KR20170063399A

KR20170063399A - F. novicida 유래 Cas9을 포함하는 유전체 교정용 조성물

Info

Publication number: KR20170063399A
Application number: KR1020160160813A
Authority: KR
Inventors: 김진수; 이승환; 김광은
Original assignee: 기초과학연구원
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2017-06-08
Also published as: WO2017095111A1; KR101906491B1

Abstract

본 발명의 방법을 이용하면, 기존의 S.pyogene Cas9 단백질을 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 제한적인 면을 해결할 수 있으므로, 유전체 교정기술에 효율적으로 이용될 수 있다.

Description

F. novicida 유래 Cas9을 포함하는 유전체 교정용 조성물{Composition for Genome Editing comprising Cas9 derived from F. novicida}

F. novicida 유래의 Cas9 단백질을 이용한 유전체 교정 기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로, F. novicida 유래의 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산 단백질, 상기 리보핵산 단백질을 포함하는 유전체 교정용 조성물, 상기 리보핵산 단백질을 이용한 유전체 교정 방법, 상기 리보핵산 단백질을 도입하여 형질전환체를 제조하는 방법, 및 상기 제조 방법에 의하여 제조된 형질전환체가 제공된다.

현재 박테리아 면역체계의 일종인 CRISPR-Cas9 시스템은 타겟 유전자를 특이적, 효율적으로 자를 수 있는 특성 때문에, 다양한 분야에서 광범위하게 사용되고 있는 추세이다. 유전자 가위라고도 불리어지는 이러한 Cas9 단백질은, 타겟 DNA를 자르기 위해 특이적인 뉴클레오타이드 서열(PAM)의 인식을 필요로 한다. 대표적인 S. pyogene Cas9의 PAM으로는 NGG 시퀀스가 있고, 이중나선의 DNA 구조를 생각할 때 매 8bp마다 목표유전자의 내부에 타겟 시퀀스를 설정할 수 있다. 이렇게 PAM 시퀀스를 기반으로 DNA에 결합한 Cas9 유전자는 PAM 시퀀스를 기점으로 3bp 앞을 blunt-end 형식으로 자르게 된다.

이런 S. pyogene Cas9의 특징들은 타겟을 자르는데 특이성을 부여하는 동시에 제한적인 성격을 가지므로, 현재 다른 박테리아 종에서 얻은 ortholog Cas9들을 이용하여 기존 S. pyogene Cas9 (SpCas9)의 제한적인 면을 보강하려는 연구가 진행되고 있다.

본 발명은 F. novicida (Francisella novicida) Cas9 단백질을 이용한 유전체 교정 기술을 제공한다.

일 예는 F. novicida (Francisella novicida) Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산 단백질을 제공한다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함하는, 유전체 교정용 조성물을 포함하는 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 세포 및/또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 유전체 교정 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 세포 및/또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 형질 전환체의 제조 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 형질 전환체의 제조 방법에 의하여 제조된 형질 전환체를 제공한다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입시킨 재조합 세포를 제공한다.

본 명세서에서는 기존의 CRISPR-Cas9 시스템에 사용되는 S. pyogene Cas9 단백질의 단점을 보완할 수 있는 새로운 Cas9 단백질을 발굴하기 위한 연구의 일환으로 기존에 알려진 Cas9 ortholog들 중에서 Francisella novicida라는 학명을 가진 박테리아 종으로부터 Cas9 ortholog (FnCas9)를 분리하여 분자수준 및 세포수준에서 표적 (타겟; target) 유전자를 절단하는 원리를 규명하여, 이를 이용한 유전체 교정 기술을 제공한다.

상기 유전체 교정 기술에 따르면, 기존의 S. pyogene Cas9 단백질을 이용한 CRISPR-Cas9 시스템의 제한 사항을 극복할 수 있으므로, 유전체 교정에 효율적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, F. novicida Cas9 단백질을 이용한 CRISPR-Cas9 시스템으로 타겟 DNA의 원하는 위치에서 접합말단 형태의 절단이 가능하다. 또한, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, F. novicida Cas9 단백질을 이용한 CRISPR-Cas9 시스템으로 세포 내 특정유전자의 교정이 가능하다. 또한, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, F. novicida Cas9 단백질을 이용한 CRISPR-Cas9 시스템으로 세포 내 특정유전자에 효율적인 외부 유전자 도입이 가능하다.

본 명세서에서, 용어 '유전체 교정 (genome editing)'은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 유전자의 표적 부위에서의 절단에 의한 핵산의 결실, 삽입 등에 의하여 유전자 기능을 상실, 변경, 및/또는 회복 (수정) 시키는 것을 의미하기 위하여 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 일 예는 Francisella novicida에서 유래하는 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산 단백질 (Cas9 단백질-가이드 RNA 복합체; Cas9 시스템이라고도 칭함)을 제공한다.

Cas9 (CRISPR associated protein 9)는 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) type II RNA-guided DNA endonuclease의 하나로, RNA 가이드 엔도뉴클레아제 (RNA-guided endonuclease; RGEN)이며, 다양한 원핵생물의 면역체계를 담당한다.

본 명세서에서 제공되는 유전자 교정 기술에서 사용되는 Cas9 단백질은 Francisella novicida에서 유래하는 단백질로서 Protein Data Bank (PDB) accession No. 5B2O (Crystal structure of Francisella novicida Cas9 in complex with sgRNA and target DNA (TGG PAM))에 기재된 아미노산 서열 (서열번호 1)을 갖는 것일 수 있다.

상기 Francisella novicida 유래 Cas9 단백질은 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 일 예로, 상기 Cas9 단백질은 세포 침투 펩타이드 및/또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 적용할 수 있다.

또한, 상기 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자는 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 상기 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트는 상기 상기 Cas9 단백질을 발현시키기 위한 프로모터 서열 등의 조절 서열, 또는 여기에 더하여, NLS 서열을 포함할 수 있다. 상기 NLS 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 특히, 상기 Cas9 단백질 또는 이를 포함하는 리보핵산 단백질이 진핵 세포 및/또는 진핵 유기체에 적용되는 경우에, 상기 NLS 서열이 필요할 수 있다.

상기 상기 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자는 분리 및/또는 정제를 위한 태그 또는 상기 태그를 암호화하는 핵산 서열과 연결될 수 있다. 일 예로, 상기 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그 등과 같은 작은 펩타이드 태그, GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그 등으로 이루어진 군에서 적절하게 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 DNA 특이적인 RNA (예컨대, DNA의 표적 부위와 혼성화 가능한 RNA)를 의미한다.

상기 가이드 RNA는, 목적하는 유전자 교정을 위하여, 두 개의 가이드 RNA, 즉, 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 추가적인 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하며, crRNA와 tracrRNA가 부분적으로 결합된 crRNA:tracrRNA 복합체 (이중 가이드 RNA (dual guide RNA)) 형태, 또는 상기 crRNA (일부 또는 전부)와 tracrRNA (일부 또는 전부)가 링커를 통하여 연결되어 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)의 형태일 수 있다.

일 예에서, Francisella novicida 유래의 Cas9 단백질을 포함하는 Cas9 시스템에 사용되는 crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:

5'-(N_cas9)m-GUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC-3' (일반식 1; 서열번호 2)

상기 일반식 1에서,

N_cas9는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위로서 표적 유전자의 표적 부위에 따라서 결정되는 부위이며, m은 상기 타겟팅 서열 부위에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 16 내지 24의 정수 또는 18 내지 22의 정수 일 수 있고, 상기의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

상기 타겟팅 서열 부위의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 28개의 뉴클레오타이드(GUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC; 서열번호 3)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이다.

본 명세서에서, 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열 (보다 구체적으로, 유전자 표적 부위의 DNA 2중 가닥 중 PAM이 존재하는 가닥의 반대 가닥의 뉴클레오타이드 서열)과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하, 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용된다).

또한, Francisella novicida 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 tracrRNA는 다음의 서열번호 4 로 표현될 수 있다:

5'- GUACCAAAUAAUUAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA-3' (서열번호 4)

상기 서열번호 4에서, 밑줄로 표시한 66개의 뉴클레오타이드 (AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA; 서열번호 5)를 포함하는 부위는 tracrRNA의 필수적 부분으로, sgRNA를 구성하는데 사용될 수 있다.

또한, Francisella novicida 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 sgRNA는 상기 Cas9의 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조를 형성하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서 crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.

crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위 및 tracrRNA의 필수적 부위는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 링커는 'GAAA'의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 sgRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:

5'-(N_cas9)_m-GUUUCAGUUGCU-(링커)-AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA-3' (일반식 2; 서열번호 6)

상기 일반식 2에서,

N_cas9는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위로서 표적 유전자의 표적 부위에 따라서 결정되는 부위이며, m은 상기 타겟팅 서열 부위에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 16 내지 24의 정수 또는 18 내지 22의 정수 일 수 있고;

상기 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며,

상기 타겟팅 서열 부위 및 링커에 포함된 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택된 것일 수 있고, 예컨대, 'GAAA'일 수 있다.

