KR20170095752A - 실시간 핵산 또는 단백질 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

실시간 핵산 또는 단백질 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 X-Y-Z의 구조를 가지고, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 핵산 또는 단백질을 실시간으로 검출하는 과정에서 프라이머 및 프로브로 사용되는 단일핵산(promer), 및 상기 단일핵산(promer)를 이용하여 검출하고자 하는 핵산을 증폭시킨 다음, 절단된 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하는 핵산 및 단백질을 실시간으로 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 핵산 또는 단백질을 검출하는 방법은 종래 검출방법에 비해 적은 올리고(oligo)를 사용하고, 실시간 확인을 위한 별도의 위치의 프로브(probe)가 필요치 않아 보다 적은 비용과 간단한 분석방법으로 검출하고자 하는 핵산 또는 단백질을 실시간으로 검출하는 것이 가능하다. 또한, 단일핵산(promer)의 Y 부위를 절단한 후 증폭하는 단계를 통해 Y 부위의 돌연변이 확인이 가능하며, 단일핵산에 부착되는 형광물질의 개수보다 많은 핵산 또는 단백질을 다중검출하는 것을 가능하므로, 다양한 질병의 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

실시간 핵산 또는 단백질 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법{Promer for Real-Time Detection of Nucleic Acid or Protein and Method of Detecting Nucleic Acid or Protein Using the Same}
본 발명은 핵산 또는 단백질의 실시간 검출을 위해 프라이머 및 프로브로 동시에 사용할 수 있는 단일핵산(promer), 및 상기 단일핵산(promer)을 이용하여 핵산 또는 단백질을 실시간으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
핵산 또는 단백질을 실시간으로 검출하는 방법은 당업계에 공지된 바와 같이 마이크로어레이(microaray), 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR; Quantitative real-time polylmerase chain reaction, qRT-PCR) 검사법, NASBA, RCA, TDMA 등의 등온 증폭 방법이 널리 사용되고 있다.
이러한 핵산 또는 단백질의 검출방법은 실시간 검출을 위해 정방향/역방향 프라이머(primer)와 SYBR과 같은 Intercalator type의 dsDNA-binding agents, 또는 probe type의 Taqman probe, Molecular Beacon, MGB probe, Catacleave probe 등을 필요로 한다. 이러한 탐지방법은 몇몇의 한계성을 지니고 있다. 그 일 예로서 miRNA와 같은 짧은 길이의 핵산 분석을 위해 cDNA 합성을 하는 과정에서 루프 RT 프라이머(loop RT primer) 또는 폴리 A(poly A)를 형성하고 폴리 A 뒤에 추가적인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 확장을 필요로 한다. 이는 miRNA와 같은 짧은 길이의 핵산 분석에서 복잡한 과정을 거치도록 하며, 추가 비용의 상승과 오랜 검출시간을 필요로 한다. 또한, 기존 방법으로는 검출하고자 하는 miRNA 하나에 하나의 형광물질만 표지가 가능하고, 현재 형광물질을 검출하기 위해 사용되는 장비는 한번에 동시 분석이 가능한 형광 채널 개수가 통상 4~7종류로 제한되어 있으므로, 8개 이상의 miRNA를 분석하기 위해서는 2번 이상의 동일한 작업이 반복적으로 이루어져야 하는 단점을 가지고 있다.
기존 방법으로 제한되는 또 다른 예로써 표적 핵산 분석을 위해 증폭하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 길이는 정방향/역방향 프라이머(primer)와 프로브(probe)의 길이를 고려하여 최소 60~70bp이상의 길이를 요구한다. 이의 경우 최소 3곳의 특이적 서열(specific sequence)을 요구한다.
또 다른 예로서 SNP(single nucleotide polymorphism)와 같은 단일위치의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변이를 측정하기 위해서는 종말점 유전형질분석(endpoint genotyping)을 위해 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 등과 같은 기술을 이용하여 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)의 특정 변이 위치의 결합력을 증가시켜야 하며, 이는 프라이머와 프로브 제작을 어렵게 하고, 많은 시간과 비용을 요구한다.
한편, 미국 등록특허 제5,763,181호는 핵산 또는 단백질의 실시간 검출 방법을 개시하고 있다. CataCleave 기법은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성이 없는 2차 효소에 의해 수행된다는 점에서 Taq-Man probe와 다르다. CataCleave 프로브는, 예를 들어 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적 분자 내에 서열을 가지고 있다. 일 구체예에서, CataCleave 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로, 절단 부위는 RNA로 구성되어 있는, 키메릭 구조를 가지고 있다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은, 양말단이나 또는 내부에 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase H 효소를 포함한다. 절단후에, 프로브의 반쪽 모두는 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응 용액으로 분산된다. 공여체 및 수용체가 분리될수록, FRET은 Taq-Man 프로브와 같은 방법으로 바뀌게 되며, 공여체 방출은 모니터 될 수 있다. 절단 및 해리는 추가적인 CataCleave 프로브 결합을 위한 부위를 재생산하게 된다. 이러한 방법으로, 프라이머가 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 신장될 때까지, 단일 앰플리콘이 표적으로서 프로브 절단을 여러회 반복할 수 있게 해준다.
그러나 상기 미국등록특허에서 개시하고 있는 카타클리브 프로브(Catacleave probe)를 이용한 실시간 검출방법은 몇가지 문제점을 가지고 있다.
첫째, 검출과정에서 Catacleave probe의 반복적인 절단으로 인해 배경 형광 값이 지속적으로 증가한다. 이에 따라 Ct 값의 정확한 측정을 어렵게 하며 이를 보완하기 위한 별도의 작업이 요구된다.
둘째, Catacleave probe가 작용하는데 최소 60~70bp 이상의 증폭구간이 필요하다.
셋째, Catacleave probe를 이용하여 SNP 분석이 어렵다. 즉, Catacleave probe의 경우 기존의 Endpoint Genotyping에 적용하기 어려우며, 점돌연변이 지점에 직접 혼성화시켜 확인하는 방법은 정확도가 떨어진다.
따라서, 본 발명은 상기한 문제점을 해결하고 기존 기술의 한계성을 극복하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 핵산 또는 단백질의 실시간 검출을 위해 프라이머 및 프로브로 사용되는 단일핵산을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 이용하여 RNA를 실시간으로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 이용하여 DNA를 실시간으로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 이용하여 단백질을 실시간으로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 핵산 또는 단백질의 실시간 검출을 위해 프라이머 및 프로브로 사용되는 단일핵산을 제공한다.
이에 정량적, 재현성 및 분리도가 뛰어나고 무엇보다 짧은 증폭 길이와 시간을 요구하는 핵산 또는 단백질을 실시간으로 검출하는 방법을 연구하던 중, 본 발명에서와 같은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 핵산 또는 단백질을 검출하는 과정에서 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용이 가능한 단일핵산(promer)을 개발하고, 상기 단일핵산을 이용할 경우 핵산을 증폭하는 과정 또는 단백질과 혼성화시키는 과정에서 절단된 단일핵산의 단편 양을 측정함으로써 검출하고자 하는 핵산 또는 단백질을 정확하고 빠르게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다. 이때 부착되는 탐지 가능한 마커의 위치는 특정 부위에 국한하지 않으며, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 탐지 가능한 마커가 분리되는 위치라면 어느 곳이든 가능하다.
