KR20170083172A - 3'UTR engineering to improve soluble expression of foreign proteins in microbial cells - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법, 목적 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율 증가용 발현벡터 및 상기 발현벡터 도입되어 목적단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시킬 수 있는 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명의 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법을 통해 효소의 활성을 조절할 수 있고, 전세포 생물전환을 이용하여 다양한 화학물질의 생산성을 증가시킬 수 있을 것이다. The present invention relates to a method for increasing the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of a target protein, an expression vector for increasing the water-soluble expression ratio to the total expression level of the target protein, and an aqueous expression ratio relative to the total expression level of the target protein The present invention relates to a transformant which can increase the transfection efficiency.
The activity of the enzyme can be controlled by increasing the expression rate of the water-soluble protein of the present invention, and the productivity of various chemical substances can be increased by using whole cell biotransformation.
Description
본 발명은 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법, 목적 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율 증가용 발현벡터 및 상기 발현벡터를 도입되어, 목적 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시킬 수 있는 형질전환체에 관한 것이다. The present invention relates to a method for increasing the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of a target protein, an expression vector for increasing the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the target protein, and an expression vector, To a transformant capable of increasing the ratio.
합성 생물학 및 시스템 생물학은 전세포 생물 촉매 및 미생물 발효를 통해 다양한 화학물질의 개발을 가능케 한다. 작은 물질 뿐만 아니라 크고 복잡한 대사물질(예를 들어, 폴리페놀, 카로테노이드, 테르페노이드, 식물 옥시리핀스) 또한, 시스템 대사 공학의 도움으로 합성될 수 있다. Synthetic biology and system biology enable the development of a variety of chemicals through whole-cell biocatalysts and microbial fermentation. Large and complex metabolites (eg, polyphenols, carotenoids, terpenoids, plant oxylipins) as well as small substances can also be synthesized with the help of system metabolic engineering.
그러나, 상기 화학물질은 미생물 촉매에서 효소의 낮은 발현 수준 등 많은 요소들에 의해 생산성이 그리 높지 않은 상황이다. 무엇보다도, 산소첨가효소(P450 모노산소첨가효소 및 Bayer-Villiger monooxygneases(BVMO))는 재생가능한 바이오메스 뿐만 아니라 탄화수소의 산화관능화, 지방산에서 크고 복잡한 대사물질을 제조하는 데에 있어 핵심 효소 중 하나이지만, 박테리아 세포에서 상기 효소들이 기능적 형태(즉, 수용성 형태)의 과발현은 어렵다. However, the chemical is not very productive due to many factors such as low expression level of the enzyme in the microbial catalyst. Above all, oxygenated enzymes (P450 monooxygenases (BVMO) and Bayer-Villiger monooxygneases (BVMO) are one of the key enzymes for the functionalization of oxidized hydrocarbons as well as renewable biomass, and the production of large and complex metabolites in fatty acids , But overexpression of functional forms (i. E., Water soluble forms) of these enzymes in bacterial cells is difficult.
박테리아 세포에서 산소첨가효소와 같은 이종 단백질의 기능적 발현은 다양한 방법에 의해 개선될 수 있다. 유전자 발현에 대한 유도조건(예를 들어, 배양 온도(Chalmers 등, 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56, 104-111), 유도물질의 농도 뿐만 아니라, 프로모터, 리보좀 결합 자리, 5'-비해석 부위(5'- UTR), 및 코돈 사용을 포함하는 유전자 발현 시스템 또한, 효소 및 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위해, 널리 연구가 이루어지고 있다. 이외에도, 분자적 샤페론을 도입하거나, 수용성 펩티드 및 단백질과 융합된 단백질 발현 및 기타 다른 단백질 엔지니어링(예를 들어, 유도진화)은 종종 박테리아 세포에서 외부 단백질 및 효소의 기능적 발현을 가능케 한다(Ario de Marco 등, 2007, BMC Biotechnology, 7:32). Functional expression of heterologous proteins such as oxygenated enzymes in bacterial cells can be improved by a variety of methods. (Chalmers et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56, 104-111), as well as the concentration of the inducer, as well as the promoter, ribosome binding site, 5'- (5'-UTR), and codon usage, have also been extensively studied in order to enhance the aqueous expression of enzymes and proteins. In addition, molecular chaperons have been introduced, and water-soluble peptides and Protein expression and other protein engineering (e. G., Inducible evolution) often allow functional expression of external proteins and enzymes in bacterial cells (Ario de Marco et al., 2007, BMC Biotechnology, 7:32).
3'UTR은 원핵생물에서 mRNA의 안정성에 기여하는 전사 터미네이터의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 의하여, 3'UTR로서 특정서열(예를 들어, REP 서열)을 삽입하여 전사적으로 활성화된 mRNA의 안정성을 증가시키는데에 사용되고 있다. 예를 들어, 3'UTR로서 REP 서열을 삽입하여, mRNA의 안정성을 증가시키고 이에 의해 대장균에서 MalE 단백질의 발현 수준을 상당히 증가시킨 보고가 있다. 그러나, 3'UTR에 RNase E 절단 부위 포함하는 염기서열을 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시키고 이에 따른 단백질의 기능적 발현(수용성 발현)을 증가시키는 연구는 아직 이루어지지 않고 있다. The 3'UTR is known to serve as a transcription terminator that contributes to the stability of mRNA in prokaryotes. Thereby, it is used to increase the stability of the transcriptionally activated mRNA by inserting a specific sequence (for example, REP sequence) as the 3'UTR. For example, it has been reported that the REP sequence as a 3'UTR is inserted to increase the stability of mRNA and thereby significantly increase the expression level of MalE protein in E. coli. However, studies have not yet been conducted to insert a nucleotide sequence containing an RNase E cleavage site into the 3 'UTR to decrease mRNA stability and thereby increase the functional expression (soluble expression) of the protein.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 대장균에서 효소의 수용성을 증가시키기 위한 새로운 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 목적하는 수용성 단백질을 코딩하는 유전자의 3'말단 UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열을 삽입하여 제조된 폴리뉴클레오티드를 수득 및 발현시켜 목적하는 단백질의 발현 수준 대비 수용성 발현비율이 증가함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors have made extensive efforts to develop a new method for increasing the water solubility of the enzyme in E. coli. As a result, it has been found that a nucleotide sequence having an RNase E cleavage site in the 3 'terminal UTR of a gene encoding a desired water- To obtain and express the polynucleotide prepared by inserting the polynucleotide of the present invention into the expression level of the desired protein, thereby completing the present invention.
본 발명의 하나의 목적은 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for increasing the water-soluble expression ratio to the total expression level of a desired protein.
본 발명의 또 하나의 목적은 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현수준 증가용 발현벡터를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an expression vector for increasing the water-soluble expression level relative to the total expression level of the desired protein.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 발현벡터가 도입되어 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시킬 수 있는 형질전환체를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a transformant which can introduce the expression vector and increase the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the desired protein.
본 발명자들은 산업에 이용되는 효소의 활성을 개선시킬 목적으로 수용성 단백질 발현수준을 증가시키는 새로운 방법을 개발하고자, 다양한 연구를 수행하던 중, RNase E 절단 부위를 3'UTR에 삽입하여 mRNA의 안정성에 영향을 주어 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법을 개발하였다. 즉, 효소 중에서 수용성 단백질이 적게 발현되는, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래의 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)인 BmoF1 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16을 재조합 방법으로 과발현시킴에 있어서, 상기 효소를 코딩하는 유전자의 3'말단에, mRNA의 안정성을 감소시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열(예를 들어, CAT 서열 등)이 삽입된 UTR을 결합시킨 형태의 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키면, 상기 BmoF1 또는 MO16의 전체 발현수준 대비 수용성 단백질 형태의 발현 비율이 증가됨을 확인하였다. 목적하는 유전자의 5' 또는 3'말단에 UTR에 결합시켜서 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써, 결과적으로 단백질의 발현수준을 증가시키는 기술은 공지되어 있으나, 본 발명에서 제공하는 RNase E 절단부위가 mRNA의 안정성을 조절하여 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다. The present inventors have conducted various studies to develop a new method for increasing the expression level of water-soluble proteins for the purpose of improving the activity of enzymes used in industry. In the course of carrying out various studies, it has been found that by inserting the RNase E cleavage site into the 3'UTR, To increase the rate of expression of soluble proteins. That is, in the case where Pseudomonas fluorescens ( Pseudomonas fluorescens) fluorescens BmoF1, BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase) derived from DSM50106 or Rhodococcus jostii ) In the overexpression of MO16 as a BVMO derived from RHA1 by a recombinant method, a nucleotide sequence (for example, a CAT sequence or the like) including an RNase E cleavage site which reduces the stability of mRNA is added to the 3 'end of the gene encoding the enzyme, The polynucleotide having the inserted UTR-linked polynucleotide was obtained. When the polynucleotide was expressed, the expression ratio of the water-soluble protein form to the total expression level of BmoF1 or MO16 was increased. Techniques for increasing the protein expression level by increasing the stability of mRNA by binding to the UTR at the 5 'or 3' end of the desired gene are known, but the RNase E cleavage site provided by the present invention is not limited to the stability of the mRNA To increase the expression rate of a water-soluble protein has not been known at all and has been developed for the first time by the present inventors.
상술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 하나의 양태는 (a) 목적하는 수용성 단백질을 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 증가시키는 UTR(untranslated region)이 결합된 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고, 상기 UTR의 염기서열 내에는 mRNA의 안정성을 저하시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 것을 특징으로 하는, 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법을 제공한다.To achieve the above object, one aspect of the present invention is a method for producing a water soluble protein comprising the steps of: (a) obtaining a polynucleotide to which an UTR (untranslated region) is bound to increase the mRNA stability at the 3 ' ; And (b) expressing the polynucleotide, wherein a nucleotide sequence containing an RNase E cleavage site, which lowers the stability of the mRNA, is inserted in the base sequence of the UTR, Thereby increasing the water-soluble expression ratio relative to the expression level.
일반적으로 수용성 단백질을 발현시킬 때 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3'말단에 UTR을 결합시켜서 상기 폴리뉴클레오티드로부터 전사되는 mRNA의 안정성을 향상시키면, 이에 의하여 폴리펩타이드의 합성 수준이 증가하는 반면, 이에 의해, 단백질의 폴딩이 일어나기 전 폴리펩타이드의 local concentration이 증가하게 된다. 이처럼 local concentration이 증가하면, 상기 폴리펩타이드끼리 서로 응집되어 봉입체(inclusion body)를 형성하게 하게 되고 결국 정상적인 폴딩에 의해 생성되는 수용성 형태로 발현되는 단백질의 수준이 감소되는 문제점이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열을 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시키고 이에 합성되는 폴리펩타이드 수를 감소시켜 local concentration을 감소시키고 이는 결국 정상적인 폴딩에 의해 생성되는 수용성 단백질의 발현수준을 증가시켜 수용성 단백질의 발현을 증가시켰다.Generally, when the water-soluble protein is expressed, the stability of the mRNA transcribed from the polynucleotide is improved by binding the UTR to the 5 'or 3' end of the polynucleotide encoding the protein, thereby increasing the synthesis level of the polypeptide On the other hand, this leads to an increase in the local concentration of the polypeptide before folding of the protein occurs. As the local concentration increases, the polypeptides aggregate with each other to form an inclusion body. As a result, the level of the protein expressed as a water-soluble form produced by normal folding is reduced. In order to solve the above problem, the present invention inserts a base sequence including an RNase E cleavage site into a 3'UTR to reduce mRNA stability and decrease the number of synthesized polypeptides, thereby reducing local concentration, Increased levels of water - soluble proteins were produced by increasing the expression level of water - soluble proteins.
본 발명은 3'UTR에 RNase E 절단부위를 포함하는 염기서열을 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시켜 단백질의 발현양을 조절한다는 점에서 프로모터의 유도(induction)정도를 조절하여 단백질 발현량을 감소시킴으로써 응집체 생성을 억제하는 방법, 5'UTR 또는 RBS(ribosome binding site)를 이용하여 mRNA의 번역수준에서 속도감소하는 방법과 구별된다. In the present invention, the nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site is inserted into the 3'UTR to reduce the mRNA stability, thereby controlling the amount of the protein expressed, thereby reducing the amount of protein expression by regulating the induction degree of the promoter, (5 'UTR or ribosome binding site (RBS)) to decrease the rate of translation at the mRNA level.
대장균에서 수용성 단백질의 생성을 촉진하기 위한 방법으로, 재조합 단백질 발현 벡터 구성 시 목적 단백질을 수용성이 높은 아미노산과 결합시켜 발현시키거나 시그날 시퀀스(signal sequence)와 연결하여 페리플라즘(periplasm)으로 분비(secretion)시키는 등의 방법과 단백질 폴딩에 관여하는 샤프론(chaperone)들을 동시에 발현시키는 방법이 알려져 있고 단백질의 수용성 발현을 위해 낮은 배양온도가 일반적으로 유리하다고 알려져 있다. 필러 등(Pilon 등, 1996, Biotechnol. Prog., 12, 331-337)은 유비퀴틴(ubiquitin)의 C-말단 17개 아미노산 서열을 융합 파트너로 이용하여 8 내지 53개의 아미노산으로 구성된 15개의 펩타이드(peptide)를 발현시키면서 열 충격을 가하여 모두 수용성으로 발현시킨 바 있다. 그러나 상기 방법과 비교하여 본 발명은 다수의 RNase E 절단 부위를 포함하는 특정 염기서열을 3'UTR에 삽입하여, mRNA 안정성을 감소시켜 폴리펩티드의 정상적인 폴딩을 유도하여 수용성 단백질의 발현을 증가시키는 점에서 구별된다. As a method for promoting the production of a water-soluble protein in E. coli, a recombinant protein expression vector may be constructed by expressing a desired protein with an amino acid having a high water-solubility, or by expressing it in a periplasm in connection with a signal sequence secretion), and a method of simultaneously expressing chaperones involved in protein folding are known. It is generally known that a low culture temperature is generally advantageous for the water-soluble expression of proteins. (Pilon et al., 1996, Biotechnol. Prog., 12, 331-337) used 15 amino acid sequences of ubiquitin as a fusion partner with 17 amino acid sequences to form 15 peptides ) Were expressed, and they were all expressed as water-soluble by applying heat shock. However, in comparison with the above method, the present invention is characterized in that a specific base sequence including a plurality of RNase E cleavage sites is inserted into the 3 'UTR to decrease the mRNA stability, thereby inducing normal folding of the polypeptide to increase the expression of the water- Respectively.
본 발명에서 사용된 용어 "목적하는 수용성 단백질"은 비수용성 및 수용성 모두 발현하는 단백질을 의미하는 것으로, 특히 단백질이 과발현되었을 때 전제 발현 수준 대비 수용성 발현이 현저히 적은 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 목적하는 수용성 단백질은 목적하는 단백질과 동일한 의미로, 혼용되어 사용될 수 있다. The term "desired water-soluble protein " as used herein refers to a protein that expresses both water-insoluble and water-soluble proteins, and particularly refers to a protein having significantly less water-soluble expression compared to the expression level when the protein is over-expressed. In the present invention, the desired water-soluble protein may be used in combination with the desired protein in the same sense.