상기 crRNA (예컨대, 일반식 1로 표현됨) 또는 sgRNA (예컨대, 일반식 3으로 표현됨)는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.

상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(66nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 앞서 설명한 바와 같은 일반식 1로 표현되는 crRNA 및 서열번호 4로 표현되는 tracrRNA를 포함하거나, 일반식 2로 표현되는 sgRNA를 포함하는 가이드 RNA 분자를 제공한다. 상기 가이드 RNA 분자는 Francisella novicida 유래 Cas9 단백질과 함께 사용하기 위한 것일 수 있다.

상기 리보핵산 단백질은 이를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 통하여 유전자 교정 하고자 하는 생체 내 또는 세포 내에 전달되어 생체 내 또는 세포 내에서 발현 및 리보핵산 단백질 복합체 형태로 형성되어 작용하거나, 생체 외 (in vitro)에서 형성된 Francisella novicida 유래 Cas9과 in vitro 생성된 가이드 RNA가 복합체를 형성하여 생성되며, 이러한 복합체 (리보핵산 단백질) 자체를 주입, 전기천공, 리포펙션 등의 방법으로 생체 내 또는 세포 내에 직접 투입되어 작용하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 Francisella novicida 유래 Cas9 단백질을 암호화하는 제1 핵산 분자 및 가이드 RNA를 암호화하는 제2 핵산 분자를 포함한다. 상기 가이드 RNA를 암호화하는 제2 핵산 분자는 앞서 설명한 crRNA의 암호화 핵산 분자 및 tracrRNA의 암호화 핵산 분자, 또는 sgRNA를 암호화하는 핵산 분자일 수 있다.

다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 Francisella novicida 유래 Cas9 단백질을 암호화하는 제1 핵산 분자를 포함하는 제1 재조합 벡터 및 가이드 RNA를 암호화하는 제2 핵산 분자를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함하거나, 상기 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자를 함께 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시켜서 제조된 것일 수 있다.

상기 핵산 분자는 발현될 숙주 세포의 발현 시스템에서 발현되기에 적절한 코돈들로 optimize된 것일 수 있다.

유전체 교정용 조성물은 세포 및/또는 유기체의 유전체 교정에 적용될 수 있으며, 상기 세포 및/또는 유기체는 진핵 세포 또는 진핵 유기체일 수 있다. 상기 진핵 세포 및/또는 진핵 유기체는, 예컨대, 진핵 세포 (예컨대, 효모 등의 균류, 진핵 동물 유래 및/또는 진핵 식물 유래 세포 (예컨대, 배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등), 진핵 동물 (예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등), 및 진핵 식물 (예컨대, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함하는, 유전체 교정용 조성물을 세포 및/또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 유전체 교정 방법을 제공한다.

본 명세서에서 제공되는 유전체 교정 방법은 타겟 유전자의 타겟 부위에서의 절단뿐 아니라, 상기 절단에 의하여 생성된 접합말단을 생성함으로써, 외래 유전자를 높은 정확도로 유전체에 도입하는데 유용하게 적용될 수 있다.

일 예에서, 상기 유전체 교정은 유전체의 타겟 유전자의 타겟 부위에 절단을 생성시키는 거셍 대하여, 절단 위치에 외래 유전자를 도입 (삽입)하는 것을 추가로 의미할 수 있다. 이에, 상기 유전체 교정 조성물은 외래 유전자를 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 별개 또는 동일한 재조합 벡터 또는 재조합 세포를 통하여 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전체 교정 방법은 외래 유전자를 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 별개의 또는 동일한 재조합 벡터 또는 재조합 세포를 통하여 상기 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 예는 리보핵산 단백질, 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 외래 유전자와 함께 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는, 외래 유전자의 유전체 도입 방법을 제공한다. 상기 외래 유전자는 상기 외래 유전자가 도입될 세포 또는 유기체와 동종 또는 이종의 것일 수 있으며, 상기 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 동일하거나 상이한 재조합 벡터 또는 재조합 세포에 의하여 도입될 수 있다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함하는 포함하는 형질 전환체 제조용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함하는, 유전체 교정용 조성물을 세포 및/또는 유기체에 도입(전달)하는 단계를 포함하는 형질 전환체의 제조 방법을 제공한다. 상기 형질 전환 유기체가 형질전환 진핵 동물 또는 형질전환 진핵 식물인 경우, 상기 제조 방법은 상기 전달하는 단계와 동시 또는 그 이후에 상기 진핵 세포의 배양 및/또는 분화 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 형질 전환체의 제조 방법에 의하여 제조된 (즉, 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 도입된(포함하는)) 형질 전환체를 제공한다.

상기 세포 및/또는 유기체는 진핵 세포 또는 진핵 유기체일 수 있다. 상기 진핵 세포 및/또는 진핵 유기체는, 예컨대, 진핵 세포 (예컨대, 효모 등의 균류, 진핵 동물 유래 및/또는 진핵 식물 유래 세포 (예컨대, 배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등), 진핵 동물 (예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등), 및 진핵 식물 (예컨대, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 유전체 교정 방법 및 형질 전환 유기체 제조 방법 있어서, 상기 진핵 동물은 인간을 제외한 것일 수 있으며, 상기 진핵 세포는 인간을 포함한 진핵 동물에서 분리된 세포를 포함할 수 있다.

상기 방법들에 있어서, 상기 리보핵산 단백질, 이를 암호화하는 핵산분자, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터/재조합 세포는 세포 및/또는 유기체, 예컨대, 진핵 세포 및/또는 진핵 유기체에 주입 (예컨대, 혈관 주입, 피하 주입, 복강 주입, 경구 주입, 목적 부위 국소(직접) 주입 등), 전기천공법(electroporation), 또는 리포펙션 (lipofection) 등의 방법으로 직접 투입될 수 있다.

