KR20170085637A - 이미징 및 다중 광 치료용 광분해성 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

이미징 및 다중 광 치료용 광분해성 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사이페이트 또는 이의 유도체와 친수성 고분자를 포함하는 양친매성 복합체가 자기-조립하여 형성된 나노입자, 및 이의 광역동 치료, 광열 치료 및 암 이미징 용도를 제공한다. 본 발명의 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 붕괴될 수 있고, 빛을 흡수하여 형광을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 단일 근적외선 조사에 의하여 활성산소와 열을 함께 발생시킬 수 있다. 본 발명의 나노입자는 동일한 양의 사이페이트 보다 더 우수한 형광 특성, 활성산소 생성 특성 및 발열 특성을 나타낸다.

Description

이미징 및 다중 광 치료용 광분해성 나노입자 및 이의 용도{Photo-decomposable nanoparticles for combined imaging and multiple phototherapies and Uses thereof}
본 발명은 이미징 및 다중 광 치료용 광분해성 나노입자 및 이의 용도에 관한 것이다.
나노입자는 EPR(enhanced permeability and retention) 효과를 통하여 종양에 우선적으로 축적될 수 있고, 뒤이은 광 치료는 공간시간적 방식(spatiotemporal manner)으로 종양을 정확하게 파괴할 수 있기 때문에, 나노기술 기반의 광 치료(nanotechnology-assisted phototherapy)는 암 치료의 유망한 전략으로 여겨져 왔다1-6. 그러나, 광역동 치료(photodynamic therapy, PDT)나 광열 치료(photothermal therapy, PTT)와 같은 단일 광 치료 방식은 제한적인 인 비보 치료 효과를 나타내었다. PDT는 종양 조직 내 산소를 고갈시키고 종양과 관련된 혈관을 파괴함으로써, 종양으로의 혈류량 감소 및 그에 따른 심각한 로칼 저산소증을 초래하는데, 이는 뒤이은 방사선 치료와 화학요법에 대한 낮은 반응성(poor responses)에 기여한다7. 광 반응성 나노물질을 이용하여 근적외선을 열로 전환시키는 것을 이용하는 PTT는, 일반적으로 고르지 못한 열전달과 종양 파괴 때문에 불완전한 종양 파괴를 초래하며, 이는 남아있는 종양 덩어리 내의 살아있는 암세포에 의하여 개시된 종양 재발을 초래하였다6, 11-14. 단일 광 치료 방식의 한계점을 극복하기 위한 PDT와 PTT를 조합하려는 최근의 시도는 현저히 향상된 치료 성과를 이룩하였다15-22. PTT에 의한 로칼 고열(hyperthermia)은 종양 내 혈류량과 산소화(oxygenation)를 증가시켰고, 이는 PDT에 도움이 된다. 반대로, PDT에 의하여 생성된 활성산소종(ROS)은 PTT에 의한 고열에 대하여 암세포를 민감하게 만든다. 그러나, 알려진 광감작제(photosensitizer, PS)를 NIR-흡수성 나노입자에 로딩하거나 접합시켜 제조된 PDT/PTT 조합 치료를 위한 이전에 보고된 시스템은 여전히 몇몇 결점을 가지고 있었다. 첫째, PS와 NIR-흡수성 나노입자의 흡수 파장의 미스매치로 인하여 두 물질을 각각 여기시키기 위한 두 종류의 레이저가 필요한데15, 19-20, 23, 이는 치료 과정을 복잡하게 만든다. 둘째, PS-로딩 NIR 나노입자는 인접하여 위치하는 PS와 NP 사이의 FRET으로 인하여 일중항산소(1O2)의 현저히 감소된 생산을 보였고21, 24-25, 이는 PDT 효과의 감소를 초래하였다. 셋째, PTT에 사용되는 대부분의 NIR 나노입자는 비-생분해성 물질(예컨대, 카본, 금 및 다른 귀금속 기반의 나노물질)로 만들어져 체내에서 오랜 시간 동안 온전하게 남아 있어16-18, 25, 장기 독성(long-term toxicity)의 우려가 있다. 추가적으로, 이전에 개발된 PDT/PTT 조합 시스템의 제조 과정의 복잡성은 미래의 임상 적용을 방해하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Kotagiri, N.; Sudlow, G. P.; Akers, W. J.; Achilefu, S. Breaking the Depth Dependency of Phototherapy with Cerenkov Radiation and Low-Radiance-Responsive Nanophotosensitizers. Nat. Nano. 2015, 10, 370-379. Carter, K. A.; Shao, S.; Hoopes, M. I.; Luo, D.; Ahsan, B.; Grigoryants, V. M.; Song, W.; Huang, H.; Zhang, G.; Pandey, R. K.; et al. Porphyrin-Phospholipid Liposomes Permeabilized by Near-Infrared Light. Nat. Commun. 2014, 5, 3546. Song, J.; Yang, X.; Jacobson, O.; Huang, P.; Sun, X.; Lin, L.; Yan, X.; Niu, G.; Ma, Q.; Chen, X. Ultrasmall Gold Nanorod Vesicles with Enhanced Tumor Accumulation and Fast Excretion from the Body for Cancer Therapy. Adv. Mater. 2015, 27, 4910-4917. Huang, J.; Guo, M.; Ke, H.; Zong, C.; Ren, B.; Liu, G.; Shen, H.; Ma, Y.; Wang, X.; Zhang, H.; et al. Rational Design and Synthesis of γFe2O3@Au Magnetic Gold Nanoflowers for Efficient Cancer Theranostics. Adv. Mater. 2015, 27, 5049-5056. 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본 발명자들은 위와 같은 종래 기술의 문제점을 개선하고자, (1) 단일 레이저를 사용하여 효과적으로 암 치료 및 이미징을 할 수 있고, (2) 분해되고 배설될 수 있으며, (3) 쉽게 스케일 업 될 수 있는 PDT/PTT 조합 치료를 위한 새로운 나노입자를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 소수성의 사이페이트(cypate)에 친수성 블록을 도입시켜 수계에서 사이페이트 자기조립체를 형성시킴으로써 사이페이트 나노입자를 제조하였고, 이의 세포 안으로의 이입 능력, 근적외선 조사에 따른 광분해 및 활성산소와 열 발생 능력, 그리고 생체 내 암 이미징 능력을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 사이페이트 유도체가 자기-조립하여 형성된 나노입자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 광역동 치료, 광열 치료 또는 이들의 조합된 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 이미징용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 동시 진단 및 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 사이페이트 유도체가 자기-조립하여 형성된 나노입자를 제공한다:
화학식 1
Figure pat00001
상기 식에서, n은 0-5의 정수이고, A1 및 A2는 각각 독립적으로 생체적합성 친수성 고분자 또는 OH이며, A1과 A2 중 적어도 하나는 생체적합성 친수성 고분자임.
