KR20170085278A - Ｔｌ 및 Ｔ２ 이중 기능의 자기공명영상 조영제 - Google Patents

Ｔｌ 및 Ｔ２ 이중 기능의 자기공명영상 조영제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T1 및 T2 이중 기능의 자기공명영상 조영 효과를 보이는 초상자성-상자성 코어-쉘 혼성나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 혼성 나노입자는 세포 내 환경에서 쉽게 분해되는 산화망간 쉘을 가지며, 쉘의 분해를 통해 T1 및 T2 강조 영상 효과가 극대화 되는 특징을 통해 영상 표적 특이적 조영효과 증강이 가능한 MR 조영제로 활용 가능하다.

Description

Ｔｌ 및 Ｔ２ 이중 기능의 자기공명영상 조영제{Ｔｌ-Ｔ２ dual-mode magnetic resonance imaging contrast agent}
본 발명은 T1 및 T2 이중 기능의 자기공명영상 조영제에 관한 것이다.
다양한 분자영상기술(molecular imaging techniques) 중에서 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI)은 조직 주변을 둘러싸고 있는 분자들과 수소이온(proton) 간의 상호작용(interaction)에 기반하여 매우 우수한 해부학적 영상을 제공해 줄 수 있기 때문에 가장 강력하고 비-침습적인(non-invasive) 진단 수단(diagnostic tool) 중의 하나로 여겨지고 있다.
MRI 조영제는 생체 내 주입(injection) 후 강력한 외부 자기장과 고주파 에너지에 의해 발생하는 T1/T2 완화시간(relaxation time)의 변화에서 오는 차이를 감지하여 정상 조직과 비정상 조직의 대조도를 증강시킴으로써 국소부위의 해부학적 혹은 기능적 영역에 대한 영상화를 가능케 하는 물질로, 일반적으로 MRI 조영제는 상자성(paramagnetic) 조영제와 초상자성(superparamagnetic) 조영제로 구분되며, 핵자기공명(nuclear magnetic resonance)의 스핀 이완(spin relaxation) 과정에 따라 T1 MRI 조영제와 T2 MRI 조영제로 나눌 수 있다(비특허문헌 1).
T1 MRI 조영제로 사용되는 상자성의 금속 이온들(paramagnetic metal ions)은 T1 이완(relaxation)을 가속화시키고 T1-강조 영상(T1-weighted image)에서 “밝은(bright)” 명암대비(contrast)를 형성시킨다. 반면에 T2 MRI 조영제로 사용되는 초상자성 철 산화물들(superparamagnetic iron oxides; SPIOs)은 T2 이완의 속도를 증가시켜 “어두운(dark)" 명암대비를 형성시킨다.
T1 및 T2 이중 기능(dual-mode)의 MRI 조영제는 한 가지 기능의 MRI 조영제에 비하여 질환에 관련하여 보다 정확하고 자세한 정보를 제공할 수 있다. T1 및 T2 이중 기능의 MRI 조영제는 T1-강조 영상의 높은 조직 분해능(tissue resolution)과 T2-강조 영상의 높은 병소(lesion) 검출 능력으로 인하여 보다 진단 정확성을 높여 줄 수 있어 최근 크게 관심을 받고 있다(비특허문헌 2). 그러나 아직까지는 임상적 사용에 적합한 성능을 가진 T1 및 T2 이중 기능의 MRI 조영제가 개발되어 있지 못한 실정이다.
