KR20170058797A - 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법 - Google Patents
비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법에 관한 것으로서, 비행 환경에서 발생할 수 있는 질병 진단 또는 예측 연구를 위하여 비행 환경에 노출 시킨 소동물 모델의 유전자 또는 단백질 발현 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법은, 비행 환경과 유사한 상태에 동물 모델을 노출시킨 후 유전자 발현을 비교 분석함으로써 쉽고 빠르게 유전자 및 단백질의 변화를 예측할 수 있으며, 나아가 비행 환경에 자주 노출되는 사람의 질병 연구에 광범위하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법에 관한 것으로서, 비행 환경에서 발생할 수 있는 질병 진단 또는 예측 연구를 위하여 비행 환경에 노출시킨 소동물 모델의 유전자 또는 단백질 발현 분석 방법에 관한 것이다.
항공우주 산업의 급속한 발달로 항공기 승무원, 비행기 조종사 등 공중 근무자들이 증가하고 있으며, 이들은 직업 상 저산소, 한랭, 소음 및 가속 등과 같은 비행으로 인한 특수 환경에 빈번하게 노출되는 실정이다. 인간의 신체 기능은 해면과 비슷한 고도에 적응되어 있기 때문에 고도가 높아지는 비행 환경에서는 신체적으로 많은 스트레스를 받게 된다. 따라서 비행 환경에 자주 노출되는 사람들의 경우 예상치 못한 질병이 발생할 수 있고, 경우에 따라서는 신체에 치명적인 문제가 생길 수도 있다.
항공우주 산업의 발달에 따라 이상 환경에서 발생되는 다양한 신체적, 유전자적 변화에 대한 기초 연구가 시급한 실정이다. 그러나 비행 환경에서 인간을 대상으로 직접 연구하는 것은 불가능하므로, 실제 비행 환경과 유사한 환경에 노출시킨 소동물 모델을 활용한 연구가 필요하다.
따라서 본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 실제 비행 환경에 노출시킨 소동물 모델을 활용하여 비행 환경에서 유전자를 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소동물 모델을 비행 환경에 노출시키는 단계, 상기 비행 환경에 노출된 소동물 및 비행 환경에 노출되지 않은 대조군 모델의 조직 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계, 상기 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계, 상기 cDNA에 분석대상 유전자의 프라이머 쌍을 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 분석대상 유전자의 발현 정도를 분석하는 단계 및 상기 비행 환경에 노출된 소동물과 대조군의 유전자 발현 정도를 비교하는 단계를 포함하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소동물 모델은 마우스 또는 래트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비행 환경은 저산소 환경일 수 있으며, 상기 저산소 환경은 산소 농도 13 ~ 8.3% 또는 해발 고도 15,000 ~ 25,000 ft인 상태에 30분 ~ 2시간 동안 노출시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비행 환경은 고중력 환경일 수 있으며, 상기 고중력 환경은 2 ~ 10 G 상태에 30분 ~ 2시간 동안 노출시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조직 샘플은 혈액 또는 간 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 분석대상 유전자는 면역 조절 단백질 발현 유전자, 당 단백질 발현 유전자 또는 질병 진단용 마커 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 분석대상 유전자는 IL-1α (interleukin-1α), IL-1β (interleukin-1β), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), IL-13 (interleukin-13), TNF-α (tumor necrosis factor), NOS2 (nitric oxide synthase 2), NOS3 (nitric oxide synthase 3), HIF-1 (hypoxia induced factor-1), OPG (osteoprotegerin) 또는 Grp78 (glucose related protein 78)을 사용하였다.
본 발명에 따른 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법은, 비행 환경과 유사한 상태에 동물 모델을 노출시킨 후 유전자 발현을 비교 분석함으로써 쉽고 빠르게 유전자 및 단백질의 변화를 예측할 수 있으며, 나아가 비행 환경에 자주 노출되는 사람의 질병 연구에 광범위하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 중합효소연쇄반응(PCR) 프로토콜을 간략히 나타낸 그림으로서, 각 단계(1~7 단계)별로 반응 온도 및 시간을 나타낸 것이다.