본 발명자들은 위와 같은 종래 기술의 문제점을 개선하고자, 단일 레이저를 사용하여 효과적으로 암 치료 및 이미징을 할 수 있고, 분해되고 배설될 수 있으며, 쉽게 스케일 업 될 수 있는 PDT/PTT 조합 치료를 위한 새로운 나노입자를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 소수성의 사이페이트에 친수성 블록을 도입시켜 수계에서 사이페이트 자기조립체를 형성시킴으로써 사이페이트 나노입자를 제조하였고, 이의 세포 안으로의 이입 능력, 근적외선 조사에 따른 광분해 및 활성산소와 열 발생 능력, 그리고 생체 내 암 이미징 능력을 확인하였다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 n은 1-5의 정수이다. A1 및 A2가 모두 OH이고, n이 2이면, 화학식 1의 화합물은 사이페이트이다. 하나의 특정예에서, 상기 화학식 1의 n은 2-5의 정수, 2-4의 정수 또는 2-3의 정수이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 적어도 하나의 생체적합성 친수성 고분자가 결합되어 있는 상기 화학식 1의 사이페이트 유도체가 자기-조립하여 형성된 입자로서, 수계에서 자기-조립하여 형성된 나노입자일 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 1 nm 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 하나의 특정예에서, 상기 나노입자는 10 nm 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 이러한 작은 크기는 본 발명의 나노입자가 EPR 효과를 통하여 암 조직에서 우선적으로 축적되는데 기여한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 근적외선(700 nm-1500 nm 파장) 조사에 의하여 붕괴(분해)된다. 본 발명의 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 나노입자를 구성하던 단량체 물질인 화학식 1의 화합물로 각각 붕괴(분해)되며, 이렇게 생성된 단량체 화합물은 나노입자와 마찬가지로 독성을 나타내지 않으며, 나노입자 보다도 작은 크기를 가지고 있어 체외로의 배출이 용이하다. 따라서, 이러한 본 발명의 붕괴 특성은 본 발명의 나노입자를 임상에서 안전하게 이용하는데 기여한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 활성산소를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 열을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 동일한 파장대의 근적외선 조사에 의하여 활성산소와 열을 함께 발생시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노입자를 사용하면, 활성산소를 발생시켜 치료 효과를 얻는 광역동 치료(PDT)와 열을 발생시켜 치료 효과를 얻는 광열 치료(PTT)의 조합된(combined) 치료 효과를 얻을 수 있으며, 종래의 PDT/PTT 조합 치료에 이용된 나노입자와 달리 단일의 근적외선 조사에 의하여 활성산소와 열을 함께 발생시킬 수 있어, 보다 경제적이며 간편한 방식으로 PDT/PTT 조합 치료의 효과를 얻을 수 있는 장점을 갖는다.
하나의 특정예에서, 본 발명의 나노입자가 발생시키는 활성산소는 일중항산소이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 근적외선을 흡수하여 형광을 나타낸다. 본 발명의 나노입자는 체내 투여 시 암조직에서 우선적으로 축적될 수 있고, 빛을 흡수하여 형광을 나타낼 수 있는바, 본 발명의 나노입자를 체내에 투여한 후 근적외선을 조사함으로써 생체 내 암의 이미징 및 진단이 가능하다.
상기 화학식 1의 화합물은 적어도 하나의 생체적합성 친수성 고분자를 포함한다. 본 발명에서 사용 가능한 친수성 고분자로는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(아크릴산)(poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염) (poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌(polystryene), 폴리옥사이드(polyoxide), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch), 폴리다당류(polysaccharide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitro propylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌옥사이드(Poly ethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide -b-propylene oxide]) 및 폴리라이신(Polylysine) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 고분자의 또 다른 예로는, 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴, 아카시아 검, 덱스트란, 피브린, 펙틴, 아가(agar), 갈락토만난(Galactomannan), 잔탄(Xanthan) 및 알지네이트 등이 있다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 고분자의 또 다른 예로는, 2-100개(예컨대 2-50개)의 아미노산으로 이루어진 친수성 펩티드 등이 있다. 상기 아미노산에는 천연형 아미노산뿐만 아니라, 비천연 아미노산도 포함된다. 친수성 아미노산에는 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 아르기닌, 세린 등이 있으며, 소수성 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 발린, 알라닌 등이 있다. 비코드화된 친수성 아미노산은, 예를 들어, Cit 및 hCys 등이 있다. 당업자는 이러한 정보와 펩티드 합성기술을 바탕으로 친수성의 펩티드를 용이하게 합성하여 본 발명의 나노입자 제조에 사용할 수 있다.
