KR20170065376A

KR20170065376A - 바이오에탄올 생산시 발생되는 잔류물로부터 항산화 물질을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20170065376A
Application number: KR1020150171731A
Authority: KR
Inventors: 이재원; 신경진
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2017-06-13

Abstract

본 발명은 목질계 바이오매스에서 바이오에탄올 생산시 발생되는 잔류물로부터 항산화 물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법은 바이오에탄올 생산시 부생성되는 투과증발 잔류물을 폐기하지 않고, 에틸아세테이트로 추출한 다음 용매상(solvent phase) 분획물로부터 항산화 물질을 용이하게 분리해낼 수 있으므로, 식품 등의 보관을 위한 항산화제(방부제)로 용이하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

바이오에탄올 생산시 발생되는 잔류물로부터 항산화 물질을 제조하는 방법{Extraction method of antioxidant from residue generated during pervaporation of bioethanol}

본 발명은 목질계 바이오매스에서 바이오에탄올 생산시 발생되는 잔류물로부터 항산화 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

현재까지 세계 각국에서는 비 재생 에너지자원인 천연가스와 석유, 석탄 등의 화석연료를 주로 사용해왔으나 가까운 미래에 고갈될 것으로 전망하고 있다. 화석연료를 대체할 수 있는 에너지로 태양광, 풍력, 조력, 수소에너지 등 다양한 대안이 있으나 그 중에서도 바이오에너지 분야가 가장 빠른 성장세를 보이고 있다. 바이오에너지는 수송용 연료를 대체할 수 있을 뿐만 아니라 일정 수준의 자립적인 에너지 공급이 가능한 장점을 가지고 있어 전 세계적으로 각광받고 있다.

옥수수, 감자 등 전분으로 이루어진 1세대 바이오매스로부터 생산되는 바이오에너지는 식량자원과 경쟁해야 하는 단점이 있어 이를 보안하기 위한 방안으로 2세대 바이오매스가 제안되었다. 2세대 바이오매스인 목질계 바이오매스는 그 양이 풍부하고 식량자원과의 경쟁을 피할 수 있을 뿐만 아니라 대기 중의 이산화탄소를 증가시키지 않는 탄소중립적인 청정 에너지원으로서의 특징을 가지고 있다.

목질계 바이오매스는 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌이 복잡하게 연결되어 분해하기 어려운 구조로 이루어져 있다. 일반적으로 목재 내 셀룰로오스 함량은 40-45%, 헤미셀룰로오스는 25-35%가 존재하므로 목재는 약 70%에 이르는 풍부한 다당류를 함유하고 있다. 목질계 바이오매스는 전분계 바이오매스와 달리 단단한 구조적 특성을 가지고 있으므로 발효가능한 당을 생성하기 위해서 전처리 공정이 요구된다. 일반적으로 산 촉매를 이용한 전처리 공정이 잘 알려져 있지만 발효저해물질을 유발시킨다는 단점을 갖고 있다.

전처리 액상 가수분해산물 내 발효저해물질로는 aliphatic acids(초산, 개미산 및 레불린산), furaldehydes(푸르푸랄, 5-hydroxymethylfurfural) 및 페놀 등의 방향족 화합물과 추출물이 있다. 일정 농도 이상의 발효저해물질은 균의 생장과 발효를 저해하는 것으로 알려져 있으므로, 발효공정에서 에탄올의 생산을 증대시키기 위해서는 이러한 물질들의 선택적 분리 및 제거가 중요하다.

발효로 생산된 에탄올은 증류ㆍ탈수의 정제공정을 거친 후 연료로 이용될 수 있다. 지난 20년간 미국을 포함한 세계 각지에서 옥수수를 이용한 에탄올 증류 산업의 급속한 성장으로 인해 얻어지는 부산물의 양이 급증했다(Robinson et al. 2008).

따라서, 부산물들을 이용한 활용방안이 요구되고 있다. 전처리와 발효공정을 거쳐 생산된 에탄올을 농축한 후 남겨진 액상산물에는 아직 제거되지 못한 퓨란 및 페놀 유도체들을 다량 함유하고 있다. 페놀 유도체로는 p-coumaric acid, ferulic acid, syringaldehyde, vanillin 등이 잘 알려져 있으며, 이들은 선행 연구결과에 의해 항산화 활성을 가지고 있다고 확인되었다(Kilic and Yeilolub 2013; Mourtzinos et al. 2009).

한편, 식품 산업에서는 주로 propyl gallate, butylated hydroxylanisol (BHA), butylated hydroxyltoluene (BHT), tertiary butylhydroquinone 등과 같은 합성 항산화제를 방부제 기능으로 사용해왔으나 독성에 대한 위험성으로 심각하게 규제됨에 따라 천연물들을 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

최근에는 천연식물뿐만 아니라 농업 및 식품 부산물에서 발생되는 여러 농업폐잔물들을 이용한 연구도 증가하고 있는 추세이다. 이러한 부산물들의 재사용으로부터 환경적 측면뿐만 아니라 경제적 측면에서도 긍정적인 효과를 기대할 수 있다. 이들 성분들은 산화 스트레스로부터 동식물 및 식품을 보호하기 때문에 많은 연구진들에 의해 항산화제로 개발되어 사용되고 있다.

