KR20170101352A

KR20170101352A - 생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 혈중 포스파티딜콜린 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR20170101352A
Application number: KR1020160023412A
Authority: KR
Inventors: 황신; 김나영; 유현주
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-09-06
Also published as: KR101825807B1

Abstract

본 발명은 생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 혈중 포스파티딜콜린 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)을 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 바이오마커 조성물, 포스파티딜콜린의 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단 키트 및 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 포스파티딜콜린 바이오마커는 생체간이식 거부반응의 비침습적 진단 마커로서, 이식 후 간의 손상을 조기에 진단할 수 있어, 면역억제제의 적절한 투여 등 환자별 맞춤치료가 가능하게 하고, 이식장기 손상에 의한 사회경제적 손실을 방지할 수 있다.

Description

생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 혈중 포스파티딜콜린 바이오마커 조성물{Biomarker composition of phosphatidylcholine in blood for non-invasive in vitro diagnosis of acute transplant rejection in living donor liver transplantation}

본 발명은 생체간이식(living donor liver transplantation; LDLT) 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 혈중 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC) 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

간이식은 1963년 미국에서 Starzl에 의해 처음 시도되었고, 1979년부터 새로운 종류의 면역억제제인 사이클로스포린(cyclosporin)이 사용되면서부터 간이식 성적은 현저히 향상되었다. 1983년에는 미국 국립보건원이 간이식은 이제는 확립된 임상 치료 수단이 되었다고 인정하였고, 이후 10년에 걸쳐 간이식은 발전을 거듭하여 말기 간질환의 치료 방법으로써 완전히 정착되었다.

간이식을 필요로 하는 환자들의 수요가 지속적으로 증가하고 있지만, 법적인 장치와 사회적 인식 부족 등으로 인하여 뇌사자 장기기증이 드문 아시아에서는 이러한 수요와 공급의 불균형이 아주 심한 상태이다. 이에, 뇌사자의 장기를 이용하는 사체 간이식의 대안으로, 건강한 성인에게서 간의 일부를 떼어서 이식하는 생체 부분간이식이 1988년 브라질의 Raia에 의해 처음 시도되었고, 1989년에는 호주에서 성공하였다. 1993년 일본에서 성인 수혜자에 대한 생체간이식이 성공한 이래 일본과 한국을 중심으로 괄목할 만한 발전이 있었으며, 환자 생존율도 구미에서의 뇌사자 전간이식과 동등하거나 그 이상이 될 만큼 향상되었다.

생체간이식은 뇌사 장기기증자를 기다리지 않아도 되기 때문에 예정된 수술 일정에 따른 선택적 수술이 가능하다. 따라서 이식대상 환자의 철저한 수술전 준비가 가능하고, 환자의 병세가 악화되기 전에 이식을 받을 수 있다. 또한 기증자가 뇌사라는 심한 손상 과정을 거치지 않고 허혈 보존시간을 짧게 하여 이식할 수 있기 때문에 이식 간절편의 질이 매우 우수하고 뇌사자 간이식 후 5 ~20%에서 발생하는 1차성 기능부전이 생체간이식 후에는 거의 발생하지 않는 장점이 있다.

하지만, 생체간이식의 경우에도 이식 후, 급성이식거부반응을 나타낼 수 있다. 장기 이식 후 거부반응의 특징은, 임상적으로는 큰 변화를 보이지 않다가 어느 순간 이식거부가 관찰된다는 것이다. 즉, 이식 후 특별한 증상이 나타나지는 않으나 실제로는 손상이 서서히 진행된다. 따라서, 장기 이식 환자의 생존율 증가에도 불구하고, 급성 이식거부반응은 여전히 이식 수혜자의 생명을 위협하는 위험성을 가지고 있다. 이식거부반응을 진단할 수 있는 바이오마커를 개발한다면, 적절하게 면역억제제를 사용하여 환자를 효과적으로 치료할 수 있다.

간 이식에 있어서 이식 거부반응을 진단할 수 있는 가장 신뢰성 있는 진단방법은 간 생체검사이나, 이는 침습적 방법이라는 단점이 있다. 현재까지 상업화된 비침습적 간이식거부반응의 진단을 위한 제품으로 CD4 세포에서 ATP를 추정하는 Immuknow 및 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)로부터 분리된 RNA를 이용하여 유전자 발현을 분석하는 AllowMap 등이 알려져 있다. 그러나 ImmuKnow는 반드시 살아있는 세포를 필요로 하기 때문에 샘플 보관 및 준비과정의 불편이 있으며, AlloMap은 RNA의 불안정성 때문에 표본 준비 및 보관에 각별한 주의가 필요하다는 단점이 있다.