또한, 상기 단일핵산은 실시간 검출을 목적으로 하는 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위에 결합하여 복합체를 형성하고, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시, Y 및 Z는 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위로부터 분리되지만 X부위는 분리되지 않고 복합체를 유지하며 증폭을 위한 프라이머로 사용되는 것을 특징으로 한다.
상기 단일핵산은 본 발명에서 “프로머(promer)”라고 명명하였으며, 이하에서는 별도의 언급이 없는 한 단일핵산은 프로머(promer)로 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용가능한 단일핵산을 의미한다.
본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 각각의 X, Y, 및 Z는 다양한 개수의 뉴클레오티드(nucleotide)를 가질 수 있다.
하나의 예로, 상기 X는 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 4 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 7 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 8 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이다. X가 60개를 초과한 염기서열을 포함하는 경우 핵산 또는 단백질의 실시간 검출시 비특이적 반응이 발생할 수도 있다.
하나의 예로, 상기 Y는 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 9개, 보다 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이다. 또한, 상기 Y는 Z가 0개의 염기로 구성될 때 최소 3개 이상, 바람직하게는 3 내지 10개, 보다 바람직하게는 3 내지 9개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 8개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 7개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 4개의 염기 서열로 구성된다. 또한, 상기 Y는 Z가 1개의 염기로 구성될 때 최소 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 9개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 7개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 3개의 염기 서열로 구성된다. Y를 구성하는 염기 서열이 상기 범위를 벗어난 경우에는 핵산 또는 단백질의 실시간 검출시 비특이적 반응이 발생하여 민감도가 감소할 수도 있다.
하나의 예로, 상기 Z는 0 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이다. Z를 구성하는 염기 서열이 상기 범위를 벗어난 경우에는 Y가 절단(cleavage)된 후 표적 핵산 또는 단백질에 결합된 Z가 표적 핵산 또는 표적 단백질로부터 이탈이 되지 않고 그대로 결합되어 있어서 핵산 또는 단백질의 검출을 할 수 없는 문제가 있다.
이때, 상기 X, Y, 및 Z 중 어느 하나가 DNA일 때 다른 두 개 중의 하나 이상은 RNA이다. 바람직하게는 상기 X, Y 및 Z는 순서대로 DNA, RNA 및 DNA 또는 RNA, DNA 및 RNA이다.
하나의 구체적 예로, X가 DNA일 때 Y 또는 Z 중 어느 하나는 RNA, 예를 들면 Y는 RNA이고 Z는 DNA이거나, Y는 DNA이고 Z는 RNA이다. 여기서 상기 DNA와 RNA는 0개 이상일 수 있으며, 상기 X, Y, 및 Z에서 정의하고 있는 개수의 DNA와 RNA를 가진다.
다른 하나의 구체적 예로, X가 RNA일 때 Y 또는 Z 중 어느 하나는 RNA, 예를 들면 Y는 RNA이고 Z는 DNA이거나, Y는 DNA이고 Z는 RNA이다. 여기서 상기 DNA와 RNA는 0개 이상일 수 있으며, 상기 X, Y, 및 Z에서 정의하고 있는 개수의 DNA와 RNA를 가진다.
또 다른 하나의 구체적 예로, Z가 0일 때 X 또는 Y 중 어느 하나는 DNA이고 다른 하나는 RNA이다. 여기서 상기 DNA와 RNA는 1개 이상으로 상기 X 및 Y에서 정의하고 있는 개수의 DNA와 RNA를 가진다.
또한, 상기 X, Y 및 Z는 비특이적인 절단을 막기 위해 전체적으로 메틸화되어 있거나 부분적으로 메틸화되도록 합성된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 시료로부터 실시간 검출하고자 하는 DNA 또는 RNA를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 탐지 가능한 마커로 형광쌍을 사용하는 경우, 형광물질과 소광물질의 위치는 X 또는 Z에 위치한 형태이거나 Y 부위에 위치할 수 있으며, 그 어느 것에 한정되는 것은 아니다. 하나의 예로서, 형광물질은 X에 위치하고 소광물질은 Y 또는 Z에 위치할 수 있다.
본 발명의 단일핵산은 핵산 또는 단백질을 검출하는데 있어서, ⅰ) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ⅱ) DNA, 또는 RNA으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; ⅲ) DNA, 또는 RNA으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; ⅳ) DNA, 또는 RNA으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 ⅴ) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 단일핵산은 RNA(miRNA 등의 small RNA 포함)로부터 cDNA를 합성하기 위한 ⅰ) RT 프라이머 및 프로브; 또는 ⅱ) 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 프로브, ⅲ) 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머 및 프로브, 또는 ⅳ) 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 단일핵산을 RNA(miRNA 등의 small RNA 포함)를 cDNA로 합성 및 증폭하기 위한 RT 프라이머; 또는 정방향 프라이머와 프로브; 또는 역방향 프라이머와 프로브로 사용하는 경우에, cDNA 합성시 RT 프라이머를 루프형태로 제작하거나 폴리 A를 형성하는 과정이 필요하지 않고 검출하고자 하는 RNA와 혼성화되어 cDNA를 합성하고 탐지하고자 하는 RNA(miRNA 등의 small RNA 포함)를 증폭 및 실시간 검출할 수 있다.
다른 하나의 구체적인 양태로서, 본 발명의 단일핵산은 시료로부터 특정 DNA를 검출하기 위한 ⅰ) 정방향 프라이머 및 프로브; ⅱ) 역방향 프라이머 및 프로브, 또는 ⅲ) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 프로브로 사용할 수 있다.
이러한 일련의 구체적인 양태에서, 본 발명의 단일핵산은 단일핵산의 Y 부위를 절단하는 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단된 후 Y 및 Z 부위는 분리되고 X 부위는 표적핵산과 복합체를 유지하여 프라이머로 사용되어 핵산을 합성 및 증폭할 수 있으며, 단일핵산의 Y 부위를 절단하는 효소에 의해 단일핵산의 Y 부분만이 절단되므로 종래 DNA 중합효소에 의해 분해되는 프로브에 비해 검출하고자 하는 핵산 또는 단백질을 보다 정확하게 탐지할 수 있다.
특히, 본 발명의 단일핵산에서 Y 또는 Z의 3`말단이 형광물질 또는 소광물질이 결합되어 있는 경우 단일핵산의 Y 부위가 절단되지 않는 한 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 핵산이 중합효소에 의해 증폭되는 것을 차단할 수 있으므로 점돌연변이(point mutation), 삽입 돌연변이(insert mutation), 결실 돌연변이(deletion mutation) 등의 돌연변이와 같은 변이를 정확하게 탐지할 수 있다.
따라서, 본 발명의 단일핵산을 핵산 또는 단백질을 검출하는데 사용하는 경우, 종래 기술에 비해, 추가적인 별도의 과정(예로, RT 프라이머의 루프 형태 제작, 폴리 A의 형성 등), 그리고 분석시간과 비용을 절감시킬 수 있으며, 종래 방법에 비해 검출하고자 하는 핵산 또는 단백질을 보다 정확하게 특이적으로 탐지할 수 있으므로, 본 발명의 단일핵산은 핵산 또는 단백질을 실시간으로 검출하기 위한 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 단일핵산을 핵산 또는 단백질을 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 이외에 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 단일핵산을 핵산 또는 단백질을 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 및 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소 이외에 DNA의 증폭반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 증폭반응에 필요한 시약은 예를 들어, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2 +), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)을 들 수 있다. 또한, 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 있다
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 단일핵산(promer)을 이용하여 RNA를 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.:
a) 시료로부터 RNA를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출한 RNA에 별도의 RT 프라이머 또는 본 발명의 단일핵산(promer)를 혼합하여 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA에 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트, 및/또는 상기 cDNA와 상보적인 염기서열 가지는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 혼합하여 신장반응을 통해 cDNA를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계를 통해 절단된 단일핵산(promer)의 단편 양을 측정하는 단계.