상기 친수성 고분자의 범위에는 위에서 언급한 고분자뿐만 아니라, 이들의 유도체도 포함된다.
하나의 특정예에서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체이다. 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는, 예를 들면, 메톡시 PEG(methoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEGaldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester) 및 PEG 숙시니미딜에스테르(PEG succinimidyl ester) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화학식 1에서, 생체적합성 친수성 고분자는 -CO-와 아마이드 결합을 통하여 결합된다. 이를 위하여, 상기 생체적합성 친수성 고분자는 측쇄 또는 말단에 아민기를 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 광역동 치료, 광열 치료 또는 이들의 조합된 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 나노입자를 유효성분으로 이용하기 때문에, 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 활성산소와 열을 발생시키는 바, 광역동 치료 및/또는 광열 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 광역동 치료와 광열 치료의 조합된 치료를 위한 약제학적 조성물이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암, 건선, 여드름 또는 사마귀 치료를 위한 약제학적 조성물이다. 본 발명이 적용 가능한 암은, 예를 들면, 흑색종, 피부암, 대장암, 췌장암, 담도암, 신경내분비종양, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 위암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에는 약제학적 유효량의 나노입자가 포함된다. 상기 용어, "약제학적 유효량"은 본 발명의 나노입자가 상기 질환의 치료에 적용되어 치료적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 가능하며, 예컨대 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 될 수 있다. 또한, 그밖에도 경구 투여, 직장 투여, 흡입 투여, 경비 투여 등이 가능하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 포함하는 암 이미징용 조성물을 제공한다.
본 발명의 암 이미징용 조성물은 상술한 본 발명의 나노입자를 유효성분으로 이용하기 때문에, 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 나노입자는 체내 투여 시 암조직에 우선적으로 축적될 수 있기 때문에, 암 조직 및 세포를 이미징하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 나노입자를 포함하는 암의 동시 진단 및 치료용 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 체내 투여 시 EPR 효과로 인하여 암 조직에 우선적으로 축적될 수 있으며, 근적외선을 흡수하여 형광을 나타낼뿐만 아니라, 암세포의 사멸을 유도하는 활성산소와 열을 함께 발생시키는 바, 암의 동시 진단 및 치료에 적용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 사이페이트 또는 이의 유도체와 친수성 고분자를 포함하는 양친매성 복합체가 자기-조립하여 형성된 나노입자, 및 이의 광역동 치료, 광열 치료 및 암 이미징 용도를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 붕괴될 수 있고, 빛을 흡수하여 형광을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 단일 근적외선 조사에 의하여 활성산소와 열을 함께 발생시킬 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 나노입자는 동일한 양의 사이페이트 보다 더 우수한 형광 특성, 활성산소 생성 특성 및 발열 특성을 나타낸다.
도 1은 암 진단 및 치료용 SP3NP의 특성을 보여준다. (A) SP3NP의 NIR 형광 이미징과 레이저에 의하여 유발된 나노입자의 분해, 및 상승적 광역동 및 광열 항암 효과에 관한 도식적 설명. (B) PBS(pH 7.4)에 담긴 SP3NP의 유체역학적 크기를 보여주는 DLS 데이터. (C) NIR 조사(808 nm, 0.8 W cm-2) 후 시간 경과에 따른 TEM 이미지. 스케일 바: 100 nm. (D) 사이페이트 및 PBS에 담긴 SP3NP 계열희석물의 형광 이미지(Ex/Em: 710-760 nm/810-875 nm). (E) 808-nm 레이저 조사(0.8 W cm-2, 5분) 후 PBS, 유리(free) 사이페이트 및 SP3NP의 아지드 나트륨(100 μM)의 존재 혹은 부존재 하에서의 525 nm(Ex: 488 nm)에서의 SOSG(singlet oxygen sensor green) 형광 강도(FI). *다른 그룹과 비교하여 p < 0.05. (F) 5분간의 808-nm 레이저 조사 시 여러 농도의 SP3NP의 광열 가열곡선.
도 2는 SP3NP의 인 비트로 세포 내 이입, NIR-유도 ROS와 열 생성, 및 세포독성을 보여준다. 유리 사이페이트 또는 SP3NP가 1시간 동안 처리된 B16F10 흑색종 세포의 CLSM 이미지(A) 및 유세포 분석(B). 사이페이트- 또는 SP3NP-처리된 세포에 808-nm 레이저(8 W cm-2, 3분)가 조사되었다. 세포 내 ROS 생성(C)을 H2DCFDA(10 μM)로 검출하였다. 빛 조사 후 세포의 열화상(D)을 IR 열화상 카메라를 사용하여 기록하였다. (E) 상이한 농도의 SP3NP를 1시간 동안 처리하고 808-nm 레이저를 조사한 다음(0.2, 0.4 또는 0.8 W cm-2, 3분), 추가적으로 24시간 동안 인큐베이션 한 B16F10 세포의 상대적 생존력.
도 3은 SP3NP의 종양 마우스에서의 인 비보 생체분포를 보여준다. (A) 1 mg/kg의 사이페이트 투여량으로 유리 사이페이트 또는 SP3NP를 투여 받은 B16F10 흑색종 마우스의 투여 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 및 24시간 후의 전신 NIR 형광 이미지. (B) Living Image Software Version 2.6을 이용한 종양 부위 내 형광 강도의 반정량 분석. (C) 유리 사이페이트 또는 SP3NP의 정맥 투여 4시간 후에 절제되어 동결 절편화된 종양 조직의 CLSM 이미지. 스케일 바: 50 μm.
