KR20170063445A - 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사슴뿔 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하여, 상기 추출물이 처리된 세포의 활성 산소에 대한 생존력을 향상시킴으로써, 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물 {The pharmaceutical composition for preventing skin aging which has an activity of inhibiting apoptosis caused by oxygen free radical}

본 발명은 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

활성산소는 유해산소라고도 하며, 화학적인 반응도가 높아 세포의 필수 구성물인 단백질, 지질, 핵산 등과 반응하여 세포 내 기능의 변화를 유발하고 결과적으로 세포 손상을 일으킨다. 또한, 핵산을 손상시켜 핵산 염기의 변형과 유리, 결합의 절단, 당의 산화분해 등을 일으켜 유전자 돌연변이를 유발하고, 암의 발생과 관련된 것으로 알려져 있다. 또한, 생리적 기능이 저하되어 각종 질병과 노화의 원인이 되기도 한다.

세포 노화란 세포의 형질 및 기능의 퇴화와 그와 관련하여 세포의 사멸 혹은 세포의 증식이 정지될 때까지의 과정을 말한다. 세포 노화의 원인으로 세포의 대사 산물에 의한 대사저해, 세포막의 구조적, 기능적 변화, 교질원 등의 세포 골격 분자 간 가교결합 증가, 자유라디칼에 의한 세포 내 열화분자 축적, 유전정보의 전사, 번역 과정에서의 과오축적, 치사유전자에 의한 유전적인 세포 수명의 프로그램화, 세포 내 DNA 상해 및 수복 능력의 저하 등이 고려되고 있다. 대부분의 경우, 이들은 염색체 이상 또는 형태적 변화를 수반하여 암세포의 성질이 가지게 된다.

세포의 사멸에는 진핵세포에서 나타나는 세포의 괴사나 병적인 죽음인 네크로시스와 세포 자살을 의미하는 아포토시스가 존재한다. 동물은 세포 사멸을 이용하여 정상적인 발생을 조절할 수 있고, 불필요하거나 비정상적인 세포를 제거하는 등 개체의 항상성을 유지할 수 있다. 이러한 세포사멸은 생리적으로 매우 중요한 현상으로, 생체 내 복잡한 기전에 의해 정교하게 조절되고 있으며, 비정상적인 조절로 인한 부적절한 세포 사멸의 유도, 즉 세포 사멸의 억제 또는 촉진은 많은 질환과 연관되어있다.

상기와 같이, 활성 산소에 의하여 세포의 노화 또는 세포의 사멸이 일어날 경우, 많은 질환이 발생할 수 있으며 특히 암이 발병할 수 있으므로 세포의 노화 또는 세포의 사멸을 억제 또는 예방할 수 있는 약학 조성물이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위한 것으로, 사슴뿔 줄기세포 추출물을 이용하여 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사슴뿔 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하여, 상기 추출물이 처리된 세포의 활성 산소에 대한 생존력을 향상시킴으로써, 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 사슴뿔 줄기세포 추출물은 사슴뿔 기둥의 골막(periosteum) 조직으로부터 얻어진 사슴뿔 줄기세포로부터 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 사슴뿔 줄기세포 추출물은 사슴뿔 기둥으로부터 분리되는 골막(periosteum) 조각을 수득하고, 상기 조각을 슬라이스하고 용해 용액에 배양하여, 용해된 조직을 수득하며, 상기 용해된 조직을 여과하여 원심분리하고, 상기 원심분리에 따라 획득되는 줄기세포를 재배양하며, 상기 재배양된 줄기 세포를 완충액에 현탁하여 획득되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 사슴뿔 줄기세포는 인간 지방 줄기세포에서 발현되는 것과 동일한 c-Myc, Sox2 및 Oct4 mRNA를 발현하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 사슴뿔 줄기세포는 Cripto1, SSEA4, Oct4, Nanog, LGALS1, c-Myc, CD105, CD9, S100A4, N-Myc, Sox2 및 Nestin 중 적어도 하나 이상의 줄기세포 마커 분자 단백질을 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 사슴뿔 줄기세포 추출물의 제조방법을 통하여 효율적으로 사슴뿔 줄기세포를 추출할 수 있으며, 적절한 효과를 갖는 사슴뿔 줄기세포 추출물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 사슴뿔 줄기세포의 추출물을 유효성분으로 포함하여, 상기 추출물이 처리된 세포의 활성 산소에 대한 생존력을 향상시킴으로써, 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖게 되어, 피부 노화 질환을 예방하는 효과를 가질 수 있다.