미국공개특허 2011-0163226 (2011.07.07 공개)

본 발명은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)을 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 바이오마커 조성물, 포스파티딜콜린의 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 조성물 및 포스파티딜콜린의 수준 측정을 통한 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)을 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포스파티딜콜린의 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 조성물을 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 포스파티딜콜린의 수준 측정을 통한 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 혈중 포스파티딜콜린 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 이식 후 간의 손상을 조기에 진단할 수 있어, 면역억제제의 적절한 투여 등 환자별 맞춤치료가 가능하게 하고, 이식장기 손상에 의한 사회경제적 손실을 방지할 수 있다.

하기 도면에 있어서, 실험군과 대조군의 비교는 student t test를 통하여 각 시점마다 수행되었고, 공통적으로 오차막대는 표준오차를 나타내고, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001을 의미하여 통계적으로 유의함을 표시한다.
도 1은 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 2는 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 3은 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 4는 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 5는 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 6은 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 7은 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.
도 8은 간 이식 후 한 달 동안 일주일 간격으로 수집한 급성 간이식거부반응 환자 및 정상 대조군 환자의 혈청으로부터 18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)의 수준을 측정한 것이다. 측정 수준은 normalized ratio (PC area/internal standard area)로 나타내었다.

이에, 본 발명자들은 비침습적이고 편리한 생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 바이오마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 거부반응을 일으킨 환자와 일으키지 않은 환자의 혈청에서 유의한 차이를 나타내는 포스파티딜콜린을 발견하고, 이들이 생체간이식 급성이식거부반응의 진단용 바이오마커가 될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)을 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 조직 또는 장기 동종이식편, 특히 간 동종이식편을 수령한 개체의 거부반응 진단용 조성물을 제공한다. 동종이식편이란 동일 종의 유전적으로 다른 두 개체들 간에 이식되는 장기 또는 조직이다. 동종이식을 받은 개체는 "수여자"이고 동종이식편을 제공한 개체는 "공여자"이다. 조직 또는 장기 동종이식편은 달리 '이식체', '이식편', '동종이식편', '공여자 조직' 또는 '공여자 장기' 등의 유사한 용어로 언급될 수 있다. 다른 종들의 두 개체들 간 이식체는 이종이식편이다.

본 명세서에서 용어, "이식거부반응" 또는 "거부반응"은 이식편의 공여자와 수여자의 유전적 배경이 다른 경우, 이식편이 수여자에 의해 이물질로 인식됨으로써 수여자의 면역계가 그 이식편을 거절하여 배제하려고 하는 여러 가지 면역반응이다. 상기 면역반응은 (1) 이식 직후에 일어나는 강한 거부반응인 초급성 거부반응 (hyper-acute rejection reaction), (2) 이식 후 수개월 이내에 보이는 급성 거부반응 (acute rejection reaction), (3) 이식 후 수개월 이후에 보이는 만성 거부반응 (chronic rejection reaction)으로 나누어진다. 또한, T 세포로 대표되는 면역 담당 세포에 의한 세포성 면역과 항체에 의한 액성 면역이 복잡하게 관련된 형태로 일어나지만, 주로 세포성 면역이다.

상기 이식거부반응에 의해 이식편은 최종적으로 괴사된다. 또한, 수여자에는 발열, 백혈구 수 증대 등의 심각한 전신증상뿐만 아니라, 이식국소의 종창이나 압통이 일어날 수 있다. 더 나아가서는 감염증 등의 심각한 합병증을 일으키게 되고, 심한 경우 수혜자를 사망에 이르게 할 수 있다. 따라서, 이러한 이식거부반응을 조기에 진단하고 치료하기 위하여 적절한 진단 마커의 개발이 필요하다.

