KR20170082888A

KR20170082888A - 3-히드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산방법

Info

Publication number: KR20170082888A
Application number: KR1020160002175A
Authority: KR
Inventors: 정규열; 임현규; 박성훈; 설은희
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2016-01-07
Publication date: 2017-07-17
Also published as: KR101760340B1

Abstract

본 발명은 3-히드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 합성 5’UTR을 이용하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산의 생합성 경로에 관여하는 유전자의 발현량을 정밀하게 조절함으로써 탄소 흐름을 최적화하고 3-히드록시프로피온산의 생산성을 향상시킨 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 관한 것이다.

Description

3-히드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산방법 {3-HYDROXYPROPIONIC ACID-PRODUCING RECOMBINANT MICROORGANISM AND METHOD OF PRODUCING 3-HYDROXYPROPIONIC ACID USING THE SAME}

3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)은 아크릴산, 아크릴아마이드, 프로피오락톤 등 다양한 플랫폼 화합물로 전환이 가능한 화합물이다. 특히, 3-HP는 2004년 US DOE에 의하여 바이오매스로부터 전환이 가능한 중요 고부가가치 화합물로 선정된 바 있으며, 18조원에 달하는 아크릴산 시장 가치만 보더라도 3-HP의 중요성을 알 수 있다.

3-HP는 화학적으로 합성될 수 있으나, 비싼 초기 물질과 반응 중간에 생성되는 독성 물질 등이 관여되기 때문에 친환경적이라고 보기 어렵다. 이에 비하여 미생물을 활용한 바이오 공정을 통한 3-HP 생합성은 친환경적이기 때문에 최근 많은 각광을 받고 있다. 자연적으로 Klebsiella pneumoniae , Lactobacillus sp ., Chloroflexus aurantiacus 등과 같은 미생물들은 다양한 생합성 경로로 중간물질 혹은 종단물질로서 3-HP를 생산한다. 2000년대 초부터 이들 미생물에서 생합성 경로에 관여하는 유전자의 도입을 통한 재조합 대장균의 개발이 시작되었다. 2008년 K. pneumoniae로부터 B-12 의존적 GDHt(glycerol dehydratase), ALDH(aldehyde dehydrase)의 발현을 통하여 바이오디젤 산업에서 부산물로 발생되는 글리세롤로부터 0.58 g/L의 3-HP 생산 가능성이 발표되었으며 (Raj et al.), C. aurantiacus로부터 malonyl-coA를 전환하여 3-HP를 생산할 수 있는 효소 도입을 통하여 0.19 g/L의 3-HP 생산 가능성이 발표된바 있다(Rathnasigh et al.) 또한, 근래에 들어 beta-alanine 경로를 통하여 3-HP 생산을 보인 경우도 있었다.

미생물을 통한 다양한 3-HP의 생합성 방법 중, 글리세롤로부터 B12 의존적 GDHt 및 ALDH를 이용한 방법이 가장 많이 연구되고 있다. 이 반응은 고가의 B12를 첨가하여야 한다는 단점이 존재하지만, 단순한 반응 과정과 이에 따른 고수율, 고생산성을 확보할 수 있다. 이 때문에, GDHt 및 ALDH를 이용한 경로가 발견된 이후, 효소공학, 글리세롤 대사경로 개발, 고밀도 세포배양 등의 방법을 통하여 3-HP 생산을 증대시킬 수 있는 다양한 방법이 발표되었다.

그러나 글리세롤로부터 B12 의존적 생합성 경로로 3-HP를 생합성 할 때, GDHt와 ALDH의 효소 활성의 불균형으로 인한 중간 생성 물질인 3-HPA의 축적이 문제가 되고 있다. 상기 3-HPA가 축적될 경우 세포에 독성을 나타낼 뿐만 아니라 효소 자체의 활성도 저해되기 때문에 결과적으로 3-HP의 생산성이 확연히 떨어지게 된다. 따라서 3-HPA와 같은 세포 독성 물질이 생성되지 않고, 3-HP 생합성 경로의 균형이 달성된 고생산 균주를 개발하는 것이 매우 필요하다.

이에, 본 발명자들은 합성 5’UTR을 이용하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산의 생합성 경로에 관여하는 유전자의 발현량을 정밀하게 조절함으로써 탄소 흐름을 최적화하고 3-히드록시프로피온산의 생산성을 향상시킨 재조합 미생물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 3-히드록시프로피온산 생산용 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 합성 5’UTR 및 GDHt를 코딩하는 dhaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP)의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 합성 5’UTR을 이용하여 3-HP의 생합성에 관여하는 유전자인 dhaB의 발현량을 정밀하게 조절할 경우, 종래 문제가 되던 대사적 부담을 겪지 않고 탄소 흐름의 균형적 최대화가 가능하며 3-HP의 생산성이 극대화된 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 또한, 상기 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 3-HP를 높은 효율로 생산할 수 있는바, 3-HP가 활용되는 다양한 산업분야에서 광범위하게 적용할 수 있다.

도 1은 미생물에서 글리세롤로부터 3-HP로의 생합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 이용된 재조합 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 선행연구에서 보고된 균주(DUBGK) 및 본 발명에서 제조한 3-HP 생합성 회로에 관여하는 유전자들을 모두 과발현시킨 균주(HGL_BK1)의 효소 활성 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 선행연구에서 보고된 균주(DUBGK, A) 및 본 발명에서 제조한 3-HP 생합성 회로에 관여하는 유전자들을 모두 과발현시킨 균주(HGL_BK1, B)의 시간대별 3-HP 생산 프로파일을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에서 제조한 HGL_BK1 내지 HGL_BK5 균주에서 DhaB1 효소의 발현량을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에서 제조한 HGL_BK1 내지 HGL_BK5 균주에서 DhaB1 효소의 활성도를 상대적인 값으로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에서 제조한 HGL_BK1 내지 HGL_BK5 균주에서 3-HP의 생산량을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에서 설계한 다양한 서열의 합성 5’UTR 변이체를 이용하여 20만 이하로 dhaB1 유전자의 발현량을 조절한 재조합 미생물(1 내지 5)에서 3-HP의 생산량을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에서 제조한 ackA -pta 또는 yqhD 유전자가 제거된 균주(HGL_DBK4) 및 상기 유전자를 제거하지 않은 균주(HGL_BK4)에서 3-HP 및 부산물의 생산량을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에서 제조한 HGL_DBK4 균주를 30시간 동안 Fed-batch 발효하였을 때, 대사 산물 프로파일을 나타낸 도이다.