앞서 개발된 T1/T2 이중 조영제들은 초소형 초상자성 철 산화물 나노입자(ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticle, < 3nm)과 같이 그 자체로 T1/T2 대조효과를 갖는 입자를 사용하거나(비특허문헌 3), 초상자성 물질과 가돌리늄 혹은 망간의 이온 또는 금속산화물 형태의 상자성 물질을 단순 조합했다(비특허문헌 4). 하지만 이들은 MR 이완도(relaxivity)가 낮거나, 서로 다른 물질이 하나의 입자로 조합되었을 때 서로의 효과를 방해하는 등(magnetic coupling effect; T1 및 T2 조영제가 서로 인접해 있을 때, 초상자성 T2 조영제의 강한 국소 자기장으로 인해 T1 조영제의 T1 이완도가 감소)의 단점이 존재했다. 이 방해효과를 줄이기 위해 T2 조영제와 T1 조영제를 적정 거리 이상 떨어뜨려 결합하는 방법들이 연구되었는데 두 물질 사이에 실리카나 폴리머 같은 반자성 물질의 껍질을 만들어 두거나(비특허문헌 5) 두 물질을 덤벨 형태로 만드는 방법(비특허문헌 6) 등이 보고되었다. 하지만 이 경우 복잡한 합성 과정 및 T1 조영제와 T2 조영제 사이의 거리 조절층 등이 불가피하여 높은 효율의 조영제를 개발하는데 문제가 발생한다. 또한, 대부분의 조영제들은 영상의 표적이 되는 세포 혹은 세포환경 마커들과 상호작용에 관계없이 항상 조영 효과를 보이는 시스템("always ON")이기 때문에 표적 대 배경신호 비율(target to background signal ratio)이 낮을 수 있다.
Journal of Nuclear Cardiology 11(6): 733-743, 2004 Nat. Mater. 5: 971, 2006 Nano Letters, 2009, vol. 9, No. 12, 4434-4440 Biomaterials, 2011, vol. 32, 4584-4593 J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 11015-11017 ACS Nano, 8(10), 9884-9896
이에, 본 발명자들은 종래 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, T2 조영제 입자 코어를 둘러싼 T1 조영제 쉘(shell) 표면이 양친매성 고분자로 개질된 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은
T2 조영제 입자 코어(core) 및
상기 코어를 둘러싼 T1 조영제 쉘(shell)을 포함하고,
상기 쉘 표면이 양친매성 고분자로 개질된
자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은
T2 조영제 입자를 제조하는 단계;
상기 T2 조영제 입자를 T1 조영제로 코팅하여 T1 조영제가 코팅된 T2 조영제 입자를 제조하는 단계; 및
상기 T1 조영제로 코팅된 T2 조영제 입자 표면을 양친매성 고분자로 개질하는 단계;
를 포함하는 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자는 열 분해법(thermal decomposition)에 기반한 시드성장법(seed-mediated growth method)을 활용해 합성되어 초상자성-상자성 코어-쉘 구조를 가지며, 상자성의 산화망간 껍질(쉘)이 환원환경에서 쉽게 분해되는 성질을 활용하였다. 특히, 초상자성물질의 T2 조영 효과가 상자성 껍질에 의해 감소(주변 물 분자와의 상호작용 방해)되었다가 껍질의 분해를 통해 다시 증강됨과 동시에 상자성 껍질의 이온화를 통한 T1 조영 효과 증강이 동시에 이루어져 T1 강조 영상과 T2 강조 영상 조영제의 역할을 동시에 수행 가능함으로써 하나의 기기(MRI)를 통한 다중 영상을 기존 기술에 비해 현저히 증가한 효과로 재현이 가능하다. 또한, 세포 내에 풍부하게 존재하는 글루타치온(glutathione) 등에 의한 환원적 환경에 감응해 조영 효과가 크게 증가(활성)할 수 있기 때문에 타겟 세포에 전달되어야 조영 효과가 최대화 되므로, 결국 배경신호를 줄이고 보고자하는 타겟의 효율적인 영상화가 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1에서 제조된 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 구조 및 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 환원환경에서 상자성의 산화망간 껍질(쉘)이 2가 망간이온(Mn2+)으로 환원됨으로써 벗겨지고 T1 및 T2 이완도(r1 & r2)가 증가하는 것을 나타낸 것이다.
도 3은 산화철 나노입자(SPION)와 산화망간 코팅된 산화철(IO@MO) 나노입자의 특성을 나타낸 것이다[a) 산화철 나노입자(SPION) TEM 사진 b) 산화망간 코팅된 산화철(IO@MO) 나노입자 TEM 사진, c) SPION 자기이력곡선, d) IO@MO 나노입자 자기이력곡선, e) XRD (초록: SPION, 파랑: IO@MO)].