도 1은 정제된 재조합 FnCas9 단백질의 SDS-PAGE 전기영동한 결과이다.
도 2a 내지 도 2c는 FnCas9의 타겟 DNA 상에서의 PAM 뉴클레오타이드 서열 및 절단지점 규명한 과정 및 결과를 보여주는 것으로,
2a는 정제된 재조합 FnCas9과 guide RNA를 이용한 In-vitro cleavage 분석방법을 모식적으로 보여주며,
2b는 2a의 PCR (PAM Randomized PCR, Stuffer PCR, Overlap PCR) 과정을 확대하여 보여주고,
2c는 In-vitro cleavage 실험후, Targeted deep-sequencing을 통해 얻어진 데이터중 FnCas9에 의해 잘려진 단편들 뉴클레오타이드 서열 정보를 합쳐서 도식화한 PAM 뉴클레오타이드 서열을 보여주는 로고 도식이다.
도 3a 및 3b는 FnCas9이 인식하는 PAM 뉴클레오타이드 서열 확인을 위한 플라스미드 절단 실험 결과를 보여주는 것으로,
3a는 CCR5 유전자의 PCR 산물을 dual-guide RNA와 single-guide RNA로 각각 잘라서 수행한 활성도 측정실험 결과를 보여주는 것이고 (타겟 뉴클레오타이드 서열은 밑줄로, crRNA와 tracrRNA를 잇는 GAAA 링커는 점으로 각각 표시됨),
3b는 플라스미드 절단을 이용한 FnCas9 PAM 뉴클레오타이드 서열 확인 실험 결과를 보여주는 것으로, Site-directed mutation으로 단일 염기가 치환되어 유전자 CCR5의 동일한 타겟 뉴클레오타이드 서열 뒤에 각각 서로 다른 PAM 뉴클레오타이드 서열을 가진 plasmid를 제한효소 NcoI으로 linearization시키고, 연이어서 정제된 FnCas9 과 guide RNA복합체를 처리한 이후, 0.8% Agarose gel 로 전기영동한 결과이다 (RGEN (RNA guided endonuclease): guide RNA + FnCas9).
도 4a 내지 4c는 FnCas9에 의한 타겟 DNA 절단지점의 5'-접착말단을 확인한 결과를 보여주는 것으로, CCR5 타겟 사이트를 포함한PCR 산물을 재조합 SpCas9 과 FnCas9으로 자른 뒤, 잘린 단편들을 표준적인 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 방식을 통해 비교분석한 결과이다. 4a는 SpCas9 단백질에 의해 잘린 타겟 CCR5 Locus 1DNA의 Run-off 시퀀싱 시퀀싱 결과이고, 4b는 FnCas9 단백질에 의해 잘린 CCR5 Locus 1 DNA의 표준적인 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 결과이며, 4c는 4b에서 얻은 마지막 뉴클레오타이드 서열이 polymerase의 A-tailing에 의한 것임을 보이기 위해, FnCas9 단백질에 의해 잘린 동일 타겟, 다른 부위 (CCR5 locus2) DNA의 표준적인 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)을 진행한 결과이다 (화살표는 타겟 CCR5 뉴클레오타이드 서열중에서 단백질들에 의해 절단된 부분을 각각 나타내며, 4b 및 4c에서 절단된 부분이후에 읽혀진 뉴클레오타이드 서열은 DNA polymerase 에 의한 A-tailing을 나타낸다).
도 5a 및 5b는 FnCas9 RNP (RNA-protein 복합체)의 세포내 전달을 이용한 세포 유전체 교정 결과를 보여주는 것으로,
5a는 T7E1 assay를 이용한 Guide RNA 길이변화에 따른 FnCas9의 K562 세포내에서의 유전자 교정 분석 결과로서, 변이가 생긴 타겟 DNA가 T7E1에 의해 잘린 정도(%)를 표시하였으며,
5b는 T7E1 assay에 사용된 동일한 실험군과 대조군을 AAVS1 targeted deep-sequencing으로 분석한 결과로서, 변이 (Insertion 과 deletion %)가 생긴 정도를 정량화하여 히스토그램화 하였고, SpCas9과 FnCas9 에 의해 타겟 DNA가 잘린 대표적인 패턴을 나타내었다 (화살표는 각각의 단백질에 의해 잘린 절단 위치를 나타냄).
도 6은 세포내 다양한 유전자에서 FnCas9 RNP (RNA-protein 복합체)의 세포내 전달을 이용한 세포 유전체 교정 결과를 보여주는 것으로, (가)는 HEK293세포 유전체의 CCR5 (TS1) 유전자 교정후 T7E1 assay및 deep-sequencing으로 확인한 결과를 보여주며 (FnCas9단백질과 CCR5 (TS1)특이적인sgRNA 를 사용하여 세포내 전달후 48시간이후 CCR5 (TS1) 위치를 PCR 증폭하여 T7E1 효소처리하여 정상유전자에 비해 돌연변이가 정확히 유도되었는지 확인할 수 있고, 별 모양 마크는 PCR 산물이 T7E1 효소에 의해 절단된 산물을 나타내고, 하단에 기재된 수치는 PCR 증폭산물을NGS(Next Generation Sequencing)를 시행하여 분석한 수치임), (나)는 HEK293세포 유전체의 CCR5 (TS1) 유전자를 비롯하여 여러 유전자(CCR5(TS2), AAVS1, NRAS, EMX1)에 대해서 FnCas9을 이용해 돌연변이가 유도되었는지 여부를 deep-sequencing (NGS) 으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 FnCas9을 이용한 세포내 목표유전자로의 외부유전자 삽입 모식도이다. 프로모터가 없고, GFP유전자를 포함한 플라스미드를 제작하여 FnCas9-guideRNA 복합체와 함께 세포내로 전달하게 된다. 플라스미드와 세포내 게놈유전자의 타겟 지역에 FnCas9에 의해 5'-접합말단이 각각 생기게 되고, 이를 이용하여 외부 유전자인 GFP가 NHEJ 방식과 유사하게 효율적으로 결합되어 세포내 게놈유전자로 삽입되게 된다. 내부 프로모터 존재 하에서만 타겟 단백질이 발현됨에 따라 GFP 형광시그널을 확인할 수 있다. FnCas9에 의해 잘리는 플라스미드와 게놈 DNA의 각 부분은 붉은 화살표로 표시되었다.
도 8a 및 8b는 FnCas9을 이용한 세포내 목표유전자로의 외부유전자 삽입 (Knock-in) 실험 과정 및 결과를 보여주는 것으로,
8a는 FnCas9에 의해 세포내 타겟 유전자에 외부유전자를 효율적으로 삽입가능한지 여부를 관측하기 위한 실험설계 모식도를 나타내며 (HEK293세포내 특정 유전자 (CCR5 (TS1)) 에 작동하는 sgRNA와 FnCas9을 전달하고 동시에 Blunt(비접합말단), Incorrect(접합말단 이면서 타겟절단면과 mis-match), Correct(접합말단 이면서 타겟절단면과 match) 형식의 DNA를 전달하여 어느정도로 세포내 유전자에 Knock-in 되는지 측정할 수 있고, 붉은 삼각형은 FnCas9에 의한 절단면을 나타냄),
8b는 FnCas9과 SpCas9에 의한 HEK293세포내 특정 유전자 (CCR5 (TS1))로의 삽입(Knock-in) 효율 deep-sequencing비교분석 결과를 나타낸다 (Y축에서 회색부분(other indel; ①)은 전체 돌연변이가 유도된 비율(%)을 나타내고, 주황색(partial KI; ②)은 부분적으로 외부유전자가 삽입된 비율(%), 푸른색(complete KI; ③)은 완벽하게 외부유전자가 삽입된 비율(%)을 나타냄).

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1. FnCas9 재조합 단백질의 분리 및 정제

FnCas9 단백질 (PDB 5B2O 참조; 서열번호 1)의 C-말단에 (6x)His-tag이 결합된 형태를 암호화하는 핵산 분자를 Gibson assembly(NEB)를 이용하여 plasmid (pET28-a; Novagen)에 클로닝한 후, 박테리아 시스템 박테리아 시스템 (Rosetta; Novagen)에 도입시키고 18℃에서 24시간동안 배양하여 FnCas9 단백질을 발현시킨 후, Ni-NTA 컬럼을 사용해 분리 및 정제하였다. 상기 정제 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 사이즈 185kDa의 순도 높은 상태의 FnCas9 단백질의 생성을 확인하였다(도 1).

또한, 가이드 RNA는 DNA template 를 토대로 T7 RNA polymerase(New England Biolabs)에 의한 In-vitro transcription을 수행하고, 제조자 사용 설명서에 따라서 RNA를 합성한 후 DNAase (Ambion)를 사용하여 DNA template을 제거하였다. Expin Combo kit (GeneAll)과 이소프로판올 침전에 의하여 전사된 RNA를 정제하였다. 상기 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 아래의 표 1에 정리하였다.

RNA type	Sequence (5' to 3')
crRNA (CCR5 Locus 1 target)	GUGACAUCAAUUAUUAUACAUGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 7)
crRNA (CCR5 Locus 2 target)	GGTAGAGCGGAGGCAGGAGGCGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 8)
tracrRNA	GUACCAAAUAAUUAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 4)
Single-guide RNA (CCR5 Locus 1 target)	GUGACAUCAAUUAUUAUACAU GUUUCAGUUGCU GAAA AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 9)
Single-guide RNA (CCR5 Locus 2 target)	GGTAGAGCGGAGGCAGGAGGC GUUUCAGUUGCU GAAA AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 10)
Single-guide RNA (AAVS1 target)	GCUCCCUCCCAGGAUCCUCUC GUUUCAGUUGCU GAAA AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 11)
crRNA (AAVS1 target,gx18)	GCCCUCCCAGGAUCCUCUCGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 12)
crRNA (AAVS1 target,gx19)	GUCCCUCCCAGGAUCCUCUCGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 13)
crRNA (AAVS1 target,gx20)	GCUCCCUCCCAGGAUCCUCUCGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 14)
crRNA (AAVS1 target,gx21)	GUCUCCCUCCCAGGAUCCUCUCGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 15)
crRNA (AAVS1 target,gx22)	GCUCUCCCUCCCAGGAUCCUCUCGUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC(서열번호 16)
Single-guide RNA (CCR5-TS1 target, gx20)	GUGGGGUGGGAUAGGGGAUACGUUUCAGUUGCUGAAAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 17)
Single-guide RNA (CCR5-TS2 target, gx20)	GUGACAUCAAUUAUUAUACAUGUUUCAGUUGCUGAAAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 18)
Single-guide RNA (AAVS1 target, gx20)	GCUCCCUCCCAGGAUCCUCUCGUUUCAGUUGCUGAAAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 19)
Single-guide RNA (NRAS target, gx20)	GGGUAAGGGGGCAGGGAGGGAGUUUCAGUUGCUGAAAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 20)
Single-guide RNA (EMX1 target, gx20)	GGAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUCAGUUGCUGAAAAUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA(서열번호 21)

상기 표 1에서 밑줄로 표시한 부분은 타겟 DNA의 타겟 부위의 뉴클레오타이드 서열 (타겟 서열)에 해당하며, 굵은 글씨로 표시한 부분은 crRNA와 tracrRNA를 연결하여 sgRNA (single-guide RNA)에서 crRNA의 일부와 tracrRNA의 일부를 연결하는 링커(GAAA)이고, 상기 링커 (GAAA)의 5' 말단쪽 이탤릭체로 표시된 부분은 crRNA의 일부를, 3' 말단쪽 이탤릭체로 표시된 부분은 tracrRNA의 일부를 각각 나타낸다.