본 발명에 있어서, 상기 목적하는 수용성 단백질은 과발현되었을 때 과발현된 단백질이 세포내에서 상호 응집하여 봉입체를 형성함으로써, 상기 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율이 50% 이하인 단백질일 수 있고, 일 예로 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)일 수 있고, 보다 구체적으로, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16일 수 있다. In the present invention, the desired water-soluble protein may be a protein having an aqueous expression ratio of 50% or less with respect to the total expression level of the protein by over-expressing the protein when the over-expressed protein co-aggregates in the cell to form an inclusion body. Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens derived from DSM 50106 or Rhodococcus jostii , RHA1 may be derived BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase), and more particularly, Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens DSM50106 derived BVMO BmoF1 or Rhodococcus jostii ) MO16, which is a BVMO derived from RHA1.
본 발명에서 사용된 용어 "수용성 단백질"은 해당유전자의 발현에 의하여 전사 및 해독된 후, 폴딩과정에 의하여 수용성을 나타나게 되는 단백질을 의미한다. 또한, 상기 수용성 단백질의 발현 수준은 단백질의 수용성 발현과 동일한 의미로, 혼용되어 사용될 수 있다. As used herein, the term "water soluble protein" refers to a protein that is transcribed and decoded by expression of the gene of interest, and then expressed in water by folding. In addition, the expression level of the water-soluble protein may be used in combination with the water-soluble expression of the protein in the same sense.
본 발명에서 사용된 용어 "UTR(untranslated region)은 비해석부위라고도 하며, mRNA 사슬 중 단백질 유전자의 주형이 되지 않는 부분, 즉 번역되지 않는 부분을 의미한다. 일반적으로 상기 UTR은 5'UTR(5'비해석부위), 3'UTR(3'비해석부위)이 존재한다. 3'UTR은 원핵생물에서 mRNA의 안정성에 기여하는 전사 터미네이터를 의미한다. 예를 들어, 3'UTR로 특정서열(예를 들어, REP 서열)을 삽입하여 전사적으로 활성화된 mRNA의 안정성을 증가시키는데에 사용되고 있다. 본 발명에서는 목적하는 단백질의 전체 발현 수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키기 위하여, 3'UTR을 이용하였다. As used herein, the term "untranslated region " (UTR) is also referred to as an uninterpreted region, and refers to a portion of the mRNA that does not become a template for a protein gene, 3 'UTR (3' uninterpreted site), 3 'UTR means a transcription terminator that contributes to the stability of the mRNA in prokaryotes. For example, the REP sequence is inserted to increase the stability of transcriptionally activated mRNA. In the present invention, 3'UTR was used in order to increase the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the desired protein.
본 발명에서 사용된 용어 "RNase E 절단 부위"는 박테리아 세포에서 RNA의 처리 및 분해 관여하는 RNase E에 의해 절단이 일어나는 부분을 의미하며, 주로 단일 가닥의 AU-rich 영역에서 절단이 일어난다. 상기 RNase E 절단 부위는 본 발명의 목적하는 수용성 단백질인 BmoF1 또는 MO16의 3'UTR에 존재하고 있는데, BmoF1의 3'UTR에는 5개, MO16의 3'UTR에는 10개의 RNase E 절단 부위가 포함되어 있다. 본 발명에서는 RNase E 절단 부위를 3'UTR에 삽입하기 위하여, hilD 염기서열 또는 CAT 염기서열을 이용하였다. 또한, 상기 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 mRNA 안정성이 감소하고, 수용성 단백질의 발현수준이 증가하며, 생물전환활성을 증가시킨다. As used herein, the term "RNase E cleavage site" means a site where cleavage occurs by RNase E involved in the treatment and degradation of RNA in bacterial cells, and mainly cleavage occurs in the AU-rich region of a single strand. The RNase E cleavage site is present in the 3'UTR of BmoF1 or MO16, which is the desired water-soluble protein of the present invention. In the 3'UTR of BmoF1, 5 RNase E cleavage sites are included in the 5 ' have. In the present invention, the hilD nucleotide sequence or the CAT nucleotide sequence was used to insert the RNase E cleavage site into the 3 'UTR. Also, as the number of RNase E cleavage sites increases, the mRNA stability decreases, the expression level of the water soluble protein increases, and the biotransformation activity increases.
본 발명에 있어서, 상기 RNase E 절단 부위는 UTR에 삽입되어 mRNA의 안정성을 저하시키기 위한 수단으로서 사용되는데, 구체적으로, 3'UTR로 삽입되는 상기 RNase E 절단 부위의 수는 10 내지 100개가 삽입될 수 있고, 보다 구체적으로, 12 내지 30개가 삽입될 수 있다. 보다 더 구체적으로, 모델 시스템인 hilD 염기서열에 포함되는 RNase E 절단 부위의 수는 12 내지 16개 일 수 있고, 모델 시스템인 CAT 염기서열에 포함되는 RNase E 절단 부위의 수는 13 내지 30개 일 수 있고, 가장 구체적으로 hilD 염기서열에는 14개, 257개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT257 염기서열에는 15개, 357개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT357 염기서열에는 18개, 557개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT557 염기서열에는 26개, CAT657 염기서열에는 28개의 RNase E 절단 부위가 포함될 수 있다.In the present invention, the RNase E cleavage site is inserted into the UTR and used as a means for lowering the stability of the mRNA. Specifically, the number of the RNase E cleavage sites inserted in the 3'UTR is 10 to 100 And more specifically, 12 to 30 can be inserted. More specifically, the number of RNase E cleavage sites included in the hilD base sequence, which is a model system, may be 12 to 16, and the number of RNase E cleavage sites included in the CAT nucleotide sequence as a model system is 13 to 30 number and, most specifically hilD nucleotide sequence is 14, the CAT257 base sequence comprising 257 nucleotides has CAT357 base sequence comprising 15, 357 nucleotides is CAT557 base sequence comprising 18, 557
또한, RNase E 절단 부위 수가 다른 CAT 염기서열 단편을 증폭시키기 위하여, 서열번호 7 및 서열번호 8에 해당하는 CAT_F 및 CAT_R 프라이머를 이용하여 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT657 서열을 PCR을 통해 증폭시켜 얻었다. 또한, 서열번호 7 및 서열 번호 9에 해당하는 CAT_F 및 CAT257_R 프라이머를 이용하여 257개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT257 서열을, 서열번호 7 및 서열번호 10에 해당하는 CAT_F 및 CAT357_R 프라이머를 이용하여 357개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT357 서열을, 서열번호 7 및 서열번호 11에 해당하는 CAT_F 및 CAT557_R 프라이머를 이용하여 557개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT557 서열을 PCR을 통해 증폭시켜 얻었다.In order to amplify a CAT nucleotide sequence fragment having a different number of RNase E cleavage sites, a CAT657 sequence containing 657 nucleotides was amplified by PCR using CAT_F and CAT_R primers corresponding to SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively. In addition, a CAT257 sequence containing 257 nucleotides was amplified using CAT_F and CAT257_R primers corresponding to SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9, 357 nucleotides were amplified using CAT_F and CAT357_R primers corresponding to SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: Was obtained by amplifying the CAT557 sequence containing 557 nucleotides through PCR using the CAT_F and CAT557_R primers corresponding to SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 11, respectively.
또한, 상기 RNase E 절단 부위의 수가 조정됨에 따라 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현 비율을 변화시킬 수 있고, 구체적으로, 상기 BmoF1 발현하는 경우, RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현 비율을 증가시키는 것 일 수 있다. In addition, as the number of RNase E cleavage sites is adjusted, the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the desired protein can be changed. Specifically, in the case of expression of BmoF1, as the number of RNase E cleavage sites increases, But may be to increase the rate of water-soluble expression relative to the level of expression.
본 발명의 일 실시예에서 다른 RNase E 절단 부위 수를 포함하는 CAT 염기서열(CAT257, CAT357, CAT557, CAT657)을 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT257, pET-BmoF1-3'UTRCAT357, pET-BmoF1-3'UTRCAT557 및 pET-BmoF1-3'UTRCAT657를 제작하여 RNase E 절단 부위 수에 따른 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준을 확인한 결과, 상기 CAT 염기서열의 뉴클레오티드에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준이 감소함을 확인하였다. 또한 RNase E 절단 부위 수에 따른 BmoF1-3'UTRCAT 단백질 발현수준을 확인한 결과, 상기 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 BmoF1-3'UTRCAT 총 단백질 발현수준은 감소하였지만, BmoF1-3'UTRCAT 수용성 단백질 발현수준은 증가함을 확인하였다. 이를 통해서 RNase E 절단 부위 수가 mRNA 안정성 및 수용성 단백질 발현수준에 영향을 주는 것을 알 수 있었다(도 5). In one embodiment of the present invention, the CAT nucleotide sequences (CAT257, CAT357, CAT557, CAT657) containing the number of other RNase E cleavage sites were inserted into the 3'UTR of BmoF1, a BVMO derived from Pseudomonas fluorescens DSM50106, E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR CAT257 , pET-BmoF1-3'UTR CAT357 , pET-BmoF1-3'UTR CAT557 and pET-BmoF1-3'UTR CAT657 were prepared and the number of RNase E cleavage sites As a result of confirming the level of BmoF1-3'UTR CAT mRNA, it was confirmed that the level of BmoF1-3'UTR CAT mRNA decreased as the number of RNase E cleavage sites present in the nucleotide of the CAT nucleotide sequence increased. In addition, RNase E BmoF1-3'UTR CAT results confirm the protein expression level, the more the increase in the number of RNase E cleavage site BmoF1-3'UTR Total CAT protein expression levels according to the number of the cut is however reduced, the water-soluble BmoF1-3'UTR CAT Protein expression levels were increased. This indicates that the number of RNase E cleavage sites affects mRNA stability and water-soluble protein expression level (FIG. 5).
상기 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열은 RNase E 절단 부위를 포함하는 한 특별히 제한되지 않는데, hilD 염기서열, 또는 CAT 염기서열의 전체 또는 일부가 사용될 수 있다. 구체적으로 상기 CAT 염기서열은 서열번호 18 내지 21일 수 있고, 보다 구체적으로 CAT 염기서열의 일부(CAT257, CAT357, CAT557)는 서열번호 18 내지 20, CAT 염기서열의 전체(CAT657)는 서열번호 21 일 수 있다. The nucleotide sequence including the RNase E cleavage site is not particularly limited as long as it contains an RNase E cleavage site, and all or part of the hilD nucleotide sequence or the CAT nucleotide sequence may be used. (CAT257, CAT357, CAT557) are represented by SEQ ID NOs: 18 to 20, and the entire CAT nucleotide sequence (CAT657) is represented by SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: Lt; / RTI >
상기 hilD 염기서열은 SPI1 유전자의 전사 조절자로 14개의 RNase E 절단 부위를 포함하고 있고, 본 발명에서는 hilD 염기서열에 포함되어 있는 RNase E 절단 부위를 목적하는 수용성 단백질의 3'말단 UTR에 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시켜, 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 단백질의 발현정도를 증가시킬 목적으로 사용되었다.The hilD nucleotide sequence contains 14 RNase E cleavage sites as a transcriptional regulator of the SPI1 gene. In the present invention, the RNase E cleavage site contained in the hilD nucleotide sequence is inserted into the 3'-terminal UTR of the desired water-soluble protein, And to increase the expression level of the water-soluble protein relative to the total expression level of the desired protein.
본 발명에 있어서, 상기 hilD 염기서열 단편을 증폭시키기 위하여, 서열번호 1 및 서열번호 2에 해당하는 hilD_F 및 hilD_R 프라이머를 이용하여 hilD 염기서열(서열번호 17)을 PCR을 통해 증폭시켜 얻었다.In the present invention, the hilD nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17) was amplified by PCR using the hilD_F and hilD_R primers corresponding to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively, in order to amplify the hilD nucleotide sequence fragment.
본 발명의 일 실시예에서는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 hilD 염기서열이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 은 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 hilD 염기서열을 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입되지 않은 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative과 비교하여, BmoF1-3'UTR hilD mRNA 수준이 낮아짐을 확인하여 대장균의 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열의 삽입이 목적하는 수용성 단백질인 BmoF1의 안정성을 영향을 미치는 것을 알 수 있었다(도 3의 A).In one embodiment of the invention the nucleotide sequence of hilD base sequence comprising RNase E cleavage site Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) DSM50106 derived BVMO of the recombinant E. coli BL21 (DE3) into the 3'UTR of BmoF1 pET-BmoF1-3'UTR hilD RNase E has the nucleotide sequence of Pseudomonas hilD base sequence comprising a cleavage site fluorenyl sense (Pseudomonas fluorescens ) Compared with BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native which was not inserted in the 3'UTR of BmoF1 derived from DSM50106 derived BVMO, BmoF1-3'UTR hilD mRNA level was lowered and RNase The insertion of the hilD nucleotide sequence containing the E-cleavage site influenced the stability of the desired water-soluble protein BmoF1 (Fig. 3A).
본 발명의 다른 일 실시예에서는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 hilD 염기서열이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 은 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 hilD 염기서열을 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입되지 않은 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative과 비교하여, BmoF1-3'UTR hilD 총 단백질 발현수준은 감소하였지만, BmoF1-3'UTR hilD 수용성 단백질의 발현수준이 증가함을 확인하여, 대장균의 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열의 삽입이 목적하는 수용성 단백질인 BmoF1의 수용성 단백질 발현수준을 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 3의 B). According to another embodiment of the invention the nucleotide sequence of hilD base sequence comprising RNase E cleavage site Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) DSM50106 derived BVMO of the recombinant E. coli BL21 (DE3) into the 3'UTR of BmoF1 pET-BmoF1-3'UTR hilD RNase E has the nucleotide sequence of Pseudomonas hilD base sequence comprising a cleavage site fluorenyl sense (Pseudomonas fluorescens ) Compared with BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native which was not inserted in the 3'UTR of BmoF1, a BmOF1-3'UTR hilD total protein expression level, but BmoF1-3'UTR hilD It was found that the expression level of the water-soluble protein BmoF1, which is an intended water-soluble protein, can be improved by inserting the hilD nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site into the 3'UTR of Escherichia coli (FIG. 3B).