도 2는 저산소 환경에 노출된 래트(rat)의 혈액 시료에서 사이토카인 (IL-1α 및 IL-1β)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 IL-1α/β-actin 및 IL-1β/β-actin을 나타내며, IL-1α 및 IL-1β 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 3은 저산소 환경(25,000 ft, 하루에 30분씩 10일 간)에 노출된 래트(rat)의 간 조직에서 사이토카인(IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-13및 TNF-α)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 IL-1α/GAPDH, IL-1β/GAPDH, TNF-α/GAPDH, IL-4/GAPDH, IL-5/GAPDH 및 IL-13/GAPDH를 나타내며, 각 사이토카인 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 4는 저산소 환경(15,000 ft 1시간씩 10일; 25,000 ft 30분 또는 1시간씩 10일 간)에 노출된 래트(rat)의 간 조직에서 염증 유발 유도성 일산화질소 합성 효소((a) NOS2, (b) NOS3)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 NOS2/GAPDH 및 NOS3/GAPDH를 나타내며, NOS2 및 NOS3 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 5는 저산소 환경(15,000 ft 1시간씩 10일; 25,000 ft 30분 또는 1시간씩 10일 간)에 노출된 래트(rat)의 간 조직에서 (a) 저산소 유도인자(HIF-1), (b) 파골세포형성 억제인자(OPG)및 (c) 글루코스 조절 단백질(Grp78)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 HIF-1/GAPDH, Grp78/GAPDH 및 OPG/GAPDH를 나타내며, HIF-1, Grp78 및 OPG 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 6은 고중력 환경(10 G, 30분)에 노출된 BALB/c 마우스의 간 조직세포에서 (a) IL-1α 및 (b) IL-1β의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. 그래프에서 Control은 고중력 환경에 노출되지 않은 정상 마우스, H는 고중력 환경에 노출된 정상 마우스, Nasal은 고중력 환경에 노출되지 않은 비염 유발 마우스, Nasal-H는 고중력 환경에 노출된 비염 유발 마우스를 의미한다. y축은 각각 IL-1α/GAPDH 및 IL-1β/GAPDH를 나타내며, IL-1α 및 IL-1β 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 7은 고중력 환경(10 G, 30분)에 노출된 BALB/c 마우스의 간 조직세포에서 (a) Grp78 및 (b) TNF-α의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. 그래프에서 Control은 고중력 환경에 노출되지 않은 정상 마우스, H는 고중력 환경에 노출된 정상 마우스, Nasal은 고중력 환경에 노출되지 않은 비염 유발 마우스, Nasal-H는 고중력 환경에 노출된 비염 유발 마우스를 의미한다. y축은 각각 Grp78/GAPDH 및 TNF-α/GAPDH를 나타내며, Grp78 및 TNF-α값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 8은 고중력 환경(9G, 1시간)에 노출된 C57BL/6 마우스의 간 조직세포에서 (a) IL-1α 및 (b) IL-1β의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. 그래프에서 Control은 고중력 환경에 노출시키지 않은 마우스, 6H, 12H, 30H 및 3D는 고중력 환경에 노출시킨 마우스로서 각각 노출 후 6시간, 12시간, 30시간 및 3일 후에 측정한 결과이다.