도 1은 사슴뿔 줄기세포를 분리한 후 배양기에서 배양한 사슴뿔 줄기세포를 나타낸 것이다.
도 2는 배양한 사슴뿔 줄기세포로부터 RNA를 추출한 후 줄기세포 마커들에 대하여 RT-PCR을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 사슴뿔 줄기세포를 분리, 배양한 후 줄기세포의 특징을 나타내는 단백질들에 대하여 웨스턴 블랏한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 살아있는 사슴뿔 줄기세포에 대하여 형광으로 세포 면역학 실험을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Neuro-2a 세포에 사슴뿔 줄기세포의 추출물을 처리한 것을 WST-1 assay로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시를 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 기술된 실시 예에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 하기에 설명되는 본 발명의 실시 예는 당업자에게 본 발명의 사상을 충분하게 전달하기 위한 것임에 유의하여야 한다.

본 발명은 사슴뿔 줄기세포 추출물에 의하여 세포 노화 및 세포 사멸을 억제 또는 예방할 수 있음을 규명한 것에 근거한 것이다. 따라서 한 양태에서 본 발명은 사슴뿔 줄기세포 추출물을 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 피부 세포 노화 및 피부 세포 사멸을 억제 또는 예방할 수 있는 사슴뿔 줄기세포 추출물에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "사슴뿔 줄기세포(antler-derived stem cell)"는 분리된 다능성 세포를 말하며, 대상체의 조직으로부터 직접 추출된 것 또는 이를 인 비트로에서 배양한 것 또는 특정 재조합 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 설명되는 "추출물"은 본 발명의 효과를 나타내는 천연 또는 재조합 유래의 생물학적 물질로서, 예를 들면, 단백질, 핵산 그리고 지질 중 적어도 하나 이상을 포함하며, 세포 전체 또는 그 일부를 융해(lyse), 파쇄(rupture) 및/또는 투과 또는 천공화(permeablization, poration)하여 제조될 수 있는 것을 모두 포함할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 가용성 및/또는 비가용성 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서는 가용성 분획이 사용되며, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, DNA, RNA 성분 및/또는 지질 성분을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서의 가용성 분획은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 성분을 포함할 수 있으며, 또 다른 구현예로 비가용성 분획이 있으며, 이는 지방 성분을 포함할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 질환에 따라 또는 성분에 따라 용액, 현탄액, 에멀젼, 리포좀 제형, 정제, 캡슐, 젤, 시럽, 패치, 연고, 크림, 스프레이 또는 좌제 중 어느 한 가지로 제형화 할 수 있는 세포 노화 또는 세포 사멸을 억제할 수 있는 약학 조성물일 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별히 제한되지 않고, 피부에 붙이는 패치형, 피부에 바르는 연고형, 피부에 분사시키는 스프레이형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있는 제형을 통하여 투여될 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사를 이용하여 투여될 수도 있다.

그리고, 본원 조성물은 본원의 활성을 억제할 수 있는 물질 이외에 질환의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효 성분을 1종 이상 또는 유효 성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "활성 산소"는 삼중항산소의 단계적 환원으로부터 생성되는 초과산화물(superoxide, O₂-), 과산화수소(H₂O₂), 히드록시라디칼(OH) 그리고 일중항산소(¹O₂) 모두를 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "세포 노화"는 세포의 기능 저하, 손상, 사멸, 및/또는 암세포로 전이되는 것을 의미하는 것으로, 이 때, 손상이라 함은 화학적, 물리적, 감염성, 자외선, 방사선 및/또는 외상성 손상에 의한 모든 것을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "예방"은 본원의 융해물, 추출물 또는 조성물의 투여를 통하여 피부의 손상 및 피부 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 포함할 수 있으며, 본원의 추출물을 포함하는 약학 조성물을 피부 노화 증상이 나타나기 전에 투여할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본원에서 사용된 용어 "치료"는 본원에 따른 융해물, 추출물 및 조성물의 투여로 피부와 연관된 각종 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "피부 노화 관련 질환"은 건조 피부염, 소양증, 감염성 피부 질환, 피부 궤양 또는 약물에 대한 이상 반응으로 인한 피부 세포의 노화와 관련된 모든 질환을 포함할 수 있다.

