KR20170063263A

KR20170063263A - miRNA를 포함하는 흑색종 전이 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20170063263A
Application number: KR1020150169426A
Authority: KR
Inventors: 김규한; 조은경; 이태룡; 김상훈; 김윤진
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2017-06-08
Also published as: KR102552776B1

Abstract

본 명세서는 서열번호 1을 포함하는 8 내지 100 mer 길이의 RNA 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 흑색종 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 RNA 핵산분자는 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 흑색종의 전이를 억제하거나 흑색종 전이유전자의 발현을 억제할 수 있고, 또한, 본 명세서는 시험물질에 대한 흑색종 전이 억제 물질을 스크리닝하는 방법 및 흑새종 전이 진단용 키트를 제공한다.

Description

miRNA를 포함하는 흑색종 전이 억제용 조성물{Composition for inhibiting melanoma metastasis comprising miRNA}

본 명세서는 흑색종 전이 억제용 조성물; 흑색종 전이 억제 물질을 스크리닝하는 방법; 및 흑색종 전이 진단용 키트 또는 조성물;에 관한 것이다.

miRNA는 발달 시기, 세포사멸사, 지방 신진대사 및 조혈 세포 분화의 조절을 포함하는 여러 생물학적 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐에 따라 생명과학분야에서 매우 큰 관심을 받고 있다.

한편, 흑색종은 주로 피부 표피의 기저층에 있는 멜라닌 세포가 악성화된 피부암으로 멜라닌 세포가 존재하는 곳 어디든 발생할 수 있는 암이다. 흑색종은 피부암으로 인한 사망의 65%를 차지하고 있는 치명적인 질환으로 전이가 쉽게 발생하며 전이가 이루어지면 5년 생존율이 5%이하로 떨어지는 예후가 좋지 않은 악성 종양으로 알려져 있다. 지난 30년간 전세계적으로 흑색종의 발생률이 점점 증가하고 있으며 특히, 호주 미국과 같은 백인에게서 발생률이 더 높게 나타난다. 우리나라 역시 중앙 암본부에 의해 발표된 자료에 따르면 흑색종은 전체 암 발병 중 0.2%를 차지하지만 점점 발병률이 증가 하고 있는 추세라고 발표되었다. 대부분의 흑색종은 간, 뼈, 뇌로 전이가 되고 피부, 피하조직, 림프절 등이 전이의 원발 부위로 알려져 있다. 전이는 암세포가 다른 조직 또는 기관의 상피세포에 영향을 미쳐 암세포를 이동시키는 단계로 전이된 암은 성장과 분화를 조절하면서 주변조직에 발암을 유도한다. 암세포는 원발 부위에서 분리되어 혈관 속으로 이동하는 침윤과정과 혈관을 통해 다른 부위로 이동하여 혈관 밖으로 빠져 나오는 과정을 통해 신체의 다른 먼 부위로 전이 된다. 발암과정에서 악성화된 멜라닌 세포는 세포간의 단단한 결합력을 느슨하게 바꿔 세포간의 부착력을 약화시키고, 세포의 이동성을 향상시켜 종양세포의 전이를 촉진시킨다.

암의 전이 및 전이에 영향을 미치는 유전자를 억제하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 21개 내외의 짧은 염기서열을 가진 상기의 miRNA를 이용하여 암 전이에 영향을 미치는 표적 mRNA의 3?비번역부위 (untranslated region, UTR)의 상보적인 염기서열에 결합하여 mRNA를 분해시키거나 해독 억제를 통해 발현을 조절하는 연구가 진행되고 있다.

그러나 흑색종의 전이와 관련하여 miRNA를 이용한 흑색종 전이를 억제하는 연구는 부족하며, 특히 흑색종 세포의 전이와 관련하여 miR-944의 기능은 아직 밝혀지지 않았으며 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.

