KR20170058035A - 진세노사이드 Rb1, 및 진세노사이드 Rg1을 포함하는 신경세포 보호용 조성물 - Google Patents

진세노사이드 Rb1, 및 진세노사이드 Rg1을 포함하는 신경세포 보호용 조성물 Download PDF

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황지연
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Abstract

본 발명의 일 측면에 따르면, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rg1 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물이 제공된다.

Description

진세노사이드 Rb1, 및 진세노사이드 Rg1을 포함하는 신경세포 보호용 조성물{COMPOSITION COMPRISING GINSENOSIDE-RB1 AND A GINSENOSIDE-RG1 FOR PROTECTING NEURONAL CELLS}
본 발명은 백삼에서 유래한 진세노사이드 Rb1, 및 진세노사이드 Rg1을 포함하는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것으로, 퇴행성 신경질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 신경세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
최근 생활환경과 식생활 패턴의 변화 등으로 현대인들은 생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환에 관심이 커지고 있다. 특히, 급속한 노령 인구의 증가에 따라, 뇌, 척추, 말초신경의 손상을 포함한 퇴행성 신경질환이 점차 증가하고 있는 추세이다. 퇴행성 신경질환은 허혈에 기인한 신경손상 및 활성산소에 의한 신경손상과 관련된 질환을 포함한다.
신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 신경질환의 주요 요인이 된다. 산화적 스트레스는 퇴행성 신경질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계, 해마, 선조체, 흑질 그리고 전뇌피질 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 퇴행성 신경질환을 초래하는 것으로 보고된 바 있다.
산소에서 유리되는 자유라디칼은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있다. 신경독성과 관련된 산화적 라디칼은 과산화수소, 과산화수소 음이온, 수산화기 등이 있으며, 과산화수소가 중추신경계의 세포사멸 유발에 있어서 가장 중요한 물질로 손 꼽힌다.
뇌신경세포에서 활성산소종(Reactive Oxygen Species)은 산화적 스트레스에 의해 생성되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파아제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 유발한다. 동시에 활성산소종은 글루타메이트, 특히 NMDA 수용체를 활성화하여 메타보트로피칼 케스케이드(metabotrophical cascade)에 의한 Ca2 + 이온의 증가를 야기하고, 세포내 Ca2 +의 증가는 카스파아제-2를 활성화하여 DNA를 손상시킨다.
현재 세계적으로 고령인구의 비중은 점차 증가하고 있다. 우리나라도 2010년 기준 65세 이상 인구의 비율이 11%로 상승하였고, 2018년에는 고령사회, 2026년에는 초고령 사회로 접어들 것으로 예견되며, 고령인구의 노인성 질병의 해결이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다.
특히, 노인성 치매질환의 약 절반을 차지하는 알츠하이머병은 현재 효과적인 치료방법과 예방방법이 없으며, 고령화 사회에 있어서 시급히 해결해야 할 신경질환에 해당한다.
한편, 인삼은 파낙스(Panax)속에 속하는 다년생 식물로, 파낙스속 식물은 식물 분류학상 오가피과(Araliaceae)에 속하 는 다년생 숙근초로서 지구상에 십여 종이 알려져 있다. 특히 고려인삼에 다량 함유된 사포닌은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re 등이 있으며, 특히 스코폴라민(scopolamine)으로 손상된 동물모델이나 해마(hippocampus) 신경세포의 손상에 의한 기억력 감퇴를 인삼이 완화시키는 것으로 알려지고 있다.
이와 같이 인삼의 신경세포 보호 효과에 대한 연구에도 불구하고, 종래의 연구는 증삼되어 제조된 홍삼의 진세노사이드 성분을 중심으로 효과가 검증되고 있는 실정이며, 가공되지 아니한 백삼에서 추출되는 진세노사이드를 활용하기 위한 연구는 미흡한 실정이었다.