상기 가이드 RNA에 의하여 타겟팅되는 표적 서열을 아래의 표 2에 정리하였다:

gene	Target Sequence (5' to 3')
CCR5 Locus 1 target	TGACATCAATTATTATACAT(서열번호 22)
CCR5 Locus 2 target	GTAGAGCGGAGGCAGGAGGC(서열번호 23)
AAVS1 target, gx20	CTCCCTCCCAGGATCCTCTC(서열번호 24)
AAVS1 target, gx18	CCCTCCCAGGATCCTCTC(서열번호 25)
AAVS1 target, gx19	TCCCTCCCAGGATCCTCTC(서열번호 26)
AAVS1 target, gx21	TCTCCCTCCCAGGATCCTCTC(서열번호 27)
AAVS1 target, gx22	CTCTCCCTCCCAGGATCCTCTC(서열번호 28)
CCR5-TS1 target, gx20	TGGGGTGGGATAGGGGATAC(서열번호 29)
CCR5-TS2 target, gx20	TGACATCAATTATTATACAT(서열번호 30)
NRAS target, gx20	GGTAAGGGGGCAGGGAGGGA(서열번호 31)
EMX1 target, gx20	GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA(서열번호 32)

실시예 2. 유전자 가위 FnCas9의 타겟 DNA에서의 PAM 뉴클레오타이드 서열 및 절단지점 규명

FnCas9이 타겟 DNA를 인식하고 절단하는 원리를 규명하기 위해, DNA 인식에 필요하다고 알려진 PAM 뉴클레오타이드 서열을 In-vitro 상에서 규명하는 시험을 수행하였다 (도 2a 참조).

우선 타겟 DNA 뉴클레오타이드 서열 (CCR5 (Genbank Accession number: U54994.1) 및 AAVS1(Genbank Accession number: S51329.1) 중 PAM으로 인식되는 부분을 무작위로 설정한 DNA 단편들의 라이브러리를 만들고, deep-sequencing 분석을 위해 PAM 뒤의(3' 방향) 특정 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가진 DNA 염기단편을 overlap PCR을 통해 길이를 연장시켜 최종 라이브러리를 형성하였다. 상기 과정을 도 2b에 모식적으로 나타내었다.

도 2b에서 사용된 프라이머 서열은 아래와 같다:

F1 primer: GGACTATCATATGCTTACCGTAACT (서열번호 33)

R1 primer: CTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTNNNNNNNNNNGAGCTGGGACCACCTTATAT (서열번호 34)

F2 primer: AAGAAAGCAAGAGGATGGAGAGCACGCTGTAGGTATCTCAGTTC (서열번호 35)

R2 primer: CTACATACCTCGCTCTGCTAATC (서열번호 36)

상기 F1-R1을 이용한 PCR, F2-R2를 이용한 PCR 및 F1-R2를 이용한 PCR은 모두 아래의 표 3 및 표 4와 같은 조건하에서 수행하였다:

DNA	10ng
Primer F (10pmol/ul)	1ul
Primer R (10pmol/ul)	1ul
dNTP(Beams biotechnology, 10mM, 5301-16L)	1ul
5X HF buffer	10ul
Phusion enzyme(Thermo, F-530L)	0.5ul
DW	to 50ul

98℃	30sec
98℃	10sec
65℃	20sec
72℃	30sec
	30cycle(98℃ - 65℃- 72℃)
72℃	5min
20℃	forever

이후, 상기 실시예 1에서 고순도로 정제한 재조합 FnCas9 단백질(도 1)과 In-vitro transcription 으로 얻은 guide RNA(도 3a 및 표 1 참조)의 복합체를 상기 준비된 최종 라이브러리 산물들과 반응시켜 In-vitro cleavage를 진행하여 특정 타겟 부위를 절단한 후, targeted deep-sequencing을 통해 FnCas9에 의해 잘려진 타겟들(DNA 단편들)만 분석하였다.

상기 targeted deep-sequencing은 다음의 과정으로 수행하였다: 특정 타겟 부위가 절단된 DNA를 컬럼 형식으로 정제한 뒤 TruSeq Custom Amplicon v1.5(Illumina)로 Mi-seq 분석에 필요한 Library를 제작하였다. 이후 Mi-seq. (Illumina)장비를 이용하여 sequencing 하여 CRISPR RGEN tool (www.rgenome.net)의 Cas Analyzer를 통해 분석하였다. CRISPR/Cas9 절단 부위로부터 5bp 이내에서의 insertion/deletions를 FnCas9에 의하여 유도된 변이로 간주하였다.

In-vitro cleavage를 통해 FnCas9에 의해 잘려진 단편들의 뉴클레오타이드 서열만 분석하여 WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)를 이용하여 logo-plot을 그린 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, PAM으로 인식되는 부분의 뉴클레오타이드 서열은 NGG로써 기존의 SpCas9 과 유사하다는 결과를 얻었으며, 단백질에 의해 직접적으로 잘리는 부분의 위치가 PAM으로부터 6bp 앞(5' 방향)으로 기존의 SpCas9에 의해 잘려진 3bp 앞 blunt-end 형식과 확연히 다르다는 결과를 얻었다.

도 2c는 Deep-sequencing 분석에 의한 로고 도식을 나타낸 것이다. FnCas9이 실제로 NGG 형식의 PAM을 인식하는지 여부를 확인하기 위해 In-vitro cleavage 실험을 진행하였다.

타겟 DNA 절단에 필요한 guide RNA는 박테리아 내부에서 존재하는 crRNA-tracrRNA 뉴클레오타이드 서열을 그대로 사용하거나, 이를 간편화하기 위하여 crRNA와 tracrRNA를 잘라 GAAA 링커로 결합시킨 짧은 형태의 single-guide RNA를 사용하였다 (도 3a 및 표 1 참조).

각각의 활성화도 테스트는 In-vitro cleavage 실험을 통하여 타겟 DNA가 잘리는 정도를 측정하였다. 이후, 특정 타겟 CCR5 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 다양한 종류의 PAM 뉴클레오타이드 서열이 들어있는 Plasmid (Genbank Accession number: U54994.1)를 T-vector cloning (genomic DNA에서 CCR5 locus 에 해당되는 부분을 PCR로 증폭한뒤, DNA정제 kit 로 정제하여, 구매한 T-vector에 ligation)과 site-directed mutation(T-vector cloning 된 CCR5 Plasmid를 기준으로 PAM(NGG)부분에서 원하는 형식으로 치환하기 위하여 특정 변이를 포함한 primer를 이용하여 전체 plasmid를 PCR로 증폭)을 통하여 제작하였고, plasmid를 제한효소 (NcoI)로 linearization한 뒤에, 타겟 CCR5 뉴클레오타이드 서열에 해당하는 guide RNA를 정제하여 재조합 FnCas9과 37℃ 1시간 처리하여 잘려진 단편들의 패턴을 agarose 0.8% gel로 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에 나타난 바와 같이. 타겟 뉴클레오타이드 서열 뒤에 NGG 형식의 PAM 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있는 plasmid 만 FnCas9이 선택적으로 인식하여 자를 수 있는 것으로 확인하였다. 또한, NGG 중의 두 개의 Guanosine 중 한 개만 다른 염기로 치환하여도 타겟을 자르지 못하는 결과를 얻었다.

FnCas9을 통한 타겟 DNA 상의 절단 지점을 보다 심층적으로 분석하기 위해, In-vitro cleavage assay (FnCas9 및 표 1에 기재된 CCR5 targeting sgRNA의 복합체를 사용하여 절단)에 의하여 얻어진 절단 단편을 표준적인 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 방식으로 분석하였다. 비교를 위하여 S. pyogene Cas9 (SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1); SpCas9) 및 CCR5 Locus 1에 대한 sgRNA 를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다. 상기 얻어진 분석 결과를 도 4a (SpCas9, CCR5 Locus 1), 4b (FnCas9, CCR5 Locus 1), 및 4c (FnCas9, CCR5 Locus 2)에 나타내었다. 도 4a 내지 4c에 나타난 바와 같이, SpCas9은 타겟 CCR5 뉴클레오타이드 서열 중 PAM 뉴클레오타이드 서열 (5'-NGG-3')로부터 5' 방향으로 3bp 떨어진 위치 (즉, PAM 서열의 5' 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이)에서 두 가닥 모두를 절단하여 blunt-end 형태의 절단 말단을 생성하는 반면, FnCas9는 PAM (5'-NGG-3')이 존재하는 가닥에서는 (5'-NGG-3')으로부터 5' 방향으로 6bp 떨어진 위치 (즉, PAM 서열의 5' 방향으로 6번째 뉴클레오타이드와 7번째 뉴클레오타이드 사이)를, PAM (NGG)이 존재하는 가닥의 반대 가닥에서는 PAM (NGG)에 상보적인 서열 (3'-NCC-5')의 3' 방향으로 3bp 떨어진 위치 (즉, PAM 서열의 3' 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이)를 각각 절단하여, 5' 말단이 3nt 돌출된 접착 말단 (sticky end) 형태의 절단 말단을 형성한다.