따라서, 본 발명에서는 목질계 바이오매스(활엽수 혼합수종)로부터 발효를 거쳐 생산된 에탄올을 투과증발막을 이용하여 농축한 후 남겨진 투과증발 잔류물로부터 항산화 활성 여부를 측정하여 부산물의 활용 가능성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

공개특허 10-2012-0067788호

본 발명의 목적은 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 얻은 항산화 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항산화 물질을 포함하는 방부제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항산화 물질을 포함하는 항균제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 목질계 바이오매스를 산(acid) 전처리하여 액상 가수분해산물을 얻는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 얻은 액상 가수분해산물을 전기투석 처리하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 전기투석 처리된 액상 가수분해산물을 발효 처리한 다음, 투과증발하여 에탄올을 농축하는 단계(단계 3);

상기 단계 3에서 투과증발 이후에 남는 잔류물을 에틸아세테이트로 추출하여, 용매상(solvent phase) 및 수성상(Aqueous phase)을 포함하는 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계(단계 4); 및

상기 에틸아세테이트 추출물 중에서 용매상(solvent phase) 추출물을 진공건조하여 항산화 물질을 얻는 단계(단계 5);

를 포함하는 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻은 항산화 물질을 제공한다. 여기서, 상기 항산화 물질은 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 상기 항산화 물질을 포함하는 방부제 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 방부제 조성물은 식품용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 항산화 물질을 포함하는 항균제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법은 바이오에탄올 생산시 부생성되는 투과증발 잔류물을 폐기하지 않고, 에틸아세테이트로 추출한 다음 용매상(solvent phase) 분획물로부터 항산화 물질을 용이하게 분리해낼 수 있으므로, 식품 등의 보관을 위한 항산화제(방부제)로 용이하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 목질계 바이오매스로부터 투과증발 잔류물 획득 및 항산화 물질 추출 과정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 PEI/PDMS 복합중공사막을 이용한 투과증발 공정을 사용하여 에탄올을 회수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 추출물의 항산화 활성을 특정하여 나타낸 그래프로, (A)는 DPPH 라디칼 소거활성 측정 그래프이고, (B)는 ABTS 라디칼 소거활성 측정 그래프이고, (C)는 에탄올 농축 이후의 잔류물로부터 얻은 추출물의 환원력 측정 그래프이다.

본 발명은 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올 생산시에 부생성되어 폐기되는 잔류물의 재활용에 관한 발명으로, 폐기되는 잔류물로부터 항산화 물질을 분리 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 1은 목질계 바이오매스를 산(acid) 전처리하여 액상 가수분해산물을 얻는 단계이다. 구체적으로, 본 단계 1은 종래 알려진 목질계 바이오매스의 산(acid) 전처리 과정을 모두 사용할 수 있다.

여기서, 상기 산(acid)로는 목질계 바이오매스 전처리에 사용되는 유기산이라면 별다른 제약없이 사용가능 하고, 바람직하게는 옥살산을 사용할 수 있다.

상기 단계 1의 산(acid) 전처리는 140-200 ℃, 바람직하게는 150-190 ℃, 더욱 바람직하게는 160-180 ℃, 특히 바람직하게는 170 ℃의 온도로 처리할 수 있다. 또한, 산(acid) 전처리 시간은 30-90분, 바람직하게는 40-80분, 더욱 바람직하게는 50-70분, 특히 바람직하게는 60분 처리할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 액상 가수분해산물을 전기투석 처리하는 단계이다. 구체적으로, 본 단계 2의 처리에 의해서 액상 가수분해산물에서 발효를 저해하는 초산(acetic acid)을 주로 제거할 수 있다.

상기 단계 2의 전기투석은 양이온교환막 및 음이온교환막이 구비된 전기투석장치를 이용하여, 5-15 V, 바람직하게는 8-12 V, 특히 바람직하게는 10 V 정전압 조건으로 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 전기투석 처리된 액상 가수분해산물을 발효 처리한 다음, 투과증발하여 에탄올을 농축하는 단계이다. 구체적으로, 발효 과정에는 바이오에탄올을 생산하기 위하여 오탄당 발효가 가능한 균주라면 별다른 제약없이 모두 사용할 수 있고, 본 발명에서는 Pichia stipitis CBS 6054를 균주로 사용하였다. 또한, 상기 투과증발은 복합중공사막을 사용할 수 있고, 본 발명에서는 폴리에테르이미드를 지지층으로 하고 폴리(디메틸실록산)을 선택층으로 하는 복합중공사막을 사용하였다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 투과증발 이후에 남는 잔류물을 에틸아세테이트로 추출하여, 용매상(solvent phase) 및 수성상(Aqueous phase)을 포함하는 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계이다. 구체적으로, 추출은 액체-액체 추출법을 사용할 수 있고, 잔류물과 에틸아세테이트를 바람직하게는 1:1 부피비로 혼합하여 추출할 수 있다. 바람직하게, 용매 추출시간을 증가시키거나, 최적의 용매 탐색으로 추출 수율을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 5는 상기 에틸아세테이트 추출물 중에서 용매상(solvent phase) 추출물을 진공건조하여 항산화 물질을 얻는 단계이다. 구체적으로, 용매상 추출물을 바람직하게는 회전식 감압농축기를 사용하여 농축시킨 후 항산화물질을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻은 항산화 물질을 제공한다.