도 2는 저산소 환경에 노출된 래트(rat)의 혈액 시료에서 사이토카인 (IL-1α 및 IL-1β)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 IL-1α/β-actin 및 IL-1β/β-actin을 나타내며, IL-1α 및 IL-1β 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 3은 저산소 환경(25,000 ft, 하루에 30분씩 10일 간)에 노출된 래트(rat)의 간 조직에서 사이토카인(IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-13및 TNF-α)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 IL-1α/GAPDH, IL-1β/GAPDH, TNF-α/GAPDH, IL-4/GAPDH, IL-5/GAPDH 및 IL-13/GAPDH를 나타내며, 각 사이토카인 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 4는 저산소 환경(15,000 ft 1시간씩 10일; 25,000 ft 30분 또는 1시간씩 10일 간)에 노출된 래트(rat)의 간 조직에서 염증 유발 유도성 일산화질소 합성 효소((a) NOS2, (b) NOS3)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 NOS2/GAPDH 및 NOS3/GAPDH를 나타내며, NOS2 및 NOS3 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 5는 저산소 환경(15,000 ft 1시간씩 10일; 25,000 ft 30분 또는 1시간씩 10일 간)에 노출된 래트(rat)의 간 조직에서 (a) 저산소 유도인자(HIF-1), (b) 파골세포형성 억제인자(OPG)및 (c) 글루코스 조절 단백질(Grp78)의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. y축은 각각 HIF-1/GAPDH, Grp78/GAPDH 및 OPG/GAPDH를 나타내며, HIF-1, Grp78 및 OPG 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 6은 고중력 환경(10 G, 30분)에 노출된 BALB/c 마우스의 간 조직세포에서 (a) IL-1α 및 (b) IL-1β의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. 그래프에서 Control은 고중력 환경에 노출되지 않은 정상 마우스, H는 고중력 환경에 노출된 정상 마우스, Nasal은 고중력 환경에 노출되지 않은 비염 유발 마우스, Nasal-H는 고중력 환경에 노출된 비염 유발 마우스를 의미한다. y축은 각각 IL-1α/GAPDH 및 IL-1β/GAPDH를 나타내며, IL-1α 및 IL-1β 값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 7은 고중력 환경(10 G, 30분)에 노출된 BALB/c 마우스의 간 조직세포에서 (a) Grp78 및 (b) TNF-α의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. 그래프에서 Control은 고중력 환경에 노출되지 않은 정상 마우스, H는 고중력 환경에 노출된 정상 마우스, Nasal은 고중력 환경에 노출되지 않은 비염 유발 마우스, Nasal-H는 고중력 환경에 노출된 비염 유발 마우스를 의미한다. y축은 각각 Grp78/GAPDH 및 TNF-α/GAPDH를 나타내며, Grp78 및 TNF-α값은 대조군을 1.0으로 하여 3회 반복 측정 후 평균치를 사용하였다.
도 8은 고중력 환경(9G, 1시간)에 노출된 C57BL/6 마우스의 간 조직세포에서 (a) IL-1α 및 (b) IL-1β의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. 그래프에서 Control은 고중력 환경에 노출시키지 않은 마우스, 6H, 12H, 30H 및 3D는 고중력 환경에 노출시킨 마우스로서 각각 노출 후 6시간, 12시간, 30시간 및 3일 후에 측정한 결과이다.
이하에서는, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.
<실험방법>
실시예
1.
실험 동물
상기 소동물 모델은 샘타코(한국, 오산)에서 무균 처리하여 구입한 7주령된 래트(rat), 6주령 된 BALB/c 마우스(mouse) 및 C57BL/6 마우스를 실험 동물로 사용하였다. 사흘 간 적응 기간을 두어 건강 상태를 점검하고, 온도 20 ~ 25℃, 습도 40 ~ 45%로 조절하여 자율적으로 먹이와 수분 공급하고, 12시간 주기 사육실 조명으로 낮과 밤을 유지하였다. 위 동물실험은 항공우주의료원 실험동물윤리위원회 승인 후 실시하였다.
한편, Ovalbum(OVA, Sigma-Aldrich) 0.0375 g, 프로테아제(protease; Sigma-Aldrich) 678.5 ㎕, PBS(Sigma-Aldrich) 9.32 ml을 혼합하여 BALB/c 마우스의 코에 일주에 세 번 20 ㎕씩 한 달간 주입하여 BALB/c 마우스의 비염 유발 모델(Nasal)을 준비하였다.
