KR20170100266A - 청색 led를 이용한 어류의 스쿠티카증의 예방 및 치료 방법 - Google Patents
청색 led를 이용한 어류의 스쿠티카증의 예방 및 치료 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 청색 LED를 이용한 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 청색 LED를 조사할 경우 스쿠티카충에 대해 우수한 살균 또는 정균 효과를 갖는 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법은 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하여 수행됨으로써, 친환경적이고 경제적이며, 어류의 생산성 증대는 물론 포르말린 또는 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 청색 LED를 이용한 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 청색 LED를 조사할 경우 스쿠티카충에 대해 우수한 살균 또는 정균 효과를 갖는 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
양식 어종 중에서도 넙치는 성장이 빠르고 양식이 매우 활성화되어 현재 전체 어류 양식 생산량에 있어서 많은 부분을 차지하고 있다. 국내 넙치 양식장은 제주도, 남해안의 완도, 거제도 일부, 부산 그리고 동해안의 경주 감포 지역에 분포되어 있으며, 특히 제주도에 대부분의 넙치 양식장이 밀집되어 있다.
양식 어류에 기생하는 섬모충의 일종인 스쿠티카충은 30 ~ 40 ㎛의 섬모충으로, 흔히 넙치의 인공종묘 및 양성어에 많이 발생한다. 스쿠티카충은 어류의 체표와 지느러미 그리고 신장, 혈관 및 뇌 조직에서 다양하게 유발되고, 대부분 소성결합 조직의 파괴를 통하여 넙치를 대량 폐사시킨다고 보고되어 있다. 또한, 다른 어류의 기생충과 달리 혈관을 통하여 뇌 조직까지 침입하여 기생하기 때문에 조기에 발견하지 못하면 감염시 치료가 어렵다. 넙치의 치어에서 성어에 이르기까지 감수성이 있어 피해가 크다. 넙치 양어장에서는 스쿠티카충의 살충제로 수산용 포르말린을 사용하고 있는데, 이 약품은 숙주인 어류에게도 어느 정도 피해를 줄 수 것으로 판단되며, 그 유효성 또한 높지 않다. 또한, 식품안전과 생태계 보전 측면에서도 그리 바람직하지 못한 방법이다.
따라서 스쿠티카충 구제에 효과가 있으면서 어류에 안전하며, 양식 환경에 해를 끼치지 않는 어류의 스쿠티카충 구제방법의 개발은 절실하다.
본 발명자들은 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법에 대해 탐색하던 중, 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사할 경우, 어류에게 어떠한 손상을 입히지 않고도 어류의 스쿠티카증을 포르말린 또는 항생제를 사용하지 않고 친환경적으로 예방 또는 치료할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 시스템을 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 장치를 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은
청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 시스템을 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 장치를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
어류의 양식산업에서는 여러 가지 사육시스템의 개발을 통해 생산성을 높이고, 질병을 예방 또는 치료하고자 하나, 양식어가에서는 최소의 투자비용으로 최대의 생산성을 낼 수 있는 방안이 요구되고 있다.
본 발명에 따른 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법은 특정 파장의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사함으로써, 어류에는 어떠한 생리학적 및 물리적 손상을 입히지 않고도 스쿠티카충만을 살균 또는 정균할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 엘이디(LED)는 일반 조명뿐만 아니라 살균, 노광 및 감식을 위한 광원으로써, 식물재배나 해충의 퇴치를 위한 조명, 바다에서 어류를 유인하기 위한 광원, 의료용 및 피부미용을 위한 광원, 심리치료를 위한 특수한 목적으로 주로 사용되고 있다. 이러한 LED는 여러가지 색광(Red, Blue, Green, White, Yellow)을 조사하는데, 상기와 같은 색광을 통해 어류의 스트레스에 대한 내성 강화가 가능함과 동시에 어류의 성장을 촉진시키고 어류 질병을 예방 또는 치유시킬 수 있다
상기 LED 광원은 하나 이상일 수 있으며, 380 내지 480 nm 범위의 파장을 갖는 것이 바람직하고, 20 내지 1500 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량으로 유지되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 405nm 파장에 대해서는 20 내지 1000 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량 및 465nm 파장에 대해서는 80 내지 1500 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량으로 유지되는 것이 바람직하다.