여기서, 상기 항산화 물질은 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)일 수 있다. 구체적으로, 상기 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)은 바닐릴알콜, 비스(트리메틸실릴) 유도체, 벤조산, 3-메톡시-4-[트리메틸실릴)옥시] 유도체, 트리메틸실릴에스테르, 3-바닐프로판올, 비스(트리메틸실릴)-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에틸렌글리콜트리스(트리메틸실릴)에테르, 3-바닐-1,2-비스(트리메틸실록시)프로판, 1,2-벤젠다이카복실산, 모노(2-에틸헥실)에스테르 등을 1종 이상 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 항산화 물질을 포함하는 방부제 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 방부제 조성물은 바람직하게는 식품용으로 사용할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

따라서, 본 발명에 따른 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법은 바이오에탄올 생산시 부생성되는 투과증발 잔류물을 폐기하지 않고, 에틸아세테이트로 추출한 다음 용매상(solvent phase) 분획물로부터 항산화 물질을 용이하게 분리해낼 수 있으므로, 식품 등의 보관을 위한 항산화제(방부제)로 용이하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험 재료 및 방법

(1) 바이오매스와 전처리

본 발명에서는 대전의 ㈜풍림에서 구입한 아카시아(Robinia pseudoacacia L.), 밤나무(Cartanea crenata), 참나무(Quercus mongolica)로 구성된 활엽수 혼합수종을 사용하였다. 실험에 사용하기 위하여 시료를 20-80 mesh로 분쇄한 후, 실온에 보관하였다.

전처리는 회전식 반응기(DM-848; Daeil Machinery, Daejeon, Korea)에서 수행하였다. 스테인리스 스틸 반응기에 활엽수 혼합수종의 전건시료 50 g과 산 촉매로서 0.1 M 옥살산(pH 1.3) 용액 200 mL를 투입하여 반응온도 170℃에서 60분간 전처리를 실시하였다. 반응 종료 후 반응기를 냉각시킨 후, 여과지(Hyundai Micro NO. 20)로 여과하여 액상 가수분해산물과 고형 바이오매스로 분리하였다.

(2) 초산 제거를 위한 전기투석

액상 가수분해산물에 포함된 초산 등의 이온성 발효저해물질을 제거하기 위하여 전기투석을 수행하였다. 전기투석장치의 이온 교환막으로는 양이온 교환막(ASTOM Crop., NEOSEPTA^® CMX, Japan) 및 음이온 교환막(ASTOM Crop., NEOSEPTA^® AMX, Japan)을 사용하였다. 유효막 면적은 550 cm²으로 이루어져 있으며 10 V 정전압 조건으로 실시하였다.

(3) 액상 가수분해산물의 발효

전기투석 후 액상 가수분해산물로부터 바이오에탄올을 생산하기 위하여 오탄당 발효가 가능한 Pichia stipitis CBS 6054를 공시균주로 사용하였다. 균주를 YPD (Yeast Extract, Peptone, Dextrose, Agar) 배지에 배양한 후 액체배지(Yeast Extract 2 g/100 mL, Peptone 4 g/100 mL, Dextrose Agar 4 g/100 mL)에 접종하여 30℃, 150 rpm으로 24시간 동안 선 배양한 후 발효에 사용하였다. 발효를 위해 액상 가수분해산물 pH는 6.0으로 조절하였으며, KH₂PO₄(1 g/L), MgSO₄(0.5 g/L), Yeast Extract (5 g/L), Urea (5 g/L)를 첨가하여 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균된 액상 가수분해산물에 배양된 P. stipitis 2 g (dry cell weight)/L을 첨가하여 30℃, 150 rpm에서 에탄올 발효를 수행하였다. 24시간 간격으로 시료를 채취하여 HPLC로 분석하였다.

(4) 에탄올 농축

Polyetherimide (PEI)를 지지층으로 하고 Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) 선택층으로 하는 복합중공사막(유효막면적 890 cm²)을 이용하여 40℃에서 에탄올 농축을 수행하였다. 회수부에서 5 mmHg의 진공 하에 투과증발막 공정에서 기화된 상태로 투과한 용액을 액체질소를 이용하여 응축된 형태로 회수하였다. HPLC를 이용하여 회수부와 유입부의 에탄올 농도를 분석하여 에탄올의 투과도(flux)와 선택도(selectivity)를 계산하였다.

(5) 액상 가수분해산물 성분분석

전처리 후 액상 가수분해산물에 포함된 발효가능한 당(글루코오스, 자일로스) 및 당 분해산물(푸르푸랄, 초산, 5-hydroxymethylfurfural (HMF))과 발효에 의해 생성된 에탄올은 HPLC (Waters 32695, USA)를 이용하여 분석하였다. 칼럼은 Aminex 87H column (300 × 7.8 mm, BIO-RAD)을 사용하였고, Refractive index detector (Waters 2414, USA)로 검출하였다. 이동상으로는 5 mM 황산을 flow rate 0.6 mL/min으로 분석하였다. 모든 분석용 시료는 0.22 ㎛ filter를 통과시켜 희석배율을 조정하여 분석을 수행하였다.