이식거부반응이 발생한 개체들은 동종이식 거부반응 검사 조력 도구로서 문헌에서 잘 알려진 다양한 증상 또는 임상지표들을 보일 수 있다. 동종이식편 생검과 더불어 수많은 임상지표들이 동종이식 거부반응을 가지거나 또는 의심되는 개체들을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 임상지표들에서 얻어진 정보는 임상 의사, 내과의사 또는 기타 임상분야 진료의사에게 사용되어 거부반응이 발생하는지, 어느 정도 신속하게 진행되는지 또는 개체의 면역억제제 약물치료법의 변경 여부를 결정할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "마커", "생물학적 마커", "바이오 마커"는 상호 교환적으로 사용된다. 상기 마커는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 분자들 또는 화합물로서, 생체의 특정 변화를 알아낼 수 있는 지표를 말한다. 본 발명에서 상기 마커는 포스파티딜콜린이며, 이들의 대사산물 역시 본 발명의 범주에 포함된다. 이들의 수준을 측정함으로써 생체간이식 급성이식거부반응을 진단할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)"은 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포콜린에 해당되는 전형적인 글리세로인지질의 1종이다. 동물, 식물, 효모, 곰팡이류에 널리 분포하고 있다. 포유류 조직에서 전체 인지질의 약 50%를 차지하는 생체막의 주요 구성성분이다.

바람직하게, 상기 포스파티딜콜린은 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC), 36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC), 36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC), 36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC), 16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC), 18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC), 18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC) 또는 18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC)은 1-올레오일-2-리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-oleoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다. 또는 1-리노레오일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-linoleoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.

[화학식 1]

상기 36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC)은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 2의 구조를 갖는다. 또는 1-스테아로일-2-리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-stearoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.

[화학식 2]

상기 36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC)은 일반적으로 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 3의 구조를 갖는다. 또는 1-올레오일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-oleoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.

[화학식 3]

상기 36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC)은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 4의 구조를 갖는다.

[화학식 4]

상기 16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC)은 1-헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 5의 구조를 갖는다.

[화학식 5]

상기 18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC)은 옥타데카트리에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(octadecatrienoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 6의 구조를 갖는다.

[화학식 6]

상기 18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC)은 1-리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 7의 구조를 갖는다.

[화학식 7]

상기 18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)은 1-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 명명되며, 하기 화학식 8의 구조를 갖는다.

[화학식 8]

상기 포스파티딜콜린의 수준을 측정하는 제제는 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있으며, 예를 들어 상기 포스파티딜콜린에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트는 생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 포스파티딜콜린에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

한편, 상기 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 생체간이식 환자에서 분리된 혈액 시료로부터 포스파티딜콜린 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 포스파티딜콜린 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 포스파티딜콜린 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 생체간이식 급성이식거부반응으로 판단하는 단계를 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상세하게는, 상기 포스파티딜콜린 수준을 측정하는 방법은 구체적으로, 상기 포스파티딜콜린에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 또는 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 생체간이식 급성이식거부반응 환자의 혈청 수집

간이식 급성이식거부반응의 비침습적 바이오마커를 탐색하기 위하여, 서울아산병원에서 수술을 받은 간이식 수여자 환자로부터 혈청을 수집하였다. 구체적으로, 간 이식 후 이식 거부반응을 일으킨 환자 (n = 156)와 이식 거부반응을 일으키지 않은 환자 (n = 213)로부터 혈청을 수집하였으며, 간 이식 후 1주일부터 한달 동안 일주일 간격으로 공복상태에서의 혈액을 SST 튜브 (BD)에 수집하였다. 채취된 혈액으로부터 혈청만 수집하여 실험 시까지 -80 ℃에 보관하였다. 간 이외의 다른 장기의 감염, 염증 또는 자가면역질환이 있는 경우, 임신한 경우, 미성년자 및 60 세 이상의 고령자의 경우에는 대상에서 제외하였다.

간 이식 수술 후 6 개월 이상 경과시 임상 정보로부터 하기 표 1과 같은 기준에 따라 급성거부반응 환자를 실험군으로 분류하고, 연령, 성별, 수술방법 등이 실험군과 유사하나 거부반응이나 기타 후유증 및 부작용이 일어나지 않은 간 이식 수여자를 대조군 (2 배수)으로 선정하였다.