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1에서 제조된 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 수력학적 크기(hydrodynamic diameter)를 측정한 DLS(dynamic light scattering) 결과를 나타낸 크기 분포표이다.
도 5는 상기 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 TEM 사진 및 XPS 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다[a) GSH 용액과 반응 전(왼쪽)과 후(오른쪽)의 혼성나노입자 TEM 사진, b) GSH 용액과 반응 전(검정 선), 후(빨간 선)의 혼성나노입자의 XPS 스펙트럼].
도 6은 UV-vis 흡광 그래프 및 용액 사진을 나타낸 것이다[a) T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 UV-vis 흡광 그래프, b) polysorbate 80 코팅된 SPION 입자의 UV-vis 흡광 그래프]
도 7은 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 GSH 처리 전후 MR 영상 대조 효과를 나타낸 것이다[a) T1과 b) T2-강조 영상을 GSH 처리(GSH (+))와 미처리(GSH (-)), c) T1과 d) T2 대조 효과를 relaxation ratio (R) vs 이온농도(mM)의 그래프로 나타냄].
도 8은 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자를 MKN-45 위암세포에 농도별(0~14 μgmetal/mL)로 처리했을 때 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자를 MKN-45 세포에 처리했을 때의 MR 영상효과를 확인한 것이다[a) 혼성나노입자를 MKN-45 세포에 처리한 농도[0(cell only), 1, 2, 5 μg/mL]에 따른 T1과 T2-강조 영상, b) GSH 억제제[N-ethylmaleimide (NEM)]를 MKN-45 세포에 먼저 처리한 후 혼성나노입자(5 μg/mL)를 처리했을 때 T1과 T2-강조 영상, c) a의 영상에서 얻어진 RANS의 세포 처리에 따른 MR 대조도 증가율(흰색 막대: T1 이완, 검은색 막대: T2 이완), d) b의 영상에서 얻어진 relaxation ratio (R1과 R2)를 NEM의 처리 정도에 따라 비교한 그래프].
본 발명은 T2 조영제 입자 코어(core) 및
상기 코어를 둘러싼 T1 조영제 쉘(shell)을 포함하고,
상기 쉘 표면이 양친매성 고분자로 개질된
자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 T2 조영제 입자는 초상자성 금속 나노입자이며, 상기 초상자성 금속 나노입자는 철 산화물, 코발트 산화물, 니켈 산화물, 및 전이금속이 도핑된 철 산화물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. T2 조영제 입자의 평균 크기는 4 내지 30 nm가 바람직하며, 4 nm 미만인 경우 자기모멘트가 낮고 상자성에 가까워지는 문제가 있고, 30 nm 을 초과하는 경우 페리자성(ferrimagnetism)을 띄어 콜로이드 안정성(colloidal stability)이 떨지는 문제가 생길 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 T1 조영제는 산화망간이며, 상기 산화망간은 MnO2, Mn3O4 또는 이의 혼합물일 수 있다. 특히, 산화망간은 환원적 환경(reducing environment)에서 쉽게 분해되어 망간이온이 생성되는 메커니즘을 가지므로, 산화망간 쉘의 분해를 통해 T2 조영제(초상자성 코어)와 T1 조영제(분해되어 나온 망간이온들)가 동시에 세포 내 환원적 환경에서 자기공명영상 효과가 증강되는 조영제 개발이 가능하다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 코어-쉘 입자의 수상 안정성과 생체에 활용도를 높이기 위해 사용되는 양친매성 고분자는 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리아미노산(polyamino acid) 등의 생체고분자(biopolymer), 또는 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리[(락틱)-co-(글리콜산)](poly(lactic-co-glycolic) acid), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)](poly(L-lactide-co-D-lactide)), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에스테르(polyester)등과 같은 화학적 합성폴리머(synthetic polymer), 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 공중합체 또는 이들에 지방산 그룹이 결합된 합성물일 수 있다. 일례로 실시예에 사용된 양친매성 고분자로는 폴리소르베이트 80이며, 폴리소르베이트 80은 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 분자로, sorbitan의 3개의 -OH에 폴리에틸렌글리콜이 각각 붙어 있고 1개의 -OH는 oleic acid와 결합된 형태의 분자로서, 폴리에틸렌글리콜에 지방산 그룹이 결합된 합성물의 한 예이다.