(6) 에탄올 농축 후 투과증발 잔류물의 액체-액체 추출

투과증발막을 이용하여 에탄올을 회수, 농축한 후 투과증발 잔류물의 추출은 액체-액체 추출법으로 수행하였다. 분별 깔때기에 투과증발 잔류물과 에틸아세테이트를 1:1 (v/v)로 혼합하여 추출하였다. 이와 같은 과정을 3회 실시하였으며 에틸아세테이트 가용부는 회전식 감압농축기를 사용하여 농축시킨 후 냉장 보관하였다(OA-E). 수용액층인 에틸아세테이트 불용부(OA-A)는 동결건조 후 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. 투과증발 잔류물 획득 및 추출 과정은 도 1에 나타내었다.

(7) 페놀성 화합물 측정

투과증발 잔류물(OA-O)과 에틸아세테이트 가용성ㆍ불용성 추출물(OA-E, OA-A)의 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위하여 Folin-Denis법을 사용하였다(Singleton et al. 1999). 각각의 추출물 0.2 mL에 1 mL의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 혼합한 후 7.5% Na₂CO₃ 0.8 mL을 첨가하였다. 그 후 실온에서 차광상태로 2시간 동안 방치한 후 UV-vis spectrophotometer (JP/UV1800, Shimadzu, Japan)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 페놀성 화합물 함량은 vanillin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하여 구하였다.

(8) 항산화 활성 측정

(8-1) DPPH (2,2- diphenyl -2- picrylhydrazyl ) 라디칼 소거활성(radical scavenging activity) 측정

DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성은 Brand-Williams 등(1995)의 방법을 변형하여 측정하였다. 에탄올에 희석된 추출물 0.1 mL와 0.4 mM DPPH 용액 1 mL를 혼합한 후 에탄올을 첨가하여 최종부피를 2.5 mL로 조절하였다. 혼합물은 실온에서 차광상태로 30분간 반응시킨 다음 UV-vis spectrophotometer (JP/UV1800, Shimadzu, Japan)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 BHT (Butylated hydroxytoluene)와 BHA (Butylated hydroxyanisole)를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 하기 수학식 1에 의해 구하였다.

상기 수학식 1에서,

As: 추출물 첨가군의 흡광도

Ac: 무첨가군의 흡광도

(8-2) ABTS (2,2'- azino -bis(3- ethylbenzothiazoline -6- sulfonic acid)) 라디칼 소거활성 측정

7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate 용액을 1:1 (v/v)로 혼합하여 12~16시간 동안 차광상태로 방치시켜 ABTS⁺를 형성시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 0.7 ± 0.02가 되도록 에탄올로 희석하였다. 희석된 ABTS⁺용액 1 mL에 농도별로 희석된 추출물 0.2 mL를 첨가하고 6분 후 흡광도의 변화를 측정 한 다음 상기 수학식 1에 의거하여 계산하였다(Ozgen et al. 2006).

(8-3) 환원력(Reducing power) 측정

환원력는 Ozgen 등(2006)에 의해 제안된 방법을 변형시켜 측정하였다. 에탄올에 희석된 시료 0.5 mL에 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6) 2.5 mL와 2.5 mL의 potassium ferricyanide (1%, w/v)를 혼합시킨 후 50℃에서 20분간 방치시켰다. 반응을 멈추기 위하여 2.5 mL의 trichloroacetic acid (10%, w/v)을 첨가한 후 10분간 원심분리 하였다. 상등액 2.5 mL에 2.5 mL의 증류수를 첨가한 후 0.1% ferric chloride 0.5 mL 투입하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(9) GC-MS (Gas chromatograph-mass spectrometer) 분석

에탄올 농축 후 투과증발 잔류물의 에틸아세테이트 가용부에 함유된 물질은 GC/MS (7890, Agillent) 분석으로 확인하였다. 분석 칼럼은 HP5MS (30 m, 0.25 mm × 0.25 ㎛)이며, MS (Agillent 5975C)는 EI 모드로 분석하였다. 온도조건은 초기 80℃에서 5분간 유지시킨 후 승온속도를 5℃/min하여 250℃까지 상승시켰다. 250℃에서 10℃/min 속도로 최종온도가 320℃가 되도록 유지하여 분석을 수행하였다. 이동상 가스로 헬륨을 사용하였으며 flow rate 1 mL/min으로 분석하였으며 주입은 20:1의 분할 방식으로 하였다. GC-MS에 의해 얻어진 결과는 MS library data (NIST)와 비교하여 분석하였다.

<실험예 1> 액상 가수분해산물 분석

바이오매스의 옥살산 전처리 후 액상 가수분해산물 분석결과는 하기 표 1과 같다.