상기 청색광 LED 광원의 파장 및 광량의 범위는 어류 스쿠티카충을 살균 또는 정균하나, 어류에는 어떠한 염증이나 괴사와 같은 물리적인 피해를 입히지 않고, 또한 스트레스 관련 인자의 발현을 유발하지 않는 LED 광원의 파장 및 광량의 범위에 해당한다.
상기 LED 광원의 광 주기는 6~12:18~12시간 (L:D)의 조건인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 스쿠티카증 감염 넙치의 경우, 광 주기 6:18시간 (L:D)의 청색광을 24일간 조사한 경우, 80~90%의 높은 생존율을 나타내었다.
상기 어류는 스쿠티카충의 감염 대상이 될 수 있는 모든 종류를 포함하며, 양식어 또는 관상어 등일 수 있다. 구체적으로는 넙치, 복어, 잉어, 민어, 뱀장어, 송어, 고등어, 삼치, 임연수, 가자미, 열갱이, 강도다리, 조피볼락, 우럭, 도루묵, 명태, 대구, 꽁치, 청어, 장어, 정어리, 연어, 참치, 가다랭이, 멸치, 갈치, 홍게, 조기 등일 수 있으며, 넙치인 것이 바람직하다.
상기 스쿠티카충은 스쿠티카 감염증의 원인충인 Miamiensis avidus, Uronema marinum 또는 Pseudocohnilembus persalinus를 의미하고, 주로 M. avids를 나타내며, 병든 넙치 등으로부터 분리될 수 있다, 또한 프로테오스펩톤(Proteose peptone), 효모 추출물(Yeast extract), 염화나트륨(Sodium chloride), 또는 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 포함하는 배지, 잉어유래상피세포(Epithelioma papulosum cyprini cell line) 또는 연어배아유래세포(Chinook Salmon Enbryi cell line)에서 배양되는 것이 바람직하다. 상기 배지 조성물은 균주 발현을 증대시킬 수 있어, 많은 양의 병원체을 얻을 수 있기 때문이다.
상기 어류는 1 내지 1×108 세포/㎖ 농도의 스쿠티카충을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 어류는 초기, 중기 또는 말기 스쿠티카증에 감염된 것일 수 있고, 초기 스쿠티카증에 감염된 것이 바람직하다.
상기 어류에 청색광의 LED 광원을 조사할 경우, 어류내에 활성산소가 발생되어 스쿠티카충을 파괴할 수 있다.
본 발명에 따른 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법은 어류에 광감각 물질(photosensitizer)을 처리한 후, 청색광의 LED 광원을 조사하여 수행될 수 있다. 상기 광감각 물질은 빛에 의해 활성화되어 그로 인한 산소분자(O2)를 활성산소로 변화시키거나, 새로운 라디칼을 만들거나 또는 새로운 화학종을 만들어 병원체를 파괴할 수 있다. 상기 광감각 물질은 인도시아닌 그린, 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루, 아미노레불린산, 프탈로시아닌, 포르피린, 텍사피린, 박테리오클로린, 메로시아닌, 소랄렌, 벤조포르피린 유도체, 포르피머 나트륨 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 수중 환경은 어항, 수족관, 양식장, 연못, 사육장 또는 해양 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 시스템을 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 장치를 제공한다.
스쿠티카증의 예방 또는 치료에 대해서는 종래 포르말린 또는 항생제를 사료와 함께 투입하여 어류에 경구투여되도록 함으로써 치료하여 왔으나, 이러한 방법은 세균성 질병이 발병하면 병원균이 장관내에 정착하여 증식하고 반복적으로 발생해 치료가 잘 되지 않으며, 항생제의 사용은 내성이 생긴 병원체를 양산할 가능성이 높다. 이에 반해. 본 발명의 청색광 LED를 이용한 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법을 이용할 경우, 어떠한 부작용이 없이도 어류의 스쿠티카증을 예방 또는 치료할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법은 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하여 수행됨으로써, 친환경적이고 경제적이며, 어류의 생산성 증대는 물론 포르말린 또는 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 LED 광원의 파장(405, 465, 520, 640nm) 영역을 나타내는 도이다.
도 2는 LED 파장(405, 465, 520 및 640nm)의 조사시간에 따른 스쿠티카충의 사멸비율을 나타내는 도이다.
도 3은 각각 포르말린 200과 400ppm, 및 청색광 405nm와 465nm 파장으로 처리된, 시간에 따른 스쿠티카충의 비활성화 계수를 나타내는 도이다.