본 발명에 따른 혼성나노입자는 초상자성 코어와 상자성 산화망간 쉘(껍질)을 갖는 형태로, 보통 환경에서는 산화망간 쉘 껍질이 초상자성 코어의 자성을 방해할 뿐만 아니라 물 분자와의 상호작용을 가로막아 T2 MR 이완도를 줄인다. 또한, 쉘이 망간 산화물 형태로 존재하여 망간 이온 형태일 때보다 물 분자와 상호 작용할 수 있는 활성점이 훨씬 적고, 초상자성 코어의 국소자기장으로 인해 방해 효과(magnetic coupling effect)를 받기 때문에 낮은 T1 대조효과를 가진다. 세포 내부에는 외부와 달리 글루타치온을 비롯한 환원성 물질이 다량 존재하여 환원적 환경을 조성하고 있는데 본 발명의 입자는 세포내부 환원환경에 감응하여 산화망간이 이온화함으로써 T1 대조 효과가 증강될 뿐만 아니라 입자내부의 초상자성 코어가 물 분자에 노출됨으로써 T2 대조효과 또한 증강하는 활성형 조영제로서의 모습을 보인다. 따라서 체내 주입 후 표적 세포에 도달하였을 때 그 효과가 극대화되어 영상화하였을 때 불필요한 부분에서의 신호를 줄이고 표적부위의 대조도를 높이는 고효율 조영제의 가능성을 지니고 있다.
즉, 본 발명은 초상자성 금속 나노입자 표면에 산화망간을 성장/코팅시켜 환원환경(reducing environment) 감응성 및 활성형 MR 신호 증가 능력을 부여하고 양친매성 고분자를 코팅함으로써 수상 안정성과 생체에 활용도를 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 혼성나노입자는 평균 입자 크기가 6 내지 40 nm인 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따른 혼성나노입자는 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영제로 활용 가능하다.
본 발명은 또한, T2 조영제 입자 코어(core) 및 상기 코어를 둘러싼 T1 조영제 쉘(shell)을 포함하고, 상기 쉘 표면이 양친매성 고분자로 개질된 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 일 구현예로,
T2 조영제 입자를 제조하는 단계;
상기 T2 조영제 입자를 T1 조영제로 코팅하여 T1 조영제가 코팅된 T2 조영제 입자를 제조하는 단계; 및
상기 T1 조영제로 코팅된 T2 조영제 입자 표면을 양친매성 고분자로 개질하는 단계;
를 포함하는 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 제조방법을 포함한다.
먼저, 열 분해법(thermal decomposition method)을 활용해 유기상에서 4 내지 30 nm의 평균 크기를 가지는 T2 조영제 입자를 합성한다. 열분해 과정에서 사용될 수 있는 유기용매의 종류는 특별히 제한되지 않으나 열분해 반응이 일어나는 온도보다 높은 끓는점을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로 알칸(alkanes), 알켄(alkene), 알킨(alkynes), 사이클로알칸(cycloalkanes) 또는 알카디엔(alkadiens)과 같은 탄화수소계 화합물; 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether), 옥틸 에테르(octyl ether), 데실 에테르(decyl ether) 등의 에테르계 화합물(ether compounds); 피리딘(pyridine), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 등의 헤테로고리 화합물(heterocyclic compounds); 톨루엔(toluene), 자일렌(xylene), 메시틸렌(mesitylene), 벤젠(benzene) 등의 방향족 화합물(aromatic compounds); 트리옥틸아민(trioctylamine), 올레일아민(oleylamine) 등 아민류(amine compound) 등이 포함된다.
이를 시드로 하여 표면에 Mn3O4을 열 분해법으로 150 내지 320도의 온도 조건 하에 성장시켰다. 유기상에 분산된 나노입자를 양친매성 고분자로 코팅하여 친수성 성질을 부여한다.