옥살산 전처리	발효가능한 당 (g/L)		발효 억제제 (g/L)
옥살산 전처리	Glucose	Xylose	Acetic acid	HMF	Furfural	TPC
가수분해 산물	5.63 (0.34)	37.28 (1.65)	12.70 (0.28)	0.21 (0.03)	2.37 (0.61)	5.29 (0.24)
전기투석 처리한 가수분해 산물	5.28 (0.03)	34.55 (0.04)	0.31 (0.02)	0.20 (0.01)	1.84 (0.05)	4.34 (0.10)

상기 표 1에서,

"HMF"는 5-hydroxymethylfurfural이고,

"TPC"는 total phenolic compounds이고,

괄호안의 결과는 3번의 실험결과를 반복하여 얻은 표준편차이다.

옥살산 전처리에 의해 헤미셀룰로오스가 선택적으로 분해되어 액상 가수분해산물에는 주로 자일로스를 포함하고 있다. HMF, 푸르푸랄은 대표적인 당 분해산물로서 3 g/L 이상의 HMF와 2.5 g/L 이상의 푸르푸랄은 Pichia stipitis의 활성을 저해시켜 에탄올 생산 효율을 감소시키는 것으로 보고되고 있다. 또한, 페놀성 화합물은 리그닌 분해산물로 2 g/L 이상을 포함할 경우 발효과정에서 미생물의 활성을 억제시킨다고 보고된 바 있다.

본 실험에서는 액상 가수분해산물 내 0.21 g/L의 HMF로 소량 함유하고 있었지만 2.37 g/L의 푸르푸랄 및 5.29 g/L의 페놀성 화합물을 포함하고 있어 발효에 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상된다. 뿐만 아니라 5 g/L 이상의 초산은 미생물 세포 활성을 저해시킨다고 보고되었다. 따라서, 에탄올 생산 효율을 증대시키기 위해 전기투석을 수행하였으며, 그 결과 대부분의 초산이 제거되었음을 확인하였다(표 1 참조).

이온 성질을 가지는 초산을 제외한 대부분의 당 분해산물들은 액상 가수분해산물에 남아있었다. 소량의 푸르푸랄과 페놀성 화합물이 전기투석에 의해 제거되었지만 이것은 막 흡착에 의한 것으로 사료된다. 이러한 경향은 기존의 연구 결과와 일치하였다. 따라서, 전기투석으로 인한 초산 및 소량의 페놀성 화합물, 푸르푸랄의 감소가 발효에 긍정적인 영향을 줄 것으로 판단된다.

<실험예 2> 액상 가수분해산물의 발효

상기 실험예 1에서 전기투석으로 발효저해물질들이 일부 제거된 옥살산 액상 가수분해산물로부터 에탄올 생산에 대한 결과는 하기 표 2에 나타냈다.

	초기 발효가능한 당 농도 (g/L)	에탄올 생산 (g/L)	시간당 에탄올 생산 (g/L·h)	에탄올 수율 (g/g sugar)
전기투석 처리된 가수분해산물	32.28 (4.57)	12.21	0.0019	0.44

상기 표 2에서,

"초기 발효가능한 당 농도"는 발효 이후에 잔류한 발효가능한 당 농도이고,

"에탄올 생산"은 발효 240시간 이후에 가장 높은 생산이 관찰되었고,

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 발효 240시간 후 12.21 g/L의 에탄올을 생산하였다. 발효가능한 당에 대한 에탄올 수율은 0.44 g/g, 시간당 생산되는 에탄올은 0.0019 g/Lㆍh로 나타났다. 전기투석-액상 가수분해산물로부터 낮은 에탄올 생산을 나타냈으며, 이는 가수분해산물 내 남아있는 퓨란계 및 페놀성 화합물에 의한 것으로 에탄올 생산에 부정적인 영향을 나타냈다. 따라서, 전기투석만을 사용하였을 때 유기산만 제거되고 대부분의 HMF, 푸르푸랄, 페놀성 화합물은 가수분해산물에 존재하였다. 에탄올 생산을 향상시키기 위해서는 이들을 제거하기 위한 추가적인 처리가 필요한 것을 알 수 있었다.

< 실험예 3> 에탄올 농축

투과증발(Pervaporation)은 끓는점의 차이를 이용하여 액체혼합물을 분리하는 막분리 공정이다. 현재 널리 사용되고 있는 증류공정에 비해 공정이 단순하여 설비비가 낮고, 에너지 소모가 낮은 장점을 지니고 있다. 최근 연구에서는 휘발성 유기화합물뿐만 아니라 알콜계의 탈수에 대해 양호한 성능을 보고하였다. 또한, 발효공정에서 사용되는 미생물에 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 발효액으로부터 생산된 알코올을 회수하는데 효과적인 공정으로 고려되고 있다.

도 2는 PEI/PDMS 복합중공사막을 이용한 투과증발 공정을 사용하여 에탄올을 회수한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 에탄올 투과도는 시간에 따라 감소하는 경향을 나타냈는데, 17.6 g/m²h에서 12.3 g/m²h로 감소하였다. 한편, 시간에 따른 에탄올의 선택도는 거의 일정한 경향을 나타냈다. 일반적으로 막분리 공정에서 막의 성능은 투과도가 증가함에 따라 선택도가 감소하는 trade-off가 성립한다고 알려져 있다. 본 실험에서는 시간에 따라 투과도가 감소하였지만 선택도가 변하지 않았는데, 이는 발효액에 있는 유기물이 막표면에 쌓이는 농도분극현상으로 볼 수 있다.