본 발명의 구체적인 내용을 기술하기에 앞서 본 명세서에 사용된 용어에 대하여 의미를 서술한다.

본 발명에 있어서, 용어 '유전자' 또는 '(폴리)뉴클레오타이드'는 특정 단백질을 발현(암호화)시키는 핵산 단편(핵산 분자)을 지칭한다. 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.

본 발명의 유전자는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 코딩하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 유전자가 코딩하는 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-히드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

상기 "목적 유전자의 발현"이란 목적 유전자를 발현시켜 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서 목적 유전자를 발현하는 방법은 상기 목적 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체(숙주세포)를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법이며, 이를 통해 상기 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종산물을 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환에는 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE (diethylaminoethyl)-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 합성 5' UTR(untranslated region) 및 GDHt(glycerol dehydratase)를 코딩하는 dhaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “3-히드록시프로피온산(3-HP; C₃H₆O₃ - MW 90.08)”은 25℃에서 pKa 4.51인 약산으로서, 구조적으로 탄소 3개를 가지는 비카이랄 유기산으로 젖산(2-히드록시프로피온산)과 이성질체이다. 상기 3-HP는 비결정질이고, 시럽과 같은 연한 노란색을 띠며, 비중은 1.25, 굴절률은 1.45이다.

상기 3-HP는 여러 화학공정에 사용되는 중요한 합성 중간체로, 1,3-프로판디올 (C₃H₈O₂ - MW 76.09), 아크릴산(C₃H₄O₂ - MW 72.06), 메틸 아크릴에이트 (C₄H₆O₂ - MW 86.09), 아크릴아미드 (C₃H₅NO - MW 71.08), 에틸 3-히드록시프로피온산 (C₅H₁₀O₃ - MW 118.13), 말로닉산 (C₃H₄O₄ - MW 104.06), 프로피온락톤 (C₃H₄O₂ - MW 72.06), 아크로니트릴 (C₃H₄N - MW 53.06) 등을 생산할 수 있는 원료로 사용된다. 상기 3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여 화학적 공정을 통해 생산될 수 있고, 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될 수도 있다.

보다 구체적으로, 생물학적으로 여러 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있으며, 첫 번째 단계는 글리세롤 디하이드라타제(glycerol dehydratase)에 의해 글리세롤을 탈수화시켜 중간물질인 3-히드록시프로피온알데히드 생산 반응을 촉매시키는 반응이며, 두 번째 단계는 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase)에 의해 3-히드록시프로피온알데히드가 탈수소화되는 반응이다. 구체적인 3-HP의 생합성 과정을 도 1에 나타내었다. 3-HP의 생산에 있어서, 두 단계의 대사적 활성도가 균형이 맞지 않아 중간 산물인 3-HPA가 세포 내에 축적될 경우 세포 성장이 저해되고, 3-HP의 생산성이 떨어지게 된다. 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고, 3-HP 생합성 회로의 최적화를 달성하기 위하여, 대사 공학적인 접근 방법을 통하여 3-HPA의 축적을 방지하고 3-HP의 생산성을 높이기 위한 새로운 방법을 제공하고자 하였으며, 탄소 흐름의 균형적 최대화 달성을 위해 글리세롤로부터 3-HPA로의 전환에 관계하는 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자의 발현량을 정밀하게 조절하고자 하였다.

본 발명에 있어서, “5’UTR(untranslated region)”은 코딩 서열의 업스트림에 위치하며, 단백질로 번역되지 않은 mRNA 부분을 의미하는 것으로, 일반적으로, 전사개시 부위와 시작 코돈 사이에 있는 영역으로 정의된다.

본 발명에 있어서, “합성 5’UTR”은 야생형 5’UTR과는 다른 서열로 이루어진 비-천연 5’UTR을 의미한다.

본 발명에 있어서, “글리세롤 디하이드라타제(glycerol dehydratase, GDHt)”는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드로 전환하는 임의의 효소로서, 비타민 B12 의존성과 비의존성 모두가 포함된다. 상기 GDHt는 dhaB1 유전자가 코딩하는 단백질인 대단위체(Large subunit 또는 α subunit), dhaB2 유전자가 코딩하는 단백질인 중단위체(Medium subunit 또는 β subunit), dhaB3 유전자가 코딩하는 단백질인 소단위체(Small subunit 또는 γ subunit)로 이루어져 있다.

상기 dhaB 유전자는 클랩시엘라 속(Klebsiella sp .), 시트로박터 속(Citrobacter sp .), 클로스트리디움 속(Clostridium sp .), 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주 등에서 유래할 수 있으며, 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 유래할 수 있고, 동일한 효소 활성을 나타내는 한 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 dhaB 유전자는 서열번호 63의 염기서열로 표시되는 dhaB1 유전자, 서열번호 64의 염기서열로 표시되는 dhaB2 유전자 및 서열번호 65의 염기서열로 표시되는 dhaB3 유전자로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 합성 5’UTR의 도입을 통해 GDHt(glycerol dehydratase)를 코딩하는 dhaB 유전자의 발현량을 서로 다르게 조절하였다. 합성 5’UTR은 이의 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 목적 유전자에 연결될 수 있다. 이때 합성 5’UTR은 서로 다른 서열로 이루어진 2 종 이상인 것이 바람직하며, 제1 합성 5’UTR은 dhaB 유전자 중 어느 하나의 예측 발현량(a. u.)이 1 초과 20만 이하, 바람직하게는 10만 이하가 되게 설계한 것이고, 제2 합성 5’UTR은 dhaB 유전자 중 나머지 두 개의 예측 발현량을 최대화, 바람직하게는 50만 이상이 되도록 설계한 것을 특징으로 한다.