실시예
2. 비행 환경 노출
본 실험에서는 비행 환경으로서 저산소 환경 및 고중력 환경을 사용하였으며, 상기 실시예 1의 실험 동물을 각각의 비행 환경에 일정 시간 노출시킨 후에 유전자 발현을 분석하여였다.
저산소 환경은 항공우주의료원에서 설계 제작한 실험 동물용 저압 환경장비(선엔지니어링·대건기계, 한국)를 이용해 구현하였으며, 상기 실험 동물을 매일 고도 15,000 ft(산소 농도가 13% 이하인 상태)에 1시간, 25,000 ft(산소 농도가 8.3% 이하인 상태)에 30분 및 1시간씩 2주간 노출시켰다.
고중력 환경은 항공우주의료원에서 설계 제작한 실험 동물용 가속도 연구장비(한국이멕스·대건기계, 한국)를 이용해 구현하였으며, 상기 실험 동물을 매일 2 ~ 10 G 상태에 30분 내지 2시간 동안 2주간 노출시켰다.
비행 환경 노출 실험 후 실험 동물을 희생하여 혈액, 간 세포를 수득하고, 하기와 같이 유전자 분석을 위한 조직 샘플을 추출하였다.
실시예
3. 혈액으로부터 RNA 추출
상기 비행 환경에 노출되었던 실험 동물로부터 수득한 전혈(whole blood) 200 ㎕에 Lysis Buffer DL 200 ㎕(구아니딘 티오시안산염(guanidinium thiocyanate) 30 ~ 60%)를 혼합 후 단백질 키나아제 5 ㎕를 넣고 15분 간 흔들면서 18 ~ 25℃에서 배양하였다. 그리고 70% 에탄올을 혼합하여 격렬히 섞어준 후 NucleoSpin RNA Blood Column에 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심분리 하였다. 여기에 MDB(Membrane desalting buffer) 350 ㎕를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심분리 한 후, 95 ㎕ rDNase 시약을 컬럼에 넣고 15분 간 방치하였다. 그 다음 세척 단계로서, 첫 번째 RB2 세척용 버퍼(washing buffer) 200 ㎕를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심 분리하였고, 두 번째 RB3세척용 버퍼 600 ㎕를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심 분리한 후, 세 번째 RB3세척용 버퍼 250 ㎕를 넣고 11,000 g에서 2분 간 원심 분리하였다. 마지막으로 60 ㎕ RNase free H2O를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심 분리 하였다. 이 중 5 ㎕를 취해 RNase free H2O 75 ㎕를 넣고 희석한 후, 자외선분광광도계를 이용하여 A260/280 nm 정량하여 순도(purity) 1.9 ~ 2.1 값 안에 들어간 시료로 cDNA를 합성하였다.
실시예
4. 간 조직으로부터 RNA 추출
상기 비행 환경에 노출되었던 실험 동물로부터 수득한 간 조직 30 mg을 취하여 튜브에 넣고, 라이시스 버퍼(lysis buffer) 200 ㎕를 넣은 후 아이스 상태에서 초음파 파쇄기를 이용하여 30초간 파쇄하였다. 그 후 라이시스 버퍼 150 ㎕와 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 3.5 ㎕를 넣어 혼합시킨 후에 NucleoSpin 필터로 11,000 g 에서 1분 간 원심 분리하였다. 여기에 70% 에탄올 350 ㎕를 혼합하고, NucleoSpin RNA II Column으로 11,000 g에서 30초 간 원심 분리하였다. 여기에 다시 MDB(Membrane desalting buffer) 350 ㎕를 넣고 11,000 g에서 1분 간 원심분리 한 후, 95 ㎕ DNase 시약을 Column에 넣고 15분간 방치하였다. 그 다음 세척 단계로서, 첫 번째 RA2 세척용 버퍼(washing buffer) 200 ㎕를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심 분리하였고, 두 번째 RA3세척용 버퍼 600 ㎕를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심 분리한 후, 세 번째 RA3세척용 버퍼 250 ㎕를 넣고 11,000 g에서 2분 간 원심 분리하였다. 마지막으로 60 ㎕ RNase free H2O를 넣고 11,000 g에서 30초 간 원심 분리 하였다. 이 중 5 ㎕를 취해 RNase free H2O 75 ㎕를 넣고 희석한 후, 자외선분광광도계를 이용하여 A260/280 nm정량하여 순도(purity) 1.9 ~ 2.1 값 안에 들어간 시료로 cDNA를 합성하였다.