도 4는 SP3NP의 NIR 레이저 유도 항종양 효과를 보여준다. (A) PBS, 유리 사이페이트 또는 SP3NP(5 mg/kg 사이페이트) 투여 4시간째 10분 동안 808-nm 레이저(0.4 W cm-2)에 노출된 B16F10 흑색종 마우스의 실시간 열화상 이미지. 원은 종양 부위를 가리킨다. (B) 808-nm 레이저의 10분간 조사 후의 종양의 광열 가열곡선. 808-nm 레이조 조사(0.4 W cm-2, 10분) 혹은 조사 없이, PBS, 유리 사이페이트 또는 SP3NP(5 mg/kg 사이페이트, 단회 투여, n= 6-7)가 정맥 투여된 B16F10 흑색종 마우스의 종양 성장곡선(C), 체중 변화(D) 및 생존율(E). *각 시점에서의 다른 그룹과 비교하여 p < 0.05. 빛 조사 12시간 후 각 마우스 그룹으로부터 얻은 종양 조직의 H&E(E) 및 TUNEL(F) 염색. 스케일 바: 25 μm.
도 5는 1H NMR(A) 및 MALDI-TOF/MS(B)에 의한 페길화 사이페이트의 특징 분석결과를 보여준다.
도 6은 SP3NP의 콜로이드 안정성(A) 및 NIR 레이저 조사에 따른 UV-vis 스펙트럼 변화를 보여준다.
도 7은 NIR 레이저 조사 후 SP3NP에 의하여 생성된 세포 내 ROS에 대한 다양한 ROS 스캐빈저의 영향을 보여준다. (A) 세포 내에서 생성된 ROS의 ROS 스캐빈저에 의한 소거(Scavenging). (B) ROS 스캐빈저의 세포보효 효과.
도 8은 SP3NP의 NIR-절단된 단편들의 세포독성 평가에 관한 것이다. (A) 분해된 단편들의 세포독성을 테스트하기 위하여 사용한 NIR 레이저에 의하여 분해된 SP3NP에 관한 도식적 설명. (B) SP3NP의 NIR-분해된 단편들의 세포독성. 결과를 4번의 독립적 실험의 평균 ± s.e.m으로 표기하였다.
도 9는 각 처치와 NIR 레이저 처리된 종양 마우스의 디지털 이미지를 보여준다. 원은 종양 부위를 가리킨다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 실험재료 및 실험방법
페길화 사이페이트(PEGylated cypate) 합성
사이페이트를 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG2000-NH2)과 아마이드 결합을 통하여 접합시켜(conjugating) 페길화 사이페이트를 제조하였다. 간략히 설명하면, N,N′-dicyclohexylcarbodiimide(DCC; 90 μmol) 및 N-hydroxysuccinimide(NHS; 90 μmol)를 디클로로메탄(10 ml)에 담긴 사이페이트(60 μmol)에 첨가하였다. 30분간 저어준 후, 불용성 부산물을 여과로 제거하였다. 활성화된 사이페이트에 mPEG2000-NH2(20 μmol)를 첨가하고, 혼합물을 상온에서 24시간 동안 반응하게 두었다. 조생성물(crude product)을 클로로포름/메탄올(75:25, v/v)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 얻어진 페길화 사이페이트를 Bruker AVANCE-500MHz FT-NMR spectrometer(Bruker, Billerica, MA, USA)를 사용하여 1H NMR 특징을 분석하였다. 페길화 사이페이트의 분자량을 Autoflex III MALD-TOF 시스템(Bruker)을 사용하여 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight spectrometry)로 측정하였다.
SP 3 NP의 제조 및 특징 분석
메탄올에 담겨있는 페길화 사이페이트(1 mg)를 건조시키고, 생성된 얇은 막을 1 ml의 PBS(pH 7.4)로 수화시키고 볼텍싱 하였다. 10분 동안의 초음파 분해 후, 큰 응집물을 0.2-μm 폴리카보네이트 막 필터(Millipore Corp., Billerica, MA, USA)를 통한 여과로 제거하여, SP3NP를 얻고 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. SP3NP의 크기와 형상을 JEM1010 시스템(Jeol Ltd, Tokyo, Japan)을 이용하여 TEM으로 확인하였다. SP3NP의 유체역학 직경(hydrodynamic diameter)과 제타 전위를 Nanosizer ZS90 instrument(Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)를 사용하여 측정하였다. SP3NP의 콜로이드 안정성을 4주 이상 동안 크기 변화를 모니터링 하여 테스트하였다. SP3NP의 UV-Vis 스펙트럼을 UV-Vis 분광광도계(NEOSYS2000; Scinco, Twin Lakes, WI, USA)를 사용하여 기록하였다.
NIR 조사에 의하여 유발된 SP 3 NP의 붕괴(disruption)
PBS에 담긴 SP3NP(100 μg ml-1)에 BWF2 continuous-wave NIR 레이저(808 nm, 0.8 W cm-2; B&W Tek Inc., Newark, DE, USA)를 사용하여 20분간 빛을 조사하였다. 빛 조사 동안의 SP3NP의 흡수 스펙트럼과 형상 변화를 UV-Vis 분광광도계 및 TEM(transmission electron microscope)을 사용하여 각각 기록하였다. NIR 조사 동안의 SP3NP의 외형을 디지털 카메라로 기록하였다.