도 4는 유세포 분석기를 이용한 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충의 크기변화를 나타내는 도이다.
도 5는 유세포 분석기를 이용한 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충의 사멸비율을 나타내는 도이다.
도 6은 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충 내에 발생하는 활성산소의 정도를 나타내는 도이다.
도 7은 LED 광량에 따른 스쿠티카충의 비활성화 정도를 나타내는 도이다.
도 8은 스쿠티카충 농도에 따른 스쿠티카충의 비활성화 정도를 나타내는 도이다.
도 9는 스쿠티카증에 감염된 넙치의 누적폐사율을 나타내는 도이다.
도 10은 스쿠티카증에 감염된 넙치의 이미지를 나타내는 도이다.
도 11은 405nm의 LED 파장을 6L:18D, 12L:12D, 18L:6D, 24L:0D의 광주기로 조사한 후, 스쿠티카증에 감염된 넙치의 누적폐사율을 나타내는 도이다.
도 2는 LED 파장(405, 465, 520 및 640nm)의 조사시간에 따른 스쿠티카충의 사멸비율을 나타내는 도이다.
도 3은 각각 포르말린 200과 400ppm, 및 청색광 405nm와 465nm 파장으로 처리된, 시간에 따른 스쿠티카충의 비활성화 계수를 나타내는 도이다.
도 4는 유세포 분석기를 이용한 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충의 크기변화를 나타내는 도이다.
도 5는 유세포 분석기를 이용한 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충의 사멸비율을 나타내는 도이다.
도 6은 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충 내에 발생하는 활성산소의 정도를 나타내는 도이다.
도 7은 LED 광량에 따른 스쿠티카충의 비활성화 정도를 나타내는 도이다.
도 8은 스쿠티카충 농도에 따른 스쿠티카충의 비활성화 정도를 나타내는 도이다.
도 9는 스쿠티카증에 감염된 넙치의 누적폐사율을 나타내는 도이다.
도 10은 스쿠티카증에 감염된 넙치의 이미지를 나타내는 도이다.
도 11은 405nm의 LED 파장을 6L:18D, 12L:12D, 18L:6D, 24L:0D의 광주기로 조사한 후, 스쿠티카증에 감염된 넙치의 누적폐사율을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. LED 광원 및 스쿠티카충의 준비
1-1. LED 광원의 준비
발광다이오드(light emitting diode, LED) 광원은 부경대학교 LED-해양융합기술 연구센터에서 제공받은 405, 465, 520, 640nm 파장의 청색광 LED 광원을 이용하였고, 라디오미터(Biospherical Instruments Inc., USA)로 각각 파장의 광량을 측정하였다. 그 결과, 각각 250, 516, 303, 586 μmol/m²ㆍs의 광량을 나타내었다.
상기 LED 광원의 파장대역을 온도조절 적분구 시스템 (Withlight Co. Ltd, Korea)을 이용하여 도 1에 나타내었다.
1-2. 스쿠티카충의 준비
스쿠티카 감염증의 원인충인 Miamiensis avidus를 병든 넙치로부터 얻은 후, 2% 프로테오스펩톤(Proteose peptone), 1% 효모 추출물(Yeast extract), 1.17% 염화나트륨(Sodium chloride) 및 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 포함하는 인공배지(P2Y1배지)에 접종하고, 20℃에 3일간 배양한 후 사용하였다.
실시예 2. LED 파장에 따른 항기생충 효과
2-1. LED 파장에 따른 항스쿠티카충 효과
2-1-1. 측정방법
먼저, 상기 실시예 1에 따라 배양된 스쿠티카충을 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 기생충의 농도를 측정한 후, 기생충의 농도가 105 세포/㎖이 되도록 P2Y1 배지에 부유하고, 5㎖을 배양플라스크(T25)에 접종하였다. 그 후, 암흑구간(대조군) 및 최대광량의 405, 465, 520, 640nm 파장 조사구간을 만들어 20℃에서 반응시키고, 3, 6, 12, 24, 48시간 후, 각각 20㎕의 배양액을 채취하고 동량의 0.25% 트립판 블루(tryphan blue)로 5분간 염색하여 혈구계산판을 이용하여 전체 세포수 및 염색된 세포수를 계수하였다.