미국공개특허 제 2014-106985호 미국공개특허 제 2012-0088687호

Tomasz Powrozek et al., Plasma circulating microRNA-944 and microRNA-3662 as potential histologic type-specific early lung cancer biomarkers, Translational Research, 2015 Mitchell S. Stark et al., Characterization of the Melanoma miRNAome by Deep Sequencing, PLOS ONE, 2010 Hong Xie et al., Novel functions and targets of miR-944 in human cervical cancer cells, International Jornal of Cancer, 2015 Lavanya Nambaru et al., Prognostic Significance of HPV Physical Status and Integration Sites in Cervical Cancer, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2009 Nicolai A. Schultz et al., Prognostic MicroRNAs in Cancer Tissue from Patients Operated for Pancreatic Cancer-Five MicroRNAs in a Prognostic Index, World J Surg, 2012 Jie Ma et al., Characterization of microRNA transcriptome in lung cancer by next-generation deep sequencing, Molecular oncology, 2014

본 발명의 일 측면은 흑색종 전이 억제하기 위한 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 측면은 흑색종 전이 억제 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 측면은 흑색종 전이 진단용 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면은, 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 8 내지 100 mer 길이의 RNA 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 서열번호 4의 서열 또는 그 단편으로서, 상기 단편은 서열번호 1의 코어서열을 포함하는, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 15 mer 이상인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 18 내지 23 mer 길이의 miRNA 핵산분자인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 상기 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 서열번호 2의 서열인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 이중가닥이며, 서열번호 1의 서열에 혼성화 가능한 서열을 더 포함하는, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 혼성화 가능한 서열은 서열번호 3인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 50 내지 100 mer 길이의 헤어핀 구조인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 헤어핀 구조의 RNA 핵산분자는 서열번호 4인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 리포좀(liposome)에 포집 또는 백터(vector)에 삽입된 형태로 포함된, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 조성물은 주사제인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 흑색종 전이 억제 물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a)흑색종 세포를 준비하는 단계; (b)상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및(c)상기 시험물질이 흑색종 세포에서 miR-944의 생성을 유도하는지 또는 활성을 촉진시키는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 전이 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 miR-944 검출시약을 포함하는 흑색종 전이 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 miR-944 검출시약을 포함하는 흑색종 전이 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 키트는 흑색종 세포의 RNA 추출 시약, 추출된 RNA를 cDNA로 역전사 하기 위한 역전사 효소, 및 역전사된 cDNA 중 miRNA-944를 증폭하기 위한 miRNA-944 프라이머를 포함하는 흑색종 전이 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 8 내지 100 mer 길이의 RNA 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 서열번호 2의 서열인, RNA 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 일측면은 상기 RNA 핵산분자는 서열번호 1의 서열에 혼성화 가능한 서열을 더 포함하는 RNA 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 일측면은 50 내지 100 mer 길이의 헤어핀 구조인 RNA 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 일측면은 상기 RNA 핵산분자는 리포좀(liposome)에 포집 또는 백터에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 흑색종의 전이를 억제하는 효과를 가진다.

본 발명에 일측면에 따른 조성물은 흑생족 전이 유전자의 발현을 억제하는 효과를 가진다.

본 발명의 다른 측면에 따른 방법은 흑색종 전이를 억제하는 물질의 스크리닝 방법으로 시험물질이 흑색종 전이 또는 흑색종 전이 유전자의 발현의 촉진제인지 억제제인지를 빠르고 간단하게 판정할 수 있다는 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따른 흑색종 전이 진단용 키트 또는 조성물은 해당 흑색종이 전이성이 강한 세포인지 아닌지를 빠르고 간단하게 판정할 수 있다는 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일측면에 따른 서열번호 4를 포함하는 핵산분자로, miR-944의 성숙한 서열을 생성하기 전의 전구체 서열이며, 헤어핀 구조를 가진다.
도 2는 본 명세서의 실험예 1에 따른 3가지 흑색종 세포주의 wound healing assay에서의 이동성을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 3은 본 명세서의 실험예 1에 따른 3가지 흑색종 세포주의 miR-944 발현량을 도시화한 그래프이다.
도 4는 본 명세서의 실험예 2에서, 대조군과 miR-944(mimic)을 형집도입한 흑색종 세포주에서의 wound healing assay에서 이동성을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 5는 본 명세서의 실험예 2에서, 대조군과 miR-944(mimic)을 형집도입한 흑색종 세포주에서의 invasion assay에서 전이성을 나타낸 사진과 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

암세포의 전이는 세포간 결합과 관련된 twist, snail 등의 유전자들에 의해 유도된다. twist는 전사인자로 세포에서 snail 유전자의 발현을 유도하며 twist에 의해 유도된 snail은 세포와 세포의 결합에 직접적으로 영향을 미치는 E-cadherin 단백질의 발현을 억제하여 세포의 전이를 촉진하는 역할을 하고 있다. 다른 전이관련 유전자로는 세포 막에 있는 세포 외 기질들을 분해하여 전이를 촉진하는 matrix-metalloproteinase (MMP)가 알려져 있다. 이 중 MMP2와 MMP9은 흑색종 조직의 E-cadherin 같은 세포 외 기질을 직접적으로 분해함으로써 침윤과 이동을 용이하게 하는 효소로 알려져 있다.