본 발명자들은 기능단백체학을 적용한 정량분석 방법을 통해 백삼 유래 진세노사이드의 신경세포 사멸 및 퇴행성 신경질환의 발병에 미치는 영향을 심층적으로 분석하, 질병과 관련된 일련의 기작을 본질적인 측면에서 밝히고자 하였으며, 백삼에서 유래한 진세노사이드의 퇴행성 신경질환의 치료 및 예방에 대한 잠재적인 활용 가능성을 확인하였다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 종래에 그 효과 및 기작이 명확하게 밝혀지지 아니한 백삼 유래의 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 신경세포보호 효과를 객관적으로 검증하고, 신경세포의 손상에 대한 보호용 조성물로서의 용도를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 조성물 및 퇴행성 신경질환 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rg1 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1 및 진세노사이드 Rg1은 백삼추출물로부터 단리될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1은 세포골격(actin cytoskeleton) 단백질 및 미토콘드리아(mitochondria) 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포골격(actin cytoskeleton) 단백질은 DSTN(Isoform 2 of destrin), CAPZB(Isoform 2 of F-actin-capping protein subunit beta), CAP1(Adenylyl cyclase-associated protein 1), 및 CFL1(Cofilin 1) 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg1은 미토콘드리아(mitochondria) 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 미토콘드리아 단백질은 TOMM40(Mitochondrial import receptor subunit TOM40 homolog) 단백질일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 신경세포 보호용 조성물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 또는 치매(dementia)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 신경세포 보호용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 및 개선용 건강기능식품이 제공된다.
본 발명에 따르면, 상기 신경세포 보호용 조성물은 진세노사이드 Rb1, Rg1의 작용 기작에 대한 명확한 이해를 바탕으로 효과적으로 신경세포의 사멸을 억제하는 방법을 제공하며, 퇴행성 신경질환에 대한 치료, 예방, 진단 또는 그 연구 등에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 신경세포에 대한 백삼 유래의 진세노사이드 Rb1(Ginsenoside Rb1)의 신경보호 효과를 확인하기 위한 LC/MS/MS기법 중 세포배양간 아미노산 안정동위원소 표지법(SILAC)을 도식화한 것이다.
도 2는 Tubulin beata-2A chain 단백질을 이용하여, 세포배양간 아미노산 안정동위원소 표지법(SILAC)이 적절하게 이루어졌는지 확인한 것이다.
도 3은 3회의 반복실험을 통하여 얻은 단백질을 벤다이어그램을 통해 도식화한 것이며(도 3A), 3회 반복실험의 실험을 통해 교집합 1231개의 단백질 중 1.5배 이상 변화된 총 39개의 단백질을 확인한 것이다(도 3B).
도 4는 바이오인포매틱스(Bioinformatics) 중 DAVID의 유전자 기능분석(Gene Ontology)을 이용하여 1.5 배 이상 변화된 단백질의 Cellular component를 분석하고(도 4A), 비중이 가장 큰Intracellular organelle part의 단백질을 이용하여 Biological process를 분석한 결과이다(도 4B).
도 5는 Intracellular organelle part에 속한 단백질의 상호 네트워크를 도식화한 것이며, 작은 원형의 색이 붉은색에 근접할수록 상향 조절(처리군/대조군의 Log2 Ratio)된 단백질이고 녹색에 근접할수록 하향 조절된 단백질이다. 파란타원은 Biological process 중 가장 비중이 큰 Organelle organization에 속한 단백질이며, 이 중 상호네트워크 및 유의성이 큰 것으로 분석된 세포골격 단백질을 점선의 타원으로 표시하였다.
도 6은 Cofilin-1은 알츠하이머질병과 밀접한 연관이 있음이 밝혀진바 있는 단백질이며, 본 실험결과 교집합에서 발견된 cofilin-1(CFL1) 및 Intracellular organelle part에 속한 단백질 간 상호관계를 도식화 한 것이다.
도 7은 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 신경세포에 대한 백삼 유래의 진세노사이드 Rg1(Ginsenoside Rg1)의 신경손상 회복 효과를 확인하기 위한 LC/MS/MS기법 중 세포배양간 아미노산 안정동위원소 표지법(SILAC)을 도식화한 것이다.
도 8은 세포배양에 의해 아미노산 안정동위원소가 세포에 표지된 것을 확인한 destrin 단백질의 EIC(Extracted ion chromatography) 결과이며, 처리군 및 대조군이 1:1 의 동일비율로 혼합된 것을 나타낸다.
도 9는 3회의 반복실험을 통하여 얻은 단백질을 벤다이어그램을 통해 도식화한 것이다.