실시예 3. FnCas9을 이용한 세포 내에서의 유전체 교정

In-vitro 상에서 FnCas9이 타겟 DNA를 자르는 원리를 규명한 이후, 이를 세포실험에 적용하였다. 상기 실시예 1에서 정제한 재조합 FnCas9 단백질과 In-vitro transcription을 통해 얻은 특정 타겟 (AAVS1) guide RNA(표 1 참조)를 적정 몰비(FnCas9 (15ug):guide RNA (20ug) = 1 : 6)로 섞어주어 electroporation 방법을 통해 K562 세포(ATCC)에 도입시켰다. 그 뒤, K562 세포를 72시간동안 37℃에서 배양한 뒤에 각각의 세포를 프랩하여 유전체 DNA (genomic DNA)를 분리하고 세포를 원심분리로 가라앉히고, lysis buffer로 용해하여 genomic DNA만 정제분리하였다. T7E1 assay (유전체 DNA에 서 특정부분 PCR 증폭이후 T7E1 (T7 Endonuclease I)을 37도에서 20분 처리한 후 전기영동)와 targeted deep-sequencing (AAVS1 유전자의 타겟 부분을 PCR로 증폭한 이후 이를 Deep-sequencing 용 PCR barcode primer 로 재차 PCR 증폭한 후, 이를 DNA 정제kit 를 사용하여 정제한 뒤에 시퀀싱)을 통해서 특정 타겟 부위 (AAVS1)에서 FnCas9에 의한 교정으로 뉴클레오타이드 서열 변이가 얼마나 발생하였는지를 빈도수 (%)로 산출하였다.

Guide RNA의 타겟 서열의 길이를 변화시키면서 (표 1의 gx18 (18bp 타겟 서열), gx19 (19bp 타겟 서열), gx20 (20bp 타겟 서열), gx21 (21bp 타겟 서열), gx22 (22bp 타겟 서열)), 이에 해당하는 sgRNA와 재조합 FnCas9과 섞어서 K562 세포에 전달하였을 때 T7E1 assay에서 분석한 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에 나타난 바와 같이, genomic DNA 상에서 FnCas9에 의한 AAVS1 사이트 교정에 의해 유의미한 변이가 생기는 것으로 확인되었다.

또한, deep-sequencing으로 변이가 일어난 정도를 정량화한 결과를 도 5b에 나타내었다. 도 5b에 나타난 바와 같이, guide RNA의 타겟 서열의 길이를 변화시킨 실험군 중에서 gX22의 길이를 사용하였을 때 FnCas9은 기존의 SpCas9 (SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1)에 유사한 빈도로 변이를 생성할 수 있음을 확인하였다. SpCas9과 FnCas9 에 의해 세포내 AAVS1 사이트에 생긴 변이 패턴을 비교분석 하였을 때, In-vitro 상에서 얻은 결과(도 2c 및 4a-4c)와 같이, FnCas9는 PAM 서열 부분으로부터 자르는 위치가 SpCas9과는 다른 것을 확인하였다. FnCas9를 사용하는 경우 주로 다양한 길이로 DNA가 제거된 상태로 유전체 교정이 이루어 졌으며, 이는 고등동물 세포내에서 FnCas9에 의해 유전자 교정을 효율적으로 수행할 수 있음을 보여준다.

K562세포의 AAVS1 타겟 이외에도 FnCas9을 이용해서 여러종류의 유전자와 세포유형에 적용시킬 수 있는지를 확인하였다. 상기 562세포와 동일한 몰비(FnCas9 (15ug):guide RNA (20ug) = 1 : 6)로 FnCas9과 guide RNA를 섞어주어 electroporation 방법을 통해 HEK293 세포(ATCC)에 도입시켰다. 다양한 타겟 (CCR5(TS1), CCR5(TS2), AAVS1, EMX1, NRAS)의 다양한 타겟 서열을 포함하는 guide RNA를 사용하여 상기 방법으로 HEK293 세포 전달하였다 (표1 타겟 서열 참조). HEK293 세포내로 FnCas9과 guide RNA 전달이후 48시간 이후, genomic DNA를 정제한 후, 모든 타겟 유전자에 대해서 PCR한 후, T7E1 assay 및 deep-sequencing assay를 수행하여 돌연변이가 유도된 비율을 산출하여 도 6에 나타내었다.

도 6의 (가)는 HEK293세포 유전체의 CCR5 (TS1) 유전자 교정후 T7E1 assay및 deep-sequencing으로 확인한 결과를 보여준다. FnCas9단백질과 CCR5 (TS1)특이적인sgRNA 를 사용하여 세포내 전달후 48시간이후 CCR5 (TS1) 위치를 PCR 증폭하여 T7E1 효소처리하여 정상유전자에 비해 돌연변이가 정확히 유도되었는지 확인할 수 있고, 별 모양 마크는 PCR 산물이 T7E1 효소에 의해 절단된 산물을 나타내고, 하단에 기재된 수치는 PCR 증폭산물을NGS(Next Generation Sequencing)를 시행하여 분석한 수치이다. 도 6의 (나)는 HEK293세포 유전체의 CCR5 (TS1) 유전자를 비롯하여 여러 유전자(CCR5(TS2), AAVS1, NRAS, EMX1)에 대해서 FnCas9을 이용해 돌연변이가 유도되었는지 여부를 deep-sequencing (NGS) 으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6에 나타난 바와 같이, FnCas9을 사용하여 다양한 종류의 고등세포 (K562, HEK293)의 다양한 유전자(CCR5, AAVS1, EMX1, NRAS)에 돌연변이를 효과적으로 유도할 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 4. FnCas9을 이용한 외부 유전자 도입

FnCas9에 의한 유전자 특정 부위 절단에 의하여, 세포내 특정 타겟 사이트를 잘라서 교정하는 것 이외에도 외부유전자를 원하는 위치에 도입시킬 수 있다. FnCas9은 타겟을 자를 때 자르는 지점의 모양을 5'-접합말단 형태로 생성하기 때문에, 세포내에서, 교정시 빈번히 일어나는 NHEJ(Non homologous end joining)와 유사한 방식으로 외부 유전자를 게놈 DNA의 원하는 부위에 높은 효율로 도입시킬 수 있다. 이를 보여주기 위한 방식으로, promoter가 포함되지 않아, 외부 GFP (green fluorescent protein) 유전자 발현이 불가능한 플라스미드를 FnCas9과 guide RNA의 복합체와 함께 세포 내부로 전달시켜 주면, 세포내로 들어간 플라스미드와 세포의 게놈 DNA는 FnCas9에 의하여 타겟 지점이 각각 잘리게 되고, 절단지점에 각각 생긴 접합말단을 이용해 서로 붙을 수 있게 된다. 이때 세포내부 게놈 DNA에 원하는 지점으로 표지 단백질 (GFP) 유전자가 들어가게 되면, 내부 프로모터를 이용해 단백질이 발현됨에 따라서 형광 시그널이 보이게 된다. 이로써 FnCas9의 타겟 DNA 절단에 의해 생기는 접합말단에 의해 외부유전자가 세포내 게놈 특정 지역으로의 삽입되는 효율을 기존 SpCas9 단백질과 비교 분석할 수 있다.

상기 과정을 도 7에 모식적으로 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 프로모터가 없고, GFP 유전자를 포함한 플라스미드를 제작하여 FnCas9-guideRNA 복합체와 함께 세포내로 전달하게 된다. 플라스미드와 세포내 게놈유전자의 타겟 지역에 FnCas9에 의해 5'-접합말단이 각각 생기게 되고, 이를 이용하여 외부 유전자인 GFP가 NHEJ 방식과 유사하게 효율적으로 결합되어 세포내 게놈유전자로 삽입되게 된다. 내부 프로모터 존재 하에서만 타겟 단백질이 발현됨에 따라GFP 형광시그널을 확인할 수 있다. FnCas9에 의해 잘리는 플라스미드와 게놈 DNA의 각 부분은 화살표로 표시되었다.

FnCas9 단백질에 의한 효율적인 외부유전자 삽입을 확인하기 위하여 짧은 DNA 편단을 이용하여 세포내 특정유전자로 삽입시키는 실험을 진행하였다 (tartget: CCR5 (TS1)). 상기 돌연변이 유도실험과 마찬가지로 같은 몰비(FnCas9:guideRNA: = 1 : 6)로 FnCas9과 guide RNA를 섞어주고, 삽입시키려는 목표 DNA 단편을 FnCas9:guideRNA:DNA = 1 : 6 :10의 비율로 추가로 섞어서 electroporation 방법을 통해 HEK293 세포(ATCC) 에 도입시켰다.