2-1-2. 측정결과
LED 파장 405, 465, 520 및 640nm의 조사시간에 따른 스쿠티카충(105 세포/㎖)의 사멸 비율을 하기 식 (a)을 이용하여 도 2에 나타내었다.
식 (a): 사멸된 스쿠티카충(
M. avidus
)
비율 (%) = 트립판 블루에 염색된 세포 수/전체 세포 수
도 2에 나타난 바와 같이, 흥미롭게도 405nm 파장에서 24시간 조사시 모든 스쿠티카충이 사멸되었고 465nm 파장에서는 48시간 조사시 80% 스쿠티카충이 사멸되었으나, 빛을 조사하지 않은 암흑구간(대조군)과 520nm 및 640nm 파장의 조사구간은 대부분의 스쿠티카충이 생존하였다.
상기 결과로부터, 405nm 및 465nm의 청색 파장대가 M. avidus를 직접 사멸시킬 수 있는 파장대임을 알 수 있다.
2-2. 항스쿠티카충 효과의 정량분석
2-2-1. 측정방법
스쿠티카충 사멸의 유효 파장인 405nm 및 465nm 파장에서의 항스쿠티카충 효과를 기존 유일한 치료방법인 포르말린과 비교하기 위해 국내 스쿠티카충 치료 권장 농도인 100-200ppm보다 높은 포르말린 농도인 200 및 400ppm으로 설정하여 실험을 진행하였다. 간단히 설명하면, P2Y1배지에 부유된 5×104 세포/㎖의 스쿠티카충 5㎖를 T25 플라스크에 접종한 후, 암흑구간, 포르말린 200 및 400ppm 처리 구간, 및 최대광량의 405, 465nm 파장 조사구간을 20℃의 항온 배양기에 두어 실험을 진행했으며 실험 진행 3, 6, 12, 24, 48시간 후 400㎕의 배양액을 채취한 뒤 혈구계산판을 이용하여 스쿠티카충의 운동성의 유무를 광학현미경으로 확인하여 계수하였다.
2-2-2. 측정결과
각각 포르말린 200과 400ppm, 및 청색 405nm와 465nm 파장으로 처리된, 시간에 따른 스쿠티카충의 비활성화 계수를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 405nm 파장의 조사구간에서는 3시간 째부터 암흑구간(대조군)에 비해 스쿠티카충의 유의적인 감소가 나타났으며 6시간 후에는 모든 스쿠티카충이 운동성을 잃었지만, 포르말린을 처리한 구간에서는 24시간 후에 처음으로 미세한 유의를 나타내었다. 또한, 465nm를 조사한 구간에서는 24시간까지는 유의적인 감소를 보이지 않았지만 48시간 조사후에는 유의적인 감소를 나타내었다.
상기 결과로부터, 405nm 및 465nm의 청색 LED 조사방법이 기존 방법인 포르말린에 비해 월등한 스쿠티카충 비활성화 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 3. LED 파장에 따른 스쿠티카충 내부의 변화관찰
3-1. 스쿠티카충 사멸 및 크기 과립도 관찰
3-1-1. 측정방법
LED 파장조사에 따른 스쿠티카충 세포내부의 변화를 확인하기 위해 스쿠티카충을 105 및 106 세포/㎖의 농도로 P2Y1 배지에 부유한 후, 10㎖을 T25 플라스크에 접종하고, 405nm 및 465nm 파장의 청색광을 조사하였다. 조사 후 3, 6, 12, 24, 48시간에서 1㎖의 배양액을 E-튜브에 분주한 후, 500g에 5분의 조건으로 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 동량의 인산완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS, pH 7.2-7.4)을 이용하여 세척하였다. 그 후, PBS에 요오드화 프로피디엄(Propidium Iodine, PI)을 5㎍/㎕의 농도로 희석하여 PI-용액을 제작한 후, 이를 E-튜브에 100㎕로 접종하고 20℃에서 15분간 반응시켰다. 반응된 세포를 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 세포의 PI 염색 유무, 크기, 및 복잡도를 관찰했으며, 양성 대조군(positve control)으로 동일 농도의 스쿠티카충을 95℃에 15분간 처리 후, 동일한 방법으로 PI 염색을 실시하여 비교하였다.