상기 T2 조영제 입자, T1 조영제 입자 및 양친매성 고분자는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 혼성나노입자 제조방법은 적절한 조건 하에 열 분해법에 기반한 시드성장법(seed-mediated growth method)을 통해 혼성나노입자 합성이 가능하고 단순한 구조(초상자성 나노입자 코어-산화망간 껍질-친수성 유기물 층)를 통해 세포환경 감응/활성형 이중 조영제의 역할을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 재료 및 방법, 디자인이 단순하며 직관적이어서 다양한 형태로 응용이 가능하며 표면 친수성 유기물의 역할 및 능력에 따라 표적형 기능성 조영제로 발전시킬 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 친수성 T2-T1 코어-쉘 혼성나노입자의 제조
1. 초상자성 산화철 나노입자( superparamagnetic iron oxide nanoparticle , SPION)의 제조
열 분해법(thermal decomposition method)을 통해 약 10 nm의 크기를 갖는 SPION을 합성하였다.
Iron (III) acetylacetonate (2 mmol), 1,2-hexadecanediol (10 mmol), oleic acid (6 mmol) 및 oleylamne (6 mmol)을 benzyl ether (20 mL)에 넣고 질소환경에서 200도에 2시간 가열하였다. 이후 300도에서 1시간 반응 후에 상온으로 식히고 과량의 에탄올에 섞어 10000 rpm 에 10분간 원심분리하는 방법으로 세척하였다. 최종 산물은 헥산에 보관하여 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticle, SPION)를 제조하였다. 비슷하게 반복하여 입자의 크기를 성장[시드성장법(seed-mediated growth)]시킬 수 있다[Macromol. Biosci. 2014, 14, 943-952].
2. 산화망간( Mn 3 O 4 ) 코팅된 산화철 나노입자(IO@MO)의 제조
20 mg의 SPION을 110 mg의 manganese (II) acetylacetonate이 녹아있는 oleylamine(18.7 mL) 용액에 넣고 100도에서 1시간 동안 교반하며 진공 상태로 둔 뒤, 180도로 가열하여 질소환경에서 9시간 동안 반응하였다. 상온으로 식힌 용액을 상기 1의 방법과 마찬가지로 에탄올로 세척하고 헥산에 보관하여 산화망간 코팅된 산화철 나노입자(IO@MO)를 제조하였다.
3. IO@MO의 표면 개질 -혼성나노입자 제조
상기 2에서 합성된 입자는 oleic acid, oleylamine과 같은 소수성 리간드로 코팅되어 있으므로 친수성 개질이 필요하다.
10 mg의 IO@MO를 2 mL 헥산에 분산하고 100 mg polysorbate 80이 녹아있는 수용액 20 mL에 1200 rpm 교반하면서 20분간 초음파 처리(450 W)하여 나노에멀젼을 만들었다. 하룻 밤 동안 헥산을 증발시킨 용액을 원심분리 필터를 통해 과량의 고분자를 제거하여 친수성 표면개질된 코어-쉘 혼성나노입자 용액을 완성하였다(도 1). 상기 결과물은 용액 상 혹은 동결건조시킨 파우더 형태로 보관 가능하다.