microRNA(miRNA)는 21-22개의 짧은 염기서열을 가진 non-coding RNA로 전사 후 억제를 통해 유전자를 조절하여 세포의 성장, 발생, 생장, 분화, 사멸 등에 영향을 미친다. miRNA 유전자는 핵 내에서 RNA Pol Ⅱ 또는 Pol Ⅲ에 의해 pri-miRNA로 전사된다. Pri-miRNA는 mRNA처럼 5' 말단에 capping과 3' 말단에 poly-A tail 구조를 가지고 있다. 이 후에 핵 내에서 세포질로 precursor miRNA 형태로 방출되고, RnaseⅢ endonuclease (Dicer)에 의해 small hairpin 구조의 precursor miRNA가 절단된 성숙한 형태의 miRNA duplex로 만들어진다. Mature 형태의 miRNA는 표적 mRNA의 3'비번역부위 (untranslated region, UTR)의 상보적인 염기서열에 결합하여 mRNA를 분해시키거나 해독 억제를 통해 발현을 조절한다. 이렇게 생성된 miRNA는 여러 암세포에서 암유전자 또는 암 억제 유전자로써 기능을 발휘한다. 특히, 암의 전이 과정에도 직접 관여하여 전이 관련 유전자들의 발현을 조절한다. 이 중에서 miR-205, miR-182, miR-27a, miR-126, miR-141, miR-373, miR-183, miR-145, miR-17, miR-92a 등이 흑색종에서 전이가 진행됨에 따라 발현이 증가하는 miRNA로 알려져 있다. 이와 같이, 암세포의 전이와 관련한 세포 이동성에 영향을 미치는 miRNA 연구가 있다.

miR-944는 TP63유전자(Genbank의 accession number는 NM_001114978 이다)의 intron에 존재하는 introgenic miRNA이다. 인간을 포함한 침팬지와 원숭이 등 영장류에서만 발견이 되는 miRNA이다. mir-944의 stem loop sequence에 해당하는 miRBase의 accession number는 MI0005769(서열번호 4에 해당)이며, mature sequence에 해당하는 miRBase의 accession number는 MIMAT0004987(서열번호 2에 해당)이다.

miR-944는 상기와 같이 알려진 miRNA지만 아직 흑색종 세포에서 miR-944의 정확한 기능에 대하여 알려진 바는 부족하다.

miRNA는 세포 내에 존재하는 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적 서열(sequence)에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다.

본 발명의 일측면은 상기와 같은 miRNA 중 miR-944에 관한 것으로서, 코어 시퀀스인 서열번호 1의 서열을 포함하는 8 내지 100 mer 길이의 RNA 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

서열번호 1(핵심 서열) : aauuauug

상기 코어 시퀀스인 서열번호 1을 포함하는 RNA 핵산분자는 바람직하게 서열번호 2의 mature sequence의 miR-944 또는 서열번호 4의 stem loop sequence의 miR-944일 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 8 mer 이상, 15 mer 이상, 20 mer 이상, 21 mer 이상, 22 mer 이상, 25 mer 이상, 30 mer 이상 또는 50 mer 이상일 수 있다.

또한, 상기 RNA 핵산분자는 100 mer 이하, 90 mer 이하, 89 mer 이하, 88 mer 이하, 87 mer 이하, 85mer 이하, 80 mer 이하, 70 mer 이하, 60 mer 이하, 50 mer 이하, 30 mer 이하, 25 mer 이하, 24 mer 이하 또는 23 mer 이하일 수 있다.

RNA 핵산분자의 길이가 상기 범위 내일 때, miRNA 로서 흑색종 전이 억제효과가 우수하다.