NIR 형광, 및 SP 3 NP의 광역동 특성과 광열 특성
PBS에 담긴 동일 농도의 유리(free) 사이페이트와 SP3NP의 형광 이미지를 Xenogen IVIS Lumina 이미징 시스템(Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 기록하였다. 아지드 나트륨(100 μM)의 존재와 부존재 하에서 유리 사이페이트와 SP3NP(25 μg ml-1)에 5분간 빛을 조사(808 nm, 0.8 W cm-2)하여 광역동 효과를 테스트하고, 발생된 일중항 산소(singlet oxygen)를 SOSG(singlet oxygen sensor green; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 검출하였다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 여러 농도의 SP3NP에 808-nm NIR 레이저(0.8 W cm-2, 5분)를 조사하여 광열 효과를 평가하였다. IR 열 이미징 시스템(FLIR T420; FLIR Systems Inc., Danderyd, Sweden)을 사용하여 온도를 정량하였다. 음성 대조군으로서 PBS의 광열 가열곡선(photothermal heating curve)을 측정하였다.
인 비트로 세포 내 흡수 테스트
SP3NP의 세포 내 흡수를 사이페이트의 고유의 형광을 이용하여 공초점 현미경과 유세포 분석기로 확인하였다. B16F10 쥐 흑색종 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)를 10% 소태아혈청, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Gibco-BRL Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. B16F10 세포를 1 x 105 세포/웰의 밀도로 24웰 플레이트의 커버 글라스에 분주하였다. 70% 컨플루언시에 도달 후, 세포에 유리 사이페이트 또는 SP3NP를 사이페이트의 처리량이 동일하게 처리하였다. 1시간 동안의 인큐베이션 후 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드로 15분간 고정시킨 다음 DAPI(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 염색하였다. 세포 형광을 공초점 레이저 현미경(LSM 5 Exciter; Carl Zeiss, Inc., Jena, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 유세포 측정은 첫 번째 수득한 세포(harvesting cells)를 2% 소태아혈청이 함유된 차가운 PBS로 세 번 세척하여 실시하였다. 이후, 세포를 Cell Quest Pro 소프트웨어를 사용하는 BD FACSCalibur 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.
빛 조사에 따른 열 발생 및 세포 내 ROS
B16F10 세포를 1 x 105 세포/웰의 밀도로 24웰 플레이트에 분주하였다. 다음날, 세포에 5 μg ml-1의 농도로 유리 사이페이트 또는 SP3NP(사이페이트의 양이 같게)를 1시간 동안 처리하였다. 차가운 PBS로 세척한 후, 세포에 3분간 NIR 레이저(808 nm, 0.8 W cm-2)를 조사하고, ROS 검출 염료인 H2DCFDA(10 μM; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)가 담긴 신선한 배지에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 형광 현미경(Leica, DM IL, Germany)을 사용하여 DCF(녹색)를 관찰하였다. 글루타치온, 아지드 나트륨(일중항 산소 스캐빈저), D-만니톨(하이드록실 라디칼 스캐빈저) 또는 피루베이트 나트륨(sodium pyruvate, 과산화수소 스캐빈저)을 포함하는 여러 ROS 스캐빈저를 NIR 조사 동안 배지에 첨가하여 발생한 ROS의 유형을 확인하였다. 이후의 절차는 위에서 설명한 바와 같다. B16F10 세포에 유리 사이페이트 또는 SP3NP(20 μg ml-1, 사이페이트의 양이 같게)를 1시간 동안 처리하여 세포 내 열 발생을 평가하였다. 차가운 PBS로 세척한 후 세포에 NIR을 3분간 조사하고(808 nm, 0.8 W cm-2), IR 열 카메라를 사용하여 위에서 설명한 바와 같이 열 이미지를 기록하였다.
레이저에 의하여 유발된 SP 3 NP의 종양 세포에 대한 광독성
NIR 조사에 따른 SP3NP의 인 비트로 항종양 효과를 MTT 분석법으로 테스트하였다. 간략히 설명하면, B16F10 세포를 96웰 플레이트에 1 x 104 세포/웰의 밀도로 분주하였다. 다음날, 세포에 SP3NP의 계열희석물을 1시간 동안 처리하였다. 차가운 PBS로 세척한 후 세포에 808-nm NIR 레이저를 3분간 조사하였다. 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, 세포 생존율을 MTT 분석으로 정량하였다. 세포에 SP3NP(100 μg ml-1)를 1시간 동안 처리하고, MTT 분석 전 추가적으로 ROS 스캐빈저(피루베이트 나트륨, 글루타치온, 아지드 나트륨 또는 D-만니톨, 100 μM)가 함유된 배지로 30분간 인큐베이션 하여 여러 ROS 스캐빈저의 세포보호 효과를 테스트하였다. NIR 레이저로 SP3NP를 완전히 분해시킨 다음 B16F10 세포에 얻어진 무색 생성물을 24시간 동안 처리하여, SP3NP의 NIR-절단된 단편의 세포독성을 테스트하였다. 세포 생존율을 MTT 분석법으로 정량하고, 비처리 대조군 그룹의 결과에 비례하여 표현하였다.
SP 3 NP의 인 비보 종양 검출 능력
인 비보 실험은 6주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Orient Bio. Lab. Animal Inc., Seungnam, Kyonggi-do, South Korea)를 사용하여 수행하였다. 털이 뽑힌 C57BL/6의 등 오른쪽 부위에 1 x 106 B16F10 세포를 피하 접종하고, 종양이 자라게 하였다. 종양 부피가 약 100 mm3에 도달 시, 사이페이트의 양을 동일하게(1 mg/kg) 유리 사이페이트 또는 SP3NP를 꼬리 정맥으로 주사하였다. 투여 후 미리 정해진 시간에 마우스 내 형광성 유리 사이페이트 및 SP3NP의 인 비보 분포를 Xenogen IVIS Lumina 이미징 시스템(Perkin Elmer Inc.)을 사용하여 확인하였다. 다른 실험에서, 종양을 절제한 후 동결 절편화(cryosection)한 다음 공초점 현미경을 이용하여 유리 사이페이트 또는 SP3NP의 종양 내 분포를 위에서 설명한 바와 같이 확인하였다.