상기 CAT(Chloramphenicol acetyltransferase) 염기서열은 대장균으로부터 분리되는 항생물질로 클로람페니콜을 아세틸화하는 효소를 암호화하는 서열을 의미한다. 상기 클로람페니콜은 50S 리보솜에 선택적으로 결합하여 펩티드 전이반응을 저해하여 원핵생물의 단백질 합성을 저해하는데 CAT 효소에 의해 아세틸화된 클로람페니콜은 50S 리보솜과 결합할 수 없게 하여, 클로람페니콜의 단백질 합성 저해 활성이 감소된다. 이런 이유로 CAT 서열은 유전자 도입에 의한 발현활성 검출에 사용되는 리포터 유전자로 주로 사용된다. 그러나, 본 발명에서 CAT 염기서열은 CAT 염기서열에 포함되어 있는 RNase E 절단 부위을 목적하는 수용성 단백질의 3'말단 UTR에 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시켜, 목적하는 단백질의 수용성 발현정도를 증가시킬 목적으로 사용되었다. The CAT (chloramphenicol acetyltransferase) base sequence refers to a sequence encoding an enzyme that acetylates chloramphenicol by an antibiotic substance isolated from E. coli. The above-mentioned chloramphenicol selectively binds to the 50S ribosome to inhibit the peptide transfer reaction, thereby inhibiting protein synthesis of the prokaryote. The acetylated chloramphenicol by the CAT enzyme can not bind to the 50S ribosome, and the protein synthesis inhibitory activity of the chloramphenicol is decreased do. For this reason, the CAT sequence is mainly used as a reporter gene used for detecting the expression activity by gene introduction. However, in the present invention, the CAT nucleotide sequence is intended to insert the RNase E cleavage site contained in the CAT nucleotide sequence into the 3'-terminal UTR of the desired water-soluble protein to reduce the mRNA stability and increase the water-soluble expression level of the desired protein Respectively.
본 발명에 있어서, CAT 염기서열의 길이가 증가할수록, 염기서열 내에 포함되는 RNase E 절단 부위의 수는 증가하였다. In the present invention, as the length of the CAT nucleotide sequence increased, the number of RNase E cleavage sites contained in the nucleotide sequence increased.
본 발명의 일 실시예에서는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 CAT 서열이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT은 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 CAT 서열이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입되지 않은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative과 비교하여 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준은 약 절반 정도 감소하는 것을 확인하여, RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT 염기서열의 삽입이 mRNA 안정성에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다(도 5의 A). In one embodiment of the invention the sequence of the base sequence CAT, which contains the RNase E cleavage site Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) DSM50106 derived BVMO the BmoF1 the nucleotide sequence of SEQ ID NO: CAT Pseudomonas fluorescein sense that the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR CAT inserted into the 3'UTR contains a cleavage site for RNase E (Pseudomonas fluorescens) Compared with recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native which was not inserted into the 3'UTR of BmoF1 derived from DSM50106-derived BVMO, BmoF1-3'UTR CAT mRNA level was reduced by about half, and RNase E Insertion of the CAT nucleotide sequence containing the cleavage site influenced mRNA stability (Fig. 5A).
본 발명의 다른 일 실시예에서는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 CAT 염기서열이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT은 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열인 CAT 염기서열이 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1의 3'UTR에 삽입되지 않은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative과 비교하여, BmoF1-3'UTRCAT 총 단백질 발현수준은 감소하지만, BmoF1-3'UTRCAT 수용성 단백질의 발현수준은 증가함을 확인하여, 3'UTR로 RNase E 절단부위를 포함하는 CAT 염기서열을 삽입하여 BmoF1의 수용성 단백질 발현수준을 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 5의 B 및 C). According to another embodiment of the invention the CAT nucleotide sequence of the nucleotide sequence comprising the RNase E cleavage site Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) DSM50106 base sequence of base sequence CAT resulting BVMO of the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR CAT inserted into the 3'UTR of BmoF1 comprises an RNase E cleavage sites are Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens ) Compared to recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native which was not inserted into the 3'UTR of BmoF1, a BmOF1-3'UTR CAT total protein expression level of DSM50106 derived BVMO, BmoF1-3 ' It was confirmed that the expression level of the UTR CAT water-soluble protein was increased, and it was found that the CAT nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site was inserted into the 3'UTR to improve the water-soluble protein expression level of BmoF1 B and C).
본 발명에서 사용된 용어 "BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)"란, 케톤을 산화시켜서 락톤이나 에스터화합물을 생성하는 Baeyer-Villiger 산화반응을 포함하는 다양한 산화반응을 촉매할 수 있는 효소인 monooxygenase의 일종을 의미한다. 본 발명의 목적상, 형질전환체에서 발현되어 키토 지방산(10-키토스테아르산 등)으로부터 사슬 내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 생산하는 반응을 촉매하는 활성을 나타내는 한, 상기 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 슈도모나스속 균주(Pseudomonas sp .), 로도코커스속 균주(Rhodococcus sp). 브레비박테리움속 균주(Brevibacterium sp .), 코마노나스속 균주(Comanonas sp .), 아시네토박터속 균주(Acinetobacter sp .), 아트로박터속 균주(Arthrobacter sp .), 브라키모나스속 균주(Brachymonas sp .) 등의 미생물로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 등이 될 수 있고, 보다 구체적으로 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1으로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)가 될 수 있다.As used herein, the term "BVMO (Baeyer-Villiger monooxygenase)" refers to a kind of monooxygenase which is an enzyme capable of catalyzing various oxidation reactions including Baeyer-Villiger oxidation reaction in which ketones are oxidized to produce lactones or ester compounds it means. For the purpose of the present invention, the BVMO (Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO)), which is expressed in a transformant and exhibits an activity of catalyzing a reaction for producing a fatty acid derivative into which an ester group is introduced from a chitosan fatty acid ) Is not particularly limited, but specifically, a strain of Pseudomonas sp. sp . ), Rhodococcus sp . Brevibacterium sp . ), Eggplant komano sp (Comanonas sp.), Acinetobacter sp (Acinetobacter sp . ), Arthrobacter sp . , Brachymonas sp . sp . ) And the like can be a BVMO (Baeyer-Villiger monooxygenase) derived from microorganisms such as, and more specifically Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens DSM 50106 or Rhodococcus jostii ) Can be BVMO (Baeyer-Villiger monooxygenase) derived from RHA1.
본 발명에 있어서, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 유전자를 증폭시키 위하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머로 PCR을 수행하여 BmoF1 유전자를 증폭시켰다. In the present invention, Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) DSM50106 to amplify the resulting BVMO BmoF1 the gene, by performing PCR with the primer of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was amplified BmoF1 gene.
본 발명에서 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위를 삽입하여 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 유전자의 3'UTR 말단에 삽입하여 상기 BmoF1 단백질의 수용성 단백질 발현을 증가시키는 것을 확인하였으므로, 상기 BmoF1과 상동성이 23.3%(도 8)로 상당히 낮은 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1으로부터 유래된 BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase)인 MO16 유전자의 3'UTR 말단에 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위를 삽입하여 MO16 단백질의 발현 수준을 확인하였다. By inserting the RNase E cleavage site present in the CAT nucleotide sequence in the present invention Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens DSM50106-derived BmOF1 gene, the BmoF1 protein was found to increase the water-soluble protein expression of the BmOF1 protein. Therefore, it was confirmed that the BmOF1 protein had a homology of about 23.3% (Fig. 8) Rhodococcus jostii ) The expression level of the MO16 protein was confirmed by inserting the RNase E cleavage site in the CAT nucleotide sequence at the 3'UTR end of the MO16 gene, BVMO (Baeyer-Villiger monooxygenase) derived from RHA1.
본 발명에 있어서, 상기 MO16 유전자를 증폭시키기 위하여, 서열번호 12 및 서열번호 13에 해당하는 MO16_F 및 MO16_R 프라이머로 PCR을 수행하여 MO16 유전자를 증폭시켜 얻었다.In the present invention, in order to amplify the MO16 gene, PCR was performed with MO16_F and MO16_R primers corresponding to SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 to amplify the MO16 gene.
또한, 상기 MO16의 3'UTR에 삽입될 RNase E 절단 부위가 포함된 CAT 염기서열을 증폭시키기 위하여, 서열번호 14 및 서열번호 15에 해당하는 MO16_CAT_F 및 MO16_CAT_R 프라이머를 이용하여 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 MO16_CAT657 염기서열을 PCR을 이용하여 증폭시켜 얻었고, 서열번호 14 및 서열번호 16에 해당하는 MO16_CAT_F 및 MO16_CAT257_R 프라이머를 이용하여 257개의 뉴클레오티드를 포함하는 MO16_CAT257 염기서열을 증폭시켜 얻었다.In order to amplify the CAT nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site to be inserted into the 3'UTR of the MO16, MO16_CAT_F and MO16_CAT_R primers corresponding to SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 were used to amplify the CAT nucleotide sequence of MO16_CAT657 containing 657 nucleotides Was obtained by amplifying the base sequence using PCR, and was obtained by amplifying the MO16_CAT257 nucleotide sequence containing 257 nucleotides using the MO16_CAT_F and MO16_CAT257_R primers corresponding to SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16, respectively.
본 발명의 일실시예에서는 RNase E 절단부위를 포함하는 CAT 염기서열(MO16_CAT257 및 MO16_CAT657)이 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16 유전자 3'UTR에 삽입된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT257 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT657의 MO16-3'UTRCAT257 및 MO16-3'UTRCAT657 단백질 발현 수준을 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative의 MO16-3'UTRnative 단백질 발현 수준과 비교한 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT657에서 단백질 발현은 나타나지 않고, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT257에서 MO16-3'UTRCAT257 수용성 단백질 발현이 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT657의 MO16-3'UTRCAT257 보다 증가함을 확인하여 MO16 효소에서도 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위의 수를 조정하여 수용성 단백질 발현을 개선시킬 수 있고 MO16 단백질의 수용성 발현은 BmoF1의 수용성 발현보다 민감한 것을 알 수 있었다(도 9). In one embodiment of the present invention, the CAT nucleotide sequences (MO16_CAT257 and MO16_CAT657) including the RNase E cleavage site are introduced into Rhodococcus jostii ) RHA1 derived BVMO of the recombinant E. coli BL21 into the MO16 gene 3'UTR (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT257 and recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT657 of MO16-3'UTR CAT257 and MO16 -3'UTR CAT657 protein expression levels were compared with the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native MO16-3'UTR native protein level of expression, recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3 ' no protein expression was not at UTR CAT657, recombinant E. coli BL21 (DE3) from pET22b-MO16-3'UTR CAT257 MO16-3'UTR CAT257 soluble protein expression the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT657 of MO16 -3 ' UTR CAT257. Therefore , the number of RNase E cleavage sites present in the CAT nucleotide sequence in the MO16 enzyme can be adjusted to improve the expression of water-soluble proteins and the water-soluble expression of the MO16 protein is more sensitive than the aqueous expression of BmoF1 (Fig. 9).
본 발명의 다른 하나의 양태로서 목적하는 수용성 단백질을 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 증가시키는 UTR이 결합된 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록, 상기 유전자가 도입될 수 있는 다중 클로닝 부위(multicloning site) 및 상기 다중 클로닝부위의 3'말단에 결합되고, mRNA의 안정성을 저하시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 UTR을 포함하는, 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율 증가용 발현벡터를 제공한다. In another embodiment of the present invention, a nucleic acid encoding a water-soluble protein is provided, wherein a multicloning site capable of introducing the UTR-linked polynucleotide, which can increase the mRNA stability, site and an UTR in which a base sequence containing an RNase E cleavage site, which binds to the 3 'end of the multiple cloning site and reduces the stability of the mRNA, is increased in proportion to the total expression level of the desired protein Lt; / RTI > expression vector.
본 발명에서 사용된 용어 "발현벡터"는 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. The term "expression vector" as used herein refers to a gene construct comprising a gene insert that is capable of expressing a desired protein in an appropriate host cell, and an essential regulatory element operably linked to the expression of said gene insert . The expression vector includes expression control elements such as an initiation codon, a termination codon, a promoter, an operator, etc. The initiation codon and termination codon are generally regarded as part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene product is administered, And must be in coding sequence and in frame. The promoter of the vector may be constitutive or inducible.
상기 발현벡터는 목적하는 수용성 단백질을 코딩하는 유전자의 3'말단에 RNase E 절단부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 UTR이 결합된 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 구체적으로 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다. The expression vector is not particularly limited as long as it is capable of expressing a UTR-linked polynucleotide into which a base sequence including an RNase E cleavage site is inserted at the 3 'end of a gene encoding a desired water-soluble protein. Such as human, monkey, rabbit, rat, hamster, mouse, etc.), plant cells, yeast cells, insect cells or bacterial cells (for example, Escherichia coli) And / or may be a vector that is expressible, specifically operably linked to a suitable promoter so that the polynucleotide can be expressed in a host cell, and may be a vector comprising at least one selectable marker, Specifically, commercially available plasmids (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), E. coli-derived plasmids (pYG601BR322, pBR3 Derived plasmids (pUB110 and pTP5), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50), lambda-phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, lambda gt10, pUC118 and pUC119), Bacillus subtilis- lambda gt11 and lambda ZAP), retrovirus, adenovirus, vaccinia virus, baculovirus, and the like. Since the amount of expression of the protein and the expression of the expression vector are different depending on the host cell, it is preferable to select and use the host cell most suitable for the purpose.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 발현벡터가 도입되어 목적하는 단백질의 전제 발현수준 대비 수용성 발현 비율을 증가시킬 수 있는 형질전환체를 제공한다. In another aspect of the present invention, there is provided a transformant, wherein the expression vector is introduced to increase the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of a desired protein.
본 발명에서 사용된 용어 "형질전환체"는, 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터를 이용하여 숙주의 내부로 도입된 후, 상기 목적하는 단백질을 발현시키도록 변이된 세포 또는 미생물을 의미한다. 이때, 상기 숙주세포에 도입되는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 한, 어떠한 형태라도 무방하다.As used herein, the term "transformant" means a cell or microorganism that has been mutated to express the desired protein after the polynucleotide encoding the desired protein has been introduced into the host using a vector . At this time, the polynucleotide introduced into the host cell may be in any form as long as it can be introduced into the host cell and expressed.
본 발명에서 제공하는 상기 형질전환체는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16을 코딩하는 유전자의 3'말단에 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 UTR이 결합된 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제작될 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 숙주세포로는 특별히 제한되지는 않으나, 일 예로서 생물전환 공정에 적용하기에 적합한 배양가능한 단세포성 원핵생물 또는 진핵생물의 세포를 사용할 수 있고, 다른 예로서 대장균, 효모 등을 사용할 수 있으며, 또 다른 예로서 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용할 수 있다.The transformant provided in the present invention is a transformant having an RNase E cleavage site at the 3 'end of a gene encoding MO16 which is BVMF1 or Rhodococcus jostii RHA1 derived BVMO derived from Pseudomonas fluorescens DSM50106 BVMO May be prepared by introducing into a host cell an expression vector capable of expressing a UTR-linked polynucleotide into which the nucleotide sequence containing the UTR is inserted. In this case, the host cell that can be used is not particularly limited. As an example, a culturable single-celled prokaryotic or eukaryotic cell suitable for application to the bioconversion process may be used, and E. coli, yeast, etc., As another example, Escherichia coli BL21 (DE3) cells can be used.