구체적인 모식도는 다음과 같다.

보다 구체적으로, 유전자 1이 dhaB1 유전자일 때, dhaB1 유전자의 발현량을 dhaB2 또는 dhaB3 유전자에 비해 상대적으로 낮게, 바람직하게는 예측 발현량(a. u.)이 1 초과 20만 이하가 되게 설계한 제1 합성 5’UTR은 바람직하게는 서열번호 1 내지 13 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이때, dhaB2 또는 dhaB3 유전자의 발현량을 최대화, 바람직하게는 50만 이상이 되도록 설계한 제2 합성 5’UTR은 유전자 2가 dhaB2 유전자 및 유전자 3이 dhaB3 유전자일 때는 바람직하게는 서열번호 39 내지 46 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있으며, 유전자 2가 dhaB3 유전자 및 유전자 3이 dhaB2 유전자일 때는 서열번호 47 내지 54 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

또한, 유전자 1이 dhaB2 유전자일 때, dhaB2 유전자의 발현량을 dhaB1 또는 dhaB3 유전자에 비해 상대적으로 낮게, 바람직하게는 예측 발현량(a. u.)이 1 초과 20만 이하가 되게 설계한 제1 합성 5’UTR은 바람직하게는 서열번호 14 내지 21 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이때, dhaB1 또는 dhaB3 유전자의 발현량을 최대화, 바람직하게는 50만 이상이 되도록 설계한 제2 합성 5’UTR은 유전자 2가 dhaB1 유전자 및 유전자 3이 dhaB3 유전자일 때는 바람직하게는 서열번호 30 내지 38 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있으며, 유전자 2가 dhaB3 유전자 및 유전자 3이 dhaB1 유전자일 때는 서열번호 47 내지 54 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

또한, 유전자 1이 dhaB3 유전자일 때, dhaB3 유전자의 발현량을 dhaB1 또는 dhaB2 유전자에 비해 상대적으로 낮게, 바람직하게는 예측 발현량(a. u.)이 1 초과 20만 이하가 되게 설계한 제1 합성 5’UTR은 바람직하게는 서열번호 22 내지 29 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이때, dhaB1 또는 dhaB2 유전자의 발현량을 최대화, 바람직하게는 50만 이상이 되도록 설계한 제2 합성 5’UTR은 유전자 2가 dhaB1 유전자 및 유전자 3이 dhaB2 유전자일 때는 바람직하게는 서열번호 30 내지 38중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있으며, 유전자 2가 dhaB2 유전자 및 유전자 3이 dhaB1 유전자일 때는 서열번호 39 내지 46 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

이상 제1 합성 5’UTR의 구체적인 서열 및 예측 발현량을 하기 표 1에, 제2 합성 5’UTR의 구체적인 서열 및 예측 발현량을 표 2에 나타내었다.

이상 제시한 합성 5’UTR의 서열은 뒤에 위치하는 유전자의 발현량을 조절하기 위하여 설계된 것으로, 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 그 구체적인 서열 범위에 본 발명의 내용이 한정되는 것이 아니며, 본 발명에서 제시하는 특정 발현량을 나타내기 위해 설계된 것이라면 본 발명의 범위에 속하는 것이 자명하다.

본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터를 모두 포함한다. 예를 들어, 발현 벡터로 pUC19, pSTV28, pBBR1MCS, pBluscriptII, pBAD, pTrc99A, pET, pACYC184 및 pBR322 계열 등의 당업계에 상용화된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 글리세롤 디하이드라타제 재활성화인자 (GDHt reactivase)를 코딩하는 gdrAB 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “글리세롤 디하이드라타제 재활성화인자 (GDHt reactivase)”는 글리세롤 디하이드라타제의 촉매 반응 시 상기 촉매의 활성을 유지시키는 작용을 한다. 상기 gdrAB 유전자는 클랩시엘라 속(Klebsiella sp .), 시트로박터 속(Citrobacter sp .), 클로스트리디움 속(Clostridium sp .), 살모넬라 속(Salmonella sp .) 균주 등에서 유래할 수 있으며, 바람직하게는 글리세롤 디하이드라타제를 제공하는 미생물과 동종의 미생물이고, 동일한 효소 활성을 나타내는 한 이에 제한되지 않는다.

상기 gdrAB 유전자는 바람직하게는, 서열번호 66의 염기서열로 표시되는 gdrA 유전자 및 서열번호 67의 염기서열로 표시되는 gdrB 유전자로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 gdrAB 유전자는 재조합 벡터 내에서 별도의 프로모터나 합성 5’UTR에 의해 발현될 수 있으며, 바람직하게는 앞서 개시한 dhaB 유전자 중 유전자 2 및 3의 뒤에 위치함으로써 최대 발현량을 낼 수 있게 설계된 제2 합성 5’UTR에 의해 발현량이 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase, ALDH)를 코딩하는 kgsadh 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase, ALDH)”는3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 역할을 한다. 상기 kgsadh 유전자는 대장균 또는 슈도모나스 애루지노사 등에서 유래될 수 있으며, 바람직하게는 아조스피릴룸 브라실렌스 (Azospirillum brasilense)이고, 이에 제한되지 않는다.