NIR 조사에 따른 SP 3 NP의 인 비보 종양 제거(tumor ablation)
B16F10 종양을 갖는 마우스를 체중과 종양 부피에 기초하여 임의적으로 6개의 그룹으로 분류하였다(n = 6-7 마우스/그룹): (1) PBS, (2) PBS + NIR 조사, (3) 유리 사이페이트, (4) 유리 사이페이트 + NIR 조사, (5) SP3NP, (6) SP3NP + NIR 조사. 마우스에 사이페이트의 투여량(5 mg/kg)이 같도록 유리 사이페이트 또는 SP3NP를 정맥으로 주사하였다. 투여 4시간 후 마우스를 마취시켰다. 종양 부위에 808-nm 지속파 NIR 레이저(0.4 W cm-2, 10분)를 조사하였다. 종양 부위의 빛에 의하여 유도된 온도 변화를 실시간 IR 열 이미징 시스템(FLIR T420)을 사용하여 기록하였다. 치료 후 종양 부피, 체중, 종양 외형 및 생존율을 모니터링 하였다. 종양 부피는 전자 자를 이용하여 2곳의 치수를 측정하고, 식 "a x b2 x 0.5(a는 가장 큰 치수이고, b는 가장 작은 치수)"에 따라 계산하여 측정하였다. 다른 실험에서, 조사 12시간 후 종양 조직을 추출하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정한 다음 파라핀에 포매 후 10 μm 크기로 절편을 제조하였다. 종양 조직 슬라이드를 H&E로 염색하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 조직 절편 내의 사멸된 세포를 TUNEL 분석법(Bio Vision)으로 확인하였다.
통계 분석
ANOVA(Analysis of variance) 및 사후 쌍별 비교(post hoc pairwise comparison)를 위한 Student-Newman-Keuls 테스트를 실험 데이터를 분석하는데 사용하였다. 모든 통계 분석은 SigmaStat 소프트웨어(version 3.5; Systat Software, Richmond, CA, USA)를 사용하여 실시하였고, p < 0.05를 유의성이 있는 값으로 간주하였다.
2. 실험결과
본 발명자들은 PDT(photodynamic therapy)/PTT(photothermal therapy)의 조합 치료에 이용할 수 있는 사이페이트 기반의 나노입자를 개발하고자 하였다. 사이페이트 기반 나노구조를 형성시키기 위하여, 본 발명자들은 친수성의 생체적합성 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사이페이트에 도입시켜 페길화 사이페이트를 제조하였다. 본 발명자들은 양친매성인 페길화 사이페이트가 자발적으로 작은 나노입자(SP3NP로 명명)로 자기-조립되고, 광분해성, 광역동 특성 및 광열 특성을 나타낼 것으로 예상하였다(도 1의 A).
사이페이트의 두 카르복실산 중 하나의 카르복실산의 카르보디이미드-활성화 형태(carbodiimide-activated form)를 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(mPEG2000-NH2)과 반응시키는 원 스텝 과정으로 페길화 사이페이트를 합성하고, 1H NMR 및 질량분석기로 특징을 분석하였다(도 5). 수용액에 놓은 경우 도 1의 A에 나타난 바와 같이, 페길화 사이페이트는 소수성의 사이페이트가 나노입자의 코어를 형성하였고, 친수성의 PEG는 물에 노출되어 있는 마이셀 형태의 나노입자(SP3NP)로 자가 조립되었다. DLS(Dynamic light scattering) 측정으로, SP3NP가 60 ± 8 nm의 평균 유체역학 직경을 가지며, 좁은 크기 분포를 보임을 확인하였다(도 1의 B). HRTEM(High-resolution in situ transmission electron microscopy) 이미징은 건조 상태에서 SP3NP가 ~40 nm 직경의 윤곽이 분명한 원형의 나노구조체임을 보여주었다(도 1의 C). 또한, SP3NP는 PBS에서 4주 이상 동안에도 크기의 유의적 변화가 없어 좋은 콜로이드 안정성을 보여주었다(도 6의 A). pH 7.4의 PBS에 담긴 SP3NP의 제타 전위는 0.06 ± 0.22 mV였고, 이러한 결과는 상기 나노입자가 거의 중성 전하를 띠고 있음을 보여준다. 또한, PBS에 담긴 SP3NP는 NIR 영역에서 강력한 흡수를 보였다(도 6의 B). 도 1의 D는 유리 사이페이트 및 SP3NP의 NIR 형광 이미지가 710-760 nm에서 여기(excitation)하였음을 보여준다. SP3NP는 유리 사이페이트 보다 훨씬 강력한 형광 강도를 보였다. 반면, SP3NP는 생리학적 조건 하에서는 자연 그대로(pristine)의 사이페이트의 강력한 형광을 보유하고 유지하고 있었으며, 이는 SP3NP를 NIR 이미징 프로브로 사용하는데 적합함을 보여준다.
SP3NP가 빛에 의하여 분해될 수 있는지 조사하였다. 도 1의 C에 나타난 바와 같이, 지속파 레이저(808 nm, 0.8 W cm-2)를 이용한 NIR 조사에 따라 SP3NP는 현저하며 비가역적인 형태 변화를 겪었으며, 이는 1분 조사 후에도 나타났고, 조사 10분 후에는 검출 가능한 나노입자가 남아있지 않았다. 이러한 NIR-유도된 광분해는 신속한 탈색(도 1의 C, 삽화)을 동반하였고, 조사 10분 후 790 nm에서 SP3NP의 특유의 흡수 피크 중 5.5%만 남아 있었다(도 7). 이 NIR-유도된 분해와 붕괴 특성은 SP3NP가 NIR 레이저를 이용한 치료 후 신체로부터 쉽게 배출될 수 있고, 이에 따라 독성문제를 완화시킬 수 있음을 보여준다. 또한, SP3NP는 약물을 탑재시켜 광 반응성 약물전달체로서 사용될 수 있다.