본 발명은 사슴뿔 줄기세포를 분리 및 배양한 후 줄기세포의 특징적인 분자들을 확인하고, 추출물로 제조하여 후술하는 바와 같이 활성산소에 의한 세포노화 예방 및 치료에 사용될 수 있음을 밝힌 것으로 그 적용례가 없다.

본 발명의 실시예를 위해 사용된 실험 단계는 하기와 같이 설명될 수 있다.

1. 사슴뿔 줄기세포의 분리 및 배양

사슴뿔은 포유류 중에서 복합적인 장기를 온전하게 재생할 수 있는 유일무이한 기관이다. 사슴뿔은 개체가 사망에 이르기까지 매해 새로운 사슴뿔을 재생하는 것으로 알려져있으며, 다른 기관과는 비교할 수 없을 정도의 빠른 성장 속도를 가지고 있다. 이러한 사슴뿔의 재생능력은 사슴뿔 줄기세포의 분열능을 뒷받침하는 것으로서, 재생 의학 측면에서 사슴뿔은 다른 기관과는 비교할 수 없는 가치를 지니고 있다.

특히, 사슴뿔 줄기세포는 줄기세포의 특징인 분화능을 갖추고 있어 여러 배양 조건에 따라 골형성세포, 지방형성세포, 연골형성세포 등 다양한 종류의 세포로 분화가 가능하며, 조직 및 기관 형성과 재생에 아주 중요한 역할을 수행할 수 있다. 또한, 사슴뿔 줄기세포는 배아 줄기세포의 특성을 가짐으로써, 배아 줄기세포에서 발현되는 핵심적인 줄기세포 마커들을 발현한다.

상기 사슴뿔 줄기세포는 실험실 내(in-vitro)에서 증식될 수 있으며, 연골세포(chondrocytes), 지방세포(adipocytes), 근관세포(myotubes), 뉴런 세포(neuronal cells) 등과 같이 다양한 계열의 세포로 분화할 수 있다.

먼저, 사슴뿔 줄기세포를 포함하고 있는 사슴뿔 기둥의 골막(periosteum) 조직을 채취하였다. 사슴뿔 줄기세포는 사슴뿔 페디클(pedicle)의 골막(periosteum) 부위에서 분리하는 것이 바람직하나 사슴뿔의 모든 부위에서의 줄기세포를 포함할 수 있다. 사슴뿔의 벨벳을 벗겨내고 드러난 골막을 수술용 매스를 이용하여 세로축을 따라서 절개하여, 가로 길이 약 5mm 정도로 만들어진 골막 조각을 이가 달린 포셉(toothed forcep)을 이용하여 사슴뿔에서 분리하였다. 채취한 골막 조직은 공기 순환을 위해 필터가 달린 플라스크에 보관하여, 아이스 박스의 내부 온도를 4℃ 정도로 유지하며 다음 단계를 위한 목적지까지 배송하였다.

그 후, 사슴뿔 줄기세포의 분리 및 배양은 클린 벤치 안에서 무균조작법으로 시행하였다. 실험용 디쉬에 조직을 올려놓고, 수술용 칼날을 이용하여 조직을 슬라이스하였다. 슬라이스 한 조직을 콜라게나아제(collagenase)가 포함된 용해 용액[DMEM + 항생제(100U/mL penicillin + 100㎍/mL streptomycin) + 콜라게나아제(collagenase) type II(2mg/mL)]이 담긴 디쉬에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양하는 동안 20분 간격으로 부드럽게 조직을 흔들어주었고, 2시간이 경과한 뒤에도 조직이 충분히 용해되어 있지 않으면 추가로 한 시간 더 배양하였다. 이후 용해된 조직을 cell strainer (100μm 크기 매쉬)를 이용하여 거르고 세포 잔해를 제거하였다. 여과된 용액은 350×g로 5분간 원심분리했고, 침전된 세포를 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액으로 총 3회 반복하여 세척하였다. 이후, 세포를 배양용 배지[DMEM + 항생제(100U/mL penicillin + 100㎍/mL streptomycin) + 5% FBS(Fetal Bovine Serum)]에 풀어주고 5% 이산화탄소 조건으로 배양하였다. 이후 배양액은 주 3회 간격으로 교체했고, 계대배양은 세포 포화도가 80~90%에 이르는 시점에서 시행하였다.