상기 kgsadh 유전자는 바람직하게는, 서열번호 68의 염기서열로 표시될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 kgsadh 유전자는 발현량을 최대화, 바람직하게는 50만 이상이 되도록 설계한 합성 5’UTR에 의해 발현량이 조절되는 것이 바람직하며, 상기 합성 5’UTR은 바람직하게는 서열번호 55 내지 62 중 1종 이상의 염기서열로 구성될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

상기 합성 5’UTR의 구체적인 서열 및 예측 발현량을 하기 표 3에 나타내었다.

본 발명에 따른 유전자 조합은 해당 조합을 구성하는 각 유전자들을 하나의 벡터에 삽입시키거나, 2 종류 이상의 벡터에 나누어 삽입시킬 수 있다. 이때 하나의 벡터에 둘 이상의 유전자들이 삽입되는 경우, 유전자들은 항시성 프로모터(예를 들어, constitutive lac promoter), 작동유전자 (operator), 터미네이터 등을 각각 가진 형태로 삽입될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 dhaB 유전자와 gdrAB 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 kgsadh 유전자를 포함하는 재조합 벡터 등 2 종류 이상의 벡터를 이용하여 재조합 미생물을 제조하였다.

본 발명에 따른 재조합 미생물은 3-HP의 생합성 과정에서 생산되는 부산물을 최소화하기 위하며, 아세테이트를 생산하도록 하는 ackA -pta 유전자 또는 1,3-PDO를 생산하도록 하는 yqhD 유전자가 제거된 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물의 제조에 사용 가능한 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등이고, 바람직하게는 대장균(E. coli), 바실러스 속(Bacillus sp .), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .), 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.), 로도박터 속(Rhodobacter sp.), 어위니아 속(Erwinia sp .) 등이며, 보다 바람직하게는 대장균이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 일 실시예에서는, 합성 5’UTR의 설계를 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생합성하는 첫 번째 단계에 관여하는 유전자 중 하나인 dhaB1 유전자의 예측 발현량을 20만 이하가 되게 하고, 첫 번째 단계에 관여하는 나머지 dhaB 유전자 및 gdrAB 유전자, 두 번째 단계에 관여하는 kgsadh 유전자의 발현량이 최대화되게 서로 다른 서열의 합성 5’UTR을 각 유전자에 연결함으로써 대사적 부담을 줄이고 탄소 흐름을 최대화한 재조합 미생물을 제조한 후, ackA -pta 유전자 및 yqhD 유전자를 제거함으로써 3-HP의 생산 효율을 더욱 높였다. 이때 첫 번째 단계에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 보통(moderate)의 복제수를 갖는 플라스미드를 통해 발현시키는 것이 바람직하며, 예를 들어 pACYC를 이용할 수 있고, 두 번째 단계에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 높은 복제수를 갖는 플라스미드를 통해 발현시키는 것이 바람직하며, 예를 들어 pUC를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP)의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양은 통상적으로 알려진 배양 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 재조합 미생물 및 이의 배양액으로부터 3-HP의 분리 및 회수는 해당 물질의 물리, 화학적 특성에 따라 적합한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출, HPLC 등을 이용할 수 있으며, 이들을 조합하여 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 3-HP 생산용 재조합 대장균의 제조

3-HP 생합성 회로의 탄소 흐름을 최적화하기 위하여, 3-HP 생합성 과정에 관여하는 두 단계를 담당하는 효소들을 코딩하는 유전자를 서로 다른 복제수를 갖는 플라스미드를 이용하여 발현하였다. 즉, 첫 번째 단계에 관여하는 효소는 보통의 복제수를 갖는 플라스미드인 pACYC(p15A origin 포함)를 통해 발현하였으며, 두 번째 단계에 관여하는 효소는 높은 복제수를 갖는 플라스미드 pUC(pMB1 origin 포함)를 통해 발현하였다.

먼저, ALDH(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 아조스피릴룸 브라실렌스 (Azospirillum brasilense) 유래의 kgsadh 유전자를 발현하기 위하여 pUC/K 플라스미드를 제작하였다. 이때, kgsadh 유전자의 발현량을 최대화하기 위하여, pUC/KGSADH 플라스미드에서 기존 발현 카세트를 tac 프로모터와 합성 5’UTR을 활용한 발현 카세트로 교체하였다. 합성 5’UTR의 경우 kgsadh 유전자의 발현량을 최대화 할 수 있게 설계한 것으로써, UTR Designer를 통하여 예측 발현량이 50만 이상이 되게 설계한 합성 5’UTR을 이용해야 하며, 그 예시로 표 3의 서열번호 55 내지 62 중 하나인 서열번호 55의 합성 5’UTR을 이용하였다. 이를 위해 pUC/KGADH 플라스미드를 주형으로 하고 pUC-F/pUC-B 프라이머 세트 또는 O-kgsadh-F1/F2/B 프라이머 세트를 이용하여 각각 플라스미드 또는 표적 유전자를 증폭한 후, SacI 및 HindIII 제한효소 서열을 이용한 클로닝을 통해 상기 플라스미드에 표적 유전자 부위를 삽입함으로써 최종적으로 pUC/K 플라스미드를 제작하였다.

다음으로, GDHt(glycerol dehydratase)를 코딩하고 있는 dhaB1 , dhaB2 , dhaB3 유전자와 GDHt 재활성화인자 (GDHt reactivase)를 코딩하고 있는 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) 유래의 gdrA , gdrB 유전자를 발현하기 위하여 pACYC_B0 플라스미드를 제작하였다. 이때, GDHt의 활성을 조절하기 위하여, GDHt를 구성하고 있는 서브유닛 중 하나인 dhaB1 유전자의 발현량을 정밀하게 조절하고, 나머지 서브유닛 유전자는 과발현하기 위해 별개의 프로모터 부위 및 합성 5’UTR을 갖게 제작하였다(제1 합성 5’UTR 및 제2 합성 5’UTR을 포함).