또한, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 수용성 단백질의 발현 수준을 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 형질전환체를 제조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.In addition, the transformation can be carried out by various methods. As long as a transformant exhibiting an effect of improving the expression level of a water-soluble protein can be produced, the method can be carried out by any of CaCl 2 precipitation method, CaCl 2 2 precipitation method using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide), an electroporation method, an electroporation method, a calcium phosphate precipitation method, a protoplast fusion method, an agitation method using silicon carbide fiber, an agrobacterium-mediated trait A transformation method using PEG, a dextran sulfate, a lipofectamine, and a dry / suppression-mediated transformation method.
본 발명에서 제공하는 형질전환체를 배양과정을 통해 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시킬 수 있다. Through the culturing process of the transformants provided in the present invention, the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the desired protein can be increased.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 과정을 의미한다.The term "cultivation" of the present invention means a process of growing microorganisms under an appropriately artificially controlled environmental condition.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 상기 형질전환체를 생육시켜서 생물전환 공정을 수행하기 위한 과정으로 이해될 수 있는데, 구체적으로 배치 공정, 주입식 배치 공정 또는 반복 주입 배치 공정 등을 통하여 회분식 또는 연속식으로 수행될 수 있다.In the present invention, the culturing can be understood as a process for growing the transformant to carry out a biotransformation process. Specifically, the culturing can be performed in a batch or continuous manner through a batch process, an implantation batch process, .
상기 배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈와 같은 당, 지방, 지방산, 글리세롤이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산과 같은 아미노산 및 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.The culture medium used for the above cultivation should meet the requirements of a specific strain in an appropriate manner while controlling the temperature, pH and the like under aerobic conditions in an ordinary medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, and the like. Carbon sources that may be used include sugars, fats, fatty acids and glycerol such as glucose, sucrose, and lactose. These materials may be used individually or as a mixture. Nitrogen sources that may be used include inorganic sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate; Amino acids such as glutamic acid, and organic peptides such as peptone, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, and casein hydrolyzate. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
또한, 배양시에 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 배양물의 온도는 통상적인 배양온도인 27℃ 내지 37℃를 유지할 수 있으며, 배양시간은 10 내지 100 시간이 될 수 있다.The method may further comprise the step of injecting oxygen or an oxygen-containing gas (e.g., air) into the culture to maintain the aerobic state during the culture, and the temperature of the culture may be in the range of 27 to 37 Lt; 0 > C, and the incubation time can be 10 to 100 hours.
본 발명에서 제공하는 목적하는 단백질의 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법은 수용성 단백질을 이용하는 다양한 산업분야에 응용될 수 있는데, 상기 산업분야에서 사용되는 수용성 단백질의 생산수율을 증가시키면, 전체적인 생산비용을 절감시켜서, 산업적인 경쟁력을 향상시킬 수 있다.The method of increasing the water-soluble expression ratio relative to the expression level of the target protein provided by the present invention can be applied to various industrial fields using water-soluble proteins. If the yield of water-soluble proteins used in the industrial field is increased, It can reduce costs and improve industrial competitiveness.
이같은 산업분야에 대한 응용방법의 일 예로서, 한국등록특허 제1500827호 또는 한국등록특허 제 1534910호에 개시된 형질전환 미생물을 이용한 생물전환공정을 들 수 있다.An example of an application method for such an industrial field is a biotransformation process using a transforming microorganism disclosed in Korean Patent No. 1500827 or Korean Patent No. 1534910.
본 발명의 일실시예에서는 전세포 생물전환을 통해 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)에서 상기 BmoF1의 에스터 생성물은 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)보다 상당히 높음을 확인하여 3'UTR로 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열의 삽입이 BmoF1 효소의 수용성 발현과 생물전환 활성에도 영향을 미침을 알 수 있었다(도 3의 C). In one embodiment of the present invention, the ester product of BmoF1 in recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD through whole cell biotransformation is pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3 'UTR Native Recombinant E. coli BL21 (DE3). It was found that insertion of the hilD nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site at the 3'UTR also affected the water-soluble expression and bioconversion activity of the BmoF1 enzyme (Fig. 3C).
본 발명의 다른 일실시예에서는 전세포 생물전환을 통해서 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들을 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)에서 RNase E 절단 부위 수가 증가함에 따라서 순차적으로 생물전환 활성, 생성률 및 에스터 생성물이 증가함을 확인하여 RNase E 절단 부위의 수가 BmoF1 효소의 수용성 발현과 생물전환 활성에도 영향을 미침을 알 수 있었다(도 6 및 7). In another embodiment of the present invention, as the number of RNase E cleavage sites increases in recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants through whole cell biotransformation, , Production rate and ester product increased, indicating that the number of RNase E cleavage sites also affected the water-soluble expression of BmoF1 enzyme and the bioconversion activity (FIGS. 6 and 7).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 전세포 생물전환을 통해 촉매활성을 비교한 결과, pET22b-MO16-3'UTRCAT257를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)는 pET22b-MO16-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)보다 35 % 더 높은 비율로 에스터 생성물를 형성함을 확인하여, 상기 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위의 삽입 및 RNase E 절단 부위 수 조정을 통해 미생물에서 M16 효소의 수용성 발현과 생물전환 활성을 개선시킴을 알 수 있었다(도 11의 A 및 B).In another embodiment of the present invention, the catalytic activity of the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing pET22b-MO16-3'UTR CAT257 was compared with the activity of pET22b-MO16-3'UTR native (RNase E) cleavage site in the CAT nucleotide sequence and the number of RNase E cleavage sites in the microorganism was confirmed to be 35% higher than that of the recombinant E. coli BL21 (DE3) Expression and bioconversion activity (Fig. 11A and B).
본 발명에서 사용된 용어 "생물전환 활성"은 전세포 생물전환시에 나타나는 생물전환 속도 및 반응물의 생성률 또는 수득률을 포함하는 개념을 의미한다. As used herein, the term " bioconversion activity "refers to a concept that includes the rate of bioconversion and the rate of yield or yield of a reactant that occurs upon conversion of whole cell biology.
본 발명의 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법을 통해 효소의 활성을 조절할 수 있고, 전세포 생물전환을 이용하여 다양한 화학물질의 생산성을 증가시킬 수 있을 것이다. The activity of the enzyme can be controlled by increasing the expression rate of the water-soluble protein of the present invention, and the productivity of various chemical substances can be increased by using whole cell biotransformation.
도 1은 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 배양액으로부터 분리한 세포 추출물의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도이다. Lane M은 마커, Lane S는 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 수용성 분획물, Lane I는 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 비수용성 분획물을 나타내었다.
도 2는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 hilD 염기서열과, 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT657 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2의 A는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 hilD 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2의 B는 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT657 염기서열을 나타낸 도이다. CAT 657 뉴클레오티드 내에서 257개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT257 염기서열은 노랑색(yellow), 357개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT357 염기서열은 노랑색+회색, 557개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT557 염기서열은 노랑색+회색+암녹색으로 나타내었다. RNase E 절단 부위는 빨강색으로 나타내었다.
도 3은 대장균에서 BmoF1의 mRNA 수준 및 단백질 발현 수준, BmoF1 효소를 이용한 리시놀레산의 생물전환을 나타낸 도이다.
도 3의 A는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 의 Bmof1-3'UTRnative(lane 1) 및 Bmof1-3'UTR hilD (lane 2)의 mRNA 수준을 나타낸 도이다. 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 배양액으로부터 분리하였고, ihfB의 mRNA 수준은 대조군으로 사용하였다.
도 3의 B는 야생형 대장균 BL21(DE3)(lane WS 및 WI), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative(lane 1 및 2), 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR hilD (lane 3 및 4) 세포 추출물에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도이다. Lane M은 마커, Lane WS, 1 및 3은 수용성 분획, Lane WI, 2 및 4는 비수용성 분획을 나타내었다.
도 3의 C는 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)(왼쪽 패널), pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)(하위 패널)을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로 전세포 생물전환을 나타낸 도이다. 실험은 세 번 수행하였고 에러 바는 표준편차로 나타내었다. 기호는 각각 리시놀레산(△), 12-케토올레산(12-ketooleic acid, ▼), 에스터(ester, ■) 및 11-히드록시운덱-9-이노익(11-hydroxyundec-9-enoic acid, ▲)의 농도를 나타내었다.
도 4는 257 내지 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT 염기서열을 삽입한 3'UTRCAT 변이체의 RNase E 절단 부위의 수를 나타내는 도이다. BmoF1 유전자의 기존 UTR에는 5개, CAT257은 15개, CAT357은 18개, CAT557은 26개, CAT657(부분 삭제되지 않은 CAT 서열과 동일)은 28개의 RNase E 절단 부위를 포함하고 있다. 또한, hilD 염기서열은 19개, MO16 유전자의 기존 UTR에는 10개의 RNase E 절단 부위를 포함하고 있다.
도 5는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체(CAT257, CAT357, CAT557, CAT657)에서 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준 및 단백질 발현 수준을 분석한 도이다.
도 5의 A는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체에서 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준을 나타낸 도이다. 샘플은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative (lane 1), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -257 (lane 2), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -357 (lane 3), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -557 (lane 4) 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -657 (lane 5)의 배양액으로부터 분리하였다. ihfB 의 mRNA 수준은 대조군으로 사용하였다.
도 5의 B는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT의 변이체에서 BmoF1-3'UTRCAT 수용성 분획물에 대한 SDS-PAGE(상위 패널) 및 웨스턴 블럿(하위 패널) 분석을 나타낸 도이다. 샘플은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative (lane 1), 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -257 (lane 2), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -357 (lane 3), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT-557 (lane 4), 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT-657 (lane 5)의 배양액으로부터 분리된 세포 추출물의 수용성 분획물을 이용하였고, Lane M은 마커를 나타낸다.
도 5의 C는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT의 변이체에서 BmoF1-3'UTRCAT 비수용성 분획물에 대한 SDS-PAGE(상위 패널) 분석을 나타낸 도이다. 샘플은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative (lane 1), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -257 (lane 2), 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT-357 (lane 3), 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -557 (lane 4), 및 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -657 (lane 5)의 배양액으로부터 분리된 세포 추출물의 비수용성 분획물을 사용하였고, Lane M은 마커를 나타낸다.
도 6은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT의 변이체를 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 도이다.
도 6의 A는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative, 도 6의 B는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -257, 도 6의 C는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -357, 도 6의 D는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT-557, 및 도 6의 E는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT -657을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 도이다. 실험은 세번 수행하였고 에러 바는 표준편차로 나타내었다. 기호는 각각 리시놀레산(△), 12-케토올레산(12-ketooleic acid, ▼), 에스터(ester, ■) 및 11-히드록시운덱-9-이노익(11-hydroxyundec-9-enoic acid, ▲)의 농도를 나타내었다.
도 7은 3'UTR에 삽입된 CAT 서열(3'UTRCAT)의 길이 및 RNase E 절단 부위 수와의 초기 생물전환 활성간의 관계을 나타낸 도이다.
도 7의 A는 3'UTR에 삽입된 CAT 서열의 길이와 초기 생물전환 속도 간의 관계를 나타낸 도이다. GC/MS에 의해 30분마다(t=0.5h) 측정한 생성물의 농도를 근거로 하여 계산하였다. X-축의 제로는 5개의 RNase E 절단 부위를 포함하고 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 초기 생물전환 속도를 나타낸다.
도 7의 B는 3'UTR에 삽입된 CAT 서열의 RNase E 절단 부위 수와 초기 생물전환 활성 간의 관계를 나타내는 도이다. X축의 5는 5개의 RNase E 절단 부위를 포함하고 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 초기 생물전환 활성을 나타낸다. 빨간색 별 모양은 19개의 잠재적인 RNase E 절단 부위를 포함하고 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 초기 생물전환 활성을 나타낸다.
도 8은 MO16과 BmoF1의 서열 상동성에 대한 개략도와 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-MO16를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타내는 도이다.
도 8의 A는 MO16과 BmoF1의 서열 상동성이 23.3 %임을 나타내는 개략도이다. 도 8의 B는 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-MO16를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 SDS-PAGE 분석을 나타내는 도이다. Lane M은 마커, Lane S는 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-MO16를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 수용성 분획물, 및 Lane I는 pCOLADuet-ADH 및 pET22b-MO16를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 비수용성 분획물을 나타낸다.
도 9는 재조합 대장균 BL21(DE3) (lane WS 및 WI), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative (lane 1 및 2), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT-257 (lane 3 및 4), 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT -657 (lane 5 및 6)의 배양액으로부터 분리한 세포 추출물에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타내는 도이다. Lanes WS, 1, 3, 및 5는 세포 추출물의 수용성 분획물을 나타낸다. Lanes WI, 2, 4, 및 6은 세포 추출물의 비수용성 분획물을 나타낸다. Lane M은 마커를 나타낸다.
도 10은 리시놀레산의 생물전환 과정을 나타내는 도이다. 리시놀레산(1)은 여러 단계 효소 반응을 거쳐 ω-히드록시운덱-9-이노익산(ω-hydroxyundec-9-enoic acid, 5)과 n-헵탄산(n-heptanoic acid, 4)으로 전환된다.
도 11은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT에 대한 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 도이다.
도 11의 A는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative, 도 11의 B는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT -257, 도 11의 C는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT -657을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환결과를 나타낸 도이다.
도 12는 리놀레산의 생물전환 과정을 나타내는 도이다. 리놀레산(6)은 여러 단계 효소 반응을 거쳐 ω-히드록시도덱-9-이노익산(ω-hydroxydodec-9-enoic acid, 11)과 n-헥산산(n-hexanoic acid, 10)으로 전환된다.
도 13은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT에 대한 13-히드록시올레산(13-hydroxyoleic acid)에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 도이다.
도 13의 A는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative, 도13의 B는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT -257, 도 13의 C는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT -657을 이용한, 13-히드록시 올레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 도이다. 실험은 세번 수행하였고 에러 바는 표준편차로 나타내었다. 기호는 각각 13-히드록시올레산(△), 13-케토올레산(13-ketooleic acid, ▼), 에스터(ester, ■) 및 11-히드록시도덱-9-이노익(11-hydroxydodec-9-enoic acid, ▲)의 농도를 나타내었다.Figure 1 shows SDS-PAGE analysis of cell extracts isolated from the culture medium of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1. Lane M is a marker, Lane S is a soluble fraction of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1, Lane I is a water-insoluble fraction of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b- Fractions.
FIG. 2 is a graph showing the activity of Salmonella enterica enterica ) and a CAT657 nucleotide sequence containing 657 nucleotides.
Figure 2 A shows Salmonella enterica is a diagram showing the base sequence of hilD enterica).
FIG. 2B is a diagram showing a CAT657 nucleotide sequence containing 657 nucleotides. The CAT257 nucleotide sequence containing 257 nucleotides in the CAT 657 nucleotide is yellow, the CAT357 nucleotide sequence containing 357 nucleotides is yellow + gray, and the CAT557 nucleotide sequence containing 557 nucleotides is yellow + gray + dark green. Respectively. RNase E cleavage sites were shown in red.
Fig. 3 is a diagram showing mRNA level and protein expression level of BmoF1 in Escherichia coli and bioconversion of ricinoleic acid using BmoF1 enzyme.