상기 삽입되는 DNA 단편은 각각 Blunt(비접합말단), Incorrect(접합말단 이면서 유전체의 타겟 부위의 절단면과 mis-match), 및 Correct(접합말단 이면서 유전체의 타겟 부위의 절단면과 match) 형식으로 제작하였으며, 그 구체적 서열은 도 8a (삼각형은 FnCas9에 의한 절단면을 나타냄) 및 아래에 나타내었다:

(BLUNT

5'GTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTAT3' forward (서열번호 37)

5'ATACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAAAC3' rear (서열번호 38)

INCORRECT

5'CTCGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTAT3' forward (서열번호 39)

5'GAGATACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAAAC3' rear (서열번호 40)

CORRECT

5'GGAGTTTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGTAT3' forward (서열번호 41)

5'TCCATACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAAAC3' rear((서열번호 42)

상기 준비된 각각의 각각 DNA를 앞서 설명한 바와 FnCas9 및 guideRNA 같이 HEK293세포에 동시에 전달한 후 48시간 후에 genomic DNA 를 정제하고, 이로부터 CCR5 유전자의 관심영역을 PCR로 증폭한뒤 deep-sequencing을 통해 외부 유전자(CATATG 포함 전체 시퀀스 분석)가 얼마나 삽입되었는지 그 비율(%)를 계산해하여, 외래 유전자가 어느 정도로 세포내 유전자에 Knock-in (KI) 되는지 측정하였다. 비교를 위하여, SpCas9를 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 FnCas9과 SpCas9에 의한 HEK293세포내 특정 유전자 (CCR5 (TS1))로의 Knock-in 효율 deep-sequencing 비교분석 결과를 아래의 표 5 및 도 8b에 나타내었다.

	FnCas9
	(-)	RNP only	Blunt	Incorrect	Correct
Others	0.056	40.455	51.439	3.837	55.763
Partial KI	0.006	0.004	30.577	83.759	0.289
Full KI	0.006	0.004	0.011	0	35.216
	SpCas9
	(-)	RNP only	Blunt	Incorrect	Correct
Others	0.09	99.321	62.544	94.414	94.284
Partial KI	0	0.018	34.231	0.008	0.198
Full KI	0	0	1.406	0	0.939

도 8b의 Y축의 진한부분 (other indel)은 전체 돌연변이가 유도된 비율(%)을 나타내고, 진한 회색 (partial KI)은 부분적으로 외부유전자가 삽입된 비율(%), 연한 회색 (complete KI)은 완벽하게 외부유전자가 삽입된 비율(%)을 나타낸다. 표 5 및 도 8에 나타난 바와 같이, 기존에 보편적으로 사용되왔던 SpCas9 보다 FnCas9을 사용할때 접합말단이 생성되도록 타겟 DNA를 자르는 특성에 의하여 불필요한 insertion과 deletion 의 존재없이 정확하게 외부유전자를 삽입할 수 있는 결과를 얻었다 (참고로, 도 8b의 FnCas9 및 crrect 말단 DNA 절편을 사용한 결과에서, 부분적으로 외부유전자가 삽입된 비율(partial KI)은 거의 관찰되지 않았으며, 그 아래 부분 (연한 회색 부분)이 완벽하게 외부유전자가 삽입된 비율(complete KI임). 이러한 결과는 FnCas9을 이용해 외부유전자를 고등세포내 특정 유전자에 삽입하여 효율적으로 정확하게 교정할 수 있음을 보여준다.