3-1-2. 측정결과
유세포 분석기를 이용한 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충의 크기 변화를 도 4에 나타내었다. 또한, 스쿠티카충의 사멸유무를 관찰하기 위해 적색형광을 읽고 게이팅(gating)하여 PI+세포의 비율을 도 5에 나타내었다. PI는 사멸한 세포에만 염색되며 적색형광을 발하기 때문에, 세포의 적색형광 발현정도를 읽는 FL-2를 이용할 경우, 죽은 세포만을 선별할 수 있다.
식(b): 상대적 수축 세포의 비율 = FSC
수축-처리군
/ FSC
수축-대조군
식(c): 상대적 사멸 세포의 비율 = PI+
처리군
/ PI+
양성대조군
상기 식(b)를 이용한 상대적 수축 세포의 분포 비율을 표 1에 나타내었고, 상기 식(c)를 이용한 상대적 사멸 세포의 비율을 표 2에 나타내었다. .
| 스쿠티카충 농도 | 파장 | 0h | 3h | 6h | 12h | 24h | 48h |
| 10 6 세포/㎖ | No light | 100.0% | 98.9% | 100.8% | 97.3% | 97.0% | 83.9% |
| 405nm | 100.0% | 108.9% | 119.0% | 122.2% | 141.0% | 163.6% | |
| 465nm | 100.0% | 113.3% | 113.3% | 122.0% | 127.5% | 156.0% | |
| 10 5 세포/㎖ | No light | 100.0% | 85.5% | 79.3% | 86.1% | 83.6% | 80.1% |
| 405nm | 100.0% | 99.8% | 105.3% | 111.3% | 145.1% | 147.9% | |
| 465nm | 100.0% | 100.8% | 113.3% | 127.3% | 138.5% | 131.4% |
| 스쿠티카충 농도 | 파장 | 0h | 3h | 6h | 12h | 24h | 48h |
| 10 6 세포/㎖ | No light | 2.5% | 2.0% | 1.2% | 3.6% | 1.0% | 11.4% |
| 405nm | 2.5% | 3.7% | 3.6% | 7.3% | 12.6% | 46.9% | |
| 465nm | 2.5% | 2.5% | 2.9% | 2.9% | 2.2% | 4.2% | |
| 10 5 세포/㎖ | No light | 2.5% | 2.5% | 3.7% | 3.2% | 1.9% | 1.5% |
| 405nm | 2.5% | 12.2% | 18.7% | 39.7% | 75.7% | 99.5% | |
| 465nm | 2.5% | 6.1% | 6.3% | 13.1% | 14.6% | 55.3% |
도 4와 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 스쿠티카충에 청색 LED를 조사할 경우, 대조군의 스쿠티카충에 비해 세포 수축이 발생함을 알 수 있다. 특히, 405nm 파장의 경우 24시간 조사 후, FSC수축군 세포의 비율이 140% 이상이었으며, 사멸된 세포의 비율도 시간이 지남에 따라 점점 증가하는 경향을 나타내었다.
그러나, 흥미롭게도 106 세포/㎖에서는 상대적인 PI+세포의 비율이 405nm에서 24시간 조사시는 12.6% 및 48시간 조사시에 46.9%였으나, 105cell/㎖에서는 405nm에서 24시간 조사시는 75.7% 및 48시간 조사시는 99.5%로 큰 차이를 나타내었다. 상기 결과는 스쿠티카충의 농도가 높을수록 동일한 광조건으로 조사하더라도 사멸 효율이 감소한다는 것을 나타낸다.
3-2. 세포 내 활성산소 측정
3-2-1. 측정방법
스쿠티카충을 5×105 세포/㎖의 농도로 P2Y1배지에 부유한 후, T25 플라스크에 접종하고, 405nm 및 465nm 파장의 청색광을 조사하였다. 조사 후 3, 6, 12, 24, 48시간에서 5×104 세포를 채취하여 E-튜브에 분주한 후 500g에 5분의 조건으로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그 후, 펠렛 상태의 스쿠티카충을 니트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium, NBT) 100㎕(1mg/㎖ P2Y1배지)와 혼합하여 20℃에서 30분간 반응시킨 후, 동일한 방법으로 P2Y1배지를 이용하여 세척하였다. 세척 후 100% 메틸 알콜로 10분간 고정한 후, 70% 메틸 알콜로 2회 세척하였다. 그 후, 100㎕의 70% 메틸 알콜로 재부유시켜 96 웰 플레이트에 접종한 후, 완전히 건조시키고, 120㎕ 2M KOH 및 140㎕ 디메틸설폭사이드(dimethly sulfoxide)를 첨가하여 630nm에서 흡광도를 측정하였다.