도 10은 백삼추출물 Rg1 처리 후 변화한 단백질의 양적 분포도를 표현한 그래프이다.
도 11은 3회 반복실험의 실험을 통해 백삼추출물 Rg1에 의해 1.5배 이상 변화한 단백질 49개의 조성물과 그 변화량을 나타낸 것이다.
도 12는 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 유전자 기능분석(Gene Ontology)을 통해 1.5배 이상 변화한 단백질을 분석하고 그 결과를 도식화한 것이다.
도 13은 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 백삼추출물 Rg1에 의해 1.5배 이상 변화한 단백질의 단백질 간 상호관계 분석(Protein-Protein Interaction analysis)을 도식화한 것이다.
도 14는 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 백삼추출물 Rg1에 의하여 변화한 미토콘드리아 관련 단백질 및 그 변화량을 나타낸 것이다.
도 15는 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 대조군과 비교하여 처리군에서 현저히 증가한 TOMM40의 질량분석 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 신경세포 사멸 환경에서 백삼추출물 Rg1에 의하여 1.5배 이상 변화한 미토콘드리아 관련 단백질의 상호관계 및 변화량을 도식화한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rg1 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물이 제공된다.
상기 신경세포 보호용 조성물은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rg1 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명자들은 종래에 심층적인 연구가 수행되지 아니한 백삼에서 유래한 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 신경세포 보호 효과 및 그 기작을 명확하게 규명하였으며, 퇴행성 신경질환의 치료 또는 예방에 대한 적용 가능성을 확인하였다.
상기 신경세포는 신경계를 구성하는 주된 세포로서, 근육을 포함한 타 세포의 작용을 조절하는 세포를 의미할 수 있다. 상기 신경세포는 일반적 세포와 달리 전기적 방법으로 신호를 전달하며 발생 단계가 종료된 후 더 이상 분열하지 않아 손상시 복구가 거의 불가능하므로 발생시 정상적으로 분열되어 정상 기능을 수행할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 상기 신경세포 보호용 조성물은 신경세포의 위치나 크기와 무관하게 모든 신경세포를 보호할 수 있으며, 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1 및 진세노사이드 Rg1은 백삼추출물로부터 단리될 수 있다.
상기 백삼은 4 내지 6년근 수삼을 원료로 하여 껍질을 벗겨내고 햇볕에 건조하여 수분 함량이 14% 이하가 되도록 가공한 원형유지 인삼을 의미하는 것으로, 본 발명자들은 백삼에서 유래한 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 종래 알려지지 아니한 신경세포 보호활성을 규명하였다.
상기 인삼의 품종 또는 외형적 가공 형태는 특별히 제한되지 아니하며, 예컨대, 고려삼(Panax ginseng), 전칠삼(P. notoginseng), 미국삼(Panax quinquefolium), 죽절삼(P. japonicus), 회기삼(P. quiquefolius), 히말라야삼(P. pseudoginseng), 베트남삼(P. vietnamensis), 삼엽삼(P. trifolium)　일 수 있다. 상기 인삼은 진세노사이드 34종(백삼 22종, 홍삼 30종)을 함유하고 있으며, 상기 진세노사이드는 중추신경계를 비롯하여 내분비계, 면역계, 대사계 등에 광범위한 영향을 미쳐 신체기능 조절, 즉 생리기능 정상화에 탁월한 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb1은 세포골격(actin cytoskeleton) 단백질 및 미토콘드리아(mitochondria) 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있다.
상기 세포골격은 세포 내의 골격기관으로 다른 세포소기관과 같이 세포질에 포함되어 있다. 상기 세포골격은 모든 세포, 즉 식물 세포나 동물 세포, 혹은 진핵세포나 원핵세포 모두에 존재하며 세포 형태를 유지하게 하거나 세포 내 수송 및 세포분열에 있어서 중요한 역할을 수행한다.
상기 미토콘드리아는 세포 소기관의 하나로 세포호흡에 관여하며, 에너지를 생산하는 역할을 수행한다. 특히, 신경세포에 산화적 스트레스가 부여되면 미토콘드리아에서 활성산소종의 생성이 증가되어 산화에 의한 손상(oxidative damage)이 유발될 수 있으며, 상기 손상은 퇴생성 신경질환의 발병과 밀접한 관련성이 있는 것으로 보고되었다.