실험예 1: SPION , IO@MO, 친수성 T2-T1 코어-쉘 혼성나노입자의 구조 및 물성 측정
투과 전자 현미경(TEM: transmission electron microscopy) 촬영 결과, 합성된 SPION은 구형으로 약 10 nm의 지름크기를 갖는 것을 확인하였고(도 3의 a)) 산화망간을 코팅한 후(IO@MO) 울룩불룩한 형태로 바뀌며 지름크기는 약 13 nm로 증가하는 것을 확인하였다(도 3의 b)). SPION의 초상자성 성질은 VSM(vibrating sample magnetometer)의 측정을 통해 확인하였고(도 3의 c)), 산화망간 코팅 후에도 SPION 코어의 강한 자성으로 인해 초상자성 성질이 유지됨을 확인하였다(도 3의 d)). SPION과 IO@MO 입자의 XRD(X-ray diffraction) 분석을 수행하였고 Fe3O4 및 Mn3O4의 결정피크를 확인하였다(도 3의 e)). IO@MO의 표면을 양친성 고분자인 polysorbate 80으로 개질하여 합성한 친수성 혼성나노입자의 수력학적 크기(hydrodynamic diameter)는 DLS (dynamic laser scattering) 측정을 통해 약 22 nm의 크기를 갖는 것으로 확인되었다(도 4). 상기의 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 환원환경 감응성은 글루타치온(glutathione: GSH) 용액에 상기 입자 용액을 섞기 전 후 물성 변화를 통해 확인되었다. GSH 용액과 반응 후 혼성나노입자의 산화망간 껍질이 망간이온으로 용해되어 구형의 SPION 형태로 돌아감을, TEM 이미지(도 5의 a))에서 혼성나노입자의 형태가 울룩불룩한 형태(왼쪽)에서 매끄러운 구형(오른쪽)으로 바뀌는 것 및 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 측정(도 5의 b))에서 혼성나노입자의 GSH 용액 반응 후 Fe의 피크는 증가하고 Mn의 피크는 감소함을 통해(산화망간 껍질이 용해되고 속의 산화철이 표면으로 드러남) 확인하였다. Polysorbate 80으로 개질된 SPION은 대조군으로 사용되었는데, polysorbate 80 개질된 IO@MO, 즉 혼성나노입자는 마찬가지로 용액 상에서 갈색을 띄며 비슷한 UV-vis 흡광 그래프를 보이는 것을 확인하였다(도 6). GSH 용액과 반응 후 갈색의 산화망간은 투명한 망간이온으로 분해되기 때문에 흡광 및 갈색 성질이 줄어들지만(도 6의 a)), SPION 입자는 변화가 없음을 확인했다(도 6의 b)).
실험예 2: T1 및 T2 강조 MR 이미지 촬영
T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자 용액을 농도별로 준비하고 GSH을 섞은 것과 그렇지 않은 것으로 비교하여 T1 및 T2 강조 MR 이미지를 촬영하였다(도 7의 a), b)). T1 강조 이미지는 Micro-47 surface core를 장착한 1.5 T 임상 스캐너(Intera, Philips Medical Systems, Best, The Netherlands)로 촬영되었다(resolution: 234x234 ㎛, section thickness:3.0 mm, TE = 18 ms, TR = 625 ms). T2 강조 이미지도 같은 스캐너로 촬영되었다(resolution: 234x234 ㎛, section thickness:2.0 mm, TE = 60 ms, TR = 4000 ms). 얻어진 이미지를 통해, 상기 혼성나노입자가 GSH 용액과 반응한 경우가 그렇지 않은 경우보다 더 강한 명대조(positive contrast, T1-강조 영상) 혹은 암대조(negative contrast, T2-강조 영상)를 보이는 것을 확인하였다.
영상으로부터 얻어진 T1 및 T2 값으로부터 T1-1(R1) 및 T2-1(R2) 대 시약 농도 그래프를 그려 추세선의 기울기를 통해 T1 및 T2 이완도(T1 relaxivity: r1, T2 relaxivity: r2)를 계산하였다(도 7의 c), d)). T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 r1 및 r2는 각각 2.38 mM-1s-1, 92.17 mM-1s-1로 측정되었고, GSH 용액과 반응 후에는 각각 16.11 mM-1s-1, 258.6 mM-1s-1로 크게 증가하는 것을 통해 환원환경에 감응해 활성화되는 스마트 조영제로서의 가능성을 보였다.