3-2-2. 측정결과
하기 식(d)를 이용한 LED 파장조사에 따른 스쿠티카충 내에 발생하는 활성산소의 정도를 도 6에 나타내었다.
식(d): 세포내 활성산소발생량 측정 = (630nm에서의 흡광도
처리군
/ 630nm에서의 흡광도
대조군
)
도 6에 나타난 바와 같이, 405nm 파장 조사구간에서는 대조군에 비해 3시간째부터 유의적인 활성산소의 증가를 나타냈으며, 465nm 파장 조사구간에서는 6시간째부터 유의적인 활성산소의 증가를 나타내었다. 상기 결과는 유효파장의 LED를 스쿠티카충에 직접 조사시에 기생충 내부에서 활성산소의 발생량이 대조군에 비해 많이 발생함을 나타낸다.
실시예 4. LED 광량에 따른 항스쿠티카충 효과
4-1. 측정방법
스쿠티카충액(103 세포/㎖ P2Y1 배지) 500㎕를 48 웰 플레이트의 12 웰에 접종한 후, 250, 185, 99, 37, 20 mol/ms의 광량으로 조절된 405nm 파장과 516, 308, 248, 146, 80 mol/ms의 광량으로 조절된 465nm 파장의 빛을 조사하였다. 그 후, 103 세포/웰의 스쿠티카충이 모두 운동성을 잃는 시간을 30분 × 2n (n=0, 1, 2, 3...)시간으로 관찰하였고, 이의 결과를 반수치사 조사광량인 LD50 값으로 측정하였다.
4-2. 측정결과
LED 광량에 따른 스쿠티카충의 비활성화 정도를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 405nm (R2=0.984) 및 465nm (R2=0.9438) 조사구간 모두 광량이 감소할수록 동일한 살균 효율을 내기 위해서는 거듭제곱만큼의 조사시간이 더 필요한 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 스쿠티카충을 비활성화시키기 위해 높은 광량을 조사해 주는 것이 조사시간을 높이는 것보다 훨씬 효과적임을 알 수 있다.
실시예 5. 스쿠티카충 농도에 따른 항스쿠티카충 효과
5-1. 측정방법
스쿠티카충 103, 104, 및 105 세포/㎖를 P2Y1 배지에 각각 부유한 후, 각 500㎕를 48 웰 플레이트의 12 웰에 접종한 후, 405nm 파장과 465nm 파장의 빛을 조사하였다. 그 후, 103 세포/웰의 스쿠티카충이 모두 운동성을 잃는 시간을 30분 × 2n (n=0, 1, 2, 3...)시간으로 관찰하였고, 이의 결과를 반수치사 조사광량인 LD50 값으로 측정하였다.
5-2. 측정결과
스쿠티카충 103, 104, 및 105 세포/㎖의 농도에 따른 비활성화 정도를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 스쿠티카충의 농도가 증가함에 따라 이들 모두를 사멸하기 위해 조사되는 시간은 점점 증가하였고, 이의 정도는 지수함수적인 연관(R2=0.9887) 관계가 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 넙치에 대한 생체실험 결과
6-1. LED 파장에 따른 항스쿠티카충 효과
6-1-1. 측정방법
잉어의 상피세포 유래 세포주인 Epithelioma Papulosum Cyprini(EPC)의 5×106 세포를 잉어로부터 채취한 후, 10% FBS, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 용액을 포함하는 Leibovitz-15 배지에 접종하고 20℃에 3일간 배양한 후, 이를 넙치의 스쿠티카 인위감염에 이용하였다.
넙치(Paralichthys olicaceus, 평균 무게= 28±6.82g)를 20℃로 유지되는 200L 수조에 1주일 이상 순치시킨 후, 1/3로 희석된 10ℓ의 해수에 스쿠티카충(M. avidus)을 103 세포/㎖의 농도가 되도록 만든 후, 30 마리의 넙치를 1시간 동안 침지감염 시켰다. 공격 후 40×30×30cm의 수조에 수용하여 405nm(사용광량= 250mol/m s) 및 465nm(사용광량= 516 mol/m s)의 LED 또는 자연광(대조군)을 하루에 12시간 조사해 주었다. 이 때 염분농도는 기존해수의 1/3로 계속 조절하였으며, 수온은 20℃로 유지하면서 24일간 누적폐사율을 관찰하였다.