하기 표 3에서는 에탄올 농축 과정에서 투과증발 공정 효율을 나타냈다.

	초기 피드에서 에탄올(%)	생산물에서 에탄올(Max at 2h) (%)	농축비 (Max at 2h)	에탄올 투과도 (g/m²h)	에탄올 선택도
발효된 가수분해산물	1.2	6.1	5.1	12.3	9.3

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 옥살산 액상 가수분해산물의 에탄올 농도가 1.2%인 조건에서 투과증발 실험을 한 결과, 투과도와 선택도는 각각 12.3 g/m²·h, 9.3을 나타냈다. 투과증발 공정에서 회수부의 최대 농도는 6.1%로 최대 농축비는 5.1이었다. 투과증발을 이용하여 6시간 동안 에탄올을 농축한 결과 투과증발 잔류물에는 2.56 g/L의 에탄올이 남아 있었다.

본 연구에서는 단일 투과증발막으로 에탄올 농축을 실시하여 서너 개 막을 직렬로 연결한 상용화된 투과증발막 공정보다 낮은 농축율을 나타냈으며, 이는 투과증발 공정에서 발효액의 유기물이 막표면에 쌓여 에탄올의 투과도를 감소시키는 농도분극 현상에 의한 결과이다.

< 실험예 4> 추출 수율 및 총 페놀성 화합물 함량

에탄올 농축 후 투과증발 잔류물 분획물의 추출 수율과 페놀성 화합물 함량에 대한 결과는 하기 표 4와 같다.

샘플	추출 수율 (%)	TPC (mg VAE/100 g extract)
OA-A	2.89	-
OA-O	2.64	2.52 (0.19)
OA-E	0.28	86.81 (0.04)

상기 표 4에서,

"OA-A"는 에탄올 농축 이후 잔류물의 에틸아세테이트 추출물 중에서 수성상(Aqueous phase) 추출물이고,

"OA-O"는 에탄올 농축 이후의 잔류물이고,

"OA-E"는 에탄올 농축 이후 잔류물의 에틸아세테이트 추출물 중에서 용매상(solvent phase) 추출물이고,

"VAE"는 Vanillin equivalent이고,

표 2에 나타난 바와 같이, 추출 수율은 추출에 사용된 잔류물 부피를 기준으로 용매(에틸아세테이트)와 수용액에 포함된 추출물 함량으로 구하였다. 투과증발 잔류물을 에틸아세테이트로 추출한 결과(OA-E), 0.28%의 추출물을 획득하였다. 에틸아세테이트로 추출한 후 불용부인 수용액층(OA-A)과 투과증발 잔류물(OA-O)의 추출 수율은 각각 2.89%, 2.64%로 나타났다. 추출 수율은 용매의 극성, 추출 온도, 고액비, pH, 추출 시간에 따라 달라질 수 있으며, 추출 온도의 경우 용해도 및 용질의 확산 계수와 직접적인 관련이 있다.

리그닌은 세 개의 페닐 프로판올(p-hydroxyl-phenyl propanol, guaiacyl-propannol, syringyl-propanol)로 구성된 비정질 고분자로 C-C 결합(5-5, β-β, β-5와 β-1 결합)과 에테르 결합(α-O-4, 5-O-4, β-O-4)으로 연결되어 있어 분해 시 다양한 형태의 페놀성 화합물을 얻을 수 있다. 페놀성 화합물은 자연계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물로 그 형태가 다양하며 phenolic hydroxyl기로 인해 항산화, 항균 등의 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

0.1 mg/mL의 에틸아세테이트 추출물(OA-E)에 포함된 페놀성 화합물은 86.81 mg으로 나타났다. OA-A는 0.1 mg/mL의 농도에서 페놀성 화합물을 나타내지 않았으며, OA-O는 2.52 mg로 페놀성 화합물이 소량 검출되었다.

따라서, 본 실험에서 에틸아세테이트 추출물의 페놀성 화합물 함량을 조사한 결과 높은 항산화 활성을 예측할 수 있었다.

< 실험예 5> 투과증발 잔류물 추출물의 항산화 활성 평가

투과증발에 의한 에탄올 농축 후 남은 액상 가수분해산물로부터 유래된 각 추출물 및 양성 대조군으로 사용된 BHT와 BHA의 DPPH 라디칼 소거활성을 도 3에 나타내었고, 에탄올 농축 이후의 잔류물로부터 얻은 추출물의 항산화 IC₅₀ 및 EC₅₀ 값을 하기 표 5에 나타내었다.

도 3은 추출물의 항산화 활성을 특정하여 나타낸 그래프로, (A)는 DPPH 라디칼 소거활성 측정 그래프이고, (B)는 ABTS 라디칼 소거활성 측정 그래프이고, (C)는 에탄올 농축 이후의 잔류물로부터 얻은 추출물의 환원력 측정 그래프이다.