입자를 처리한 MKN-45 위암 세포의 MR 이미지는 상기의 입자 용액 영상화와 같은 방법을 사용하여 조건별로 약 2 x 107 개의 MKN-45 세포를 PCR 튜브에 모아 촬영하였다(도 9의 a)). 세포만 촬영한(cell only) MR 영상은 T1-강조 영상에서 어둡게, T2-강조 영상에서 밝게 나타났으나 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자 처리 농도가 높아질수록 T1-강조 영상 및 T2-강조 영상에서 각각 밝고 어둡게 나타나 대조도가 증가함을 보임으로써, 상기 입자가 생체에서도 T1 및 T2 이중 조영 효과를 나타냄을 확인하였다. 세포에 입자를 처리하지 않은 것과 처리한 것을 R1 및 R2의 변화를 수치화(R/RNontreatment)하여 비교함으로써, 생체에서도 T1 및 T2 이중 조영성이 확인됨을 검증하였다(도 9의 c)). GSH 생성 억제제로 알려져 있는 NEM(N-ethylmaleimide)를 세포에 먼저 처리한 후 상기 입자(5 μg/mL)를 처리하여 MR 조영 효과를 비교한 결과(도 9의 b) NEM을 처리할수록 T1 및 T2 강조 MR 조영 효과가 떨어지는 양상을 보였고 이는 GSH에 의한 세포 내 환원환경이 상기 조영제의 조영 효과에 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 도 9의 b)의 영상결과에서 얻은 R1 및 R2의 변화를 그래프로 나타내어 NEM에 의한 조영 효과 억제를 비교하였다(도 9의 d)).
실험예 3: T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 세포독성
T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자 용액을 농도별(0 ~ 14 μgmetal/mL)로 준비하고, 96 well plate의 well에 각각 1 x 104 개의 MKN-45 위암 세포를 배양하고 상기 용액을 각각 처리하여 하루간 배양한 후 세포의 생존율을 MTT assay를 통해 확인하였다(도 8). 처리한 혼성나노입자의 모든 농도조건에서 80% 이상의 높은 생존율을 보여 그 생체적합성이 확인되었다.

Claims (17)

  1. T2 조영제 입자 코어(core) 및
    상기 코어를 둘러싼 T1 조영제 쉘(shell)을 포함하고,
    상기 쉘 표면이 양친매성 고분자로 개질된
    자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 T2 조영제 입자는 초상자성 금속산화물 나노입자인 혼성나노입자.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 초상자성 금속산화물 나노입자는 철 산화물, 코발트 산화물, 니켈 산화물, 및 전이금속이 도핑된 철 산화물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 혼성나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 T1 조영제는 산화망간인 혼성나노입자.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 산화망간은 MnO2, Mn3O4 또는 이의 혼합물인 혼성나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 양친매성 고분자는 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리[(락틱)-co-(글리콜산)](poly(lactic-co-glycolic) acid), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)](poly(L-lactide-co-D-lactide)), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에스테르(polyester). 이들의 공중합체 및 이들에 지방산 그룹이 결합된 합성물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 혼성나노입자.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 T2 조영제 입자의 평균 크기는 4 내지 30 nm인 혼성나노입자.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 혼성나노입자의 평균 크기는 6 내지 40 nm인 혼성나노입자.
  9. 제 1 항의 혼성나노입자를 포함하는 MRI 조영제.
  10. T2 조영제 입자를 제조하는 단계;
    상기 T2 조영제 입자를 T1 조영제로 코팅하여 T1 조영제가 코팅된 T2 조영제 입자를 제조하는 단계; 및
    상기 T1 조영제로 코팅된 T2 조영제 입자 표면을 양친매성 고분자로 개질하는 단계;
    를 포함하는 자기공명영상 T1 및 T2 이중 조영성 혼성나노입자의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 T2 조영제 입자는 초상자성 나노입자인 혼성나노입자의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 초상자성 금속 나노입자는 철 산화물, 코발트 산화물, 니켈 산화물, 및 전이금속이 도핑된 철 산화물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 혼성나노입자의 제조방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 T1 조영제는 산화망간인 혼성나노입자의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 산화망간은 MnO2, Mn3O4 또는 이의 혼합물인 혼성나노입자의 제조방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 양친매성 고분자는 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리아미노산(polyamino acid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리[(락틱)-co-(글리콜산)](poly(lactic-co-glycolic) acid), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)](poly(L-lactide-co-D-lactide)), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에스테르(polyester), 이들의 공중합체 및 이들에 지방산 그룹이 결합된 합성물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 혼성나노입자의 제조방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 T2 조영제 입자는 열 분해법으로 제조하는 혼성나노입자의 제조방법.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 T1 조영제 입자는 열 분해법으로 제조하는 혼성나노입자의 제조방법.
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