2. 사슴뿔 줄기세포의 융해물 제작

사슴뿔 줄기세포 추출물의 제조를 위하여, 배양된 사슴뿔 줄기세포를 차가운 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 수확한 후, 200×g에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 시킨 사슴뿔 줄기세포를 추출 완충액 (1mM DTT(Dithiothreitol), 1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), protease inhibitor cocktail P8340, 0.1% DEPC(Diethylpyrocarbonate) in PBS(Phosphate Buffered Saline))에 현탁하고, 주사기에 연결된 바늘로 수회 통과시켜 융해시킬 수 있다. 이 때, 상기 주사기에 연결된 바늘을 이용하여 융해시키는 것이 바람직하나, 초음파를 이용하여 분해한 후 융해시킬 수도 있다. 그 후, 융해물을 14,000×g에서 15분 동안 원심분리하고, 상층액을 주사기 필터 유니트(0.45μm)에 통과시켜 여과시켰다. in-vitro 조건에서 처리하기 위한 추출 완충액으로는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Welgene, Korea)을 사용하였다. 약 5×10⁶개의 세포를 이용하여 100㎍의 사슴뿔 줄기세포 추출물을 제조하였다.

또한, 인간 지방 줄기세포는 상기 기술된 방법과 동일한 방법으로 배양 및 추출하여 추출물을 제조하였다.

3. RT-PCR을 이용한 줄기세포 마커 발현 분석

배양된 사슴뿔 줄기세포 또는 지방 줄기세포에 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 total RNA를 분리하였다. SuperScript™ III First-Strand Synthesis System을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 각 유전자에 사용된 primer들은 다음과 같다. c-Myc: Forward 5'-CCG AGG AGA ATG TCA AGA-3'; Reverse 5'-CAA GAC TCA GCC AAG GTT-3'. SOX2: Forward 5'-TGT CAA GGC AGA GAA GAG-3'; Reverse 5'-TCA GGC GAA GAA TAA TTT GG-3'. OCT4: Forward 5'-AGG AAG CCG ACA ACA ATG AG-3'; Reverse 5'-CTG AGT AGA GTG TGG TGA AGT G-3'. GAPDH: Forward 5'-ATC CCA TCA CCA TCT TCC AG-3'; Reverse 5'-ATG AGT CCT TCC ACG ATA CC-3'.

4. 줄기세포 마커들에 대한 웨스턴 블랏팅

배양된 사슴뿔 줄기세포를 세척한 후 PBS(Phosphate Buffered Saline) 중에 회수하였다. 단백질 추출물은 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제(Roche, USA)를 포함하는 융해 용액(Lysis buffer(100mM Tris-HCl, pH 7.4; 150mM NaCl; 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride; 1mM EDTA; 1% Triton X-100, 1mM NaF, 1mM Na₃VO₄, protease inhibitor cocktail) RIPA(Radio Immuno Precipitation Assay)로 준비하였다. 그 후, 4℃의 조건에서 13,000×g에서 20분간 원심분리시켜 얻어진 상등액을 사용하여, 25㎍의 총 단백질을 8~12%의 SDS-PAGE에서 전기영동 한 후 PVDF 막으로 전달하였다. 1차 항체로 Cripto1(Abcam, Cat NO. ab19917), SSEA4(Abcam, Cat NO. ab16287), Oct4(Abcam, Cat NO. ab18976), Nanog(Abcam, Cat NO. ab80892), LGALS1(Abcam, Cat NO. ab154351), c-Myc(Abcam, Cat NO. ab51154), CD105(Abcam, Cat NO. ab107595), CD9(Abcam, Cat NO. ab92726), S100A4(Abcam, Cat NO. ab27957), N-Myc(Abcam, Cat NO. ab24193), Sox2(Chemicon Cat NO. AB5603), Nestin(Abcam, Cat NO. ab27952), β-actin(Santa cruz Cat NO. SC-47778)을 사용하였고, 2차 항체로 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 컨쥬게이트 된 항-마우스(anti-mouse) 또는 항-토끼(anti-rabbit) 항체 (1:5000; GE Healthcare)와 배양하여, ECL 키트를 이용하여 발색하였다.