실시예
5. RNA 정량 및 cDNA합성
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 추출한 실험 동물의 RNA가 제대로 분리되었는지 확인하기 위하여 자외선분광광도계를 이용하여 정량하였으며, 순도(purity) 1.9 ~ 2.1 값 안에 들어간 시료로 cDNA를 합성하였다.
cDNA 합성은 ReverTra Ace-α-reverse transcriptase kit(Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan)를 사용하였고, 상기 실시예 3 및 4의 각 시료로부터 정량한 농도의 RNA를 이용하여 반응 용액을 혼합하고 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 상기 정량한 RNA (X ㎕)에 5x RT 완충액 4 ㎕, dNTP혼합물(각 10 mM) 2 ㎕, RNase저해제 (10 U/㎕) 1 ㎕, 프라이머 혼합물 1 ㎕, ReverTra Ace 1㎕ 및 RNAase-free H2O를 혼합하여 반응 용액 총 부피가 20 ㎕가 되도록 준비하였다. 이때 상기 프라이머 혼합물은 임의의 프라이머(random primer, 25 pmol/㎕), 올리고(dT)20(10pmol/㎕), 특정 프라이머(10 pmol/㎕)의 혼합용액이다. 상기 임의의 프라이머는 제조사에서 제조한 것이며, 상기 특정 프라이머 서열은 아래 표 1 및 표 2와 같다.
| No. | 프라이머 서열 이름 | 염기서열 (5'-3') | |
| 서열번호 1 | rGAPDH | Forward | CAT AGACAAGATGGTGAA GGT |
| 서열번호 2 | Reverse | AGTTGAGGT CAATGAAGG G | |
| 서열번호 3 | rACTIN | Forward | CCCGCGAGT ACAACCTTC T |
| 서열번호 4 | Reverse | CGT CATCCATGG CGA ACT | |
| 서열번호 5 | rHIF-1α | Forward | GTG TGA ATTTTG TAA GTGGTA T |
| 서열번호 6 | Reverse | TCG TGT CCT CAG ATT CCA | |
| 서열번호 7 | rNOS2 | Forward | CTT GCCCCTGGAAGTTTC |
| 서열번호 8 | Reverse | TTGATGCTT GTG ACTCTT AGG | |
| 서열번호 9 | rNOS3 | Forward | GCATCACCT ACGATA CCC |
| 서열번호 10 | Reverse | GGC TCT GTAACT TCC TTGG | |
| 서열번호 11 | rOPG | Forward | GGCAAGTTGACC GTTAGC |
| 서열번호 12 | Reverse | GGAACAAGA AAC ACTGGACTC | |
| 서열번호 13 | rGrp78 | Forward | CCT GGT TCT GCT TGA TGT G |
| 서열번호 14 | Reverse | TGT TAC GGT GGG CTG ATT A | |
| No. | 프라이머 서열 이름 | 염기서열 (5'-3') | |
| 서열번호 15 | mGAPDH | Forward | CGT GCCGCCTGGAGA AACC |
| 서열번호 16 | Reverse | TGGAAGAGT GGGAGTTGCTGT TG | |
| 서열번호 17 | mβ-ACTIN | Forward | ATGGTGGGA ATGGGT CAG |
| 서열번호 18 | Reverse | GGGTAC TTC AGG GTC AGG | |
| 서열번호 19 | mHIF-1α | Forward | GGA TGA TGA CGA CCT GCT A |
| 서열번호 20 | Reverse | ACT TGT TGG CTT ATG TTC TGT | |
| 서열번호 21 | mVEGF | Forward | ATT TATTGG TGC TACTGT TTA TCC |
| 서열번호 22 | Reverse | TCTGTATTT CTT TGT TTATT | |
| 서열번호 23 | mVWF | Forward | ATG ACC CTG AAGCAA GATG |
| 서열번호 24 | Reverse | TAC TCT CCT CTC TCG TTGAC | |
| 서열번호 25 | mIL-1α | Forward | CGT GTT GCT GAA GGA GTT |