5'- GUUCCAGACACAUCUCAUCUGAUAUACAAUAUUUUCUUAAAUUGUAUAAAGAGAAAUUAUUGUACAUCGGAUGAGCUGUGUCUGGGAU -3' (서열번호 4)

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 상기 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 서열번호 2의 서열인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다

5'- aaauuauuguacaucggaugag -3' (서열번호 2)

구체적으로 상기 혼성화 가능한 서열은 서열번호 3인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

5'- aaauuauuguacaucggaugag -3' (서열번호 2)

5'- cucauccgauguacaauaauuu -3' (서열번호 3)

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 2 및 서열번호 3은 서로 상보적으로 혼성화된, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 일측면에 따른 RNA 핵산분자는 흑색종의 전이를 억제하거나 흑색종 전이유전자의 발현을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일측면에 따른 RNA 핵산분자의 단편 또는 변이체를 세포 내로 주입하면 상기 miRNA-944의 과발현 현상을 유발할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일측면에 따른 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 8 내지 100 mer 길이의 RNA 핵산분자는 흑색종의 전이를 억제하거나 흑색종 전이유전자의 발현을 조절할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 상기 RNA 핵산분자는 헤어핀 구조로 존재하는, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기 헤어핀 구조는 서열번호 2의 성숙한 서열을 최종적으로 생성하기 전에 만들어지는 전구체 서열일 수 있으며, 하기 서열번호 4의 서열일 수 있으나, 본 발명의 헤어핀 구조가 서열번호 4의 서열로 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 4는 도 1의 헤어핀 구조일 수 있으며, 핵심 서열인 서열번호 1 및 이를 포함하는 서열번호 2을 포함하므로, 서열번호 4의 miRNA 핵산분자를 포함하는 조성물은 흑색종 전이 억제용 조성물일 수 있다.

그러므로, 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 흑색종 전이 억제효과 등을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 일측면으로, 상기 RNA 핵산분자는 리포좀(liposome)에 포집또는 백터에 삽입된 형태로 포함된, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 RNA 핵산분자는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기 RNA 핵산분자는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 uM 이상, 2 uM 이상, 3 uM 이상, 5 uM 이상, 7 uM 이상, 9 uM 이상, 11 uM 이상, 15 uM 이상, 16 uM 이상, 17 uM 이상, 18 uM 이상, 19 uM 이상, 20 uM 이상, 21 uM 이상, 22 uM 이상, 23 uM 이상, 24 uM 이상, 25 uM 이상 또는 50 uM 이상일 수 있다.

또한, 상기 RNA 핵산분자는 상기 리포좀에 대하여 농도가 200 uM 이하, 190 uM 이하, 180 uM 이하, 170 uM 이하, 150 uM 이하, 130 uM 이하, 100 uM 이하, 80 uM 이하, 50 uM 이하, 40 uM 이하, 30 uM 이하, 29 uM 이하, 28 uM 이하, 27 uM 이하, 26 uM 이하, 25 uM 이하, 24 uM 이하, 23 uM 이하, 22 uM 이하, 21 uM 이하 또는 20 uM 이하일 수 있다.

상기 RNA 핵산분자의 농도가 상기 범위 내 일 때, 흑색종 전이 억제 효과가 우수하다.

또한, 본 발명의 일측면으로, 상기 조성물은 본 발명의 일측면 따른 핵산분자를 포함하는 리포좀을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001~30.0 중량%의 양으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 피부 외용제 조성물은 화장품 조성물 또는 약학 조성물을 포함한다.

상기 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장품 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로0.01~5 중량%, 구체적으로 0.01~3 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명은 일 실시예로서 본 발명의 일측면 따른 RNA 핵산분자를 포함하는 흑색종 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 주사제인 흑색종 전이 억제용 조성물을 제공한다

상기 약학 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 사용 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은, 흑색종 전이 억제 물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a)흑색종 세포를 준비하는 단계; (b)상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c)상기 시험물질이 흑색종 세포에서 miR-944의 생성을 유도하는지 또는 활성을 촉진시키는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 전이 억제 물질의 스크리닝 방법 을 제공한다.

상기 (b) 단계에서 시험물질은 세포의 리포좀(liposome) 또는 백터(vector)에 트렌스펙션시킬 수 있다. 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 스크리닝은 시험 물질이 miR-944의 과발현 여부는 당업계에 널리 공지된 방법인 RNA assay를 이용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, miR-944 검출시약을 포함하는 흑색종 전이 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다. 구체적으로 상기 키트는 흑색종 세포의 RNA 추출 시약, 추출된 RNA를 cDNA로 역전사 하기 위한 역전사 효소, 및 역전사된 cDNA 중 miRNA-944를 증폭하기 위한 miRNA-944 프라이머를 포함하는 흑색종 전이 진단용 키트일 수 있다.