5. 줄기세포 마커들에 대한 면역 세포화학 실험

사슴뿔 줄기세포를 1×10⁴ cells/well로 하여, 8well chamber slide(SPL 30128)에 플레이팅 하고, 2일간 배양한 후에 4% paraformaldehyde로 고정하여 실험을 진행하였다. 1차 항체로 상기 기술한 웨스턴 블랏 실험에 사용된 항체들을 사용하였으며, 2차 항체로 Alexa Fluro 488-conjugated goat anti-rabbit(Life Technologies A11008)와 Alexa Fluro 594-conjugated donkey anti-mouse(Life Technologies A21203)를 이용하였다. 또한, 핵 염색을 위하여 DAPI(1mg/ml, 1:1000 희석)를 사용하였으며 공초점 현미경(chonfocal microscope)으로 cell image를 캡쳐하였다.

6. in-vitro 조건에서의 활성 산소 공격 및 세포생존도 측정

활성산소는 동물 세포 또는 식물 세포들의 대사과정에서 생성되는 산소화합물로 동맥경화, 암 등의 발병 원인과 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 활성 산소는 세포의 노화를 유발하는 것으로 알려져 있다.

마우스 뉴로블라스트 세포(Neuro-2a, American Type Culture Collection, USA)를 웰당 5000개의 밀도로 96웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 10% FBS, 100U 페니실린 및 0.1mg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂/95% 대기 조건에서 하루 동안 배양하였다. 배양 2일째에 DMEM 배지를 사슴뿔 줄기세포 추출물 (100㎍/well)을 포함하는 배지로 교환한 후, 상기와 동일한 방법으로 마우스 Neuro-2a 세포를 배양하였다. 그 후, 마우스 Neuro-2a 세포에 PBS 용액을 처리한 것을 사슴뿔 줄기세포 추출물을 처리한 것에 대하여 대조 및 비교군으로 사용하였다. 배양 3일째에 in-vitro 조건에서 세포의 산화를 위하여 H₂O₂(JUNSEI, cat NO, 7722-84-1)를 이용하여 산화를 24시간 유도하였다. 세포의 생존도는 WST-1 시약(5mmol/L, 1:9, Roche, Mannheim, Germany)을 제조사의 방법대로 사용하여 진행하였고, Microplate reader(Versa)를 이용하여 측정하였다. 측정한 결과는 각 대조군의 OD 값으로 평준화시킨 비로 적정화하였다.

7. 데이터 분석 및 통계

WST-1의 측정값을 비교하기 위하여, 스튜던트의 T-검정을 이용하였다. 모든 결과는 평균±표준 에러로 나타내었다. 통계 분석에 SPSS 21.0(SPSS Inc, Chicago, Ill)을 사용하였고, P-수치는 0.05보다 작은 값을 유의한 것으로 하였다.

<실시예 1> 사슴뿔 줄기세포 배양

본 발명의 <실시예 1>에 따른 사슴뿔 줄기세포의 배양은 상기에서 설명한 것과 실질적으로 동일한 배양 방법으로 수행하였다. 사슴뿔 줄기세포를 분리한 후, 배양기에서 배양하고, 첫 계대를 실시한 결과를 나타낸 것을 도 1에 나타내었다. 도 1은 왼쪽에서부터 각각 1일, 2일, 3일 후의 계대배양 결과를 나타내며, 이를 통하여 사슴뿔 줄기세포의 doubling 시간을 3~4일로 예측할 수 있었다.