거부 활성 지표 (REJECTION ACTIVITY INDEX, RAI)
세계 소화기내과 협회 (the World Gastroenterology Consensus)에서 정의한 급성 간이식거부반응을 평가하는데 사용될 수 있는 기준
카테고리 (Category)	기준 (Criteria)	점수
간문맥 염증 (Portal Inflammation)	소수의 간세동이(portal triad)에서 나타나는 주로 림프구성 염증(lymphocytic inflammation)이나, 두드러지게 확장되지 않음	1
	모세포(blast), 중성구(neutrophil) 및 호산구(eosinophil)과 함께 림프구를 포함하는 혼합 침윤물 (mixed infiltrate)에 의해 대부분 또는 모든 간세동이로 확장됨	2
	수많은 모세포 및 호산구를 포함하는 혼합된 침윤물에 의해 대부분 또는 모든 간세동이 및 문맥 주위 실질(periportal parenchyma)로 뚜렷하게 확장됨	3
쓸개관(bile duct) 염증 손상	염증 세포가 소수의 쓸개관에 침투하여 상피세포(epithelial cell)의 핵 : 세포질 비율 증가와 같은 가벼운 반응성 변화를 보임	1
	염증 세포가 대부분 또는 모든 쓸개관으로 침투함. 일부 쓸개관에서 상피(epithelium)의 핵 다형성(nuclear pleomorphism), 불규칙 극성(disordered polarity) 및 세포질 공포화(cytoplasmic vacuolization)와 같은 퇴화성 변화를 보임	2
	대부분 또는 모든 쓸개관이 상기 퇴화성 변화 또는 중심 내강 파괴(forcal lumenal disruption)를 보임	3
정맥 내피 염증 (Venous endothelial inflammation)	문맥 및/또는 간정맥(hepatic venules) 일부에 내피하의(subendothelial) 림프구 침윤	1
	문맥 및/또는 간정맥 대부분 또는 전부에 내피하의 림프구 침윤	2
	문맥 및/또는 간정맥 대부분 또는 전부에 내피하의 림프구 침윤과 함께, 정맥 주위 실질(perivenular parenchyma)로 확장되고 정맥 주위 간세포 괴사와 관련된, 보통 또는 심각 한 수준의 정맥 주위 염증	3
총 RAI 점수 = _/9
Reference Anonymous. Banff Schema for Grading Liver Allograft Rejection: An International Consensus Document. Hepatology 1997;25(3):658-63.

RAI 2, 중간 (intermediate) (급성 거부반응 기준을 충족하지 못함)

RAI 3-4, 가벼움 (mild)

RAI 5-6, 보통 (moderate)

RAI 7-9, 심각함 (severe)

< 실시예 2> 환자 혈청에서 포스파티딜콜린( phosphatidylcholine )의 추출

상기 실시예 1에서 수집한 환자 혈청 50 ㎕에 클로로포름/메탄올 1:2 (v/v) 200 ㎕를 넣고 혼합하였다. 여기에 포스파티딜콜린의 정확한 정량을 위하여 내부표준물질 용액 30 ㎕를 첨가하였다. 내부표준물질 용액은 200 nM의 (18:0 D70-18:0) 포스파티딜콜린을 포함하는 메탄올 용액으로 구성되어 있다. 내부표준용액 첨가 후 잘 섞은 후에 14000 rpm에서 20분 정도 원심분리하여 극성, 비극성 용액의 두 개 층으로 분리되도록 하였다. 아래의 비극성 용액 층을 피펫을 이용하여 조심스럽게 채취하여 새로운 용기에 모았다. 이후, 질소 또는 진공하에서 건조하고, 액체 크로마토그래피-탠덤질량분석기(LC-MS/MS)로 분석하기 전까지 영하 20도에서 최대 1주일간 보관하였다. 기기 분석 전에 300 ㎕ 메탄올로 건조상태에 있는 포스파티딜콜린을 용해시켜 시료를 준비하였다.

< 실시예 3> 다양한 지방산 길이의 포스파티딜콜린을 이용한 LC retention time의 확인

시판중인 계란 노른자에서 추출한 포스파티딜콜린을 1mg/mL의 농도로 메탄올에 녹인 후 LC-MS/MS 분석을 수행하여, 지방산 길이에 따른 포스파티딜콜린의 액체크로마토그래피에서의 분리시간을 확인하였다.

< 실시예 4> 액체 크로마토그래피-탠덤질량분석기 (LC-MS/MS)를 이용한 포스파티딜콜린의 정량분석

정량 분석을 위해, 액체 크로마토그래피-탠덤질량분석기 (LC-MS/MS, Agilent 1290 HPLC (Agilent) -Qtrap 5500 (ABSciex))를 사용하였다. 포스파티딜콜린의 분리를 위해 역상 크로마토그래피 컬럼을 사용하였다.