이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실험예1] 흑색종의 전이성과 miR-944의 역할규명

흑색종 세포에서 miR-944의 역할을 규명하기 위해 먼저 세포의 이동성에 차이가 있는 흑색종 세포주(한국세포주은행에서 구입한 A375P, A375SM, Wm266-4) 간에 miR-944의 발현과 세포 이동성을 조사하였다.

실험예 1-1 흑색종 세포주의 전이성(3가지 흑색종세포에서 wound healing 어세이를 수행하여 wound closure를 측정)

A375P, A375SM, Wm266-4 세포주를 35mm 배양접시에 배양 후 Wound healing assay를 실시하였다. 200μl tip을 이용하여 세포층 표면을 손상시킨 후 PBS로 세척하고 CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 세포 이동거리 계산은 Image j software (National Institutes of Health, MD, USA)를 이용해 산출하였다. 면적 측정은 손상된 면적을 산출한 뒤 0시간의 면적에서 24시간의 면적 값을 뺀 후, 24시간 동안 이동한 거리를 계산하였고, 계산된 값은 대조군 세포의 이동 거리에 대한 백분율(%)로 환산 하였다.

실험 결과 A375P 흑색종 세포가 3가지 흑색종 세포주 중에서 가장 이동성이 적었고, Wm266-4 흑색종 세포주가 A375 세포 비하여 약 3.5배 더 많은 이동성을 나타내었다 (도 2).

실험예 1-2 흑색종 세포주의 miR-944 발현량 측정

다음으로 이들 세포주에서 서열번호 2의 miR-944의 발현을 측정하였다. 수거한 세포에 Trizol reagent (Invitrogen, Carlabad, CA, USA)를 반응시켜 total RNA를 분리하였다. miRNA 발현 정도는 Taqman microRNA assay (Applied biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. Taqman reverse transcription kit (Applide biosystems, foster assay, CA USA)를 이용하여 100ng RNA에서 cDNA를 합성한 다음 miR-944 primer (Applied biosystems, Foster City, CA, USA)(Cat: # 4427975)(ID: 002189) 를 이용하여 Rotor-Gene 6000 기기 (Qigen, Duesseldorf, Germany)로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분간 반응 시킨 다음 15초 95℃, 1분 60℃를 한 주기로 40cycle 동안 실시하여 miRNA을 증폭하였다. miRNA 발현량은 U6 SnRNA 발현량 (Cat: # 4427975)(ID: 001093) 에 대한 상대적인 발현량으로 정량하여 ΔΔCt 값을 이용해 보정하였다.

실험 결과, miR-944는 이동성이 가장 적은 세포주인 A375P 세포 주를 기준으로 A375Sm에서는 약 75%, Wm266-4에서는 99.4%의 순서로 발현이 감소하였다. 이는 세포의 이동성과는 반대의 경향성으로 miR-944의 발현 결과가 나타났다 (도 3). 이러한 결과는 흑색종 세포에서 miR-944의 발현이 세포의 전이에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.

[실험예2] miR-944 모사체(mimic)를 이용한 흑색종 세포에서 miR-944 과발현 실험

흑색종 세포주에서 miR-944의 전이에 대한 기능을 조사하기 위하여 miR-944의 발현이 가장 적게 나타난 흑색종 세포주 Wm266-4에 서열번호 2와 3인 혼성화된miR-944의 mimic를 20nM로 Thermo Fisher Scientific 社의 Lipofectaminer® RNAiMAX Reagent를 이용하여 liposome에 포집하여 트랜스펙션시켰다. miRNA mimics는 GenePharma (Shanghai, China)에서 합성하였다. miR-944의 염기서열을 AAA UUA UUG UAC AUC GGA UGA G, Scramble oligo(NC)의 염기서열은 UUG UAC UAC ACA AAA GUA CUG로 합성하였다.

실험예2-1 miR-944 과발현 후의 wound healing assay(이동성 측정)

miRNA mimic을 흑색종 세포주 Wm266-4에 도입후 24시간 후에 wound healing assay를 실시하였다. Wound healing assay은 실험예1-1과 같은 방법으로 실시하였다.

실험결과 wound healing assay 실험에서 대조군에 비해 miR-944가 도입된 세포에서 세포 이동성이 약 60%정도 감소하였다 (도 4). 이러한 결과는 흑색종 세포에서 miR-944 발현이 세포의 이동성을 감소 시킬 수 있음을 나타낸다.