<실시예 2> 사슴뿔 줄기세포에서 c-Myc, Sox2, Oct4 mRNA 발현 확인

배아 줄기세포의 특성을 가지는 사슴뿔 줄기세포에서, 배아 줄기세포에서 발현되는 핵심적인 줄기세포 마커들인 c-Myc, Sox2, Oct4에 대한 mRNA의 발현 유무를 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 대조군으로 지방 줄기세포에서 추출한 cDNA를 사용하였으며, 대조군과 실험군의 loading control로 GAPDH를 사용하였다. 상기 도 2의 라인 1은 지방 줄기세포의 cDNA에 대한 각 마커들의 RT-PCR 결과이고, 라인 2는 사슴뿔 줄기세포에 대한 각 마커들의 RT-PCR 결과를 나타낸다.

c-Myc의 경우, 사슴뿔 줄기세포에서의 발현량은 대조군으로 사용된 지방 줄기세포에서의 발현량에 비해 적었지만, band가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

Sox2와 Oct4의 경우, 사슴뿔 줄기세포에서와 대조군으로 사용된 지방 줄기세포에서의 발현량의 차이는 거의 없었으며, band가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 사슴뿔 줄기세포에서 c-Myc, Sox2, Oct4의 mRNA는 인간 지방 줄기세포에서와 마찬가지로 발현됨을 도 2를 통하여 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 사슴뿔 줄기세포에서 줄기세포 마커들의 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인

사슴뿔 줄기세포를 분리, 배양한 후, 줄기세포 마커 분자들의 단백질을 분리하여 Cripto1, SSEA4, Oct4, Nanog, LGALS1, c-Myc, CD105, CD9, S100A4, N-Myc, Sox2, Nestin과 같은 줄기세포 마커 분자들이 발현함을 웨스턴 블랏으로 확인한 것을 도 3에 나타내었다. 본 발명의 <실시예 3>에 따른 웨스턴 블랏은 상기에서 설명한 것과 실질적으로 동일한 1차 항체와 2차 항체를 사용하여 수행되었다.

도 3의 라인 1은 대조군으로서 지방 줄기세포로부터 분리한 상기 각각의 마커 분자들에 대하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 것이고, 라인 2는 사슴뿔 줄기세포로부터 분리한 상기 각각의 마커 분자들에 대하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 것이다.

지방 줄기세포와 사슴뿔 줄기세포에서 각각의 마커 분자들의 발현량은 서로 비슷하거나 상이할 수 있지만, 각각의 마커 분자들이 band를 형성한 것을 확인함으로써 Cripto1, SSEA4, Oct4, Nanog, LGALS1, c-Myc, CD105, CD9, S100A4, N-Myc, Sox2, Nestin과 같은 줄기세포 마커 분자들이 사슴뿔 줄기세포에서도 발현하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4> 사슴뿔 줄기세포에서 줄기세포 마커들의 단백질 발현을 면역 세포 화학적으로 확인

사슴뿔 줄기세포로부터 분리한 줄기세포 마커들의 단백질 발현 여부를 직접으로 확인할 수 있는 세포 면역학적 실험으로 DAPI를 이용하여 형광 염색을 수행하였다. 본 발명의 <실시예 4>에 따른 세포 면역학적 실험은 상기에서 설명한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다. 또한, 상기 <실시예 3>의 웨스턴 블랏에서 사용한 1차 항체와 실질적으로 동일한 항체를 사용하였고, Alexa Fluro 488-conjugated goat anti-rabbit 및 Alexa Fluro 594-conjugated donkey anti-mouse 를 2차 항체로 사용하였다.

도 4는 DAPI로 형광 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 좌측에 배열된 이미지는 모든 세포들의 핵을 염색시키는 DAPI를 사용하여 사슴뿔 줄기세포를 형광 염색한 것을 나타내며, 가운데에 일렬로 배열된 이미지는 C-Myc, CD9, CD105, Cripto1, Nanog, Oct4, N-Myc, SSEA4, S100A4, LGALS1 및 SOX2에 대한 항체를 사용하여 형광 염색한 결과이며, 이들이 사슴뿔 줄기세포에 발현되는 것을 나타낸다. 도 4의 우측에 배열된 이미지는 좌측 이미지와 가운데 이미지 신호를 겹쳐(Merge) 본 이미지이며, 이 때 상당히 많은 부분이 겹쳐지는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 일반적으로 알려져 있는 줄기세포 마커들이 사슴뿔 줄기세포에서도 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 사슴뿔 줄기세포 추출물에 의한 세포 생존도(viability) 향상

본 발명의 <실시예 5>에 따른 활성 산소에 대한 세포 보호 효과를 조사하기 위한 방법은 상기에서 설명한 바와 실질적으로 동일하다. 배양된 Neuro-2a 세포에 사슴뿔 줄기세포 추출물을 처리하고, H₂O₂로 1일(24시간) 세포 산화를 유도한 후, WST-1 assay로 세포 생존도를 측정하였다.