<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE <120> Composition for Genome Editing comprising Cas9 derived from F. novicida <130> DPP20165073KR <150> KR 10-2015-0168794 <151> 2015-11-30 <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1636 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 derived from Francisella novicida <400> 1 Met Asn Phe Lys Ile Leu Pro Ile Ala Ile Asp Leu Gly Val Lys Asn 1 5 10 15 Thr Gly Val Phe Ser Ala Phe Tyr Gln Lys Gly Thr Ser Leu Glu Arg 20 25 30 Leu Asp Asn Lys Asn Gly Lys Val Tyr Glu Leu Ser Lys Asp Ser Tyr 35 40 45 Thr Leu Leu Met Asn Asn Arg Thr Ala Arg Arg His Gln Arg Arg Gly 50 55 60 Ile Asp Arg Lys Gln Leu Val Lys Arg Leu Phe Lys Leu Ile Trp Thr 65 70 75 80 Glu Gln Leu Asn Leu Glu Trp Asp Lys Asp Thr Gln Gln Ala Ile Ser 85 90 95 Phe Leu Phe Asn Arg Arg Gly Phe Ser Phe Ile Thr Asp Gly Tyr Ser 100 105 110 Pro Glu Tyr Leu Asn Ile Val Pro Glu Gln Val Lys Ala Ile Leu Met 115 120 125 Asp Ile Phe Asp Asp Tyr Asn Gly Glu Asp Asp Leu Asp Ser Tyr Leu 130 135 140 Lys Leu Ala Thr Glu Gln Glu Ser Lys Ile Ser Glu Ile Tyr Asn Lys 145 150 155 160 Leu Met Gln Lys Ile Leu Glu Phe Lys Leu Met Lys Leu Cys Thr Asp 165 170 175 Ile Lys Asp Asp Lys Val Ser Thr Lys Thr Leu Lys Glu Ile Thr Ser 180 185 190 Tyr Glu Phe Glu Leu Leu Ala Asp Tyr Leu Ala Asn Tyr Ser Glu Ser 195 200 205 Leu Lys Thr Gln Lys Phe Ser Tyr Thr Asp Lys Gln Gly Asn Leu Lys 210 215 220 Glu Leu Ser Tyr Tyr His His Asp Lys Tyr Asn Ile Gln Glu Phe Leu 225 230 235 240 Lys Arg His Ala Thr Ile Asn Asp Arg Ile Leu Asp Thr Leu Leu Thr 245 250 255 Asp Asp Leu Asp Ile Trp Asn Phe Asn Phe Glu Lys Phe Asp Phe Asp 260 265 270 Lys Asn Glu Glu Lys Leu Gln Asn Gln Glu Asp Lys Asp His Ile Gln 275 280 285 Ala His Leu His His Phe Val Phe Ala Val Asn Lys Ile Lys Ser Glu 290 295 300 Met Ala Ser Gly Gly Arg His Arg Ser Gln Tyr Phe Gln Glu Ile Thr 305 310 315 320 Asn Val Leu Asp Glu Asn Asn His Gln Glu Gly Tyr Leu Lys Asn Phe 325 330 335 Cys Glu Asn Leu His Asn Lys Lys Tyr Ser Asn Leu Ser Val Lys Asn 340 345 350 Leu Val Asn Leu Ile Gly Asn Leu Ser Asn Leu Glu Leu Lys Pro Leu 355 360 365 Arg Lys Tyr Phe Asn Asp Lys Ile His Ala Lys Ala Asp His Trp Asp 370 375 380 Glu Gln Lys Phe Thr Glu Thr Tyr Cys His Trp Ile Leu Gly Glu Trp 385 390 395 400 Arg Val Gly Val Lys Asp Gln Asp Lys Lys Asp Gly Ala Lys Tyr Ser 405 410 415 Tyr Lys Asp Leu Cys Asn Glu Leu Lys Gln Lys Val Thr Lys Ala Gly 420 425 430 Leu Val Asp Phe Leu Leu Glu Leu Asp Pro Cys Arg Thr Ile Pro Pro 435 440 445 Tyr Leu Asp Asn Asn Asn Arg Lys Pro Pro Lys Cys Gln Ser Leu Ile 450 455 460 Leu Asn Pro Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Pro Asn Trp Gln Gln Tyr 465 470 475 480 Leu Gln Glu Leu Lys Lys Leu Gln Ser Ile Gln Asn Tyr Leu Asp Ser 485 490 495 Phe Glu Thr Asp Leu Lys Val Leu Lys Ser Ser Lys Asp Gln Pro Tyr 500 505 510 Phe Val Glu Tyr Lys Ser Ser Asn Gln Gln Ile Ala Ser Gly Gln Arg 515 520 525 Asp Tyr Lys Asp Leu Asp Ala Arg Ile Leu Gln Phe Ile Phe Asp Arg 530 535 540 Val Lys Ala Ser Asp Glu Leu Leu Leu Asn Glu Ile Tyr Phe Gln Ala 545 550 555 560 Lys Lys Leu Lys Gln Lys Ala Ser Ser Glu Leu Glu Lys Leu Glu Ser 565 570 575 Ser Lys Lys Leu Asp Glu Val Ile Ala Asn Ser Gln Leu Ser Gln Ile 580 585 590 Leu Lys Ser Gln His Thr Asn Gly Ile Phe Glu Gln Gly Thr Phe Leu 595 600 605 His Leu Val Cys Lys Tyr Tyr Lys Gln Arg Gln Arg Ala Arg Asp Ser 610 615 620 Arg Leu Tyr Ile Met Pro Glu Tyr Arg Tyr Asp Lys Lys Leu His Lys 625 630 635 640 Tyr Asn Asn Thr Gly Arg Phe Asp Asp Asp Asn Gln Leu Leu Thr Tyr 645 650 655 Cys Asn His Lys Pro Arg Gln Lys Arg Tyr Gln Leu Leu Asn Asp Leu 660 665 670 Ala Gly Val Leu Gln Val Ser Pro Asn Phe Leu Lys Asp Lys Ile Gly 675 680 685 Ser Asp Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Trp Leu Val Glu His Ile Arg 690 695 700 Gly Phe Lys Lys Ala Cys Glu Asp Ser Leu Lys Ile Gln Lys Asp Asn 705 710 715 720 Arg Gly Leu Leu Asn His Lys Ile Asn Ile Ala Arg Asn Thr Lys Gly 725 730 735 Lys Cys Glu Lys Glu Ile Phe Asn Leu Ile Cys Lys Ile Glu Gly Ser 740 745 750 Glu Asp Lys Lys Gly Asn Tyr Lys His Gly Leu Ala Tyr Glu Leu Gly 755 760 765 Val Leu Leu Phe Gly Glu Pro Asn Glu Ala Ser Lys Pro Glu Phe Asp 770 775 780 Arg Lys Ile Lys Lys Phe Asn Ser Ile Tyr Ser Phe Ala Gln Ile Gln 785 790 795 800 Gln Ile Ala Phe Ala Glu Arg Lys Gly Asn Ala Asn Thr Cys Ala Val 805 810 815 Cys Ser Ala Asp Asn Ala His Arg Met Gln Gln Ile Lys Ile Thr Glu 820 825 830 Pro Val Glu Asp Asn Lys Asp Lys Ile Ile Leu Ser Ala Lys Ala Gln 835 840 845 Arg Leu Pro Ala Ile Pro Thr Arg Ile Val Asp Gly Ala Val Lys Lys 850 855 860 Met Ala Thr Ile Leu Ala Lys Asn Ile Val Asp Asp Asn Trp Gln Asn 865 870 875 880 Ile Lys Gln Val Leu Ser Ala Lys His Gln Leu His Ile Pro Ile Ile 885 890 895 Thr Glu Ser Asn Ala Phe Glu Phe Glu Pro Ala Leu Ala Asp Val Lys 900 905 910 Gly Lys Ser Leu Lys Asp Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Arg Ile Ser 915 920 925 Pro Glu Asn Ile Phe Lys Asp Lys Asn Asn Arg Ile Lys Glu Phe Ala 930 935 940 Lys Gly Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Asn Leu Thr Asp Gly Asp Phe 945 950 955 960 Asp Gly Ala Lys Glu Glu Leu Asp His Ile Ile Pro Arg Ser His Lys 965 970 975 Lys Tyr Gly Thr Leu Asn Asp Glu Ala Asn Leu Ile Cys Val Thr Arg 980 985 990 Gly Asp Asn Lys Asn Lys Gly Asn Arg Ile Phe Cys Leu Arg Asp Leu 995 1000 1005 Ala Asp Asn Tyr Lys Leu Lys Gln Phe Glu Thr Thr Asp Asp Leu Glu 1010 1015 1020 Ile Glu Lys Lys Ile Ala Asp Thr Ile Trp Asp Ala Asn Lys Lys Asp 1025 1030 1035 1040 Phe Lys Phe Gly Asn Tyr Arg Ser Phe Ile Asn Leu Thr Pro Gln Glu 1045 1050 1055 Gln Lys Ala Phe Arg His Ala Leu Phe Leu Ala Asp Glu Asn Pro Ile 1060 1065 1070 Lys Gln Ala Val Ile Arg Ala Ile Asn Asn Arg Asn Arg Thr Phe Val 1075 1080 1085 Asn Gly Thr Gln Arg Tyr Phe Ala Glu Val Leu Ala Asn Asn Ile Tyr 1090 1095 1100 Leu Arg Ala Lys Lys Glu Asn Leu Asn Thr Asp Lys Ile Ser Phe Asp 1105 1110 1115 1120 Tyr Phe Gly Ile Pro Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Ile Ala Glu Ile 1125 1130 1135 Arg Gln Leu Tyr Glu Lys Val Asp Ser Asp Ile Gln Ala Tyr Ala Lys 1140 1145 1150 Gly Asp Lys Pro Gln Ala Ser Tyr Ser His Leu Ile Asp Ala Met Leu 1155 1160 1165 Ala Phe Cys Ile Ala Ala Asp Glu His Arg Asn Asp Gly Ser Ile Gly 1170 1175 1180 Leu Glu Ile Asp Lys Asn Tyr Ser Leu Tyr Pro Leu Asp Lys Asn Thr 1185 1190 1195 1200 Gly Glu Val Phe Thr Lys Asp Ile Phe Ser Gln Ile Lys Ile Thr Asp 1205 1210 1215 Asn Glu Phe Ser Asp Lys Lys Leu Val Arg Lys Lys Ala Ile Glu Gly 1220 1225 1230 Phe Asn Thr His Arg Gln Met Thr Arg Asp Gly Ile Tyr Ala Glu Asn 1235 1240 1245 Tyr Leu Pro Ile Leu Ile His Lys Glu Leu Asn Glu Val Arg Lys Gly 1250 1255 1260 Tyr Thr Trp Lys Asn Ser Glu Glu Ile Lys Ile Phe Lys Gly Lys Lys 1265 1270 1275 1280 Tyr Asp Ile Gln Gln Leu Asn Asn Leu Val Tyr Cys Leu Lys Phe Val 1285 1290 1295 Asp Lys Pro Ile Ser Ile Asp Ile Gln Ile Ser Thr Leu Glu Glu Leu 1300 1305 1310 Arg Asn Ile Leu Thr Thr Asn Asn Ile Ala Ala Thr Ala Glu Tyr Tyr 1315 1320 1325 Tyr Ile Asn Leu Lys Thr Gln Lys Leu His Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn 1330 1335 1340 Tyr Asn Thr Ala Leu Gly Tyr Lys Lys Tyr Ser Lys Glu Met Glu Phe 1345 1350 1355 1360 Leu Arg Ser Leu Ala Tyr Arg Ser Glu Arg Val Lys Ile Lys Ser Ile 1365 1370 1375 Asp Asp Val Lys Gln Val Leu Asp Lys Asp Ser Asn Phe Ile Ile Gly 1380 1385 1390 Lys Ile Thr Leu Pro Phe Lys Lys Glu Trp Gln Arg Leu Tyr Arg Glu 1395 1400 1405 Trp Gln Asn Thr Thr Ile Lys Asp Asp Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Phe 1410 1415 1420 Phe Asn Val Lys Ser Ile Thr Lys Leu His Lys Lys Val Arg Lys Asp 1425 1430 1435 1440 Phe Ser Leu Pro Ile Ser Thr Asn Glu Gly Lys Phe Leu Val Lys Arg 1445 1450 1455 Lys Thr Trp Asp Asn Asn Phe Ile Tyr Gln Ile Leu Asn Asp Ser Asp 1460 1465 1470 Ser Arg Ala Asp Gly Thr Lys Pro Phe Ile Pro Ala Phe Asp Ile Ser 1475 1480 1485 Lys Asn Glu Ile Val Glu Ala Ile Ile Asp Ser Phe Thr Ser Lys Asn 1490 1495 1500 Ile Phe Trp Leu Pro Lys Asn Ile Glu Leu Gln Lys Val Asp Asn Lys 1505 1510 1515 1520 Asn Ile Phe Ala Ile Asp Thr Ser Lys Trp Phe Glu Val Glu Thr Pro 1525 1530 1535 Ser Asp Leu Arg Asp Ile Gly Ile Ala Thr Ile Gln Tyr Lys Ile Asp 1540 1545 1550 Asn Asn Ser Arg Pro Lys Val Arg Val Lys Leu Asp Tyr Val Ile Asp 1555 1560 1565 Asp Asp Ser Lys Ile Asn Tyr Phe Met Asn His Ser Leu Leu Lys Ser 1570 1575 1580 Arg Tyr Pro Asp Lys Val Leu Glu Ile Leu Lys Gln Ser Thr Ile Ile 1585 1590 1595 1600 Glu Phe Glu Ser Ser Gly Phe Asn Lys Thr Ile Lys Glu Met Leu Gly 1605 1610 1615 Met Lys Leu Ala Gly Ile Tyr Asn Glu Thr Ser Asn Asn Lys Leu Ala 1620 1625 1630 Ala Ala Leu Glu 1635 <210> 2 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA, wherein "n" represents a targeting sequence comprising 16-24 or 18-22 nucleotides, eacg of which is independently seleected from a, u, c and g <400> 2 nguuucaguu gcugaauuau uugguaaac 29 <210> 3 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> essential sequence of crRNA <400> 3 guuucaguug cugaauuauu ugguaaac 28 <210> 4 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 4 guaccaaaua auuaaugcuc uguaaucauu uaaaaguauu uugaacggac cucuguuuga 60 cacgucugaa uaacuaaaaa 80 <210> 5 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> essential sequence of tracrRNA <400> 5 augcucugua aucauuuaaa aguauuuuga acggaccucu guuugacacg ucugaauaac 60 uaaaaa 66 <210> 6 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA, wherein "n" at position 1 represents a targeting sequence comprising 16-24 or 18-22 nucleotides and "n" at position 14 represents targeting sequence comprising 3-5 nucleotides, each of the nucleotides are independently selected from a, u, c, and g <400> 6 nguuucaguu gcunaugcuc uguaaucauu uaaaaguauu uugaacggac cucuguuuga 60 cacgucugaa uaacuaaaaa 80 <210> 7 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for CCR5 Locus 1 target <400> 7 gugacaucaa uuauuauaca uguuucaguu gcugaauuau uugguaaac 49 <210> 8 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for CCR5 Locus 2 target <400> 8 ggtagagcgg aggcaggagg cguuucaguu gcugaauuau uugguaaac 49 <210> 9 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for CCR5 Locus 1 target <400> 9 gugacaucaa uuauuauaca uguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 10 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for CCR5 Locus 2 target <400> 10 ggtagagcgg aggcaggagg cguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 11 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for AAVS1 target <400> 11 gcucccuccc aggauccucu cguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 12 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for AAVS1 target, gx18 <400> 12 gcccucccag gauccucucg uuucaguugc ugaauuauuu gguaaac 47 <210> 13 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for AAVS1 target, gx19 <400> 13 gucccuccca ggauccucuc guuucaguug cugaauuauu ugguaaac 48 <210> 14 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for AAVS1 target, gx20 <400> 14 gcucccuccc aggauccucu cguuucaguu gcugaauuau uugguaaac 49 <210> 15 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for AAVS1 target, gx21 <400> 15 gucucccucc caggauccuc ucguuucagu ugcugaauua uuugguaaac 50 <210> 16 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA for AAVS1 target, gx22 <400> 16 gcucucccuc ccaggauccu cucguuucag uugcugaauu auuugguaaa c 51 <210> 17 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for CCR5-TS1 target, gx20 <400> 17 gugggguggg auaggggaua cguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 18 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for CCR5-TS2 target, gx20 <400> 18 gugacaucaa uuauuauaca uguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 19 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for AAVS1 target, gx20 <400> 19 gcucccuccc aggauccucu cguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 20 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for NRAS target, gx20 <400> 20 ggguaagggg gcagggaggg aguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 21 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single-guide RNA for EMX1 target, gx20 <400> 21 ggaguccgag cagaagaaga aguuucaguu gcugaaaaug cucuguaauc auuuaaaagu 60 auuuugaacg gaccucuguu ugacacgucu gaauaacuaa aaa 103 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5 Locus 1 target <400> 22 tgacatcaat tattatacat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5 Locus 2 target <400> 23 gtagagcgga ggcaggaggc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 target, gx20 <400> 24 ctccctccca ggatcctctc 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 target, gx18 <400> 25 ccctcccagg atcctctc 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 target, gx19 <400> 26 tccctcccag gatcctctc 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 target, gx21 <400> 27 tctccctccc aggatcctct c 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 target, gx22 <400> 28 ctctccctcc caggatcctc tc 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5-TS1 target, gx20 <400> 29 tggggtggga taggggatac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5-TS2 target, gx20 <400> 30 tgacatcaat tattatacat 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS target, gx20 <400> 31 ggtaaggggg cagggaggga 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMX1 target, gx20 <400> 32 gagtccgagc agaagaagaa 20 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer <400> 33 ggactatcat atgcttaccg taact 25 <210> 34 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer <400> 34 ctctccatcc tcttgctttc ttnnnnnnnn nngagctggg accaccttat at 52 <210> 35 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer <400> 35 aagaaagcaa gaggatggag agcacgctgt aggtatctca gttc 44 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 primer <400> 36 ctacatacct cgctctgcta atc 23 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blunt DNA fragment forward <400> 37 gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtat 34 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blunt DNA fragment rear <400> 38 ataccgttat taacatatga caactcaatt aaac 34 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Incorrect DNA fragment forward <400> 39 ctcgtttaat tgagttgtca tatgttaata acggtat 37 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Incorrect DNA fragment rear <400> 40 gagataccgt tattaacata tgacaactca attaaac 37 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Correct DNA fragment forward <400> 41 ggagtttaat tgagttgtca tatgttaata acggtat 37 <210> 42 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Correct DNA fragment rear <400> 42 tccataccgt tattaacata tgacaactca attaaac 37