보다 구체적으로, pACYC_duet 플라스미드(Novagen)를 주형으로 하고 pACYC-F/B 프라이머 세트를 이용하여 플라스미드 부위를 증폭하였다. 상기 플라스미드에 dhaB2, dhaB3, gdrA , gdrB 유전자를 삽입하기 위하여, pDK7 (p15A)_DhaB123, gdrAB 플라스미드를 주형으로 이용하고, O-dhaB2-F1/F2/B 프라이머 세트를 이용하여 표적 유전자 부위를 증폭하였다. speI과 pacI 제한효소 서열을 이용한 클로닝을 통해 pACYC 플라스미드에 dhaB2 , dhaB3, gdrA , gdrB 유전자 부위를 삽입하여 pACYC_B0 플라스미드를 제작하였다. 이때, dhaB2 , dhaB3, gdrA , gdrB 유전자의 발현량을 최대화하기 위하여, 가장 앞에 위치하는 유전자인 dhaB2 유전자의 5’UTR 부위를 UTR Designer를 통하여 예측 발현량이 50만 이상이 되게 설계한 합성 5’UTR로 변경하였으며, 그 예시로 표 2의 서열번호 39 내지 46 중 하나인 서열번호 39의 합성 5’UTR을 이용하였다. dhaB2 , dhaB3, gdrA , gdrB의 순서에 따라 가장 앞에 위치하는 유전자에 맞춰 합성 5’UTR의 서열을 적절하게 변경해야 한다.

추가적으로 pACYC_B0 플라스미드 내에 dhaB1 유전자의 삽입을 위하여, pDK7 (p15A)_DhaB123, gdrAB 플라스미드를 주형으로 하고, O-dhaB1-F1/O-dhaB2-F2/O-dhaB1-B1/BO-dhaB1-B2 프라이머 세트를 이용하여 표적 유전자 부위를 증폭하였으며, speI 제한효소 서열을 이용한 클로닝을 통해 최종적으로 pACYC_B1 (dhab1-V1 포함) 플라스미드를 제작하였다. 한편, dhaB1 유전자 발현량을 조절하기 위하여, dhaB1 유전자의 5’UTR 부위를 UTR Designer를 통하여 예측 발현량에 따라 서로 다른 서열로 설계된 합성 5’UTR로 변경하였으며, 이를 위해 O-dhaB1-F1 프라이머 대신, O-dhaB1-F1-V2, V3, V4를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 클로닝을 통해 pACYC_B2(dhab1-V2 포함), pACYC_B3(dhab1-V3 포함), 및 pACYC_B4(dhab1-V4 포함) 플라스미드를 각각 제작하였다.

이상의 과정을 통해 구축된 2개의 플라스미드의 모식도를 도 2에 나타내었으며, 이를 산성 물질에 내성을 보이는 Escherichia coli W 균주(KCTC1039)에 형질전환하여, 재조합 대장균(HGL_BK1, HGL_BK2, HGL_BK3, HGL_BK4, HGL_BK5)을 제조하였다.

이상의 실험에서 사용한 Phusion DNA 폴리머라제(Polymerase)와 제한효소는 New England Biolabs에서, 배양액 제조를 위한 재료들은 BD Bioscience 및 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 또한, 이상의 실험에서 사용한 균주 및 플라스미드의 정보를 표 4에, PCR 증폭 시 사용한 프라이머의 서열을 표 5에, 본 발명에서 제작한 합성 5’UTR 서열 및 예측 발현량을 표 6에 나타내었다. 표 5에서 F는 정방향(Forward) 프라이머를, B는 역방향(Reverse) 프라이머를 의미하며, 밑줄로 표시한 부분은 클로닝을 위한 제한효소 부위를 의미한다. 표 6에서 붉은 색으로 표시한 부분은 리보좀 결합 부위를 의미한다.

이름	특징
균주
E. coli W	Acid tolerant strain
HGL_BK1	W/pACYC_B1/pUC_K
HGL_BK2	W/pACYC_B2/pUC_K
HGL_BK3	W/pACYC_B3/pUC_K
HGL_BK4	W/pACYC_B4/pUC_K
HGL_BK5	W/pACYC_B0/pUC_K
플라스미드
pUC_KGSADH	pMB1 ori, Kan^R, P_lac-kgsadh
pACYC_Duet	Expression vector; p15A ori, Cm^R
pACYC_B0	p15A ori, Cm^R, P_tac-SynUTR_dhaB2-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB
pACYC_B1	p15A ori, Cm^R, P_tac-SynUTR1_dhaB1-dhaB1- P_tac-SynUTR_dhaB2-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB
pACYC_B2	p15A ori, Cm^R, P_tac-SynUTR2_dhaB1-dhaB1- P_tac-SynUTR_dhaB2-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB
pACYC_B3	p15A ori, Cm^R, P_tac-SynUTR3_dhaB1-dhaB1- P_tac-SynUTR_dhaB2-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB
pACYC_B4	p15A ori, Cm^R, P_tac-SynUTR4_dhaB1-dhaB1- P_tac-SynUTR_dhaB2-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB
pUC/K	pMB1 ori, Kan^R, P_tac-SynUTR_kgsadh-kgsad h

이름	서열 (5'-3')
pACYC-F	caggatccgaattcgagctcg
pACYC-B	ctggttACTAGTaagggagagcgtcgagatcc
O-dhaB2-F1	ggaattgtgagcggataacaattaataagcaacaaaaaggaggaaaaggtgcaacagacaacccaaattcag
O-dhaB2-F2 (speI)	cccaacACTAGTttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatt
O-dhaB2-B (pacI)	tctctcTTAATTAAaagctttctagatcagtttctctcacttaacg