본 발명에 따른 RNA를 실시간으로 검출하는 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
a) 시료로부터 RNA를 추출하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료이거나, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검 표본으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 또는 보관된 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, 또는 이들의 단편일 수 있다. 그러나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 보관된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1주일 이상, 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동 보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료로부터 RNA의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 하나의 예로, 트리졸(trizol) 또는 트리톤 X-100 등을 이용하여 이루어질 수 있다.
b) RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계에서 추출한 RNA에 별도의 RT 프라이머를 혼합하여 cDNA를 합성하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 RT 프라이머는 검출하고자 하는 RNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 5 내지 30개, 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 핵산이다. 이때, RT 프라이머는 당업계에 일반적으로 공지된 RT 프라이머 또는 본 발명의 단일핵산일 수 있다.
본 발명에 있어서, RT 프라이머로 본 발명의 단일핵산을 사용하는 경우, 상기 단일핵산은 검출하고자 하는 핵산의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 cDNA의 합성은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 이루어질 수 있으며, 하나의 예로, 시료로부터 수득된 RNA를 주형으로 역전사 효소와 DNA 중합효소에 의해 이루어질 수 있다. 또한 상기에 언급한 단일핵산을 RT 프라이머로 사용하지 않은 경우, polyA tail, specific primer, random primer를 이용하여 cDNA를 합성한 경우에도 단일핵산을 이용한 RNA 분석이 가능하다.
c) cDNA를 증폭하는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA에 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트, 및/또는 상기 cDNA와 상보적인 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 혼합하여 신장반응을 통해 cDNA를 증폭시키는 단계이다.
상기 단일핵산을 포함하는 키트는 본 발명의 단일핵산과 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소로 이루어진 것을 말한다.
상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 X 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 X 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, X 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것으로, cDNA를 증폭하기 위한 ⅰ) 정방향 프라이머 및 프로브, ⅱ) 역방향 프라이머 및 프로브, 또는 ⅲ) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 상기 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 Y 및 Z는 분리되고 X는 분리되지 않고 프라이머로 작동한다. 이러한 단일핵산의 구조는 상술한 바와 같다.
상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산은 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산 이외에 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머가 사용될 수 있다. 이때, 상기 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머는 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA와 상보적 결합이 가능하며, 5 내지 30개, 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 DNA이다. 여기서, 상기 역방향 프라이머는 상기 b) 단계의 RT 프라이머와 동일한 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 역방향 프라이머로 사용되는 단일핵산은 상기 b) 단계의 단일핵산과 동일한 것일 수 있으며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 부착된 탐지 가능한 마커는 상기 b) 단계의 단일핵산과 동일하거나 서로 다른 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, cDNA의 증폭은 A) 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 본 발명의 단일핵산과 당업계에서 일반적으로 사용되는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에 의해 어닐링되거나, B) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 본 발명의 단일핵산에 의해 어닐링되며, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 등온온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 등온이란 열 순환(thermal cycling)이 없다는 것을 의미하는 것으로, 반드시 물리적으로 동일한 온도를 의미하는 것은 아니다.
하나의 구체적 예로, 본 발명에서 증폭반응이 수행되는 등온온도는 40 내지 80℃, 바람직하게는 55 내지 75℃, 보다 바람직하게는 60 내지 75℃일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 cDNA의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 핵산가득 전치 증폭(stRNAd displacement amplification) 및 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 방법으로 이루어질 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 cDNA의 증폭반응은 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트 이외에 증폭이 필요한 시약, 예컨대, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2 +), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등을 추가로 사용하여 이루어질 수 있다.
d) 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 절단된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 real-time PCR machine, 트라이애드 멀티모드 디렉터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer) LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, X 말단에 형광 공여체가 부착되고 Z 말단에 퀀쳐가 부착된 단일핵산(promer)이 표적 핵산과 혼성화를 이루고 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 Y 및 Z 부위가 분리되기 전에는 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 의해 크게 감소된 상태를 유지한다. 그러나, Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 X 부위는 분리되지 않고 Y 및 Z 부위만이 표적 핵산으로부터 분리되어 반응용액으로 분산되면 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 영향을 받지 않고 증가하게 된다. 이때 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광 방출의 증가를 상술한 기기를 이용하여 표적 핵산을 실시간으로 검출할 수 있다.
하나의 구체적 예로서, 소형 RNA(small RNA)와 상보적인 결합을 나타내는 RT 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성한 후, 본 발명에 따라 cDNA와 상보적인 결합을 나타내며, FAM이 부착된 단일핵산을 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하여 cDNA를 증폭한 결과, 종래 탐지 가능한 마커가 부착되지 않은 정방향 프라이머를 사용하여 증폭된 cDNA와 달리 cDNA가 증폭하는 과정 중에 증폭 곡선이 나타났음을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 단일핵산(promer)을 이용하여 DNA를 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.:
a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출한 DNA에 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트, 및/또는 상기 DNA와 상보적인 염기서열 가지는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 혼합하여 신장반응을 통해 DNA를 증폭시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계를 통해 절단된 단일핵산(promer)의 단편 양을 측정하는 단계.
본 발명에 따른 DNA를 실시간으로 검출하는 방법을 각 단계에 따라 설명하면 다음과 같다.
a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료, 생물학적 시료로부터 분리된 DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검 표본으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상, 또는 보관된 생물학적 시료로부터 분리된 DMA 또는 이들의 단편일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 보관된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동 보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료로부터 DNA의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 하나의 예로, 클로로포름(chloroform) 또는 에탄올(ethanol) 등을 이용하여 이루어질 수 있다.
b) DNA를 증폭하는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계에서 수득한 DNA에 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트, 및/또는 상기 DNA와 상보적인 염기서열 가지는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 혼합하여 신장반응을 통해 DNA를 증폭시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산을 포함하는 키트는 본 발명의 단일핵산과 상기 단일핵산의 X 부위를 절단할 수 있는 효소로 이루어진 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
위에서 언급한 것처럼, 상기 단일핵산은 상기 a) 단계에서 수득한 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것으로, DNA를 증폭하기 위한 ⅰ) 정방향 프라이머 및 프로브, ⅱ) 역방향 프라이머 및 브로브, 또는 ⅲ) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용될 수 있다. 또한, 위에서 언급한 것처럼, 본 발명의 상기 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 Y 및 Z는 분리되며 X는 분리되지 않고 프라이머로 작동한다. 이러한 단일핵산의 구조는 상술한 바와 같다.
상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산은 상기 a) 단계에서 추출된 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산 이외에 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머가 사용된다. 이때, 상기 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머는 상기 a) 단계에서 추출된 DNA와 상보적 결합이 가능하며, 5 내지 30개, 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 DNA이다.