샘플	IC₅₀ 값 (mg/ml)		EC₅₀ 값 (mg/ml)
샘플	DPPH 소거	ABTS 소거	환원력 (Reducing power)
OA-A	5.05 (0.08)	-	-
OA-O	3.14 (0.36)	-	5.38 (0.41)
OA-E	0.87 (0.04)	0.85 (0.11)	0.71 (0.04)
BHT	0.69 (0.14)	0.47 (0.02)	0.90 (0.50)
BHA	0.40 (0.06)	0.21 (0.04)	0.24 (0.12)

상기 표 5에서,

"IC₅₀"은 DPPH 또는 ABTS 라디칼 소거활성 50%를 나타내는 유효농도이고,

"EC₅₀"은 환원력 50%를 나타내는 유효농도이고,

도 3 및 표 5에 나타난 바와 같이, 모든 추출물들의 DPPH 라디칼 소거활성(도 3(A))은 농도 의존적으로 증가하였으며, OA-E의 경우 11.90~86.56%의 소거능을 보였으며, OA-A는 0~19.65% 보였고, OA-O의 경우 0~31.36%으로 나타나 전체적으로 에틸아세테이트 추출물이 다른 추출물보다 높은 항산화 활성을 나타냈다. 그러나 추출물의 DPPH radical을 50% 억제를 위해 요구되는 시료의 농도(IC₅₀)에 대한 결과, OA-E의 IC₅₀은 BHT와 BHA보다 높은 값을 나타내고 있어 합성 항산화제보다 낮은 항산화력을 나타냈다(표 5). OA-E는 0.87 mg/mL으로 나타났으며 BHT와 BHA는 각각 0.69 mg/mL와 0.40 mg/mL이었다.

ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과(도 3 (B))는 대부분의 추출물에서 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하였다. 한편, OA-E와 양성 대조군을 제외한 나머지 추출물들에서는 가장 높은 실험농도(2 mg/mL)에서도 소거활성이 10%를 넘지 못하는 매우 낮은 활성을 나타냈다. IC₅₀에 대한 결과 OA-E의 경우 0.85 mg/mL로 추출물 중에서 가장 높은 활성을 나타냈으나 BHA (0.21 mg/mL)와 BHT (0.47 mg/mL)의 합성 항산화제보다는 낮았다(표 5).

에탄올 농축 후 투과증발 잔류물의 각 분획물에 대한 환원력을 측정한 결과(도 3 (C)), 0.125 ~ 1 mg/mL 농도에 따른 환원력을 측정한 결과 OA-E의 경우 0.184 ~ 0.784, OA-O는 0 ~ 0.121으로 낮았으며, OA-A에서는 환원력이 나타나지 않았다. 합성 항산화제의 경우, BHA는 가장 높은 환원력을 보여준 반면, BHT는 0.211 ~ 0.782로 OA-E와 유사한 환원력을 나타냈다. 추출물의 환원력을 EC₅₀으로 나타냈을 때 OA-E는 0.59 mg/mL로 BHA (EC₅₀= 0.25 mg/mL)보다는 환원력이 낮았으나 BHT (EC₅₀ = 0.51 mg/mL)와 유사한 값을 나타냈다(표 5). 따라서 에탄올을 회수ㆍ농축 후 투과증발 잔류물의 OA-E 추출물은 BHT와 견줄만한 항산화 활성을 나타내고 있어, 합성 항산화제를 대체할 수 있는 새로운 자원으로서 판단된다.

< 실험예 6> GC -MS 분석

높은 항산화 활성을 나타낸 에틸아세테이트 가용부(OA-E)에 함유된 성분을 분석하고자 GC-MS 분석을 실시하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

Peak No.	Retention time (min)	Compounds name	Area (%)
Sugar derived compounds			3.59
5	12.50	Butanedioic acid, bis (trimethylsilyl) ester	0.70
6	19.74	D-Xylose, tetrakis (trimethylsilyl)	0.65
7	22.00	Xylulose tetrakis (trimethylsilyl)-	2.24
Phenolic compounds			5.42
8	20.43	Vanillyl alcohol, bis (trimethylsilyl)-deriv.	1.15
9	23.11	Benzoic acid, 3-methoxy-4-[(trimethylsilyl)oxy]-, trimethylsilyl ester	1.41
10	24.25	3-Vanilpropanol, bis (trimethylsilyl)-	0.55
11	24.83	(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl) ethylene glycol tris (trimethylsilyl) ether	0.42
12	27.38	3-Vanil-1,2-bis (trimethylsilyloxy) propane	1.41
13	36.80	1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono (2-ethylhexyl) ester	0.48
Miscellaneous			37.36
1	4.48	Silane, (2-furanylmethoxy) trimethyl-	28.34
2	4.58	3,6-Dioxa-2,7-disilaoctane, 2,2,4,7,7-pentamethyl-	2.71
3	10.55	Urea, N,N'-bis (trimethylsilyl)-	5.70