Figure 3 A is a Bmof1 of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD recombinant E. coli BL21 (DE3) - 3'UTR native ( lane 1) and Bmof1 - 3 ' Lt; RTI ID = 0.0 > UTR hilD (lane 2). & Lt; / RTI > Recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native and recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR hilD And the level of ihfB mRNA was used as a control.
B of FIG. 3 shows the results obtained from the wild-type Escherichia coli BL21 (DE3) (lane WS and WI), recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native (
Figure 3C shows recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR native (left panel), pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD expressing recombinant Escherichia coli BL21 DE3) (lower panel), showing the conversion of whole cell biosyntheses from ricinoleic acid to an ester. The experiment was performed three times and the error bars were expressed as standard deviations. The symbols are respectively ricinoleic acid (?), 12-ketooleic acid (?), Ester (11) and 11-hydroxyundec-9-enoic acid ).
FIG. 4 is a diagram showing the number of RNase E cleavage sites of a 3'UTR CAT mutant inserted with a CAT nucleotide sequence containing 257 to 657 nucleotides. The BmoF1 gene contains 5 RNase E, 15 CAT257, 18 CAT357, 26 CAT557, and CAT657 (the same as the CAT sequence without partial deletion). In addition, there are 19 hilD sequences and 10 RNase E cleavage sites in the existing UTR of the MO16 gene.
5 is an analysis of BmoF1-3'UTR CAT mRNA level and protein expression level in recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants (CAT257, CAT357, CAT557, CAT657).
FIG. 5A is a graph showing the level of BmoF1-3'UTR CAT mRNA in the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT mutant. Samples recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native (lane 1), recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -257 (lane 2), recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b- BmoF1-3'UTR CAT -357 (lane 3), recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -557 (lane 4) , and recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -657 (lane 5). The mRNA level of ihfB was used as a control.
Figure 5B shows SDS-PAGE (upper panel) and Western blot (lower panel) analysis of the BmoF1-3'UTR CAT water soluble fraction in recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants to be. Samples recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native (lane 1), E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -257 (lane 2), recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1 3'UTR CAT- 357 (lane 3), recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT-557 (lane 4), and recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT-657 (lane 5), and Lane M represents a marker.
FIG. 5C is an SDS-PAGE (upper panel) analysis of the BmoF1-3'UTR CAT insoluble fraction in recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants. Samples recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native (lane 1), recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -257 (lane 2), E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1 -3'UTR CAT-357 (lane 3) , E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -557 (lane 4), and E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -657 (lane 5) was used, and Lane M represents a marker.
6 is a diagram showing biotransformation from ricinoleic acid to an ester using a mutant of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT .
Figure 6 A to C of the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native , Figure 6 is a recombinant E. coli B BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT -257, Figure 6 is a recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT- 357 , FIG. 6D shows recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT-557 and FIG. 6E shows recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b- BtoF 3'UTR CAT- 657 , showing biotransformation from ricinoleic acid to an ester. Experiments were performed three times and error bars were expressed as standard deviations. The symbols are respectively ricinoleic acid (?), 12-ketooleic acid (?), Ester (11) and 11-hydroxyundec-9-enoic acid ).
7 is a graph showing the relationship between the length of the CAT sequence (3'UTR CAT ) inserted in the 3'UTR and the initial bioconversion activity with the number of RNase E cleavage sites.
7A is a diagram showing the relationship between the length of the CAT sequence inserted in the 3'UTR and the initial organism conversion rate. Was calculated on the basis of the concentration of the product measured every 30 minutes (t = 0.5h) by GC / MS. The zero of the X-axis contains five RNase E cleavage sites and is a pNAP-binding site that expresses pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR native Indicates the initial bioconversion rate of recombinant E. coli BL21 (DE3).
FIG. 7B is a graph showing the relationship between the number of RNase E cleavage sites in the CAT sequence inserted in the 3'UTR and the initial bioconversion activity. 5 on the X-axis shows the initial bioconversion activity of recombinant E. coli BL21 (DE3) containing five RNase E cleavage sites and expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR native . The red star shape contains 19 potential RNase E cleavage sites and represents the initial bioconversion activity of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD .
Figure 8 is a schematic diagram of sequence homology of MO16 and BmoF1 and SDS-PAGE analysis of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-MO16.
Figure 8A is a schematic diagram showing that the sequence homology of MO16 and BmoF1 is 23.3%. FIG. 8B shows SDS-PAGE analysis of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-MO16. Lane M is a marker, Lane S is a soluble fraction of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b-MO16, and Lane I is a soluble fraction of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLADuet-ADH and pET22b- Water-soluble fraction.
FIG. 9 is a graph showing the effect of the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) (lane WS and WI), recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native (
10 is a diagram showing the biological conversion process of ricinoleic acid. Ricinoleate converted to resan 1 is ω- hydroxy-undec-9-Ino acid (ω-hydroxyundec-9-enoic acid, 5) and n- heptanoic acid (n -heptanoic acid, 4) through a multi-step enzyme reaction do.
11 is a diagram showing the result of biotransformation from ricinoleic acid to an ester for recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT .
A in Fig. 11 is a recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native , 11 B of the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT -257, Figure 11 C is a recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3 ' UTR CAT -657, showing biotransformation from ricinoleic acid to an ester.
12 is a diagram showing the biological conversion process of linoleic acid. Linoleic acid (6) is converted to the number of steps through enzymatic reaction ω- hydroxy-9-deck also Ino acid (ω-hydroxydodec-9-enoic acid, 11) and the hexanoic acid n- (n -hexanoic acid, 10) .
13 is a diagram showing biotransformation from 13-hydroxyoleic acid to an ester to recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT .
C of FIG. 13 A is a recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native, B is a recombinant E. coli BL21 (DE3) in Fig. 13 pET22b-MO16-3'UTR CAT -257, Figure 13 is a recombinant E. coli BL21 (DE3) is a diagram showing the result of a biotransformation using an ester in the pET22b-MO16-3'UTR CAT -657, 13- hydroxy oleic acid. Experiments were performed three times and error bars were expressed as standard deviations. Symbols are 13-hydroxyoleic acid (?), 13-ketooleic acid,?, Ester, and 11-hydroxydodec-9-enoic acid, ▲).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예Example 1. One. hilDhilD 염기서열을 이용한 대장균에서 단백질 In E. coli using the nucleotide sequence, BmoF1의Of BmoF1 수용성 발현 Aqueous expression
원하는 다양한 화합물의 케토그룹에 인접한 탄소 골격으로 위치특이적인 산소삽입하여 산화반응을 촉매한다고 알려진 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106의 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)인 BmoF1는 대장균 균주에서 수용성 형태로 발현하기 어렵다(도 1). BmoF1, a BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase) of Pseudomonas fluorescens DSM 50106, known to catalyze an oxidation reaction by inserting a position-specific oxygen into the carbon skeleton adjacent to a keto group of various compounds desired, is expressed in a soluble form in E. coli strain (Fig. 1).
최근 연구에 따르면, 대장균에서 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) hilD mRNA의 안정성은 14개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 310개의 뉴클레오티드로 구성된 3'UTR(3'untranslated reigion)의 유무에 의해 현저하게 영향받음이 보고되었다(도 2의 A). 예를 들어, 3'UTR의 제거는 hilD mRNA 수준을 증가시키고 이에 의하여, 대장균에서 유전자 발현은 강화된다.According to a recent study, the stability of Salmonella enterica hilD mRNA in E. coli was significantly affected by the presence of a 3 'untranslated reong consisting of 310 nucleotides containing 14 RNase E cleavage sites (Fig. 2A). For example, removal of the 3'UTR increases hilD mRNA levels, thereby enhancing gene expression in E. coli.
본 발명에서는 상기와 같은 3'UTR 엔지니어링을 통해 BmoF1 mRNA 안정성의 변화가 세포질에서 새롭게 합성되는 BmoF1 폴리펩타이드의 국소농도(local concentration)에 영향을 줄 수 있고, 이에 의해 BmoF1 수용성 단백질의 발현이 증가하는지 알아보고자, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In the present invention, the 3'UTR engineering as described above can affect the local concentration of the BmoF1 polypeptide newly synthesized in the cytoplasm by the change in BmoF1 mRNA stability, thereby increasing the expression of the BmoF1 water soluble protein To investigate, the following experiment was carried out.
실시예Example 1.1: 1.1: 3'UTR으로By 3'UTR hilDhilD 염기서열의 삽입( Insertion of base sequences ( hilDhilD 3'UTR3'UTR , , 3'UTR3'UTR hilDhilD )에 )on 따른 Following BmoF1 mRNA 수준 분석BmoF1 mRNA level analysis
실시예Example 1.1.1: 1.1.1: hilDhilD 염기서열의 유전자 Nucleotide sequence gene 클로닝Cloning
hilD 염기서열을 BmoF1 유전자의 3'UTR에 삽입하기 위하여, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) hilD mRNA는 코스모진 텍에서 합성하였고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로써 hilD_F(5'-AAGCTTCATTTTTTGTATCTGTCACTTAAG-3', 서열번호 1) 및 hilD_R(5'-CTCGAGAATAAAATGCCGGCCTTAATCC-3', 서열번호 2)을 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시켜 hilD 염기서열(서열번호 17)을 분리하였다. 상기 증폭된 hilD 서열 단편은 BmoF1 유전자의 3'UTR에 해당하고 pET22b-BmoF1의 HindIII-XhoI의 제한효소부위에 삽입하여 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 제조하였다. In order to insert the hilD nucleotide sequence into the 3 'UTR of BmoF1 gene, Salmonella enterica hilD mRNA was synthesized in COSMOJINTECH and PCR was carried out using hilD_F (5'-AAGCTTCATTTTTTGTATCTGTCACTTAAG-3 ', SEQ ID NO: 1) and hilD_R (5'-CTCGAGAATAAAATGCCGGCCTTAATCC-3', SEQ ID NO: 2) as a forward primer and reverse primer And amplified through PCR (reaction) to separate the hilD nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17). The amplified hilD sequence fragment corresponds to the 3'UTR of the BmoF1 gene and inserted into the HindIII-XhoI restriction enzyme site of pET22b- BmoF1 to prepare E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR hilD .
실시예Example 1.1.2: RNA 추출 및 1.1.2: RNA extraction and 역전사Reverse transcription PCRPCR (reverse transcription reverse transcription PCRPCR )에 따른 mRNA 수준 분석Analysis of mRNA levels according to
상기 제조된 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 의 BmoF1-3'UTR hilD mRNA 수준을 확인하기 위하여, 상기 대장균을 키운 세포를 이용하여 RNA 추출 및 역전사 PCR을 수행하여 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 의 BmoF1-3'UTR hilD mRNA 수준을 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative mRNA 수준과 비교분석하였다. In order to confirm the BmoF1-3'UTR hilD mRNA level of the E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD prepared above, RNA extraction and reverse transcription PCR were performed using the E. coli-grown cells to obtain E. coli BL21 (DE3 ) pET-BmoF1-3'UTR the BmoF1-3'UTR hilD hilD mRNA levels were compared with E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native BmoF1-3'UTR native mRNA levels.
먼저, 정지기상의 배양 세포로부터 얻은 1 mL 분주는 5분 동안 13,000 rpm, 4oC로 원심분리하였고 상기 원심분리한 것은 RNeasy 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA는 50 ㎕의 RNase-free water에 현탁시켰고, 상기 현탁시킨 용액의 RNA 농도는 ND-1000 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 확인하였다.First, the 1 mL aliquot obtained from the incubated cells on the stationary phase was centrifuged at 13,000 rpm and 4 ° C for 5 minutes. The centrifuged extract was extracted with the RNeasy extraction kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions . The extracted total RNA was suspended in 50 μl of RNase-free water, and the RNA concentration of the suspended solution was confirmed by ND-1000 spectrophotometer.
역전사 중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)은 제조자의 지시에 따라서 HiPi™ One-step 5X RT-PCR 프리믹스를 사용하여, 10 nmol의 RNA 주형 및 5 pmol의 프라이머는 RT-PCR 프리믹스 튜브에 혼합하고 RNase-프리 증류수(distilled water)를 20 ㎕까지 될 때까지 첨가하였다. The reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed using a HiPi ™ One-step 5X RT-PCR primer according to the manufacturer's instructions, and 10 nmol RNA template and 5 pmol primers were RT- PCR premix tube and RNase-free distilled water was added until it was up to 20 [mu] l.
RT-PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다.The RT-PCR reaction was performed as follows.
cDNA 합성은 30분 동안 42℃에서 1 사이클을 수행하였고 94℃로 5분 동안 두었다. 증폭은 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃ 및 45초 동안 72℃로 50 사이클을 수행하였다. BmoF1에 해당하는 부분을 증폭하기 위한 프라이머 서열은 5'-ATGAATGCCCACAGTGATTCCATCGACATCGCCATCATCGGTTCGGGTTTTGCCG-3'(정방향 프라이머, 서열번호 3) 및 5'-TGAGAGGCTGCCTTCTGCCGTGGAGTGGGGCGCCGTGGCCGGACGGGGCGGCGCA-3' (역방향 프라이머, 서열번호 4)이었다. 대조군 유전자인 ihfB 증폭을 위한 PCR 프라이머 서열은 5'-ATGACCAAGTCAGAATTGATAGAAAGACTTGCCACCCAGCAATCGCACATTCCCG-3' (정방향 프라이머, 서열번호 5) 및 5'-TTAACCGTAAATATTGGCGCGATCGCGCAGTTCTTTACCAGGTTTAAAGTGAGGA-3' (역방향 프라이머, 서열번호 6)이었다. 상기 프라이머로 RT-PCR를 수행하여 얻어진 PCR 생성물은 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해서 분석하였다. The cDNA synthesis was carried out for 30 minutes at 42 DEG C for 1 cycle and at 94 DEG C for 5 minutes. Amplification was carried out at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 45 seconds. The primer sequence for amplifying the portion corresponding to BmoF1 was 5'-ATGAATGCCCACAGTGATTCCATCGACATCGCCATCATCGGTTCGGGTTTTGGTTCGGGTTTTGCCG-3 '(forward primer, SEQ ID NO: 3) and 5'-TGAGAGGCTGCCTTCTGCCGTGGAGTGGGGCGCCGTGGCCGGACGGGGCGGCGCA-3' (reverse primer, SEQ ID NO: 4). The PCR primer sequence for ihfB amplification as a control gene was 5'-ATGACCAAGTCAGAATTGATAGAAAGACTTGCCACCCAGCAATCGCACATTCCCG-3 '(forward primer, SEQ ID NO: 5) and 5'-TTAACCGTAAATATTGGCGCGATCGCGCAGTTCTTTACCAGGTTTAAAGTGAGGA-3' (reverse primer, SEQ ID NO: 6). RT-PCR was performed with the above primers PCR products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis.