다음으로, SP3NP가 NIR 조사에 반응하여 광역동 효과를 위한 일중항 산소(1O2) 또는 광열 치료를 위한 열을 발생시키는지 조사하였다. 도 1의 E에 나타난 바와 같이, SOSG(singlet oxygen sensor green)의 형광 강도를 측정하여, 808-nm의 레이저 조사에 의하여 1O2가 생성되었음을 확인하였다. SP3NP는 유리 사이페이트와 비교하여 훨씬 강력한(~3.8배) SOSG 형광 강도를 나타내었다. 이 형광 강도는 대표적인 1O2가 스캐빈저인 NaN3의 존재 하에서 현저히 감소되었으며, 이는 SP3NP가 NIR 레이저 조사에 반응하여 1O2를 생산할 수 있음을 뒷받침한다. 다음으로, SP3NP가 NIR 조사에 반응하여 열도 발생시킬 수 있는지 조사하였다. 808 nm의 레이저 조사 동안 샘플 용액의 온도를 기록하였다(도 1의 F). 본 발명자들은 SP3NP의 농도 증가에 따라 온도가 빠르게 상승하여 조사 2분 내에 안정기에 도달하였고, 100 및 200 μg ml-1의 SP3NP가 각각 17.4℃ 및 25.3℃만큼의 온도를 증가시켰음을 확인하였다. PBS 대조군은 이러한 광열 효과를 보이지 않았다. 이러한 결과는, SP3NP가 좋은 광열 특성 역시 가지고 있음을 보여준다. 흥미롭게도, SP3NP의 온도는 이들의 피크에 도달한 후 점진적으로 감소하였는데, 이는 SP3NP가 NIR-유도된 광퇴색과 광분해를 격고 있음을 보여준다(도 7). 종합적으로, 이러한 NIR-유도된 열 및 1O2의 동시적이고 효율적인 발생은, SP3NP의 효과적인 암 치료를 위한 조합된 PDT 및 PTT에서의 유망한 이용을 시사한다.
다음으로, SP3NP-처리된 암세포에서의 NIR 레이저(0.8 W cm-2, 3분) 노출에 따른 세포 내 ROS 생성 수준을 ROS-검출 형광 프로브인 H2DCFDA를 사용하여 측정하였다. 예상된 바와 같이, SP3NP-처리된 암세포는 H2DCFDA의 활성화 결과로서 강력한 형광을 나타내었으며, 이는 높은 수준의 세포 내 ROS 생성을 의미한다(도 2의 C). NIR을 조사하지 않은 경우에는 SP3NP-처리된 암세포에서 ROS가 생성되지 않았다(도 8). 또한, 글루타치온 또는 아지드 나트륨(1O2 스캐빈저)을 함께 처리한 경우 세포 내 형광 강도가 백그라운드 수준까지 감소된 반면, D-만니톨(하이드록실 스캐빈저)을 처리한 경우에는 형광 강도에 영향이 없었고, 이를 통하여 1O2가 SP3NP의 빛 조사에 의하여 생성된 주요 세포 내 ROS임을 재차 확인하였다. 이러한 ROS 생성의 증가는 SP3NP-처리된 세포의 온도를 ~4℃ 상승시켰다.
SP3NP는 NIR에 노출됨에 따라 1O2 및 열을 세포 안에서 생성할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 이의 암세포 사멸 효과를 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 확인하였다. 도 2의 E에 나타난 바와 같이, SP3NP의 세포독성은 SP3NP의 농도 및 사용한 레이저 세기와 양의 상관관계를 나타내었다. 예상된 바와 같이, 보다 높은 광파워가 조사된 보다 높은 농도의 나노입자가 가장 우수한 항암 효과를 나타내었다. 그러나, SP3NP는 NIR 조사가 없는 경우에는 세포독성을 나타내지 않았다. 하이드록실 라디칼 스캐빈저(피루베이트 나트륨 또는 D-만니톨)의 첨가는 세포 생존율에 영향을 미치지 않은 반면, 1O2 스캐빈저(글루타치온 또는 아지드 나트륨)의 공동 처리는 SP3NP-유도 세포독성을 유의성 있게 감소시켰다(도 9). 또한, NIR 조사에 따라 생성된 절단되고 분해된 SP3NP의 산물들은 세포독성을 나타내지 않았는데, 이는 NIR 광-유도 항암 효과를 나타낸 후에는 SP3NP가 더 낮은 독성을 나타내는 단편으로 분해됨을 암시한다. 이상과 같은 인 비트로 세포 실험은 SP3NP가 NIR 조사 후 암세포에 효율적으로 이입될 수 있고, 1O2의 세포 내 생성 및 고열(hyperthermia)의 조합된 효과를 통하여 암세포를 죽일 수 있음을 보여준다.