또 다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산은 상기 a) 단계에서 추출된 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성되며, 상기 단일핵산 이외에 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머가 요구되지 않는다.
본 발명에 있어서, DNA의 증폭은 A) 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 본 발명의 단일핵산과 당업계에서 일반적으로 사용되는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에 의해 어닐링되거나, B) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 본 발명의 단일핵산에 의해 어닐링되며,, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 등온온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 등온이란 열 순환(thermal cycling)이 없다는 것을 의미하는 것으로, 반드시 물리적으로 동일한 온도를 의미하는 것은 아니다.
하나의 구체적 예로, 본 발명에서 DNA 증폭반응이 수행되는 등온온도는 40 내지 80℃, 바람직하게는 55 내지 75℃, 보다 바람직하게는 60 내지 75℃일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 핵산가득 전치 증폭(stRNAd displacement amplification) 및 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 방법으로 이루어질 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA의 증폭반응은 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트 이외에 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2 +), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등을 추가로 사용하여 이루어질 수 있다.
c) 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 절단된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, X 말단에 형광 공여체가 부착되고 Z 말단에 퀀쳐가 부착된 단일핵산(promer)이 표적 핵산과 혼성화를 이루고 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 Y 및 Z 부위가 분리되기 전에는 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 의해 크게 감소된 상태를 유지한다. 그러나, Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 X 부위는 분리되지 않고 Y 및 Z 부위만이 표적 핵산으로부터 분리되어 반응용액으로 분산되면 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 영향을 받지 않고 증가하게 된다. 이때 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광 방출의 증가를 상술한 기기를 이용하여 표적 핵산을 실시간으로 검출할 수 있다.
본 발명에 따라 단일핵산을 이용한 핵산 검출방법은 종래의 방법에 비해 다음과 같은 개선점을 제공한다.
1. 종래의 방법은 정방향 및 역방향의 프라이머 및 프로브를 각각 제조하고 사용하여 핵산을 실시간으로 검출하였다. 그러나 본 발명은 1개의 정방향 또는 역방향의 단일핵산(promer)과 1개의 정방향 또는 역방향의 프라이머를 제조하여 핵산을 실시간 검출하거나 정방향 및 역방향 단일핵산(promer)를 제조하여 핵산을 실시간 검출한다. 따라서 본 발명은 종래 방법에 비하여 적은 올리고(oligo)를 사용하므로 비용 절감 및 간단한 분석방법을 제공할 수 있다. 특히, 종래의 Catacleave probe는 단지 프로브로 사용될 뿐 프라이머로 사용되지 않으나, 본 발명의 단일핵산(promer)은 프라이머와 프로브로 동시에 사용된다(도 1 참조).
2. 종래 방법은 실시간 확인을 위한 별도 위치의 프로브(probe)가 필요하여 최소 60 내지 70bp의 증폭 구간을 필요로 하였으나, 본 발명은 프라이머 및 프로브로 동시 작용 가능하여 별도 위치의 프로브가 필요하지 않아 보다 짧은 증폭구간만을 필요로 한다. 일 예로, 종래 기술의 분석방법은 최소 60bp - 70bp의 증폭구간을 필요러 하나, 본 발영의 단일핵산 (Promer)를 사용할 경우에는 40bp이상의 증폭구간을 필요로 한다. 이는 본 발명을 사용했을 때, miRNA와 같은 소형 핵산 분석 과정에서 추가적인 올리고(oligo)의 신장을 필요하지 않아 보다 빠르고 간편한 검출 방법을 제공한다. 특히, 종래의 Catacleave Probe는 절단효소에 의해 절단 부위가 절단된 후 절단 부위의 전후 부위가 모두 표적 핵산 및 단백질로부터 분리된다. 그러나 본 발명의 단일핵산(Promer)은 Y 부위 절단 후 X 부위는 표적 핵산과 복합체를 유지하고, Y 및 Z 부위만이 표적핵산으로부터 분리되어 프라이머 및 프로브로 동시 사용 가능하다.
3. 본 발명의 단일핵산(promer)은 Y 부위가 절단된 후 증폭하는 단계에 의해 Y 부위의 돌연변이 구별을 용이하게 하므로, 이후의 핵산 증폭 반응을 통해 돌연변이 확인을 가능하게 한다. 즉, 본 발명의 단일핵산(promer)에서 Y 부위와 표적 핵산의 돌연변이 부위에 혼성화를 형성하도록 하였을 경우, Y 부위가 돌연변이 부위와 정확하게 상보적인 결합을 한 경우에만 절단되고 이후에 증폭반응이 수행되기 때문에 돌연변이 여부를 명확하게 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 돌연변이 부위가 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 측정하고자 하는 돌연변이가 없음을 의미하게 된다. 이와 반대로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위를 표적 핵산의 돌연변이가 발생하는 부위의 비 돌연변이인 경우와 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 돌연변이가 있음을 의미하게 된다.
4. 종래 방법 중 Catacleave Probe는 도 18과 같이 반복적인 절단에 의해 배경 형광광도가 지속적으로 증가하는 경향을 나타내어 Ct 값(threshold cycle value)의 정확한 측정이 어렵고 Ct값 측정을 위한 별도의 작업이 필요하나, 본 발명은 Ct값 측정을 위한 별도의 작업이 필요로 하지 않으며 정확한 측정이 가능하다.
5. 종래의 Catacleave Probe와 Taqman probe와 같은 Hydrolysis probe의 경우 1번의 증폭을 통해 증폭량만큼 정확한 형광표시자를 발생시키지 않는다. 일 예로 TaqMan probe나 MGB Probe의 경우 혼성화된 probe가 올리고뉴클레오티드의 합성하는 과정에서 절단되어야 하나 절단되지 않고 그대로 이격하는 경우가 발생한다. 또한 Catacleave Probe의 경우에는 반복적인 혼성화와 절단으로 인해 실제 표적핵산의 증폭량보다 많은 형광표시자를 발생시킨다. 그러나 본 발명은 단일핵산(Promer)이 표적핵산과 혼성화한 후에 Y 부위 절단으로 1개의 형광표시자를 발생시킨 후에 올리고뉴클레오티드의 합성이 이루어져 형광표시자의 수량과 증폭되는 표적핵산이 정확하게 일치하여 증폭한다.
6. 본 발명의 단일핵산(promer)을 정방향 및 역방향 프라이머로 사용함으로써 보다 개선된 다중(multiplex) 검출방법을 제공한다. 통상적으로 알려진 다중(multiplex) 검출의 경우 사용되는 형광물질의 종류만큼 가능하나, 본 발명의 경우 상기 단일핵산(proemr)에 서로 같거나 다른 형광물질 부착하여 보다 많은 핵산을 검출할 수 있다. 하나의 예로, 본 발명의 경우 2개의 형광물질을 사용할 경우 5종, 3개의 형광물질을 사용할 경우 9종, 4개의 형광물질을 사용할 경우 14종의 핵산을 다중(multiplex) 검출하는 것을 가능케 한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일핵산(promer)를 이용하여 단백질을 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
a) 본 발명의 단일핵산(promer)과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계; b) 검출 대상 단백질을 포함하는 시료와 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 결합시켜 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계; c) 상기 b) 단계에서 형성된 단백질-항체 복합체에 본 발명의 단일핵산(promer)을 포함하는 키트를 혼성화시켜 단백질-항체-단일핵산 복합체를 형성시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계를 통해 절단된 단일핵산(promer)의 단편 양을 측정하는 단계.