표 6에 나타난 바와 같이, 전기투석 후 가수분해산물에 포함된 당 및 당 유래 분해산물은 발효공정에서 완전히 이용되지 못하고 일부 남았으며, 이와 같은 성분들은 에탄올 농축 후 에틸아세테이트 가용부 및 불용부에 포함되어 GC/MS에 의해 검출되었다. 리그닌 유래 페놀성 화합물로는 주로 Vanillyl alcohol, bis (trimethylsilyl)-deriv., Benzoic acid, 3-methoxy-4-[(trimethylsilyl)oxy]-, trimethylsilyl ester, 3-Vanilpropanol, bis (trimethylsilyl)-이 확인되었다. 이는 guaiacyl 및 syringyl 리그닌 유도체로부터 파생된 것으로 사료된다. 페놀성 화합물은 항산화 활성을 나타낸다고 보고된 바 있다(Conde et al. 2009). Ezhilan 등(Pharmacognosy Research 4(1), 2012, 11-14)에 의하면 페놀성 화합물은 항산화뿐만 아니라 항균 활성도 갖는다고 보고하였다. 따라서, 본 연구에서 획득한 OA-E 추출물은 항균 활성도 나타낼 것으로 예측된다.

실험결과의 종합

본 발명에서는 화석연료의 고갈로 인해 세계 각국에서 각광받고 있는 대체에너지인 바이오에탄올을 생산ㆍ농축 후 투과증발 잔류물로부터 항산화 활성 여부를 측정하여 부산물의 이용 가능성을 확인하였다. 옥살산 전처리 가수분해산물에 포함된 초산을 전기투석으로 제거하였지만 비이온성 물질인 HMF, 푸르푸랄, 페놀성 화합물은 가수분해산물에 남아 에탄올 발효를 지연시켰다. 생산된 에탄올은 투과증발법에 의해 회수, 농축되었다. 하지만 투과증발 잔류물에는 대부분의 발효저해산물이 잔존하였다. 투과증발 잔류물을 에틸아세테이트로 분획하여 가용부와 불용부, 그리고 미추출부에 대한 항산화 활성(DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, reducing power)을 평가한 결과, 에틸아세테이트 가용부에서 가장 높은 페놀성 화합물을 함유하고 있었으며, 이에 따라 높은 항산화 활성을 나타냈다.

따라서, 본 발명에 따른 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법은 바이오에탄올 생산시 부생성되는 투과증발 잔류물을 폐기하지 않고, 에틸아세테이트로 추출한 다음 용매상(solvent phase) 분획물로부터 항산화 물질을 용이하게 분리해낼 수 있으므로, 식품 등의 보관을 위한 항산화제에 용이하게 이용할 수 있다.

Claims

목질계 바이오매스를 산(acid) 전처리하여 액상 가수분해산물을 얻는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 얻은 액상 가수분해산물을 전기투석 처리하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 전기투석 처리된 액상 가수분해산물을 발효 처리한 다음, 투과증발하여 에탄올을 농축하는 단계(단계 3);
상기 단계 3에서 투과증발 이후에 남는 잔류물을 에틸아세테이트로 추출하여, 용매상(solvent phase) 및 수성상(Aqueous phase)을 포함하는 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계(단계 4); 및
상기 에틸아세테이트 추출물 중에서 용매상(solvent phase) 추출물을 진공건조하여 항산화 물질을 얻는 단계(단계 5);
를 포함하는 목질계 바이오매스로부터 항산화 물질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 1의 산(acid)은 옥살산인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 1의 산(acid) 전처리는 140-200 ℃에서, 30-90분간 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 2의 전기투석은 양이온교환막 및 음이온교환막이 구비된 전기투석장치를 이용하여, 5-15 V 정전압 조건으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 3의 투과증발은 폴리에테르이미드를 지지층으로 하고 폴리(디메틸실록산)을 선택층으로 하는 복합중공사막을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 항산화 물질은 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)은 바닐릴알콜, 비스(트리메틸실릴) 유도체, 벤조산, 3-메톡시-4-[트리메틸실릴)옥시] 유도체, 트리메틸실릴에스테르, 3-바닐프로판올, 비스(트리메틸실릴)-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에틸렌글리콜트리스(트리메틸실릴)에테르, 3-바닐-1,2-비스(트리메틸실록시)프로판, 1,2-벤젠다이카복실산 및 모노(2-에틸헥실)에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법으로 얻은 항산화 물질.
제8항에 있어서,
상기 항산화 물질은 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)인 것을 특징으로 하는 항산화 물질.
제9항에 있어서,
상기 폐놀성 화합물(Phenolic compounds)은 바닐릴알콜, 비스(트리메틸실릴) 유도체, 벤조산, 3-메톡시-4-[트리메틸실릴)옥시] 유도체, 트리메틸실릴에스테르, 3-바닐프로판올, 비스(트리메틸실릴)-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)에틸렌글리콜트리스(트리메틸실릴)에테르, 3-바닐-1,2-비스(트리메틸실록시)프로판, 1,2-벤젠다이카복실산 및 모노(2-에틸헥실)에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항산화 물질.
제8항의 항산화 물질을 포함하는 방부제 조성물.
제11항에 있어서,
상기 방부제 조성물은 식품용인 것을 특징으로 하는 방부제 조성물.
제8항의 항산화 물질을 포함하는 항균제 조성물.