실험예2-2 miR-944 과발현 후의 invasion assay(전이성 측정)

miRNA mimic을 흑색종 세포주 Wm266-4에 도입후 24시간 후에 invasion assay를 실시하였다. 세포 전이 실험은 martrigel이 깔려있는 8μm pore size로 구성된 24well plate(Corning, NY, USA)를 이용하여 실험하였다. Wm266-4 세포에 실험 하루전 날 miR-944 mimc을 형질주입 한 후에 각각의 세포를 transwell에 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 1.0 X 10⁵으로 분주하였다. transwell 아래 쪽에 10% FBS가 포함된 정상배지를 공급한 다음 48시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 포름알데하이드로 고정화 시키고, 면봉을 이용하여 martrigel 위쪽에 전이가 되지 않은 세포를 제거하고 아래로 이동한 세포를 0.1% crystal violet으로 염색하여 관찰하였다. 무작위로 5부분을 선택하고 광학현미경을 이용하여 세포 수를 측정하였다.

실험 결과, 대조군 (miR-negative control)에 비하여 miR-944 mimic을 도입한 Wm266-4 세포에서 약 60%정도 전이된 세포가 감소하였다(도 5). 이러한 결과는 흑색종 세포에서 miR-944 발현이 세포의 전이를 감소 시킬 수 있음을 나타낸다.

따라서, 상기 실험예 1과 실험예 2로부터 본 발명의 일측면에 따른 조성물 및 스크리닝 방법이 흑색종 전이 억제에 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 영양로션

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.

원료명 함량	함량(중량%)
정제수	잔량
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
실험예 2의 miR-944 mimic을 포함하는 리포좀	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.5
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1
계	100

[제형예 2] 영양크림

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.

원료명 함량	함량(중량%)
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
실험예 2의 miR-944 mimic을 포함하는 리포좀	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 3] 연고

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.

원료명 함량	함량(중량%)
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
실험예 2의 miR-944 mimic을 포함하는 리포좀	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0
정제수	잔량
계	100

[제형예 4] 주사제

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있다.

원료명 함량	중량비(1ml 당)
염화나트륨	9.0mg
소듐 카르복시메틸셀룰로오즈	30.0mg
Tween 20	1.0mg
실험예 2의 miR-944 mimic을 포함하는 리포좀	1.0mg
주사용 증류수	잔량

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> Composition for inhibiting melanoma metastasis comprising miRNA <130> 15P615IND <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of miR-944 <400> 1 aauuauug 8 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature sequence of miR-944 <400> 2 aaauuauugu acaucggaug ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of miR-944 <400> 3 cucauccgau guacaauaau uu 22 <210> 4 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hairpin of miR-944 <400> 4 guuccagaca caucucaucu gauauacaau auuuucuuaa auuguauaaa gagaaauuau 60 uguacaucgg augagcugug ucugggau 88

Claims

서열번호 1을 코어서열로 포함하는 8 내지 100 mer 길이의 RNA 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 서열번호 4의 서열 또는 그 단편으로서, 상기 단편은 서열번호 1의 코어서열을 포함하는, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 18 내지 23 mer 길이의 miRNA 핵산분자인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 상기 서열번호 1을 코어서열로 포함하는 서열번호 2의 서열인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 이중가닥이며, 서열번호 1의 서열에 혼성화 가능한 서열을 더 포함하는, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 혼성화 가능한 서열은 서열번호 3인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 50 내지 100 mer 길이의 헤어핀 구조인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 7항에 있어서
상기 헤어핀 구조의 RNA 핵산분자는 서열번호 4인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 리포좀(liposome)에 포집된 형태 또는 백터에 삽입된 형태로 포함된, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 RNA 핵산분자는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 조성물은 주사제인, 흑색종 전이 억제용 조성물.
흑색종 전이 억제 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
(a)흑색종 세포를 준비하는 단계;
(b)상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(c)상기 시험물질이 흑색종 세포에서 miR-944의 생성을 유도하는지 또는 활성을 촉진시키는지 여부를 확인하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 전이 억제 물질의 스크리닝 방법.
miR-944 검출시약을 포함하는 흑색종 전이 진단용 조성물.
miR-944 검출시약을 포함하는 흑색종 전이 진단용 키트.
제 14항에 있어서,
상기 키트는
흑색종 세포의 RNA 추출 시약,
추출된 RNA를 cDNA로 역전사 하기 위한 역전사 효소, 및
역전사된 cDNA 중 miRNA-944를 증폭하기 위한 miRNA-944 프라이머를 포함하는 흑색종 전이 진단용 키트.