본 발명에 따른 단백질을 검출하는 방법을 각 단계에 따라 설명하면 다음과 같다.
a) 본 발명의 단일핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 단일핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산은 본 발명의 단일핵산의 염기서열을 주형으로 하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 증폭반응을 통해 합성된 것이다.
위에서 언급한 것처럼, 본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 Y 및 Z는 분리되며 X는 분리되지 않고 프라이머로 작동한다. 이러한 단일핵산의 구조는 상술한 바와 같다.
상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 항체의 Fc 영역에 본 발명의 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산이 연결고리(linker)로 연결되어 이루어진 구조를 가진다. 여기서, 상기 연결고리는 통상적으로 1 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA이다.
본 발명에 있어서 본 발명의 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산과 항체를 연결시키는 방법은 통상적으로 2가지 방법이 사용될 수 있다. 첫 번째 방법은, 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로핵산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethl)Cyclohexane-1-Carboxylate; SMMCC), 술포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로핵산-1-카르복실레이트(Sulfo Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethl)Cyclohexane-1-Carboxylate; Sulfo-SMCC), n-숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(n-Succinimidyl-3-(2-Pyridylthio)Propionate; SPDP), N-숙시니미딜-6-(3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도)헥사노에이트(N-Succinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionamido)hexanoate; NHS-Ic-SPDP), 또는 술포숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SulfoSuccinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionaamido)hexanoate; Sulfo-NHS-Ic-SPDP) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 시약을 사용하여 5'-말단이 티올(thiol)로 변형된 DNA를 항체의 유리 아미노 그룹들에 연결시키는 것이다. 상기 시약들은 그들 간격을 띄우는 그룹(spacer)의 길이와 물에 대한 용해도 정도가 다르다. 만약 필요하다면, 추가적인 조작을 위하여 DNA를 방출시키는 티올화(thiolation) 시약으로 연결 부위를 절단할 수 있다.
두 번째 방법은, 사량체(tetrameric) 단백질인 스트렙아비딘(strepavidin)에 의해서 항체-DNA 사이의 연결 부위를 제공함에 의해서, 상기 단백질은 비오틴(biotin)과 충분히 비가역적인 결합을 형성하는 것이다. 항체의 유리 아미노 그룹들은 비오틴-n-하이드록시숙시니미드(biotin-nhydroxysuccinimide)와 반응하여 비오틴으로 표지된다. DNA의 비오틴화는 5'-비오틴 포스포아마다이트(5'-biotin phoshporamidite)의 사용 또는 5'-말단의 아미노기 표지 뒤에, 비오틴-n-하이드록시숙시니미드와 반응시켜 이루어질 수 있다. DNA, 스트랩아비딘 및 항체의 결합(conjugate)은 1 몰당량의 항체를 DNA-스트랩아비딘 결합체에 첨가하여 제조될 수 있다.
상기한 방법에 따라 본 발명의 단일핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 결합된 항체는 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 항체-핵산 결합체를 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 컬럼으로 정제함으로써 항체-핵산 결합체를 수득할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 항체는 검출하고자 하는 단백질만을 특이적으로 인식함과 동시에 본 발명의 단일핵산이 혼성화될 수 있으므로 검출하고자 하는 단백질을 실시간으로 검출하는데 용이하게 사용될 수 있다.
b) 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 b) 단계는 검출 대상 단백질을 포함하는 시료와 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 결합시켜 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 단백질을 포함하는 생물학적 시료일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검 표본으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상, 또는 검출 대상 단백질을 포함하는 보관된 생물학적 시료일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 보관된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질과 항체의 결합은 검출 대상 단백질을 포함하는 시료와 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 혼합하여 이루어질 수 있다.
c) 단백질-항체-단일핵산 복합체를 형성시키는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계에서 형성된 단백질-항체 복합체에 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트를 혼성화시켜 단백질-항체-단일핵산 복합체를 형성시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산을 포함하는 키트는 본 발명의 단일핵산과 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소로 이루어진 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 단백질-항체 복합체와 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트의 혼성화는 단백질-항체 복합체에 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트를 혼합하여 이루어질 수 있다.
d) 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 절단된 단일핵산의 단편 양을 측정하여 단백질을 검출하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 절단된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 트라이애드 멀티모드 디렉터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, X 말단에 형광 공여체가 부착되고 Z 말단에 퀀쳐가 부착된 단일핵산(promer)이 검출하고자 하는 단백질과 복합체를 형성한 항체와 혼성화를 이루고 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 Y 및 Z 부위가 분리되기 전에는 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 의해 크게 감소된 상태를 유지한다. 그러나, Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 X 부위는 분리되지 않고 Y 및 Z 부위만이 항체로부터 분리되어 반응용액으로 분산되면 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 영향을 받지 않고 증가하게 된다. 이때 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광 방출의 증가를 상술한 기기를 이용하여 표적 단백질을 실시간으로 검출할 수 있다.
일 예로서 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 단백질을 검출하는 방법은 본 발명의 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산이 결합된 항체와 본 발명의 단일핵산을 사용함으로써 검출하고자 하는 단백질을 검출하는 속도와 정확도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다. 즉, 상기에 설명하였듯이 본 발명의 단일핵산(promer)은 짧은 증폭 구간과 높은 특이도로 인하여 단백질-항체 복합체에 결합된 단일핵산의 보다 빠른 검출과 정확도를 제공한다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 단일핵산(promer)을 이용한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 종래 검출방법에 비해 적은 올리고(oligo)를 사용하고, 실시간 확인을 위한 별도의 위치의 프로브(probe)가 필요치 않아 보다 적은 비용과 간단한 분석방법으로 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 실시간으로 검출하는 것이 가능하다.
또한, 단일핵산(promer)의 Y 부위를 절단한 후 증폭하는 단계를 통해 Y 부위의 돌연변이 확인이 가능하다.
단일핵산에 부착되는 형광물질의 개수보다 많은 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 다중검출하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 단일핵산(promer) 및 이를 이용한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질 실시간 검출방법은 KRAS, BRAF, EGFR 등에서 발생하는 다양한 점 돌연변이를 구분할 수 있어 다양한 질병의 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있으며, 점 돌연변이로 발생하는 항생제 내성균 등과 같은 각종 세균 및 바이러스 검출을 보다 용이하게 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 단일핵산(promer)에 의한 표적 핵산의 검출 과정을 예시화한 그림이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 2 및 7의 프라이머로 SW620 인간 세포주 및 PBMC(A peripheral blood mononuclear cell)의 CK-18 유전자의 발현 여부를 중합효소연쇄반응으로 확인한 그림이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 3 및 8의 프라이머로 SW620 인간 세포주 및 PBMC에서 CK-19 유전자의 발현 여부를 중합효소연쇄반응으로 확인한 그림이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 6 및 9의 프라이머로 SW620 인간 세포주 및 PBMC에서 GAPDH 유전자의 발현 여부를 중합효소연쇄반응으로 확인한 그림이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 1의 프로머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 SW620 인간 세포주 및 PBMC의 CK-18 유전자의 발현 여부를 중합효소연쇄반응으로 확인한 그림이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 3의 전방향 프라이머 및 서열번호 4의 프로머로 SW620 인간 세포주 및 PBMC의 CK-19 유전자의 발현 여부를 중합효소연쇄반응으로 확인한 그림이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 5의 프로머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 SW620 인간 세포주 및 PBMC의 GAPDH 유전자의 발현 여부를 중합효소연쇄반응으로 확인한 그림이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 11의 프로머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 10의 프로머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 KRAS 유전자의 G12V 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 10의 프로머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 14의 프로머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 OPN1MW 유전자의 T529C 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 14 및 15의 프로머와 서열번호 19의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 OPN1MW 유전자의 T529C 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 14 및 16의 프로머와 서열번호 19의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 OPN1MW 유전자의 T529C 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 14 및 17의 프로머와 서열번호 19의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 OPN1MW 유전자의 T529C 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 14 및 18의 프로머와 서열번호 19의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 OPN1MW 유전자의 T529C 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 20 및 21의 프로머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 KRAS 유전자의 G12D 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 서열번호 22 및 23의 프로머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 KRAS 유전자의 G12V 위치 돌연변이 여부를 확인한 그림이다.