| 서열번호 26 | Reverse | ATG TGA AGT AGT TCT TAG AGT TGA T | |
| 서열번호 27 | mIL-1β | Forward | CTA CAG GCT CCG AGA TGA |
| 서열번호 28 | Reverse | TTG TCG TTG CTT GGT TCT | |
| 서열번호 29 | mGrp78 | Forward | GGA GAG GAG GAA TTG GCT AT |
| 서열번호 30 | Reverse | TTA TTG GTG TCA CTT ATG GTA GAA | |
| 서열번호 31 | mTNF-α | Forward | ACC ACC ATC AAG GAC TCA A |
| 서열번호 32 | Reverse | AAG GTC TGA AGG TAG GAA GG | |
다음으로, 상기 제조한 반응 용액으로 ReverTraAce-alpha-(TOFSK-101)(TOYOBO, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 반응 용액 20 ㎕를 30℃에서 10분 간 전배양(pre-incubation), 42℃에서 20분 간 배양(incubation), 99℃에서 5분 간 가열(heating)하고 반응 종료 후 냉동 보관하였다.
실시예
6.
중합효소연쇄반응
(
PCR
)
상기 실시예 5에서 합성한 cDNA시료 5 ㎕에 분석대상 유전자의 프라이머 쌍 각각 0.5 ㎕, 형광물질(SsoAdvanced SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories, Inc.) 10 ㎕, RNA-free H2O 4 ㎕를 혼합하여 PCR 반응 용액을 만들었다. 상기 프라이머 서열은 상기 표 1 및 2에 나타난 바와 같다.
다음으로, 상기 제조한 PCR 반응 용액을 96-well plate에 20 ㎕씩 분주하였으며, CFX 96 Real-Time System(BIO-RAD, USA)의 C1000 Thermal Cycler를 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 95℃에서 3분동안 가열하는 것을 시작으로 Normal expression(delta delt Ct) 모드의 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였으며, 구체적인 프로토콜을 도 1에 나타내었다.
<실험 결과>
1. 저산소 환경에 노출된
래트의
혈액 시료에서 사이토카인 발현 확인
상기 실시예 1의 래트를 해발고도 25,000 ft의 저산소 환경에 하루에 30분씩 10일 간 노출시킨 후 채취한 혈액 시료에서 IL-1α 및 IL-1β의 mRNA 발현량 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 저산소 환경에 노출된 래트에서 IL-1α의 발현량은 6.6배 증가하였고, IL-1β의 발현량은 7배 증가하였다. 이로부터 저산소 환경은 면역기전에 영향을 주고, 장시간 노출될 때 건강과 질병에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 수 있었다.
2. 저산소 환경에 노출된
래트의
간 조직에서 사이토카인 발현 확인
상기 실시예 1의 래트를 해발고도 25,000 ft의 저산소 환경에 하루에 30분씩 10일 간 노출시킨 후 채취한 간 조직 시료에서 IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-13및 TNF-α의 mRNA 발현량 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 저산소 환경에 노출된 래트의 간 조직에서IL-1α(5.3배), IL-1β(3배), IL-4(5배), IL-6(5.6배), IL-13(1.4배) 유전자의 발현량은 증가한 반면, TNF-α의 발현량은 1/3로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 저산소 환경은 혈액뿐만 아니라 대사기능 최대 장기인 간에도 영향을 주어 면역 기능 저하를 일으키며, 장시간 노출 시 건강에 지대한 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다.
