 코팅되어 브이. 콜레라의 불활성화된 전체 세포 백신과 함께 경구로 투여될 때 위에서 안정하게 유지되었다. 장용성 코팅은 세단계로 수행되었다: rCTB 적층, 밀봉 코팅 및 중합체에 의한 장용성 코팅. 세단계의 장용성 코팅에 사용된 공정 매개변수는 표 1에 제시되어 있다.

장용성 코팅에 사용된 공정 매개변수
	rCTB 코팅	밀봉 코팅	장용성 코팅
입구 온도	42-44℃	42-44℃	30-32℃
생성물 온도	35℃	35℃	28℃
분무 공기(bar)	0.8 bar	0.8 bar	0.8-0.9 bar
컬럼 높이(mm)	15	15	15
스프레이 비율 (gm/min)	0.7-1.2	0.5	1.5
스프레이 속도 (RPM)	2-3	2	4

rCTB 적층을 위해, rCTB 및 결합제인 Opadry 06A390050(Colorcon)을 1 : 2.5의 비율로 혼합하여 2% w/w 코팅 용액을 만들고, 250-300 미크론의 슈가 펠렛에 적층하여 1mg의 rCTB을 150mg의 슈가 펠렛에 적층하였다. 밀봉 코팅을 Opadry 03K19229(5중량%의 펠렛, rCTB 및 결합제)를 함유한 4% 코팅 용액을 제조하여 수행한다.

장용성 코팅을 중합체 Eudragit L-30D 55와 가소제 Plasacryl HTP20(60중량%의 펠렛, rCTB, 결합제 및 밀봉 코트)을 함유한 20% 용액으로 수행한다. 각 단계에서 샘플의 SDS-PAGE을 도 1에 도시되는 바와 같이 수행한다. 샘플을 상이한 코팅 무게 게인(gain)에서 채취하여 rCTB ELISA를 위해 보내고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 백신 1회분에는 1mg의 rCTB로 코팅된 150mg의 슈가 펠렛을 함유한다. 상이한 퍼센트의 코팅에서의 ELISA로부터 명백히 인증되는 바와 같이, 각각 150mg의 슈가 펠렛이 1mg의 rCTB로 코팅되는 것으로 관측된다. 전체 공정에서 rCTB가 전체적으로 20%-30% 감소했다.

또한, 산 보호 수준을 0.1NHCl(pH 3-4) 5ml 및 PBS(pH 6.8-7.4) 5ml에서 rCTB 코팅 과립을 현탁시키고 15-30분 동안 혼합하여 용해 시험을 수행함으로써 검사한다. 그 사이에 샘플을 채취하여 rCTB 방출을 확인한다.

용해 시험은, 장용성 코팅된 rCTB는 위장에서의 산성 pH를 견딜수 있으며 알칼리성 pH에서 수분 이내에 방출될 수 있음을 보였다.

Claims (10)

1. 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법으로서,
   상기 방법은
   - 정제된 제조합 콜레라 독소(rCTB)를 코팅하여 산 안정화된 rCTB를 수득하는 단계;
   - 상기 산 안정화된 rCTB를 비브리오 콜레라( Vibtio cholerae )의 불활성화된 전체 세포와 배합하는 단계
   를 포함하고,
   상기 방법은 비브리오 콜레라 및 장내독소생성 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli )(ETEC)와 같은 다양한 박테리아에 의해 유발되는 설사에 대해 상승작용적 보호를 갖는 백신을 제공하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 정제된 재조합 콜레라 독소의 코팅은 유동층 우스터 피복기를 사용하는 3단계:
   a. 소정의 조건에서 rCTB 적층;
   b. 소정의 조건에서 밀봉 코팅; 및
   c. 소정의 조건에서 장용성 코팅
   을 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 rCTB 적층물은 2% ± 1 w/w의 1 : 2.5 ± 0.5 비율의 rCTB 및 결합제의 rCTB 적층 용액으로 이루어지고; 상기 결합제는 Opadry 06A390050 colorcon인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 rCTB 적층 용액은 상기 rCTB 1mg이 슈가 펠렛 150mg에 적층되도록 상기 슈가 펠렛 상에 적층되는, 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 rCTB 적층을 하기의 소정의 조건에서 수행하는, 방법:
   공정 매개변수 값
   입구 온도 42-44℃
   생성물 온도 35℃
   분무 공기 0.8 bar
   컬럼 높이 15mm
   스프레이 비율 0.7-1.2 (gm/min)
   스프레이 속도 2-3 (rpm).
6. 제2항에 있어서, 상기 밀봉 코팅물은 4%의 결합제, 바람직하게는 Opadry 03K19229의 밀봉 코팅 용액으로 이루어지는, 방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 밀봉 코팅을 하기의 소정의 조건에서 수행하는, 방법:
   공정 매개변수 값
   입구 온도 42-44℃
   생성물 온도 35℃
   분무 공기 0.8 bar
   컬럼 높이 15mm
   스프레이 비율 0.5 (gm/min)
   스프레이 속도 2 (rpm).
8. 제2항에 있어서, 상기 장용성 코팅물은 장용성 중합체 및 가소제의 장용성 코팅 용액으로 이루어지고; 상기 장용성 중합체는 Eudragit L-30D 55이고, 상기 가소제는 Plasacryl HTP20인, 방법.
9. 제2항에 있어서, 상기 장용성 코팅을 하기의 소정의 조건에서 수행하는, 방법:
   공정 매개변수 값
   입구 온도 30-32℃
   생성물 온도 28℃
   분무 공기 0.8-0.9 bar
   컬럼 높이 15mm
   스프레이 비율 1.5 (gm/min)
   스프레이 속도 4 (rpm).
10. 브이. 콜레라(V. cholera)의 불활성화된 전체 세포 및 산 안정화된 재조합 콜레라 독소 B(rCTB)를 포함하는, 산 안정화된 경구용 박테리아 백신의 제형화 방법.

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