Claims

Francisella novicida 유래 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산 단백질.
제1항에 있어서, 상기 Francisella novicida 유래 Cas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 리보핵산 단백질.
제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 또는 이들의 조합을 포함하는 이중 가이드 RNA (dual guide RNA), 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)인, 리보핵산 단백질.
제3항에 있어서, 상기 crRNA는 일반식 1로 표현되고, 상기 tracrRNA는 서열번호 4로 표현되는 것인, 리보핵산 단백질:
5'-(N_cas9)m-GUUUCAGUUGCUGAAUUAUUUGGUAAAC-3' (일반식 1; 서열번호 2)
상기 일반식 1에서,
N_cas9는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위이고,
m은 상기 타겟팅 서열 부위에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 16 내지 24의 정수이며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택됨;
5'-AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA-3' (서열번호 4).
제3항에 있어서, 상기 sgRNA는 일반식 2로 표현되는 것인, 리보핵산 단백질:
5'-(N_cas9)m-GUUUCAGUUGCU-(링커)-AUGCUCUGUAAUCAUUUAAAAGUAUUUUGAACGGACCUCUGUUUGACACGUCUGAAUAACUAAAAA-3' (일반식 2; 서열번호 6)
상기 일반식 2에서,
N_cas9는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위이고,
m은 상기 타겟팅 서열 부위에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 16 내지 24의 정수이며,
상기 링커는 3 내지 5개의 뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 타겟팅 서열 부위 및 링커에 포함된 뉴클레오타이드들은 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택된 것임.
제4항에 있어서, 상기 일반식 1로 표현되는 crRNA는 5' 말단에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 단백질.
제5항에 있어서, 상기 일반식 2로 표현되는 sgRNA는 5' 말단에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS) 서열을 추가로 포함하는 것인, 리보핵산 단백질,
제1항 내지 제7항의 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
제9항에 있어서, 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS) 서열의 암호화 핵산 분자를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
제1항 내지 제7항의 리보핵산 단백질, 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 포함하는 유전체 교정용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 유전체 조성물은 진핵 세포 또는 진핵 유기체에 적용하기 위한 것인, 유전체 교정용 조성물.
제12항에 있어서, 리보핵산 단백질은 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 추가로 포함하는 것인, 유전체 교정용 조성물.
제11항에 있어서, 외래 유전자를 추가로 포함하는, 유전체 교정용 조성물.
제1항 내지 제7항의 리보핵산 단백질, 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 유전체 교정 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포 또는 유기체는 진핵 세포 또는 진핵 유기체인, 유전체 교정 방법.
제16항에 있어서, 상기 리보핵산 단백질은 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 추가로 포함하는, 유전체 교정 방법.
제15항에 있어서, 상기 도입하는 단계는 목적 부위 직접 주입, 전기천공, 또는 리포펙션에 의하여 수행되는 것인, 유전체 교정 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포 또는 유기체에 외래 유전자를 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 유전체 교정 방법.
제1항 내지 제7항의 리보핵산 단백질, 상기 리보핵산 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환체의 제조 방법.
제20항에 있어서, 상기 세포 또는 유기체는 진핵 세포 또는 진핵 유기체인, 형질전환체의 제조 방법.
제21항에 있어서, 상기 리보핵산 단백질은 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 추가로 포함하는, 형질전환체의 제조 방법.
제20항에 있어서, 상기 도입하는 단계는 목적 부위 직접 주입, 전기천공, 또는 리포펙션에 의하여 수행되는 것인, 형질전환체의 제조 방법.
제20항의 형질전환체의 제조 방법에 의하여 제조된 형질전환체.
제24항에 있어서, 상기 형질전환체는 진핵 세포 또는 진핵 유기체인, 형질전환체.