3. 저산소 환경에 노출된
래트의
간 조직에서
NOS2
,
NOS3
발현 확인
상기 실시예 1의 래트를 다양한 조건의 저산소 환경에 노출시킨 후 고도와 노출 시간에 따른 염증유발 유도성 일산화질소(NO) 합성효소 관련 유전자의 발현 정도를 비교하였다. 구체적으로, 래트를 각각 고도 15,000 ft에서 1 시간, 25,000 ft에서 30분, 25,000 ft에서 1시간씩 10일 동안 노출시킨 후 간 조직에서 NOS2(nitric oxide synthase 2, iNOS), NOS3(nitric oxide synthase 3) 발현 정도를 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, NOS2 및 NOS3의 발현은 고도가 높아지고(산소 농도가 낮아지고), 노출 시간이 증가할수록 감소하는 경향을 나타내었다. 이로부터 저산소 환경은 산화성 스트레스로 인한 간 조직에 영향을 주고 있음을 알 수 있었다.
4. 저산소 환경에 노출된
래트의
간 조직에서
HIF
-1,
OPG
,
Grp78
발현 확인
상기 실시예 1의 래트를 각각 고도 15,000 ft와 25,000 ft에서 각각 1시간씩 10일 동안 노출시킨 후 간 조직에서 HIF-1(hypoxia induced factor-1), OPG (osteoprotegerin) 및 Grp78(glucose related protein 78) 유전자의 발현 정도를 분석하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, HIF-1, OPG 및 Grp78 발현은 고도가 높아질수록(산소 농도가 낮아질수록) 발현이 감소하는 경향을 보였다. 이로부터 고도가 높아지고 저산소 환경에의 노출시간이 길어짐에 따라 면역단백질이 저하되고, 파골세포 생성인자가 감소하여, 장기간 노출 시 골다골증이 생길 수 있음을 간접적으로 알 수 있었다.
5.
고중력
환경에 노출된 마우스의 간 세포에서 사이토카인 발현 확인
상기 실시예 1의 BALB/c 마우스를 정상군(Control)과 비염 유발 군(Nasal)으로 나누고, 각각 고중력 환경인 10 G에서 30분씩 10일 동안 노출시킨 후 간 조직에서 RNA를 추출하여 IL-1α 및 IL-1β 유전자 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, IL-1α 및 IL-1β의 발현량은 정상군에 비해 비염 유발군에서 증가하였고, 비노출군에 비해 고중력 환경 노출군에서 증가하여, 비염 유발 마우스를 고중력 환경에 노출시켰을 때 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 이로부터 IL-1α 및 IL-1β 유전자는 비염이 있는 상태에서 고중력 환경에 노출되었을 때 간에서 면역기능에 문제가 생겨 질병이 유발될 가능성이 높다는 것을 간접적으로 알 수 있었다.
6.
고중력
환경에 노출된 마우스의 간 세포에서
Grp78
,
TNF
-α 발현 확인
상기 실시예 1의 BALB/c 마우스를 정상군(Control)과 비염 유발 군(Nasal)으로 나누고, 각각 고중력 환경인 10 G에서 30분씩 10일 동안 노출시킨 후 간 조직에서 RNA를 추출하여 Grp78 및 TNF-α 유전자 발현 변화를 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, Grp78의 발현량은 정상군에 비해 비염 유발군에서 증가하였고, 비노출군에 비해 고중력 환경 노출군에서 감소하여, 고중력 환경에 노출되지 않은 비염 유발군에서 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 한편, TNF-α의 발현량은 정상군에 비해 비염 유발군에서 현저히 증가하였는데, 정상군의 경우 고중력 환경에 노출되었을 때 TNF-α의 발현이 증가한 반면, 비염 유발군의 경우 고중력 환경 노출군에서 발현이 감소하여 상반된 결과를 나타내었다. 이로부터 비염 유발군이 고중력 환경에 노출되었을 때, 고중력 환경은 Grp78 및 TNF-α 유전자 발현 변화에 영향을 주지 못한 반면, 비염이 오히려 두 유전자에 영향 준 것을 알 수 있었다.