6-1-2. 측정결과
스쿠티카증에 감염된 넙치의 누적폐사율을 도 9에 나타내었고, 감염 17일째에 넙치의 이미지를 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 24일간 관찰한 결과 자연광(대조군)에서는 100%의 넙치가 스쿠티카증 감염에 의해서 폐사되었으며, 405nm 및 465nm 파장 조사구간에서는 각각 30% 및 70%의 폐사율을 나타내어 405nm 및 465nm 파장 조사군이 대조군 대비 각각 70% 및 30%의 상대생존율을 나타내었다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 405nm 파장 조사구간에서는 스쿠티카증에 의한 궤양형성이 대조군에 비해 매우 경미한 수준인 것으로 나타났으며 465nm 파장 조사구간은 대조군보다는 궤양형성의 정도가 심하지 않았나 405nm 파장 조사구간보다는 심한 증상을 보였다. 상기 결과로부터 405nm 파장 조사구간이 스쿠티카증을 치료 및 예방하는데 매우 효과적인 파장대임을 알 수 있다.
6-2. 광주기에 따른 항기생충 효과
6-2-1. 측정방법
넙치(평균 무게= 15±4.40g)를 20℃로 유지되는 200L 수조에 1주일 이상 순치시킨 후, 1/3로 희석된 10ℓ의 해수에 스쿠티카충(M. avidus)을 103 세포/㎖의 농도가 되도록 만든 후, 넙치를 1시간 동안 침지감염 시켰다. 공격 후 40×30×30 cm의 수조에 수용하여 405nm 파장을 광주기에 따라 6시간 조사 구간(6L:18D), 12시간 조사 구간(12L:12D), 18시간 조사 구간(18L:6D), 및 24시간 조사 구간(24L:0D)과 자연광 조사 구간(12L:12D)으로 나누어 최대 광량으로 조사하였다.
6-2-2. 측정결과
405nm의 LED 파장을 6L:18D, 12L:12D, 18L:6D, 24L:0D의 광주기로 조사한 후 스쿠티카에 인위 감염된 넙치의 누적폐사율을 도 11에 나타내었다. 여기서 L은 하루 광 조사시간 및 D 비조사시간을 나타낸다.
도 11에 나타난 바와 같이, 조사 24일 후, 대조군은 67%의 폐사율을 나타내었고, 6L:18D는 17%, 12L:12D는 25%, 18L:6D는 67%, 24L:0D는 42%의 폐사율을 나타내어 상대생존율은 순서대로 83%, 75%, 33%, 58%였다. 이는 LED를 이용하여 넙치의 생체에 적용시에는 조사시간이 하루에 최대 12시간이 넘어가게 되면, 오히려 그 효과가 반감될 수 있다는 것을 의미한다.
Claims (12)
- 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 LED 광원은 380 내지 480 nm 범위의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 LED 광원은 20 내지 1500 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량으로 유지되는 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 LED 광원의 광 주기는 6~12:18~12시간 (L:D)의 조건인 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 어류는 넙치, 복어, 잉어, 민어, 뱀장어, 송어, 고등어, 삼치, 임연수, 가자미, 열갱이, 강도다리, 조피볼락, 우럭, 도루묵, 명태, 대구, 꽁치, 청어, 장어, 정어리, 연어, 참치, 가다랭이, 멸치, 갈치, 홍게, 및 조기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 어류는 1 내지 1×108 세포/㎖ 농도의 스쿠티카충을 포함하는 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 어류는 초기 스쿠티카증에 감염된 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 어류에 청색광의 LED 광원을 조사할 경우, 스쿠티카충 내에 활성산소가 발생하는 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 어류에 광감각 물질(photosensitizer)을 처리한 후, 청색광의 LED 광원을 조사하는 것을 특징으로 하는 것인, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 9항에 있어서,
상기 광감각 물질은 인도시아닌 그린, 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루, 아미노레불린산, 프탈로시아닌, 포르피린, 텍사피린, 박테리오클로린, 메로시아닌, 소랄렌, 벤조포르피린 유도체 및 포르피머 나트륨으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 제 1항에 있어서,
상기 수중 환경은 어항, 수족관, 양식장, 연못, 사육장 또는 해양인 것을 특징으로 하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료방법. - 청색광의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 시스템을 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 장치.
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