O-dhaB1-F1	ggaattgtgagcggataacaattccataggtcaaaaggagcatcacaaatgaaaagatcaaaacgatttgcagtactgg
O-dhaB1-F1-V2	ggaattgtgagcggataacaattccataggtcaaaaggagcatcaccaatgaaaagatcaaaacgatttgcagtactgg
O-dhaB1-F1-V3	ggaattgtgagcggataacaattatttgctccaaaaggagcatatcgaatgaaaagatcaaaacgatttgcagtactgg
O-dhaB1-F1-V4	ggaattgtgagcggataacaattcatgcgctaaaacagaagcatcagtgatgaaaagatcaaaacgatttgcagtactgg
O-dhaB1-B1	ggttcagcccgacaccattgaataacgcaaaaaaccccgcttcggcggggttttttcgc
O-dhaB1-B2	ccaacaACTAGTgcgaaaaaaccccgccgaag

pUC-F	ttgccgttcggtcttgccggctacgcgtt
pUC-B	acacacacgagCTCGAGtgagctaactcacattaattgcgttgc
O-kgsadh-F1	gtgtggaattgtgagcggataacaattattttaggcaaaaggaggatctatcatggctaacgtgacttatacggatacg
O-kgsadh-F2	gagttagctcactcGAGCTCttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatt
O-kgsadh-B	ccggttcgcttgctgtcc

실시예 2. 3-HP 생산용 재조합 대장균에서 효소 활성 분석

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균에서 3-HP 생합성 경로가 증폭된 것을 확인하기 위하여, 모든 효소들이 과발현된 균주인 HGL_BK1 균주에서 효소 활성을 분석하였다. 대조군으로는 선행 연구에서 사용된 HGL_BK 균주(pDK7(p15A)_DhaB123, gdrAB (p15A ori, CmR, Ptac-dhaB123-gdrAB 포함) 및 pUC_KGSADH 플라스미드로 형질전환된 W 균주, DBUGK)를 이용하였다.

보다 구체적으로, GDHt 활성을 분석하기 위하여, 35 mM 인산 버퍼 (pH 8.0), 50 mM 염화칼륨, 50 mM 1,2-프로판디올, 2 mM NAD+, 1 mM DTT, 15 uM coenzyme B12 및 10 units/ml의 알데히드 디하이드로게나제(Saccharomyces cerevisiae 유래)를 포함하는 반응 버퍼를 이용하였으며, 각각의 재조합 균주를 Bugbuster를 사용하여 용혈시킨 용해물과 함께 섞어 반응을 유도한 후, 생성되는 NADH의 양을 측정하기 위해 340 nm에서의 흡광도를 분석하였다(Victor3 1420 Multilabel Plate Reader를 이용).

또한, ALDH의 활성을 분석하기 위하여, 35 mM 인산 버퍼 (pH 8.0), 50 mM 염화칼륨, 5 mM 프로피온알데하이드 및 2 mM NAD+를 포함하는 반응 버퍼를 이용하는 것을 제외하고는 상기 GDHt 활성 분석 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, HGL_BK1 균주에서 GDHt 및 ALDH 효소 활성이 나타남을 확인하였으며, 이는 대조군인 HGL_BK (DBUGK) 균주에 비해 GDHt의 경우 27.3%, ALDH의 경우 26.5% 증가한 결과임을 확인하였다. 이를 통해, 상기 실시예 1에서 제조한 HGL_BK1 균주 내에서 3-HP 생합성 경로에 관여하는 효소들이 과발현됨을 확인하였다.

실시예 3. 3-HP 생산용 재조합 대장균에서 3-HP 생산성 분석

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균에서 3-HP 생산성을 확인하기 위하여, 모든 효소들이 과발현된 균주인 HGL_BK1를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 대조군으로는 HGL_BK (DBUGK) 균주를 이용하였다.

보다 구체적으로, 각 재조합 균주를 변형된 20 ml의 글리세롤 M9 배지(100 mM 인산버퍼, 5 g/L MgSO₄.7H₂O, 2 g/L NH₄Cl, 2 g/L NaCl, 1 g/L yeast extract를 포함하며, 100 mM의 glycerol을 유일 탄소원으로 사용)에 넣은 후, 37°C, 250 rpm의 교반기에서 24시간 동안 배양하였다. 플라스미드의 유지를 위하여 50 ug/ml의 카나마이신과 25 ug/ml의 클로람페니콜을 배지에 포함하였으며, 유전자 발현을 위해서 0.1 mM의 IPTG 및 2 uM의 coenzyme B12를 첨가하였다. 배양 후, HPX-87H 칼럼과 분당 0.6 ml의 5 mM H₂SO₄를 이동상으로 이용하여 배지 내 유기물들은 측정하였으며, 검출에는 Shodex RI-101 기기를 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, HGL_BK1 균주는 대조군인 HGL_BK (DBUGK) 균주에 비해 45.7% 감소한 수치인 1.69 g/L의 3-HP를 생산함을 확인하였다. 또한, HGL_BK1 균주는 대조군인 HGL_BK (DBUGK) 균주에 비해 세포 비성장속도 및 글리세롤 흡수(uptake) 속도 역시 각각 12.1%, 44.6% 감소한 것을 확인하였다. 이는 HGL_BK1 균주에서 3-HP 생합성 효소가 과발현되긴 하나, 탄소 흐름의 불균형에 의한 대사적 부담(metabolic burden)의 발생에 의한 것으로 판단되었다.