SP3NP는 이의 상대적으로 작은 크기(~60 nm)와 높은 페길화 표면으로 인한 EPR 효과를 통하여 종양 부위에 우선적으로 위치할 수 있을 것으로 기대되었다. 이를 테스트하기 위하여, 유리 사이페이트 또는 SP3NP(0.25 mg/kg, 동량의 사이페이트)를 B16F10 흑색종 동종이식편을 갖는 마우스에 꼬리 정맥을 통하여 투여하였다. 도 3의 A는 다양한 시간에서의 실시간 생체분포와 종양 축적을 보여준다. 유리 사이페이트가 투여된 마우스의 종양 부위에서는 오직 약한 형광만이 확인되었다. 반면, SP3NP는 유리 사이페이트와 비교하여 24시간 이상의 연장된 체내 순환/머무름(circulation/retention)뿐만 아니라, 종양 부위에서 훨씬 강한 형광신호를 나타내었다. 4시간 후, 종양 대 배경(tumor-to-background) 강도의 차이가 명확해져서 종양 부위의 경계가 뚜렷해졌다. 종양 부위 내 광량의 시간경과에 따른 측정은, 주사 1시간 후 SP3NP-처리된 마우스에서의 종양의 형광 강도가 유리 사이페이트가 처리된 마우스에 비하여 ~18배 강력하였음을 보여주었다(도 3의 B). 주사 4시간 후 종양 조직을 절제하고 동결 절편화하였다. CLSM 이미징은 SP3NP가 유리 사이페이트보다 매우 높은 강도로 종양 조직 내에 균일하게 분포되어 있음을 보여주었다(도 3의 C). NIR-조사된 SP3NP에서 관찰된 높은 수준의 종양 축적과 분포는 암의 이미징을 이용하는(imaging-guided) 효과적인 광 치료에 매우 유리하다.
다음으로, NIR 레이저 조사에 따른 SP3NP의 치료 효과를 종양 마우스에서 조사하였다. NIR 노출에 따른 종양 부위의 온도를 계속적으로 모니터링 하였다(도 4의 A). PBS가 처리된 마우스는 빛 조사 동안에 온도 증가를 나타내지 않았으나, SP3NP 주사 그룹의 마우스는 45℃까지 현저한 온도 증가를 나타내었고, 이는 유리 사이페이트가 주사된 마우스(~38℃)에서 보다 훨씬 높은 온도이다(도 4의 B). 단일 정맥주사와 뒤이은 NIR 조사 후의 치료 효능을 종양 부피, 체중 및 생존율(도 4의 C)을 측정하여 평가하였다. PBS 단독 또는 PBS + NIR 그룹에서는 종양 성장의 억제가 확인되지 않았고, 두 그룹의 종양 부피는 유사하였다. SP3NP 및 유리 사이페이트 단독 그룹에서의 종양 성장은 PBS 대조군과 유사하였으며, 이는 NIR 조사가 없는 상황에서의 치료는 세포독성을 나타내지 않음을 보여준다. 반면, SP3NP + NIR 그룹에서의 종양은 완전히 제거(ablated)되었다(도 4의 A). 나아가, 계속적인 모니터링은 SP3NP + NIR 그룹에서 42일 후까지도 종양이 재발하지 않아 100%의 생존율을 초래하였음을 보여주었다(도 4의 E). 또한, SP3NP + NIR 그룹의 마우스는 유의성 있는 체중 감소의 징후를 보이지 않았으며, 이는 나노입자 그 자체 또는 광 치료의 급성 부작용이 없음을 보여준다(도 4의 D). 비록 유리 사이페이트 + NIR 처리 마우스는 종양 성장을 억제하였지만, 이 그룹의 모든 마우스는 36일 안에 종양으로 인하여 사망하였다.
항종양 효과를 H&E 염색 및 TUNEL 분석으로 재차 평가하였다. 도 4의 F 및 G에 나타난 바와 같이, PBS + NIR, 유리 사이페이트 및 SP3NP 단독 그룹은 높은 다형성(pleomorphic) 핵을 갖는 암세포의 침윤을 보였고, PBS 대조군과 유사하게 아폽토시스에 대한 증거를 보이지 않았다. SP3NP + NIR 처리된 마우스의 종양 조직 절편은 세포 핵의 큰 파괴와 상당한 아폽토시스를 보였으며, 이는 PDT와 PTT의 조합 치료의 강력함을 보여준다. 본 연구에서 사용한 광파워 강도(0.4 W cm-2)는 보고된 인 비보 PTT용 광파워(~1-2 W cm-2) 중 가장 낮은 수준이다. 이러한 결과는, SP3NP가 표면의 높은 페길화 특성과 적절한 크기로 인하여 종양 부위로 우선적으로 이동할 수 있고, 광학 이미징을 이용한 NIR 레이저 조사(optical imaging-guided NIR laser irradiation) 후 PTT와 PDT 조합의 상승적 항종양 효능의 결과로써 종양을 효과적으로 제거하고, 종양의 재발없이 마우스의 생존을 연장시킬 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1의 사이페이트(cypate) 유도체가 자기-조립(self-assembled)하여 형성된 나노입자:
    화학식 1
    Figure pat00002

    상기 식에서, n은 1-10의 정수이고, A1 및 A2는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 OH이며, A1과 A2 중 적어도 하나는 친수성 고분자임.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 수계에서 자기-조립하여 형성된 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 1 nm 내지 500 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 붕괴되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 활성산소를 발생시키는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 근적외선 조사에 의하여 열을 발생시키는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 동일한 파장대의 근적외선 조사에 의하여 활성산소와 열을 함께 발생시키는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 근적외선을 흡수하여 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리(아크릴산)(poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌(polystryene), 폴리옥사이드(polyoxide), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch), 폴리다당류(polysaccharide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropro pylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌옥사이드(Polyethylene oxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-b-propylene oxide]) 및 폴리라이신(Polylysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 나노입자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 광역동 치료(photodynamic therapy), 광열 치료(photothermal therapy) 또는 이들의 조합된 치료를 위한 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 암, 건선, 여드름 또는 사마귀 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 광역동 치료와 광열 치료의 조합된 치료를 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는 암 이미징용 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 동시 진단 및 치료용 조성물.
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