역상 크로마토그래피 컬럼은 Zorbax Eclipse C18, 150×2.1 mm를 사용하였다. 이동상 (A)로는 10mM 암모늄아세테이트를 메탄올/이소프로판/물 (900/50/50, v/v/v)에 녹인 용액을, 이동상 (B)로는 10mM 암모늄아세테이트를 메탄올/이소프로판/물 (940/50/10, v/v/v)에 녹인 용액을 사용하였다. 이동상 속도는 400 ㎕/분으로, 컬럼오븐의 온도는 영상 35도를 유지하였다. 이동상 구배는 50 % (B)에서 시작하여 5 분간 유지하고, 5분부터 10분 사이에 50% (B)에서 80% (B)로 조성을 변화시키고 27분까지 유지하였다. 27분에서 27.1분 사이에 80% (B)를 50% (B)로 조성을 변화시키고 30분까지 50% (B)를 유지하여 다음 분석을 준비토록 하였다. 총 분석시간은 30분이었다.

질량분석기의 precursor ion scan 기법을 사용하여 분자 이온의 조각이 m/z 184과 m/z 86을 나타내며, 액체 크로마토그래피에서의 분리시간이 앞서 표준물질에 포함된 포스파티딜콜린의 분리시간과 일치하는 경우에 한하여 해당 지방산 길이의 포스파티딜콜린으로 동정하였다. 특정 포스파티딜콜린의 특이적 이온조각 (m/z 184)에 해당하는 추출 이온 크로마토그래피 (extracted ion chromatography)의 면적을 내부표준물질의 특이적 이온조각 (m/z 184)에 해당하는 추출 이온 크로마토그래피의 면적으로 나눈 값을 구하여 상대정량을 수행하였다. 정량한 포스파티딜콜린은 16:0 lysoPC, 18:3 lysoPC, 18:2 lysoPC, 18:1 lysoPC, 18:0 lysoPC, 34:2 PC, 34:1 PC, 34:0 PC, 36:4 PC, 36:3 PC, 36:2 PC, 36:1 PC, 36:0 PC이었다.

그 결과, 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 3 주 및 4 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 1).

36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 3 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 2).

36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 3 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 3).

36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 4 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 4).

16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 4 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 5).

18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 3 주 및 4 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 6).

18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 3 주 및 4 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 7).

18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)은 간 이식 후 한 달 동안 계속적으로 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 간 이식 후 3 주 및 4 주째에 급성 간이식거부반응 환자에서 정상 대조군에 비해 통계적으로도 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것을 확인하였다(도 8).

상기 결과를 종합하면, 간 이식 후 한 달 내의 급성 간이식거부반응 환자의 혈청에는 포스파티딜콜린이 정상 대조군에 비해 낮은 수준으로 존재한다는 것을 확인하였으며, 이를 통해 급성 간이식거부반응 여부를 정확하고 비침습적으로 진단할 수 있다.

이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

포스파티딜콜린(phosphatidylcholine; PC)을 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC), 36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC), 36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC), 36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC), 16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC), 18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC), 18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC) 및 18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 바이오마커 조성물.
포스파티딜콜린의 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린의 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 포스파티딜콜린에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC), 36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC), 36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC), 36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC), 16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC), 18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC), 18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC) 및 18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 조성물.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 생체간이식 급성이식거부반응의 비침습적 체외진단을 위한 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단용 키트.
(1) 생체간이식 환자에서 분리된 혈액 시료로부터 포스파티딜콜린 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 측정된 포스파티딜콜린 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 측정된 포스파티딜콜린 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 생체간이식 급성이식거부반응으로 판단하는 단계를 포함하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 36:3 포스파티딜콜린(36:3 PC), 36:2 포스파티딜콜린(36:2 PC), 36:1 포스파티딜콜린(36:1 PC), 36:0 포스파티딜콜린(36:0 PC), 16:0 리소포스파티딜콜린(16:0 Lyso PC), 18:3 리소포스파티딜콜린(18:3 Lyso PC), 18:2 리소포스파티딜콜린(18:2 Lyso PC) 및 18:0 리소포스파티딜콜린(18:0 Lyso PC)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 수준 측정은 상기 포스파티딜콜린에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 수준 측정은 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 및 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 생체간이식 급성이식거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.