따라서 3-HP 생산성을 증진시키기 위해서는, 탄소 흐름의 균형적 최대화의 달성이 요구되는바, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 글리세롤로부터 3-HPA로의 전환에 관여하는 효소인 GDHt의 활성도를 조절하고자, 상기 실시예 1과 같이 서로 다른 서열의 합성 5’UTR 및 dhaB1 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환하여 서로 다른 dhaB1 유전자의 발현량을 보이는 재조합 균주(HGL_BK1, HGL_BK2, HGL_BK3, HGL_BK4, HGL_BK5)를 동일한 조건에서 배양하였다. 각 재조합 균주에서 DhaB1의 발현량을 SDS-PAGE를 통해 분석하였으며, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 GDHt의 활성을 분석하고, 3-HP의 생산량을 측정하였다. 이상의 실험결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 합성 5’UTR의 서열에 따라 DhaB1 단백질 발현량 및 GDHt 활성이 조절됨을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, dhaB1 유전자 발현량 조절에 따라 3-HP의 생산성이 달라짐을 확인하였으며, 20만 이하의 dhaB1 유전자 발현을 보이는 HGL_BK3 및 HGL_BK4 균주가 약 4.5 g/L의 우수한 3-HP 생산능을 보임을 확인하였다. 이는 dhaB1가 과발현된 HGL_BK1 균주에 비하여 266% 증가한 결과이며, 3-HP 생합성 과정에서 생성되는 주요한 부산물인 아세테이트와 1,3-PDO의 합성 과정의 제거 없이도, 두 부산물 모두 현저히 적은 양이 생산됨을 확인하였다 (각각 0.40 g/L, 0.07g/L).

다음으로, 20만 이하의 dhaB1 유전자 발현량을 보이도록 합성 5’UTR의 서열을 서로 다르게 설계하고, 각각을 포함하는 플라스미드를 이용하여 형질전환 재조합 균주를 제조하였으며, 이로부터 3-HP의 생산능을 확인하였다. 본 실험에 이용된 합성 5’UTR의 서열을 표 7에 나타내었으며, 실험 결과를 도 8에 나타내었다.

5’ UTR	예측발현량 (a. u.)
AATTGCTCCAAAAGGAGCATATCTA (서열번호 9)	72,024
ATTTGCTCCGAAAGGAGCATCTCTA (서열번호 10)	33,850
ATTTGCTCCAAAAGGAGCATATCGA (서열번호 11)	26,318
AATTGCTCCGAAAGGAGCATCTCGA (서열번호 12)	13,080
CTTTGCTCCGAAAGGAGCATATCGA (서열번호 13)	9,351

도 8에 나타낸 바와 같이, 20만 이하의 dhaB1 유전자 발현량을 보이도록 설계한 합성 5’UTR을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 재조합 균주는 합성 5’UTR의 서열에 관계 없이 유사한 수준의 3-HP 생산능을 보임을 확인하였다.

실시예 4. 고농도 글리세롤 배지에서의 배양

상기 실시예 3에서 3-HP의 생산성이 높다고 확인된 HGL_BK4 균주에서 3-HP의 생산성을 재확인하기 위하여, 400 mM의 글리세롤을 유일 탄소원으로 하는 배지에서 배양하였다. 이때 3-HP가 생산되는 동안 배지의 pH가 낮아지기 때문에, 이를 보정하기 위하여 10 M NaOH 수용액을 이용하였다.

그 결과, HGL_BK4 균주는 고농도 글리세롤 배지에서 21.4 g/L의 3-HP를 생산함을 확인하였다. 그러나 이 경우 2.11 g/L의 아세테이트 및 0.54 g/L의 1,3-PDO가 부산물로 다량 생산되는 문제가 발생하였다.

상기와 같은 문제점을 해소하고, 3-HP의 생산능을 높이기 위하여, HGL_BK4 균주에서 부산물인 아세테이트 및 1,3-PDO를 생산하는 효소를 암소화하는 ackA -pta 및 yqhD 유전자를 제거하여 HGL_DBK4 균주(HGL_BK4/△ackA-pta/△yqhD)를 제조하고, 동일한 고농도 글리세롤 배지에서 배양하였다. 상기 실험에서 PCR 증폭 시 사용한 프라이머의 서열을 표 8에 나타내었으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, HGL_DBK4 균주는 고농도 글리세롤 배지에서 22.0 g/L의 3-HP를 생산하며, 부산물인 아세테이트는 HGL_BK4 균주에 비해 31.3% 감소한 1.45g/L, 1,3-PDO는 HGL_DBK4 균주에 비해 88.9% 감소한 0.06 g/L를 생산함을 확인하였다. 이와 같은 HGL_DBK4 균주에서 소모된 글리세롤 대비 3-HP의 생산 수율은 0.75 g/g으로써 기존에 발표된 결과에 비하여 훨씬 높은 수치로 확인되었다.