그 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 의 BmoF1-3'UTR hilD mRNA 수준은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative mRNA 수준보다 약간 낮아짐을 확인하였다(도 3의 A).As a result, the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD BmoF1-3'UTR hilD mRNA level of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native BmoF1-3'UTR native mRNA levels of (FIG. 3, A).
이를 통해, 대장균에서 3'UTR로 삽입된, RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열에 의해 mRNA 안정성에 영향을 주는 것을 알 수 있었다.Thus, it was found that the hilD nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site inserted into the 3 'UTR in E. coli influences mRNA stability.
실시예Example 1.2: 1.2: 3'UTR으로By 3'UTR hilDhilD 염기서열의 삽입( Insertion of base sequences ( hilDhilD 3'UTR3'UTR , , 3'UTR3'UTR hilDhilD )에 따른 단백질 발현 수준 분석Analysis of protein expression level
상기 제조된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 의 BmoF1-3'UTR hilD 단백질 발현 수준을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 수행하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 의 BmoF1-3'UTR hilD 단백질 발현 수준을 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative 단백질 발현 수준과 비교분석하였다. In order to confirm the BmoF1-3'UTR hilD protein expression level of the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD prepared above , SDS-PAGE analysis was performed to obtain recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3 "BmoF1-3'UTR hilD the protein level of expression of UTR hilD E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1 - were compared with the native 3'UTR protein expression level - BmoF1 the native 3'UTR.
먼저, 단백질 샘플을 제작하기 위하여, 세포들은 25%의 진폭으로, 각각 초음파 처리할 때마다 5초 동안 정지시키면서 15초 동안 6번 초음파 처리하였다. 수용성 단백질 용해물(lysate)은 4℃에서 10분 동안 13000 rpm으로 원심분리를 수행하여 분리하였고, 나머지 비수용성 단백질에 대해서는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)을 수용성 단백질 용해물과 동일한 양을 첨가하였다. 상기 수용성 및 비수용성 단백질은 열로 변성시켰고(100 ℃에서 5 분) 각각 5X 샘플 완충용액(엘피스 바이오텍, 한국)으로 혼합하였다. 상기 방법으로 제조된 수용성 및 비수용성 단백질 샘플은 10% 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔(10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 로딩한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하였다. First, to produce a protein sample, the cells were sonicated 6 times for 15 seconds with an amplitude of 25% and a 5 second hold for each ultrasonic treatment. The soluble protein lysate was separated by centrifugation at 13000 rpm for 10 min at 4 ° C and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) for the remaining non-water soluble protein was added to the same volume as the soluble protein lysate Was added. The water-soluble and non-water-soluble proteins were heat-denatured (at 5O < 0 > C for 5 min) and mixed with 5X sample buffer (Elpis Biotech, Korea). The water-soluble and non-water-soluble protein samples prepared by the above method were loaded on a 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel) and then loaded onto Coomassie Brilliant Blue R-250 Lt; / RTI >
그 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD 의 BmoF1-3'UTR hilD 총 단백질 발현수준은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative 총 단백질 발현수준보다 낮았고, 반면에 BmoF1-3'UTR hilD 수용성 단백질 발현수준은 BmoF1-3'UTRnative의 수용성 단백질 발현수준보다 현저히 높음을 확인하였다(도 3의 B). As a result, the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR hilD BmoF1-3'UTR hilD Total protein expression levels of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1 - BmoF1 the native 3'UTR - lower than the native 3'UTR total protein expression levels, while the BmoF1-3'UTR hilD The water-soluble protein expression level was found to be significantly higher than the water - soluble protein expression level of BmoF1-3'UTR native (Fig. 3B).
이를 통해, 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열을 삽입하여 BmoF1 mRNA 안정성을 감소시키고 이를 통해서 BmoF1의 수용성 단백질 발현수준은 개선됨을 알 수 있다.In this way, the hilD nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site was inserted into the 3'UTR to reduce the BmoF1 mRNA stability, thereby improving the level of soluble protein expression of BmoF1.
실시예Example 1.3: 1.3: 3'UTR으로By 3'UTR hilDhilD 염기서열의 삽입( Insertion of base sequences ( hilDhilD 3'UTR3'UTR , , 3'UTR3'UTR hilDhilD )에 따른 BmoF1의 촉매활성 비교분석Comparison of catalytic activity of BmoF1 according to
실시예Example 1.3.1: 1.3.1: 전세포Whole cell 생물전환 Biotransformation
BmoF1는 세포 외에서 순수형태로 분리하기에 너무 불안정하다고 알려져 있으므로, BmoF1의 촉매활성은 전세포 생물전환을 통해 확인하고자 하였다. BmoF1 발현 뿐만 아니라 BmoF1의 기질을 만드는 Micrococcus luteus NCTC2665의 장쇄 2차 알코올 분해효소(long chain secondary alcohol dehydrogenase)를 발현시키는 재조합 대장균(E. Coli) BL21(DE3) pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 제조하여 전세포 생물전환을 수행하였다. Since BmoF1 is known to be too unstable to separate out of the extracellular form, the catalytic activity of BmoF1 is to be verified by whole cell biotransformation. Micrococcus , which not only expresses BmoF1 but also produces a substrate for BmoF1 long-chain secondary alcohol-decomposing enzyme luteus NCTC2665 recombinant E. coli expressing the (long chain secondary alcohol dehydrogenase) ( E. Coli) BL21 (DE3) to prepare a pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD a whole cell biotransformation Respectively.
먼저, 재조합 세포는 30℃에서 리젠버그 배지에서 배양하였고, 0.6의 OD600에서 0.1 mM IPTG로 타겟 유전자의 발현을 유도하였다. 그 후에, 배양온도는 20℃로 감소시켰다. 배양이 정지기에 도달할 때, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus NCTC2665, M. luteus NCTC2665) 유래 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase, ADH)와 슈도모나스 플루오레센스 DSM50106(Pseudomonas fluorescens DSM50106, P. fluorescens DSM 50106) 유래 BVMO를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3) pCOLADuet-ADH 및 pET22b-BmoF1를 4℃에서 20분 동안 3500 g로 원심분리하여 수득하였고, 50 mM Tris-HC 완충용액(pH 8.0)에 7.2 g 건조 세포(dry cell)/L를 현탁하였다. 생물전환은 5 mM의 리시놀레산 및 0.5 g/L 트윈 80을 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)에 첨가하여 시작하였고 진탕배양기에서 35℃, 200 rpm으로 수행하였다.First, the recombinant cells were cultured in a regenberg medium at 30 ° C, and expression of the target gene was induced with 0.1 mM IPTG at 0.6 OD600. Thereafter, the incubation temperature was reduced to 20 占 폚. When the culture reaches the stopper, the alcohol dehydrogenase (ADH) derived from Micrococcus luteus NCTC 2666, M. luteus NCTC 2666 and the Pseudomonas fluorescens DSM 50106 ( P. fluorescens DSM 50106) derived from Pseudomonas fluorescens DSM 50106 Recombinant E. coli BL21 (DE3) pCOLADuet-ADH expressing BVMO and pET22b-BmoF1 were obtained by centrifugation at 3500 g for 20 min at 4 ° C and 7.2 g dried cells (pH 8.0) in 50 mM Tris-HC buffer dry cell) / L was suspended. Bioconversion was initiated by the addition of 5 mM ricinoleic acid and 0.5 g / L Tween 80 to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and run in shaking incubator at 35 ° C and 200 rpm.
실시예Example 1.3.2: 1.3.2: GCGC /MS 분석/ MS analysis
상기 실시예 1.3.1과 같은 방법으로 전세포 생물전환을 수행한 후 상기 전세포 생물전환에 따른 반응물의 변화를 확인하기 위하여, GC/MS 분석을 수행하였다.GC / MS analysis was carried out in order to confirm the change of the reactants upon conversion of whole cell biotransformation after the whole cell biotransformation was performed in the same manner as in Example 1.3.1.
반응배지는 내부표준으로써, 5 g/L 팔미트산을 포함하는 에틸 아세테이트의 3배에 해당하는 양을 혼합하였다. 유기상(organic phase)은 격렬히 볼텍싱한 후 수득하였고 그리고 나서 N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아마이드(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, TMS)로 유도체화하였다. TMS 유도체는 이온 트랩 메스 검출기(ion trap mass detector)가 연결된 Thermo Ultra Trace GC system을 사용하여 분석하였다. 유도체는 비극성 캐필러리 컬럼(capillary column, 30-m 길이, 0.25-㎛ 필름 두께, HP-5MS, Aligent)에서 분리하였다. 일직선의 온도 변화는 다음과 같이 프로그램하였다(90℃, 5℃/min to 280℃). 주입 포트(injection port) 온도는 230℃였다. The reaction medium was mixed with an amount corresponding to three times that of ethyl acetate containing 5 g / L palmitic acid as an internal standard. The organic phase was obtained after vigorous vortexing and then derivatized with N-methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (TMS). The TMS derivative was analyzed using a Thermo Ultra Trace GC system connected to an ion trap mass detector. The derivatives were separated on a non-polar capillary column (30-m length, 0.25-μm film thickness, HP-5MS, Aligent). Linear temperature changes were programmed as follows (90 ° C, 5 ° C / min to 280 ° C). The injection port temperature was 230 ° C.
질량스펙트럼(Mass spectra)은 70 eV로 전자 충격 이온화(electron impact ionization)에 의해 얻었다. 스캔 스펙트럼은 100 내지 600m/z의 범위내에서 얻었다. 선택 이온 모니터링(Selected ion monitoring, SIM)은 반응 생성물의 탐지 및 단편화를 위해 사용하였다. 반응 기질 및 생성물의 농도는 실험실에서 분리된 생성물 또는 상업적으로 이용가능한 생성물을 사용하여 결정된 보정 곡선(calibration curves)에 근거하여 결정하였다. The mass spectra were obtained by electron impact ionization at 70 eV. The scan spectrum was obtained within the range of 100 to 600 m / z. Selected ion monitoring (SIM) was used for detection and fragmentation of reaction products. The concentrations of the reaction substrates and products were determined based on calibration curves determined using the products isolated in the laboratory or commercially available products.
실시예Example 1.3.3: 전세포 생물전환을 통한 촉매활성 비교분석 1.3.3: Comparative analysis of catalytic activity through whole cell bioconversion
상기 실시예 1.3.1 및 1.3.2에서 개시된 방법으로 전세포 생물전환을 수행하고 얻어진 생성물을 GC/MS로 측정하여, pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 촉매활성 결과를 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)과 비교분석하였다.The whole cell biotransformation was carried out by the methods described in Examples 1.3.1 and 1.3.2 above and the obtained product was measured by GC / MS to obtain recombinant Escherichia coli BL21 (pCOLA-ADH) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD DE3) were compared with recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR native .
리시놀레산을 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 정지기의 재조합 대장균 BL21(DE3)의 배양 배지에 추가하면, pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)에서 상기 BmoF1에 의한 에스터 생성물은 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)보다 상당히 높았다(도 3의 C).Adding ricinoleate in the culture medium of recombinant E. coli BL21 (DE3) of the stopper expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD, expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD In the recombinant E. coli BL21 (DE3), the ester product by BmoF1 was significantly higher than the recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR native (FIG.
상기 결과를 통해, 3'UTR로 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열의 삽입이 BmoF1 mRNA의 안정성을 감소시키고, 이는 결국 BmoF1 총 단백질 발현 수준을 감소시키지만, 대장균(BL21(DE3))에서 BmoF1 수용성 단백질의 발현을 증가시켜 BmoF1 효소의 수용성 발현과 생물전환 활성에도 영향을 미침을 알 수 있었다. The above results show that insertion of the hilD nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site at the 3'UTR reduces the stability of BmoF1 mRNA, which in turn decreases the level of BmoF1 total protein expression, but BmoF1 (SEQ ID NO: It was found that the expression of water - soluble protein was increased and the water - soluble expression and bioconversion activity of BmoF1 enzyme were also influenced.
실시예Example 2. CAT 염기서열을 이용한 단백질 2. Protein using CAT nucleotide sequence BmoF1의Of BmoF1 수용성 발현 Aqueous expression
상기 실시예 1을 통해서 RNase E 절단부위를 포함하는 hilD 염기서열을 3'UTR로 삽입을 통해서 BmoF1 mRNA의 안정성을 감소시키고 이를 통해 대장균에서 BmoF1의 수용성 단백질의 발현을 증가시킴을 확인하였으므로, 이와 같은 3'UTR 엔지니어링의 영향을 보다 더 조사하기 위하여, 대장균의 클로람페니콜 아세틸전달효소(Chloramphenicol acetyltransferase)를 암호화하고, 28개로 추정되는 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT 염기서열(도 2의 B)을 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.As a result of inserting the hilD nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site into the 3'UTR through the Example 1, it was confirmed that the stability of BmoF1 mRNA was decreased and the expression of the soluble protein of BmoF1 was increased in E. coli. To further investigate the effect of 3'UTR engineering, E. coli chloramphenicol acetyltransferase was coded and a CAT nucleotide sequence (Figure 2B) containing an RNase E cleavage site estimated at 28 The following experiment was carried out.
실시예Example 2.1: 2.1: 3'UTR로By 3'UTR CAT 염기서열의 삽입( Insertion of CAT nucleotide sequence ( 3'UTR3'UTR CATCAT )에 따른 )In accordance mRNAmRNA 수준 및 단백질 발현수준 분석 Level and Protein Expression Level Analysis
실시예Example 2.1.1: CAT 염기서열의 유전자 2.1.1: gene of CAT nucleotide sequence 클로닝Cloning
CAT 염기서열은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로써 CAT657_F(5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT-3', 서열번호 7) 및 CAT657_R(5'-CTCGAGGGCATCAGCACCTTGTCG-3', 서열번호 8) 프라이머로 PCR을 통해 pACYCDuet-1 벡터로부터 증폭하였다. 상기 증폭된 CAT 염기서열 단편은 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT657 염기서열(서열번호 21)이고, BmoF1 유전자의 3'UTR에 pET22b-BmoF1의 HindIII-XhoI 제한효소부위로 삽입하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT를 제작하였다.The CAT nucleotide sequence was amplified from pACYCDuet-1 vector by PCR using CAT657_F (5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT-3 ', SEQ ID NO: 7) and CAT657_R (5'-CTCGAGGGCATCAGCACCTTGTCG-3', SEQ ID NO: 8) primers as forward primer and reverse primer Respectively. The amplified CAT nucleotide sequence is a CAT657 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 21) containing 657 nucleotides and is inserted into the HindIII-XhoI restriction enzyme site of pET22b-BmoF1 in the 3'UTR of the BmoF1 gene to obtain recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT was prepared.