도 18은 종래 기술에 따른 Catacleave probe를 이용하여 살모넬라 세트 33(Salmonella Set 33) 증폭 여부를 확인한 결과이다.
이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 본 발명에 따른 프로머를 이용한 실시간 핵산 분석
CK-18(cytokeratin-18), CK-19(cytokeratin-19), 및 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phophate dehydrogenase)의 유전자 발현 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 프로머(promer)와 프라이머(primer)를 하기 표 1에서와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다(표 1 참조). 여기서 프로머(promer)의 경우 5' 말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 3' 말단에는 3IABkFG를 부착하였으며, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 “r”로 표시하였다. 비교군으로서 SYBR method로 사용할 primer를 IDT에 의뢰하여 표 2와 같이 제조하였다.
Human CK18 F-Promer 5'-ATCTTGGTGATGCCTTrGrGAC-3' 서열번호 1
Human CK18 R primer 5’-CCTGCTTCTGCTGGCTTAAT-3’ 서열번호 2
Human CK19 F primer 5’-GTCACAGCTGAGCATGAAAG-3’ 서열번호 3
Human CK19 R-Promer 5'-TCACTATCAGCTCGCArCrATC-3' 서열번호 4
Human GAPDH F-Promer 5'-AAGGTGAAGGTCGGAGrUrCAA-3' 서열번호 5
Human GAPDH R primer 5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’ 서열번호 6
Human CK18 F primer 5’-ATCTTGGTGATGCCTTGGAC-3’ 서열번호 7
Human CK18 R primer 5’-CCTGCTTCTGCTGGCTTAAT-3’ 서열번호 2
Human CK19 F primer 5’-GTCACAGCTGAGCATGAAAG-3’ 서열번호 3
Human CK19 R primer 5’-TCACTATCAGCTCGCACATC-3’ 서열번호 8
Human GAPDH F primer 5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’ 서열번호 9
Human GAPDH R primer 5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’ 서열번호 6
상기 표 1 및 표 2에서 제조한 프로머 및 프라이머가 각각 10μM 농도의 1μl 존재하에, 인간 혈액에서 채취한 SW620 및 PBMC의 RNA를 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)을 통해 합성시킨 각각의 cDNA 10ng, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4μl를 넣고 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20μl로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 62 ~ 63℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며, SYBR 방법은 40 cycle, 본 발명에 따른 promer의 경우 45cycle을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 2 내지 도 7에 나타내었다.
그 결과, SYBR 방법을 이용하여 CK-18, CK-19 및 GAPDH의 발현 여부를 측정한 경우 GAPDH를 제외한 CK-18 및 CK-19의 경우 negative control에서 비특이적인 증폭곡선이 나타났고, positive control에서도 비특이적인 증폭이 발생하는 것을 확인할 수 있었다(도 2 내지 4 참조). 이에 반하여, 본 발명에 따른 프로머(promer)를 사용한 경우에는 GAPDH 뿐만 아니라 CK-18 및 CK-19의 경우에도 비특이적 증폭 반응과 같은 문제가 발생하지 않았다. 따라서 실시예 1를 통하여 본 발명의 프로머(promer)를 사용하는 방법은 종래 SYBR 방법에 비하여 비특이적 반응 없이 유전자 발현 및 분석에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 본 발명에 따른 프로머를 이용한 돌연변이 측정
본 발명에 따른 단일핵산 프로머를 이용하여 KRAS gene의 G12D 및 G12V 돌연변이(mutant) 여부를 측정하였다. 구체적으로, IDT에 의뢰하여 본 발명에 따른 프로머(promer)와 reverse primer를 하기 표 3에서와 같이 제조하였으며, 프로머(promer)의 경우 5' 말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 3' 말단에는 3IABkFG를 부착하였으며, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 “r”로 표시하였다.
G12D Forward-Promer 5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGrATG-3' 서열번호 10
G12V Forward-Promer 5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGrATG-3' 서열번호 11
Uni-reverse primer 5`-CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG-3' 서열번호 12
또한, 측정하고자 하는 KRAS gene을 SW620(BioSample: SAMN05292430) 및 LS174T cell-line (BioSample: SAMN03701686)에서 total DNA로 수득하였다. wild-type의 gene은 정상인의 혈액에서 동일한 방법으로 total DNA를 수득하였다. 여기서, SW620은 G12V mutant cell-line, LS174T는 G12D mutant cell-line으로 알려져 있다.
이후, 상기 제조한 서열번호 11의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 각각을 10μM 농도로 1μl씩 준비하고, 10m unit의 내열성 RNase H, 및 AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4μl, SW620에서 추출한 total DNA 40ng에 LS174T에서 추출한 Total DNA 4pg, 40pg 400pg, 및 4ng을 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20μl로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 수행하여 LS174T mutant로 알려진 G12D mutant를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 5분, 62 ~ 63℃에서 60초, 95℃에서 10초이다. 그에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
또한, 상기와 동일한 조건이지만 서열번호 10의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 존재하에, SW620에서 추출한 total DNA를 LS174T에서 추출한 total DNA에 첨가하는 것 대신에 LS174T에서 추출한 total DNA 40ng에 SW620에서 추출한 total DNA 4pg, 40pg 400pg, 4ng을 첨가하여 SW620 mutant로 알려진 G12V mutant를 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
또한, 상기와 동일한 조건이나 서열번호 10의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 존재하에, SW620에서 추출한 total DNA를 LS174T에서 추출한 total DNA에 첨가하는 것 대신에 정상인의 total DNA 40ng에 LS174T cell line에서 추출한 total DNA 40pg을 첨가하여 LS174T mutant로 알려진 G12D mutant를 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
이들 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 프로머를 사용할 경우 우수한 민감도 및 특이성으로 돌연변이 여부를 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
즉, 기존의 점 돌연변이를 측정하는 방법으로 널리 사용되고 있는 Endpoint Genotyping의 경우 real-time PCR 반응을 통해서는 돌연변이의 유무만 판별이 가능하며, 종류와 비율에 관하여는 melting curve를 확인하는 과정을 거쳐야 분석이 가능하였다. 그러나 본 발명에 의한 단일핵산(promer)을 사용하는 경우에는, 위에서 설명한 것 처럼, real-time PCR 반응만을 통하여 돌연변이의 종류와 비율도 분석이 가능한 것을 알 수 있었다. 또한 기존의 방법의 경우에는 최대 1~0.1% 정도의 돌연변이 확인이 가능하나 본 발명의 경우에는 0.01%의 돌연변이 분석이 가능하다.