도 5는 WST-1 assay를 이용하여, 사슴뿔 줄기세포 추출물이 처리된 Neuro-2a 세포의 세포 생존도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 5의 (A)는 Neuro-2a 세포를 PBS 용액으로 처리하고, H₂O₂를 이용하여 1일(24시간) 동안 세포 산화를 유도하기 전과 후를 나타낸 것이다. 도 5의 (B)는 Neuro-2a 세포를 사슴뿔 줄기세포 추출물을 처리하고, H₂O₂를 이용하여 1일(24시간) 동안 세포 산화를 유도하기 전과 후를 나타낸 것이다. 도 5의 (C)는 PBS 용액을 처리한 대조군과 사슴뿔 줄기세포 추출물을 처리한 군의 세포 생존도를 WST-1 assay를 이용하여 측정한 결과를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 상기 막대 그래프에서 가로축은 대조군과 실험군 각각의 세포 산화를 유도하기 위하여 처리한 H₂O₂의 농도를 0μM, 500μM, 1000μM로 나타내고, 세로축은 세포 생존도를 대조군과의 비율로 나타낸 것이다. 상기 막대 그래프에서 수직선은 평균±표준 편차를 나타내며, **은 p < 0.01인 것을 실험군과 대조군에서 비교한 것이고, ##은 p<0.01인 것을 H₂O₂의 농도 500μM과 1000μM로 처리한 대조군 내에서 비교한 것이며, n.s는 그 값이 서로 차이가 없음을 뜻한다.

상기 도 5의 (C)에 나타난 막대 그래프를 통하여, H₂O₂의 농도가 증가할수록 PBS 용액으로 전처리한 Neuro-2a 세포보다 사슴뿔 줄기세포 추출물로 전처리한 Neuro-2a 세포의 생존력이 훨씬 더 큰 것을 알 수 있다. 또한, 이를 통하여 사슴뿔 줄기세포 추출물이 항산화 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

또한, 이로부터 항산화 효과를 나타내는 사슴뿔 줄기세포 추출물이 활성 산소로부터 유발되는 세포의 노화 또는 세포의 사멸을 억제하거나 예방할 수 있는 것을 확인할 수 있다.

Claims (5)

1. 사슴뿔 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하여, 상기 추출물이 처리된 세포의 활성 산소에 대한 생존력을 향상시킴으로써, 활성산소로 인한 세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 사슴뿔 줄기세포 추출물은 사슴뿔 기둥의 골막(periosteum) 조직으로부터 얻어진 사슴뿔 줄기세포로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 사슴뿔 줄기세포 추출물은
   사슴뿔 기둥으로부터 분리되는 골막(periosteum) 조각을 수득하고, 상기 조각을 슬라이스하고 용해 용액에 배양하여, 용해된 조직을 수득하며, 상기 용해된 조직을 여과하여 원심분리하고,
   상기 원심분리에 따라 획득되는 줄기세포를 재배양하며, 상기 재배양된 줄기 세포를 완충액에 현탁하여 획득되는 것을 특징으로 하는
   피부 노화 질환 예방용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 사슴뿔 줄기세포는 인간 지방 줄기세포에서 발현되는 것과 동일한 c-Myc, Sox2 및 Oct4 mRNA를 발현하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 사슴뿔 줄기세포는 Cripto1, SSEA4, Oct4, Nanog, LGALS1, c-Myc, CD105, CD9, S100A4, N-Myc, Sox2 및 Nestin 중 적어도 하나 이상의 줄기세포 마커 분자 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 질환 예방용 약학 조성물.
   

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