실시예 5. Fed-batch 배양

3-HP의 고생산을 위하여 HGL_DBK4 균주에 글리세롤과 글루코오스를 동시에 공급하며 Fed-batch 배양을 진행하였다. pH는 암모니아 수용액을 이용하여 7로 조정하였으며, 글리세롤은 전체 10 g/L 이하로 유지되도록 하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, HGL_DBK4 균주 배양시 IPTG 첨가 후 반응기에 3-HP가 축적되기 시작하였으며 초기 생산성은 0.3g/L/h로 확인되었다. 또한, 배양 15시간 이후에 최대 생산성이 3.2g/L/h에 달하였으며 최종적으로 30 시간 동안의 배양 결과 40.51g/L의 3-HP가 생산됨을 확인하였다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> 3-HYDROXYPROPIONIC ACID-PRODUCING RECOMBINANT MICROORGANISM AND METHOD OF PRODUCING 3-HYDROXYPROPIONIC ACID USING THE SAME <130> 1-24 <160> 68 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 1 tcaaatctgg aaaggagcat ccgat 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 2 tcaaatctgg aaaggagcat cagat 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 3 tcaaatctga aaaggagcat cagat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 4 ggtagcactg aaaggagcat cgcca 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 5 tcatatctgg aaaggagcat cagat 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 6 tcgttttgac aaaggagcat cggct 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 7 ggagggcccg aaaggagcat cgcca 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 8 catgcgctaa aacagaagca tcagtg 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 9 aattgctcca aaaggagcat atcta 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 10 atttgctccg aaaggagcat ctcta 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 11 atttgctcca aaaggagcat atcga 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 12 aattgctccg aaaggagcat ctcga 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB1 <400> 13 ctttgctccg aaaggagcat atcga 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB2 <400> 14 ttgggattga aaaggagtat cagca 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR - dhaB2 <400> 15 ttgggattga aaaggagttt 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ggtgccgatc gataacgcca gcccgctgga aaaaattcgt 1560 ctcgtgcgcc ggcaggcgaa agagaaagtg tttgtcacca actgcctgcg cgcgctgcgc 1620 caggtctcac ccggcggttc cattcgcgat atcgcctttg tggtgctggt gggcggctca 1680 tcgctggact ttgagatccc gcagcttatc acggaagcct tgtcgcacta tggcgtggtc 1740 gccgggcagg gcaatattcg gggaacagaa gggccgcgca atgcggtcgc caccgggctg 1800 ctactggccg gtcaggcgaa ttaa 1824 <210> 67 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB gene <400> 67 atgtcgcttt caccgccagg cgtacgcctg ttttacgatc cgcgcgggca ccatgccggc 60 gccatcaatg agctgtgctg ggggctggag gagcaggggg tcccctgcca gaccataacc 120 tatgacggag gcggtgacgc cgctgcgctg ggcgccctgg cggccagaag ctcgcccctg 180 cgggtgggta ttgggctcag cgcgtccggc gagatagccc tcactcatgc ccagctgccg 240 gcggacgcgc cgctggctac cggacacgtc accgatagcg acgatcatct gcgtacgctc 300 ggcgccaacg ccgggcagct ggttaaagtc ctgccgttaa gtgagagaaa ctga 354 <210> 68 <211> 1446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kgsadh gene <400> 68 atggctaacg tgacttatac ggatacgcaa ctgctgatcg acggcgagtg ggtcgacgcc 60 gcgagcggca agacgatcga cgtcgtgaac ccggcgaccg gcaagccgat cggcagggtg 120 gcccatgcgg gcatcgccga tctcgaccgt gcgctcgccg ccgcgcaaag cggcttcgag 180 gcatggcgca aggtgcccgc gcacgagcgc gcggcgacga tgcgcaaggc ggccgcgctg 240 gtgcgtgaac gcgccgacgc gatcgcgcag ctgatgacgc aggagcaggg caagccgctc 300 accgaagcgc gcgtcgaagt gctgtcggcg gcggacatca tcgaatggtt cgcggacgaa 360 ggccgccgcg tgtacggccg gatcgtgccg ccgcgcaacc tcggcgcaca gcagacggtc 420 gtgaaggagc cggtcggccc ggtcgccgcg ttcacgccgt ggaatttccc ggtcaaccag 480 gtcgtgcgca agctgagcgc cgcgctggca accggctgtt cgttcctcgt gaaagcgccg 540 gaagaaaccc ccgcgtcgcc ggccgcgctg ctgcgcgcct tcgtcgacgc aggcgtgccg 600 gccggcgtga tcggcctcgt gtacggcgat ccggccgaaa tctcgtcgta cctgatcccg 660 cacccggtga tccgcaaggt cacgttcacg ggttcgacgc cggtcggcaa gcagctcgcc 720 tcgctggcgg gcctgcacat gaagcgcgcg acgatggagc tgggcgggca cgcaccggtg 780 atcgtggccg aagacgccga cgttgcgctc gcggtgaaag cggccggcgg cgcgaagttc 840 cgcaacgcgg ggcaggtctg catctcgccg acgcgcttcc tcgtgcacaa cagcatccgc 900 gacgaattca cgcgcgcgct ggtcaagcat gccgaagggc tgaaggtcgg caacggcctc 960 gaggaaggca cgacgctcgg cgcgctcgcg aacccgcgcc ggctgaccgc gatggcgtcg 1020 gtcatcgaca acgcgcgcaa ggtcggtgcg agcatcgaaa ccggcggcga gcggatcggc 1080 tcggaaggca acttcttcgc gccgaccgtg atcgcgaacg tgccgctcga tgcggacgtg 1140 ttcaacaacg agccgttcgg cccggtcgcg gcgattcgcg gtttcgacaa gctcgaagag 1200 gcgatcgcgg aagcgaaccg tttgccgttc ggtcttgccg gctacgcgtt cacgcgttcg 1260 ttcgcgaacg tgcacctgct cacgcagcgc ctcgaagtcg ggatgctgtg gatcaaccag 1320 ccggcgacgc cgtggccgga aatgccgttc ggcggcgtga aggactcggg ctacggttcg 1380 gaaggcggcc cggaagcgct cgagccgtac ctggtcacga agtcggtgac ggtgatggcc 1440 gtctga 1446

Claims

합성 5’UTR(untranslated region) 및 GDHt(glycerol dehydratase)를 코딩하는 dhaB 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 dhaB는 dhaB1 , dhaB2 또는 dhaB3인 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제2항에 있어서, 상기 합성 5’UTR은 dhaB 유전자 중 어느 하나의 예측 발현량(a. u.)이 1 초과 20만 이하가 되게 설계된 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제3항에 있어서, 상기 합성 5’UTR은 dhaB1 유전자의 발현량을 조절하기 위한 것이며, 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제3항에 있어서, 상기 합성 5’UTR은 dhaB2 유전자의 발현량을 조절하기 위한 것이며, 서열번호 14 내지 21 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제3항에 있어서, 상기 합성 5’UTR은 dhaB3 유전자의 발현량을 조절하기 위한 것이며, 서열번호 22 내지 29 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 GDHt 재활성화인자(GDHt reactivase)를 코딩하는 gdrAB 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 ALDH(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 kgsadh 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 ackA -pta 또는 yqhD 유전자가 제거된 것을 특징으로 하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산용 재조합 미생물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 방법.