실시예Example 2.2.2: 2.2.2: mRNAmRNA 수준 및 단백질 발현 수준 분석 Level and Protein Expression Level Analysis
상기 제조된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT657의 BmoF1-3'UTRCAT657 mRNA 수준을 확인하기 위하여, 상기 재조합 대장균을 키운 세포를 이용하여 RNA 추출 및 역전사 PCR을 수행하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657의 BmoF1-3'UTRCAT657 mRNA 수준을 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative mRNA 수준과 비교분석하였다. In order to confirm the BmoF1-3'UTR CAT657 mRNA level of the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT657 prepared above, RNA extraction and reverse transcription PCR were carried out using the cells cultured with the recombinant E. coli, the BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR BmoF1-3'UTR CAT657 mRNA levels of CAT657 were compared with BmoF1-3'UTR native mRNA level of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native .
mRNA 수준 분석을 위한 RNA 추출 및 역전사 PCR은 실시예 1.1.2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. RNA extraction and reverse transcription for mRNA level analysis was performed in the same manner as described in Example 1.1.2.
그 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657의 BmoF1-3'UTRCAT657 mRNA 수준은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative mRNA 수준과 비교하여 약 절반 정도까지 감소하는 것을 확인하였다(도 5의 A). As a result, the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR BmoF1-3'UTR CAT657 mRNA levels of CAT657 is recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native BmoF1-3'UTR native mRNA levels of (A in FIG. 5).
이를 통해, RNase E 절단부위를 포함하는 CAT 염기서열이 mRNA 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하였고, 상기 서열이 활성화된 3'UTR로 사용될 수 있음을 보여주었다.This confirmed that the CAT nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site affected mRNA stability and showed that the sequence could be used as an activated 3'UTR.
다음으로, 상기 제조된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657의 BmoF1-3'UTRCAT657 단백질 발현 수준을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블럿을 수행하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657의 BmoF1-3'UTRCAT657 단백질 발현 수준을 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative 단백질 발현수준과 비교분석하였다. Next, the thus-prepared recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR CAT657 BmoF1-3'UTR CAT657 In order to confirm the protein expression level, SDS-PAGE analysis and Western blot were performed to determine the BmoF1-3'UTR CAT657 (SEQ ID NO : 1) of recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR CAT657 The protein expression levels of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1 - were compared with the native 3'UTR protein expression level - BmoF1 the native 3'UTR.
SDS-PAGE 분석은 실시예 1.2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였고 웨스턴 블럿은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. SDS-PAGE analysis was performed in the same manner as described in Example 1.2, and western blotting was performed in the following manner.
멤브레인은 5% 탈지유 및 0.5% 트윈 20을 포함하는 PBS에서 밤새도록 차단시켰고, PBST-5% 탈지유에서 1:5000로 희석시킨 항-His 일차 항체(IG Therapy Co., Ltd. Tokyo, Japan)를 함께 1 시간 동안 상온에서 배양시켰다. 0.5% 트윈 20을 포함한 PBS을 이용하여 세척한 후, 멤브레인은 PBST-5% 탈지유로 1:500으로 희석한, 알카라인 포스파타아제가 컨쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgG(Abcam, Cambridge, UK)과 함께 상온에서 1시간 동안 배양시켰다. 블럿은 BCIP/NBT solution substrate(Abcam)을 이용하여 발생시켰다(develop). The membranes were blocked overnight in PBS containing 5% skim milk and 0.5
SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657의 BmoF1-3'UTRCAT657 총 단백질 발현 수준은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative의 BmoF1-3'UTRnative 총 단백질 발현 수준보다 낮았지만(도 5의 C) BmoF1-3'UTRCAT657의 수용성 단백질 발현 수준은 BmoF1-3'UTRnative의 수용성 단백질 발현 수준은 현저히 높아졌다(도 5의 B).After performing SDS-PAGE and Western blot, BmoF1-3'UTR CAT657 total protein level of expression of the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR CAT657 is recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1 - 3'UTR total native 3'UTR natatjiman than protein expression level (C in Fig. 5) water-soluble protein level of expression of BmoF1-3'UTR CAT657 is BmoF1 - - BmoF1 of native soluble protein level of expression of native 3'UTR was significantly increased (Fig. 5 B).
이를 통해, RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT 염기서열의 삽입에 의해 BmoF1 mRNA 안정성의 감소되고 BmoF1의 수용성 단백질 발현이 증가함을 알 수 있었다.This suggests that the insertion of the CAT nucleotide sequence containing the RNase E cleavage site reduced the stability of BmoF1 mRNA and increased the expression of soluble proteins of BmoF1.
실시예Example 2.2: 2.2: 3'UTR로By 3'UTR 삽입되는 Inserted RNaseRNase E 절단 부위의 수에 따른 E Depending on the number of cutting sites mRNAmRNA 수준 및 단백질 발현수준 분석 Level and Protein Expression Level Analysis
실시예Example 2.2.1: 유전자 2.2.1: gene 클로닝Cloning
CAT 염기서열에서 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 mRNA 안정성과 연관이 있는지 알아보기 위하여, 3'UTR에 삽입되는 CAT 염기서열(3'UTRCAT)의 부분적인 삭제를 포함하는 변이체들의 세트를 제작하였다. To determine if the number of RNase E cleavage sites present in the CAT nucleotide sequence is associated with mRNA stability, a set of variants including partial deletion of the CAT nucleotide sequence (3'UTR CAT ) inserted in the 3'UTR was constructed.
3'UTR에 삽입되는 CAT 염기서열의 부분 삭제된 단편들은 정방향 프라이머 CAT_F 및 다른 역방향 프라이머 CAT257_R(5'-CTCGAGCGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3', 서열번호 9), CAT357_R(5'-CTCGAGTCCCATATCACCAGCTCA-3', 서열번호 10) 및 CAT557_R(5'-CTCGAGTATGTGTAGAAACTGCCG-3', 서열번호 11)를 이용하여 PCR을 통해 CAT 257(서열번호 18), CAT357(서열번호 19), CAT557(서열번호 20) 염기서열을 증폭하였고, pET22b-BmoF1로 삽입하였다.The partially deleted fragments of the CAT nucleotide sequence inserted in the 3'UTR were amplified by PCR using the forward primer CAT_F and the other reverse primer CAT257_R (5'-CTCGAGCGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3 ', SEQ ID NO: 9), CAT357_R (5'-CTCGAGTCCCATATCACCAGCTCA- CAT357 (SEQ ID NO: 19) and CAT557 (SEQ ID NO: 20) were amplified by PCR using CAT557_R (5'-CTCGAGTATGTGTAGAAACTGCCG-3 ', SEQ ID NO: -BmoF1. ≪ / RTI >
그 결과, CAT 염기서열의 5'영역에서부터 257, 357, 557개의 뉴클레오티드를 포함하는 변이체(3'UTR에 삽입되는 CAT 염기서열의 부분 삭제된 단편들)는 CAT 서열의 길이가 증가할수록(뉴클레오티드의 수가 증가할수록) 단계적으로 RNase E 절단 부위가 증가함을 보여주었다(도 2의 B 및 도 4).As a result, mutants containing 257, 357, and 557 nucleotides from the 5 'region of the CAT nucleotide sequence (partially deleted fragments of the CAT nucleotide sequence inserted into the 3' UTR) increased in length as the length of the CAT sequence increased The number of RNase E cleavage sites was increased stepwise (as shown in FIG. 2B and FIG. 4).
실시예Example 2.2.2: 2.2.2: mRNAmRNA 수준 및 단백질 발현수준 분석 Level and Protein Expression Level Analysis
CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수에 따른 mRNA 안정성의 변화를 확인하기 위하여, RNA 추출 및 역전사 PCR을 수행하여 RNase E 절단 부위 수가 다른 CAT 서열을 포함하는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준을 비교분석하였다. In order to confirm the change of mRNA stability according to the number of RNase E cleavage sites present in the CAT nucleotide sequence, RNA extraction and reverse transcription PCR were carried out to obtain recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1 having different numbers of RNase E cleavage sites -3'UTR CAT The BmoF1-3'UTR CAT mRNA levels of mutants were compared and analyzed.
그 결과, CAT 염기서열의 길이가 257개의 뉴클레오티드에서부터 657개의 뉴클레오티드로 증가함에 따라, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준은 점차 감소하였다(도 5의 A)As a result, as the length of the CAT nucleotide sequence increased from 257 nucleotides to 657 nucleotides, the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT The BmoF1-3'UTR CAT mRNA levels of mutants gradually decreased (Fig. 5A)
이를 통해, CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 mRNA 안정성이 감소함을 알 수 있었다. These results indicate that the mRNA stability decreases as the number of RNase E cleavage sites in the CAT nucleotide sequence increases.
다음으로, CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수에 따른 단백질 발현 수준의 변화를 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 수행하여 RNase E 절단 부위 수가 다른 CAT 염기서열을 포함하는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT 단백질 발현 수준을 비교분석하였다. Next, in order to confirm the change of the protein expression level according to the number of RNase E cleavage sites existing in the CAT nucleotide sequence, SDS-PAGE analysis was carried out to obtain recombinant Escherichia coli BL21 (DE3 ) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants were compared and analyzed for their BmoF1-3'UTR CAT protein expression levels.
그 결과, CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위의 수가 증가함에 따라, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT 총 단백질 발현 수준은 감소하였지만(도 5의 C), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT 수용성 단백질 발현 수준은 증가하였다(도 5의 B).As a result, as the number of RNase E cleavage sites in the CAT nucleotide sequence increased, recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT The BmoF1-3'UTR CAT total protein expression level of the mutants was decreased (FIG. 5C), but the recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT The level of BmoF1-3'UTR CAT- soluble protein expression of mutants increased (FIG. 5B).
이를 통해, CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록, 수용성 단백질의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다. As a result, the number of RNase E cleavage sites in the CAT nucleotide sequence increased and the expression of soluble protein increased.
실시예Example 2.3: 2.3: RNaseRNase E 절단 부위 수의 따른 E Depending on the number of cutting sites 생촉매Biocatalyst 활성의 변화 비교 분석 Comparative analysis of changes in activity
대장균에서 BmoF1의 생촉매 활성에 있어서 3'UTR에 삽입되는 RNase E 절단 부위 수에 따른 효과를 알아보기 위하여, pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-UTRnative, 또는 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-UTRCAT 변이체들을 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3) 변이체는 리시놀레산과 반응시켜 전세포 생물전환을 수행하였다. PCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-UTR native , or pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-UTR CATs , respectively, in order to investigate the effect of the number of RNase E cleavage sites inserted in the 3'UTR on the biocatalytic activity of BmoF1 in Escherichia coli The recombinant E. coli BL21 (DE3) variants expressing the mutants were subjected to whole cell biotransformation by reaction with ricinoleic acid.
반응 조건은 도 3의 C에서 보여준 조건과 동일하였고, 전세포 생물전환 및 반응 생성물 측정은 실시예 1.3.1 및 1.3.2에서 보여주는 방법과 동일하게 수행하였다. The reaction conditions were the same as those shown in Fig. 3C, and whole cell biotransformation and measurement of reaction products were carried out in the same manner as in Examples 1.3.1 and 1.3.2.
그 결과, pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRCAT257/, pET22b-BmoF1-3'UTRCAT357/pET22b-BmoF1-3'UTRCAT557/pET22b-BmoF1-3'UTRCAT657 변이체들을 발현하는 재조합 대장균 BL21 (DE3)의 리시놀레산에 대한 생물전환 활성은 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21 (DE3)과 비교하여 순차적으로 생물전환 활성이 증가함을 보여주었다(도 6 및 표 1). As a result, recombinant Escherichia coli BL21 expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR CAT257 /, pET22b-BmoF1-3'UTR CAT357 / pET22b-BmoF1-3'UTR CAT557 / pET22b-BmoF1-3'UTR CAT657 mutants (DE3) showed more bioconversion activity than that of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR native (Fig. 6 and Table 1).
(U g CDW-1) [b] Initial bioconversion activity
(U g CDW -1 ) [b]
(%) [c] Product yield (%)
(%) [c]
[a] 상대적인 mRNA 수준은 도 5에서 보여준 것과 같이 덴시토미터(densitometer)를 전기영동 결과로부터 측정하였다.[a] Relative mRNA levels were measured from the electrophoresis results as shown in FIG. 5 by a densitometer.
[b] 초기 생물전환 활성은 생성물 농도에 근거하여 계산하였고, 이는 GC/MS에 의해 30분 마다 측정하였으며, 모든 실험은 3번 수행하였다.[b] The initial bioconversion activity was calculated based on the product concentration, which was measured every 30 minutes by GC / MS, and all experiments were performed three times.
[c] 생성률은 기질 소모 및 생성물 농도를 근거로 하여 측정하였고 이는 GC/MS에 의해 측정하였고, 모든 실험은 3번 수행하였다. [c] production rate was measured based on substrate consumption and product concentration, which was measured by GC / MS and all experiments were performed three times.
또한, 30분마다 에스터(ester) 농도를 측정하여 에스터 생성물이 증가하는 것을 확인하여 초기 생물전환 활성과 RNase E 절단 부위의 수 사이에 매우 연관성이 있음을 확인하였다(도 7). 따라서, RNase E 절단 부위의 수가 증가할수록 초기 생물전환 활성이 증가함을 확인하였다. In addition, the ester concentration was measured every 30 minutes to confirm that the ester product was increased, and it was confirmed that there was a very high correlation between the initial bioconversion activity and the number of RNase E cleavage sites (FIG. 7). Therefore, it was confirmed that the initial bioconversion activity increased as the number of RNase E cleavage sites increased.
실시예 1.3에서도 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR hilD 를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)의 초기 생물전환 활성이 RNase E 절단 부위 수와 관련이 있음을 나타내고 있으므로, 상기 결과를 종합하여 볼 때, 3'UTR 서열보다 RNase E 절단 부위의 수가 생물전환 활성에 중요하고, BmoF1 수용성 단백질 발현 수준은 또한 3'UTR에서 RNase E 절단 부위의 수에 따라 달라지는 것으로 결론지을 수 있다. Also in Example 1.3, the initial bioconversion activity of recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pCOLA-ADH and pET22b-BmoF1-3'UTR hilD was shown to be related to the number of RNase E cleavage sites. , It can be concluded that the number of RNase E cleavage sites is more important for bioconversion activity than the 3'UTR sequence and that the level of BmoF1 soluble protein expression also depends on the number of RNase E cleavage sites in the 3'UTR.
실시예Example 3. CAT 염기서열을 이용한 3. Using the CAT nucleotide sequence RhodococcusRhodococcus jostiijostii RHA1RHA1 유래 origin BVMO의Of BVMO 수용성 발현 Aqueous expression
슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106의 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)인 BmoF1와 마찬가지로, 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO(즉, MO16, BmoF1과 서열 상동성: 23.3%, 도 8의 A)인 MO16는 대장균 세포에서 수용성 형태의 발현이 매우 어렵다(도 8의 B). 그러므로, 대장균에서 MO16의 수용성 단백질 발현에 있어서, 3'UTR에 CAT 서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수에 따른 효과를 알아보기 위하여, SDS-PAGE 분석 및 전세포 생물전환을 수행하였다. Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens Similar to BmoF1 as BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase) of DSM50106, Rhodococcus jostii MO16, which is RHA1-derived BVMO (i.e., MO16, sequence homology with BmoF1: 23.3%, Fig. 8A), is very difficult to express a soluble form in E. coli cells (Fig. Therefore, SDS-PAGE analysis and whole-cell biotransformation were performed to examine the effect of MOE 16 on the expression of water-soluble proteins of E. coli according to the number of RNase E cleavage sites present in the CAT sequence at 3'UTR.