7.
고중력
환경에 노출된 마우스의 간 조직에서 IL-
1α
, IL-
1β
발현량 변화
상기 실시예 1의 C57BL/6 마우스를 고중력 환경인 9 G에 1시간씩 10일 동안 노출시킨 후 회복기 동안 시간 변화에 따라간 조직에서 IL-1α 및 IL-1β 유전자 발현 변화를 추적하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, IL-1α의 발현량은 고중력 환경에 노출된 이후 12시간 경과시까지 발현량이 증가하였다가, 차츰 감소하는 것으로 나타났다. 한편, IL-1β의 발현량은 시간이 지날수록 점점 증가하여 고중력 노출 후 3일이 경과한 시점에 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 이로부터 지상 환경이 아닌 이상 환경에 장기간 노출되었을 때 유전자 발현 변화가 나타나는 점으로부터 면역 체계를 비롯한 신체적인 변화가 서서히 진행되어 가고 있음을 간접적으로 확인할 수 있었다.
본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위하여 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 본 명세서에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적이거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에서 개시된 기술의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 그 기술의 사상이 제한되는 것은 아니며, 본 명세서에 개시된 기술의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (8)
- (a) 소동물 모델을 비행 환경에 노출시키는 단계;
(b) 상기 비행 환경에 노출된 소동물 및 비행 환경에 노출되지 않은 대조군 모델의 조직 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계;
(c) 상기 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(d) 상기 cDNA에 분석대상 유전자의 프라이머 쌍을 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 분석대상 유전자의 발현 정도를 분석하는 단계; 및
(e) 상기 비행 환경에 노출된 소동물과 대조군의 유전자 발현 정도를 비교하는 단계를 포함하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소동물 모델은 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비행 환경은 저산소 환경 또는 고중력 환경인 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 저산소 환경은 산소 농도 13 ~ 8.3% 또는 해발 고도 15,000 ~ 25,000 ft인 상태에 30분 ~ 2시간 동안 노출시키는 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 고중력 환경은 2 ~ 10 G 상태에 30분 ~ 2시간 동안 노출시키는 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조직 샘플은 혈액 또는 간 세포인 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분석대상 유전자는 면역 조절 단백질 발현 유전자, 당 단백질 발현 유전자 또는 질병 진단용 마커 유전자인 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 분석대상 유전자는 IL-1α (interleukin-1α), IL-1β (interleukin-1β), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), IL-13 (interleukin-13), TNF-α (tumor necrosis factor), NOS2 (nitric oxide synthase 2), NOS3 (nitric oxide synthase 3), HIF-1 (hypoxia induced factor-1), OPG (osteoprotegerin), Grp78 (glucose related protein 78)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150162867A KR101854740B1 (ko) | 2015-11-19 | 2015-11-19 | 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020150162867A KR101854740B1 (ko) | 2015-11-19 | 2015-11-19 | 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170058797A true KR20170058797A (ko) | 2017-05-29 |
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| KR1020150162867A KR101854740B1 (ko) | 2015-11-19 | 2015-11-19 | 비행 환경에서 유전자 발현 분석 방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102135178B1 (ko) * | 2019-01-15 | 2020-07-17 | 한남대학교 산학협력단 | 고중력에 노출된 쥐의 유전자 분석방법 |
| KR20220092137A (ko) | 2020-12-24 | 2022-07-01 | 한국기초과학지원연구원 | 시스템 상태 진단 장치 및 방법 |
-
2015
- 2015-11-19 KR KR1020150162867A patent/KR101854740B1/ko active IP Right Grant
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| KR20220092137A (ko) | 2020-12-24 | 2022-07-01 | 한국기초과학지원연구원 | 시스템 상태 진단 장치 및 방법 |
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|---|---|
| KR101854740B1 (ko) | 2018-05-04 |
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