실시예 3: 본 발명에 따른 프로머의 최적 크기 결정
X 염색체의 장완(Xq28)에 위치하는 OPN1MW 유전자(The medium-wave-sensitive opsin-1 gene)는 색약, 색맹과 관련된 유전자로서 뉴클레오티드 4개의 위치에서 돌연변이가 일어나며, 이로 인해 적록색약이 발생한 것으로 알려져 있다. 그 돌연변이 위치는 C282A, T529C, T607C, G989A이다.
이에 본 발명자는 본 발명에 따른 프로머(promer)의 길이에 따른 돌연변이 탐지 여부를 확인하기 위하여 OPN1MW T529C 돌연변이 유전자의 241 ~ 1030번째의 뉴클레오티드(서열번호 13의 DNA 서열 참조)가 삽입된 플라스미드를 제조한 후 10fM, 1fM, 100aM, 10aM 농도로 희석한 후 1μl씩 취한 후 하기 표 4와 같이 IDT에 의뢰하여 제조된 5종의 프로머와 reverse primer를 사용하여 탐지하였다. 여기서 제조된 5종의 프로머는 5' 말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 3' 말단에는 3IABkFG를 부착하였으며, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 “r”로 표시하였다. 이에 대한 결과로서 서열번호 14의 프로머로 사용한 경우의 결과(도 11 참조)와 서열번호 13의 프로머와 서열번호 15, 16, 17, 및 18의 각각의 프로머를 사용하여 비교한 결과(도 12 내지 15 참조)를 도 11 내지 15에 나타내었다.
529CA1 Promer 5'-TGGGCATTGCCTTCTCCrCGG-3' 서열번호 14
529CA2 Promer 5'-GCCTTCTCCrCGG-3' 서열번호 15
529CA3 Promer 5'-CAAGCTGGCCATCGTGGGCATTGCCTTCTCCrCGG-3' 서열번호 16
529CA4 Promer 5'-TGGGCATTGCCTTCTCCrCGGATCTGGGC-3' 서열번호 17
529CA5 Promer 5'-TGGGCATTGCCTTCTCCrCGGATCTGGGCTGCTGTG-3' 서열번호 18
Reverse primer 5'-GTACCTGCTCCAACCAAAGA-3' 서열번호 19
도 11 내지 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 프로머(promer)의 X-Y-Z 구조에서 X 부위의 염기가 9개로 구성된 경우에 Y 부위의 절단 후 X 부위도 주형으로부터 분리되어 프라이머로 작동하지 않고 단지 프로브로만 작동하였으며(도 12 참조), X 부위의 염기가 31개로 구성된 경우에 비특이적인 증폭 반응이 관찰되었다(도 13 참조). 또한, Z 부위의 염기가 2개 또는 10개인 경우에는 Y 부위의 절단 후 Z 부위만 주형으로부터 분리되고 X 분위는 분리되지 않은 채 증폭반응이 정상적으로 이루어졌으나(도 11 및 14 참조), Z 부위의 염기가 17개인 경우에 Y 부위의 절단 후 Z 부위가 주형으로부터 분리되지 않아 정상적인 증폭 반응이 발생하지 않았다(도 15 참조). 이와 같이, 본 발명에 따른 프로머는 X 및 Z 부위에서 특정 범위의 염기 개수로 구성될 경우 특이적 반응이 이루어질 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 2의 실험과 동일한 방법이나, 본 발명에 따른 프로머를 하기 표 5와 같이 Y 부위는 RNA가 1개 존재하도록 제조하고 Z부위는 DNA가 1개 또는 2개로 합성하여 KRAS 유전자의 돌연변이 여부를 확인하였다. 구체적으로, 서열번호 20의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 각 10μM 및 1μl, 또는 서열번호 21의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 각 10μM 및 1μl, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4μl, LS174T에서 추출한 Total DNA 120pg 및 1.2ng을 각각 첨가한 다음 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20μl로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 95℃에서 5분, 62 ~ 63℃에서 60초, 95℃에서 10초간의 조건으로 실행하고 LS174T mutant로 알려진 G12D mutant를 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 16에 나타내었다.
또한, 서열번호 22의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 각 10μM 1μl와 서열번호 23의 프로머 및 서열번호 12의 프라이머 각 10μM 및 1μl, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4μl, SW620에서 추출한 Total DNA 120pg 및 1.2ng을 각각 첨가한 다음 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20μl로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응을 95℃에서 5분, 62 ~ 63℃에서 60초, 95℃에서 10초간 실행하고 SW620 mutant로 알려진 G12V mutant를 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 17에 나타내었다.
G12D Forward-Promer rY Type 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGrAT-3' 서열번호 20
G12D Forward-Promer rYY Type 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGrATG-3' 서열번호 21
G12V Forward-Promer rY Type 5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGrUT-3' 서열번호 22
G12V Forward-Promer rYY Type 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGrUTG-3' 서열번호 23
Uni-reverse primer 5`-CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG-3' 서열번호 12
도 16 및 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 절단되는 Y 부위로부터 Z 부위의 간격이 최소 2bp를 유지하는 경우에 본 발명에 따른 프로머에 의한 증폭 반응이 원활하게 이루어짐을 알 수 있었다.