실시예Example 3.1: 유전자 3.1: gene 클로닝Cloning
pET22b-MO16를 제작하기 위하여, 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii)의 MO16 유전자는 정방향 및 역방향 프라이머로써 MO16_F(5'-CATATGTCACACACCGAGACCGCCGCCGA-3', 서열번호 12) 및 MO16_R(5'-GGATCCCGGGCGGCTGAAGGTCATGGCGTCGTCC-3', 서열번호 13)로 PCR을 수행하여 pET-MO16 벡터부터 증폭시켰다. MO16_CAT 염기서열은 MO16_CAT657_F(5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT-3', 서열번호 14), 및 MO16_CAT657_R(5'-CTCGAGCGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3', 서열번호 15) 또는 MO16_CAT257_R(5'-CTCGAGCGCCCCCTGCCACTCATCG-3', 서열번호 16)를 사용하여 pACYCDuet-1 벡터로부터 증폭시켰다. 상기 MO16_CAT 서열 단편은 pET22b-MO16의 HindIII-XhoI 제한효소 부위로 서브클로닝하여 각각 pET22b-MO16-3'UTRCAT657 및 pET22b-MO16-3'UTRCAT257을 제작하였다. 모든 제작된 플라스미드 서열은 마크로젠(서울, 한국)을 통해 확인하였다.To make pET22b-MO16, The MO16 gene of Rhodococcus jostii was subjected to PCR using MO16_F (5'-CATATGTCACACACCGAGACCGCCGCCGA-3 ', SEQ ID NO: 12) and MO16_R (5'-GGATCCCGGGCGGCTGAAGGTCATGGCGTCGTCC-3', SEQ ID NO: 13) as forward and reverse primers And amplified from the pET-MO16 vector. The MO16_CAT nucleotide sequence is represented by SEQ ID NO: 16), MO16_CAT657_F (5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAAATCACTGGATATA-3 ', SEQ ID NO: Lt; / RTI > vector. The MO16_CAT sequence fragment was subcloned into the HindIII-XhoI restriction enzyme site of pET22b- MO16 to construct pET22b-MO16-3'UTR CAT657 and pET22b-MO16-3'UTR CAT257 , respectively. All prepared plasmid sequences were confirmed by Macrogen (Seoul, Korea).
실시예Example 3.2: 단백질 발현 수준 분석 3.2: Analysis of protein expression level
CAT 서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수에 따른 단백질 발현 수준을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 수행하여, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT257 및 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT657의 단백질 발현 수준을 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative의 MO16-3'UTRnative 단백질 발현 수준과 비교하였다.(DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT257 and recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b (DE3) were performed by SDS-PAGE analysis to confirm protein expression levels according to the number of RNase E cleavage sites present in the CAT sequence -MO16-3'UTR CAT657 was compared to the level of MO16-3'UTR native protein expression of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native .
그 결과, MO16-3'UTRCAT657은 대장균에서 어떠한 발현도 나타나지 않았고, SDS-PAGE 분석에서 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT657의 MO16-3'UTRCAT657 단백질 발현도 거의 나타나지 않음을 확인하였다(도 9). 대조적으로, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT257의 MO16-3'UTRCAT257 단백질 발현은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative의 MO16-3'UTRnative 단백질 발현 수준과 비교하여 주로 수용성 단백질 발현이 나타나는 것을 확인하였다(도 9).As a result, MO16-3'UTR CAT657 showed no expression in E. coli and showed almost no expression of MO16-3'UTR CAT657 protein of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT657 on SDS-PAGE analysis (Fig. 9). In contrast, recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT257 MO16-3'UTR CAT257 protein expression recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native MO16-3'UTR native protein expressed in the (Fig. 9). As shown in Fig.
이를 통해, MO16 효소에서도 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수를 이용하여 수용성 단백질의 발현을 개선시킬 수 있음을 알 수 있었고, 또한, 3'UTR로 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위의 삽입에 따른 MO16의 수용성 단백질 발현은 BVMO 수용성 단백질의 발현보다 민감하게 작용하는 것을 알 수 있었다. It was also confirmed that the expression of water-soluble protein can be improved by using the number of RNase E cleavage sites present in the CAT nucleotide sequence in the MO16 enzyme. Further, the 3'UTR can be used to detect the RNase E cleavage site in the CAT nucleotide sequence The water soluble protein expression of MO16 was more sensitive than the BVMO soluble protein expression.
실시예Example 3.3: 전세포 생물전환 3.3: Whole cell biotransformation
대장균에서 BmoF1의 생촉매 활성에 있어서 3'UTR에 삽입되는 RNase E 절단 부위 수에 따른 효과를 알아보기 위하여, pET22b-MO16-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3), pET22b-MO16-3'UTRCAT257를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3) 및 pET22b-MO16-3'UTRCAT657를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)는 리시놀레산과 반응시켜 생물전환을 수행하였다.In order to investigate the effect of the number of RNase E cleavage sites inserted in the 3'UTR in the biocatalytic activity of BmoF1 in Escherichia coli, recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing pET22b-MO16-3'UTR native , pET22b-MO16- Recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing 3'UTR CAT257 and recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing pET22b-MO16-3'UTR CAT657 were reacted with ricinoleic acid to effect bioconversion.
전세포 생물전환 및 반응 생성물 측정은 실시예 1.3.1 및 1.3.2에서 보여주는 방법과 동일하게 수영하였다. Whole cell biotransformation and reaction product measurements were swim in the same manner as in Examples 1.3.1 and 1.3.2.
그 결과, pET22b-MO16-3'UTRCAT657를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)는 배양배지에서 MO16에 대한 반응 생성물 중 에스터(ester)의 생성이 없고(도 10의 3에 해당하는 화합물), 12-케토올레산(도 10의 2에 해당하는 화합물)이 축적되는 것을 통해서 MO16가 거의 대장균에서 발현되지 않음을 확인하였다(도 11).As a result, recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) expressing pET22b-MO16-3'UTR CAT657 had no ester formation in the reaction product with respect to MO16 in the culture medium (compound corresponding to 3 in Fig. 10), 12 -Ketooleic acid (compound corresponding to 2 in FIG. 10) accumulated in the culture medium, MO16 was hardly expressed in E. coli (FIG. 11).
그러나, pET22b-MO16-3'UTRCAT257를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)는 pET22b-MO16-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)보다 35% 더 높은 비율로 에스터 생성물을 형성함을 통해서 MO16의 촉매활성이 개선됨을 확인하였다(도 11).However, recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pET22b-MO16-3'UTR CAT257 formed an ester product at a 35% higher rate than recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pET22b-MO16-3'UTR native To improve the catalytic activity of MO16 (FIG. 11).
이러한 경향은 13-히드록시올레산의 전세포 생물전환에서도 동일하게 관찰되었다 (도 12 및 13).This tendency was also observed in the conversion of 13-hydroxy oleic acid to whole cell biology (FIGS. 12 and 13).
따라서, 상기 결과들을 통해 상기 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위의 삽입 및 RNase E 절단 부위 수의 조정을 통해 MO16 수용성 단백질을 증가시켜 미생물에서 MO16 효소의 수용성 발현과 생물전환 활성을 개선시킴을 알 수 있었다. Therefore, through the above results, the MO16 water-soluble protein was increased through the insertion of the RNase E cleavage site and the number of RNase E cleavage sites present in the CAT nucleotide sequence, thereby improving the water-soluble expression and biotransformation activity of the MO16 enzyme in the microorganism Could know.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> 3'UTR engineering to improve soluble expression of foreign proteins in microbial cells <130> KPA151267-KR <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hilD_F primer <400> 1 aagcttcatt ttttgtatct gtcacttaag 30 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hilD_R primer <400> 2 ctcgagaata aaatgccggc cttaatcc 28 <210> 3 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BmoF1 forward primer <400> 3 atgaatgccc acagtgattc catcgacatc gccatcatcg gttcgggttt tgccg 55 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BmoF1 reverse primer <400> 4 tgagaggctg ccttctgccg tggagtgggg cgccgtggcc ggacggggcg gcgca 55 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ihfB forward primer <400> 5 atgaccaagt cagaattgat agaaagactt gccacccagc aatcgcacat tcccg 55 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ihfB reverse primer <400> 6 ttaaccgtaa atattggcgc gatcgcgcag ttctttacca ggtttaaagt gagga 55 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT657_F primer <400> 7 aagcttatgg agaaaaaaat cactggatat 30 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT657_R primer <400> 8 ctcgagggca tcagcacctt gtcg 24 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT257_R primer <400> 9 ctcgagcgcc ccgccctgcc actcatcg 28 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT357_R primer <400> 10 ctcgagtccc atatcaccag ctca 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT557_R primer <400> 11 ctcgagtatg tgtagaaact gccg 24 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16 forward primer <400> 12 catatgtcac acaccgagac cgccgccga 29 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16 reverse primer <400> 13 ggatcccggg cggctgaagg tcatggcgtc gtcc 34 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16_CAT657_F primer <400> 14 aagcttatgg agaaaaaaat cactggatat 30 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16_CAT657_R primer <400> 15 ctcgagcgcc ccgccctgcc actcatcg 28 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16_CAT257_R primer <400> 16 ctcgagcgcc ccctgccact catcg 25 <210> 17 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant hilD sequence <400> 17 cattttttgt atctgtcact taagtaaaga tttttattaa aattgtaata atttaaaatt 60 cagactgcgc attaacacgc tctatcagga tgggaggcta ttcaatatca ttgttctgtc 120 cggaagacag cttatactga tatctatggt aatttaaagt aaggctgatt atataacacg 180 atttttgtga acttgtcatc gctatgatga ctggtaaaac gatattgcct tattcacagc 240 gtaagaattc gtccagatga cactatctcc ttccggcttt aaccctgtgg attaaggccg 300 gcattttatt 310 <210> 18 <211> 257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant CAT257 sequence <400> 18 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggagttcc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatggga 257 <210> 19 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant CAT357 sequence <400> 19 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggagttcc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacata 357 <210> 20 <211> 557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant CAT557 sequence <400> 20 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggagttcc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcactatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540 gacaaggtgc tgatgcc 557 <210> 21 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant CAT657 sequence <400> 21 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggagttcc gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcactatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtctgtga tggcttccat 600 gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcg 657 <110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> 3'UTR engineering to improve soluble expression of foreign proteins in microbial cells <130> KPA151267-KR <160> 21 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hilD_F primer <400> 1 aagcttcatt ttttgtatct gtcacttaag 30 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hilD_R primer <400> 2 ctcgagaata aaatgccggc cttaatcc 28 <210> 3 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BmoF1 forward primer <400> 3 atgaatgccc acagtgattc catcgacatc gccatcatcg gttcgggttt tgccg 55 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BmoF1 reverse primer <400> 4 tgagaggctg ccttctgccg tggagtgggg cgccgtggcc ggacggggcg gcgca 55 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IhFB forward primer <400> 5 atgaccaagt cagaattgat agaaagactt gccacccagc aatcgcacat tcccg 55 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ihfB reverse primer <400> 6 ttaaccgtaa atattggcgc gatcgcgcag ttctttacca ggtttaaagt gagga 55 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT657_F primer <400> 7 aagcttatgg agaaaaaaat cactggatat 30 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT657_R primer <400> 8 ctcgagggca tcagcacctt gtcg 24 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT257_R primer <400> 9 ctcgagcgcc ccgccctgcc actcatcg 28 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT357_R primer <400> 10 ctcgagtccc atatcaccag ctca 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAT557_R primer <400> 11 ctcgagtatg tgtagaaact gccg 24 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16 forward primer <400> 12 catatgtcac acaccgagac cgccgccga 29 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16 reverse primer <400> 13 ggatcccggg cggctgaagg tcatggcgtc gtcc 34 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16_CAT657_F primer <400> 14 aagcttatgg agaaaaaaat cactggatat 30 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16_CAT657_R primer <400> 15 ctcgagcgcc ccgccctgcc actcatcg 28 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MO16_CAT257_R primer <400> 16 ctcgagcgcc ccctgccact catcg 25 <210> 17 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant hilD sequence <400> 17 cattttttgt atctgtcact taagtaaaga tttttattaa aattgtaata atttaaaatt 60 cagactgcgc attaacacgc tctatcagga tgggaggcta ttcaatatca ttgttctgtc 120 cggaagacag cttatactga tatctatggt aatttaaagt 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Claims (13)
(b) 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고,
상기 UTR의 염기서열 내에는 mRNA의 안정성을 저하시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 것을 특징으로 하는, 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법.
(a) obtaining a polynucleotide bound to an untranslated region (UTR) that increases mRNA stability at the 3 'end of a gene encoding a desired water-soluble protein; And
(b) expressing the polynucleotide,
Wherein a base sequence including an RNase E cleavage site which lowers the stability of mRNA is inserted into the nucleotide sequence of the UTR to increase the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the desired protein.
[Claim 2] The protein according to claim 1, wherein when the desired water-soluble protein is over-expressed, the over-expressed protein co-aggregates in the cell to form an inclusion body, whereby the water-soluble expression ratio of the desired protein is 50% In method.
The method according to claim 1, wherein the desired water-soluble protein is Pseudomonas fluorescens DSM 50106 or Rhodococcus jostii RHA1-derived BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase).
4. The method of claim 3 wherein the Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens DSM50106 derived BVMO is BmoF1.
4. The method according to claim 3, wherein the Rhodococcus jostii ) Wherein the RHA1 derived BVMO is MO16.
2. The method according to claim 1, wherein the water-soluble expression ratio of the target protein with respect to the total expression level of the target protein is changed by adjusting the number of RNase E cleavage sites.
[Claim 7] The method according to claim 6, wherein when BmoF1 is expressed, the water-soluble expression ratio with respect to the total expression level of the desired protein is increased as the number of RNase E cleavage sites increases.
2. The method of claim 1, wherein the number of RNase E cleavage sites inserted into the UTR is between 10 and 100.
The method according to claim 1, wherein the base sequence comprising the RNase E cleavage site is all or part of a hilD base sequence, CAT base sequence.
10. The method of claim 9, wherein the number of RNase E cleavage sites included in the hilD base sequence is from 12 to 16.
10. The method according to claim 9, wherein the number of RNase E cleavage sites included in the CAT nucleotide sequence is 13-30.
A multicloning site into which the gene can be introduced so that the UTR (untranslated region) -binding polynucleotide that increases the mRNA stability at the 3 'end of the gene encoding the desired water soluble protein can be expressed, An increase in the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the target protein, including the UTR (untranslated region), which is inserted at the 3 'end of the multiple cloning site and inserted with a nucleotide sequence containing an RNase E cleavage site which lowers the stability of mRNA Expression vector.
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