<110> Nuribio Co., Ltd. <120> Promer for Real-Time Detection of Nucleic Acid or Protein and Method of Detecting Nucleic Acid or Protein Using the Same <130> PA-17-0105 <150> KR 10-2016-0017359 <151> 2016-02-15 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CK18 Forward promer <220> <223> RNA is located in 17th and 18th of sequence. <400> 1 atcttggtga tgccttggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CK18 Reverse primer <400> 2 cctgcttctg ctggcttaat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CK19 forward primer <400> 3 gtcacagctg agcatgaaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CK19 Reverse promer <220> <223> RNA is located in 17th and 18th of sequence. <400> 4 tcactatcag ctcgcacatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH Forward promer <220> <223> RNA is located in 17th and 18th of sequence. <400> 5 aaggtgaagg tcggagucaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH Reverse primer <400> 6 aatgaagggg tcattgatgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CK18 Forward primer <400> 7 atcttggtga tgccttggac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CK19 Reverse primer <400> 8 tcactatcag ctcgcacatc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH Forward primer <400> 9 aaggtgaagg tcggagtcaa 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12D Forward promer <220> <223> RNA is located in 20th of sequence. <400> 10 cttgtggtag ttggagctga tg 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12V Forward promer <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 11 acttgtggta gttggagctg atg 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12D and G12V Uni-reverser primer <400> 12 catattcgtc cacaaaatga ttctg 25 <210> 13 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a nucleotid located in 241 to 1030 at OPN1MW T529C mutant gene <400> 13 ttcaagaagc tgcgccaccc gctgaactgg atcctggtga acctggcggt cgctgacctg 60 gcagagaccg tcatcgccag cactatcagc gttgtgaacc aggtctatgg ctacttcgtg 120 ctgggccacc ctatgtgtgt cctggagggc tacaccgtct ccctgtgtgg gatcacaggt 180 ctctggtctc tggccatcat ttcctgggag agatggatgg tggtctgcaa gccctttggc 240 aatgtgagat ttgatgccaa gctggccatc gtgggcattg ccttctcccg gatctgggct 300 gctgtgtgga cagccccgcc catctttggt tggagcaggt actggcccca cggcctgaag 360 acttcatgcg gcccagacgt gttcagcggc agctcgtacc ccggggtgca gtcttacatg 420 attgtcctca tggtcacctg ctgcatcacc ccactcagca tcatcgtgct ctgctacctc 480 caagtgtggc tggccatccg agcggtggca aagcagcaga aagagtctga atccacccag 540 aaggcagaga aggaagtgac gcgcatggtg gtggtgatgg tcctggcatt ctgcttctgc 600 tggggaccat acgccttctt cgcatgcttt gctgctgcca accctggcta ccccttccac 660 cctttgatgg ctgccctgcc ggccttcttt gccaaaagtg ccactatcta caaccccgtt 720 atctatgtct ttatgaaccg gcagtttcga aactgcatct tgcagctttt cgggaagaag 780 gttgacgatg gctctgaact ctccagcgcc 810 <210> 14 <211> 20 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 529CA1 Promer <220> <223> RNA is located in 18th of sequence. <400> 14 tgggcattgc cttctcccgg 20 <210> 15 <211> 12 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 529CA2 Promer <220> <223> RNA is located in 10th of sequence. <400> 15 gccttctccc gg 12 <210> 16 <211> 34 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 529CA3 Promer <220> <223> RNA is located in 32th of sequence. <400> 16 caagctggcc atcgtgggca ttgccttctc ccgg 34 <210> 17 <211> 28 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 529CA4 Promer <220> <223> RNA is located in 18th of sequence. <400> 17 tgggcattgc cttctcccgg atctgggc 28 <210> 18 <211> 35 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 529CA5 Promer <220> <223> RNA is located in 18th of sequence. <400> 18 tgggcattgc cttctcccgg atctgggctg ctgtg 35 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 529CA Reverse primer <400> 19 gtacctgctc caaccaaaga 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12D Forward Promer rY Type <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 20 acttgtggta gttggagctg at 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12D Forward Promer rYY Type <220> <223> RNA is located in 20th of sequence. <400> 21 cttgtggtag ttggagctga tg 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12V Forward Promer rY Type <220> <223> RNA is located in 22th of sequence. <400> 22 aacttgtggt agttggagct gut 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G12V Forward Promer rYY Type <220> <223> RNA is located in 21th of sequence. <400> 23 acttgtggta gttggagctg utg 23

Claims (17)

  1. 핵산 또는 단백질의 실시간 검출을 위해 프라이머 및 프로브로 사용되는 단일핵산(promer)으로 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있고, 실시간 검출을 목적으로 하는 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위에 결합하여 복합체를 형성하고, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 X 부위는 표적 핵산 또는 표적 단백질과 복합체를 유지하면서 프라이머로 작용하며, Y 및 Z는 상기 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위로부터 분리되는 것을 특징으로 하며, 상기 X, Y, 및 Z 중 어느 하나가 DNA일 때 다른 두 개 중의 하나 이상은 RNA인 것을 특징으로 하며,
    상기 X, Y, 및 Z는 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며,
    상기 X, Y, 및 Z 중 어느 하나가 DNA일 때 다른 두 개 중의 하나 이상은 RNA인 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 X는 1 내지 60개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA;
    상기 Y는 1 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA; 및
    상기 Z는 0 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며,
    상기 Z가 0일 때 Y는 3 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며,
    상기 Z가 1일 때 Y는 2 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA로 구성된 것을 특징으로 하는 단일 핵산 (promer).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 X, Y, 및 Z는 순서대로 DNA, RNA, 및 DNA, 또는 RNA, DNA, 및 RNA로 구성된 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍인 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단일핵산(promer)의 X, Y 및 Z는 비특이적인 절단을 막기 위해 전체적으로 메틸화되어 있거나 부분적으로 메틸화되도록 합성된 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단일핵산(promer)의 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이고, Y는 1 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이고, 상기 Z는 2 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 Y 부위가 DNA일 때 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소를 사용하며, X 부위가 RNA일 때 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2를 사용하는 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단일핵산(promer)은 ⅰ) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ⅱ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; ⅲ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; ⅳ) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 ⅴ) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용되는 것을 특징으로 하는 단일핵산(promer).
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 하나의 단일핵산(promer) 및 상기 단일핵산(promer)의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소로 이루어진 핵산 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 효소는 단일핵산(promer)의 X 부위가 DNA일 때 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소를 사용하며, X 부위가 RNA일 때 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 키트는 DNA의 증폭 반응에 필요한 시약을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  12. a) 시료로부터 RNA를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출한 RNA에 별도의 RT 프라이머, 또는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단일핵산(promer)을 혼합하여 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 합성한 cDNA에 ⅰ) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트로서 그 키트에 포함된 단일핵산이 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 키트와 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가지는 역방향 프라이머, ⅱ) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트로서 그 키트에 포함된 단일핵산이 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 역방향 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 키트와 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및, 또는 ⅲ) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트로서 그 키트에 포함된 단일핵산이 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 키트를 혼합하여 신장반응을 통해 cDNA를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계를 통해 분리된 단일핵산(promer)의 단편 양을 측정하는 단계;를 포함하는 RNA를 실시간으로 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 c) 단계는 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA와 결합한 단일핵산이 키트에 포함된 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단되어 Y 및 Z 부위가 분리되고 X 부위가 프라이머로 작동하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 RNA를 실시간으로 검출하는 방법.
  14. a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 추출한 DNA에 ⅰ) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트로서 그 키트에 포함된 단일핵산이 상기 a) 단계에서 추출된 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 키트와 상기 a) 단계에서 추출된 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가지는 역방향 프라이머, ⅱ) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트로서 그 키트에 포함된 단일핵산이 상기 a) 단계에서 추출 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 역방향 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 키트와 상기 a) 단계에서 합성된 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및, 또는 ⅲ) 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트로서 그 키트에 포함된 단일핵산이 상기 a) 단계에서 추출된 DNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브인 것을 특징으로 하는 키트를 혼합하여 신장반응을 통해 DNA를 증폭시키는 단계; 및 c) 상기 b) 단계를 통해 절단된 단일핵산(promer)의 단편 양을 측정하는 단계;를 포함하는 DNA를 실시간으로 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 b) 단계는 상기 a) 단계에서 추출된 DNA와 결합한 단일핵산이 키트에 포함된 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단되어 Y 및 Z 부위가 분리되고 X 부위가 프라이머로 작동하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 DNA를 실시간으로 검출하는 방법.
  16. a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단일핵산(promer)과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계; b) 검출 대상 단백질을 포함하고 있는 시료와 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 결합시켜 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계; c) 상기 b) 단계의 복합체에 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 키트를 혼성화시켜 단백질-항체-단일핵산 복합체를 형성시키는 단계; 및 d) 상기 c)단계를 통해 절단된 단일핵산(promer)의 단편 양을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 단백질을 실시간으로 검출하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 d) 단계는 상기 a) 단계에서 제조한 항체와 결합한 단일핵산이 키트에 포함된 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단되어 Y 및 Z 부위가 분리되고 X 부위가 프라이머로 작동하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 시료 내 단백질을 실시간으로 검출하는 방법.
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