상기 세포골격 단백질 및 미토콘드리아 단백질은 알츠하이머병을 포함하는 퇴행성 신경질환과 밀접한 관련성이 있는 것으로 알려진 바 있으며, 본 발명자들은 상기 진세노사이드 Rb1이 상기 세포골격 단백질 및 미토콘드리아 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포골격(actin cytoskeleton) 단백질은 DSTN(Isoform 2 of destrin), CAPZB(Isoform 2 of F-actin-capping protein subunit beta), CAP1(Adenylyl cyclase-associated protein 1), 및 CFL1(Cofilin 1) 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.
특히, 상기 CFL1(Cofilin 1) 단백질은 인산화에 의해 퇴행성 신경질환에서 발현 정도가 상이해지는 것으로 알려진 CAP1 단백질과 상호작용하고 발현에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 본 발명자들은 상기 진세노사이드 Rb1이 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 상기 CFL1 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있음을 확인하였다.
이 때, 상기 단백질의 Gene name은 공식 명명된 유전자 이름을 지칭하며, 상기 괄호의 protein description은 공식 명명된 단백질의 이름을 지칭한다.
또한, 상기 진세노사이드 Rg1은 신경세포 사멸이 유발된 환경에서 미토콘드리아(mitochondria) 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있으며, 상기 미토콘드리아 단백질은 TOMM40(Mitochondrial import receptor subunit TOM40 homolog) 단백질일 수 있다.
상기 TOMM40 단백질은 신경세포의 미토콘드리아에 단백질을 수송하는 역할을 하는 것으로 알려진 바 있으며, 상기 단백질의 변이에 의해 미토콘드리아의 기능이 저해되고 알츠하이머병을 유발하는 것으로 보고된 바 있다.
본 발명자들은 상기 진세노사이드 Rb1 및 Rg1이 TOMM40 단백질과 관련 미토콘드리아 단백질의 발현을 상향 조절할 수 있음을 확인하였으며, 이는 상기 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 퇴행성 신경질환의 치료 또는 예방에 대한 잠재적 가능성을 시사한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 신경세포 보호용 조성물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.
상기 “퇴행성 신경질환”은 신경세포의 점진적인 구조적, 기능적인 손실로 인해 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차원적인 기능이 저해 또는 손실되는 포괄적인 병태를 지칭한다. 상기 퇴행성 신경질환은 신경계의 특정부위를 주로 침범하여 치매, 추체외로 이상, 소뇌 이상, 감각 장애, 운동 장애 등의 증상을 동반하며, 동시에 여러 부위가 침범되어 복합적으로 나타날 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 또는 치매(dementia)일 수 있다.
상기 신경세포 보호용 조성물은 당해 기술 분야의 통상적인 방법에 따라 건조, 농축 가공과 함께 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 상기 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산 일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 “예방”은 동물의 병리학적 세포의 발생 또는 세포의 손상, 소실의 정도의 감소를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생 또는 신경세포의 사멸이나 손실 등이 상기 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다. 또한, 상기 “치료”는 퇴행성 신경질환의 하나 이상의 증상을 개선하거나, 증상의 진행을 저지하는 것을 의미하며, 통상적으로 사용되는 치료의 의미를 포괄할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다.
상기 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 전신 또는 국소 투여할 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 상기 신경세포 보호용 조성물이 치료제로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.
따라서, 상기 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.
상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.　
한편, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 신경세포 보호용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 및 개선용 건강기능식품이 제공된다. 상기 건강보조식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강보조식품의 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 건강보조식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 엑스, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 건강기능식품은 신경세포 보호 작용에 의해 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상을 포함한 각종질환의 예방 및 개선에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 형태로 가공되어 복용이 용이하고 쉽고 제품화가 용이하다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
실험예 1 : 분석 시료의 제조
실험예 1-1 : SILAC 방법을 이용한 신경세포 단백체(Proteome ) 분석
본 발명자들은 질량분석법(mass spectrometry) 기반의 단백체 분석을 수행하기 위하여 SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture) 방법을 적용하였다. 상기 단백체 분석을 통해 백삼에서 유래한 Rb1 및 Rg1의 신경보호 효과에 의한 단백질의 현저한 변화를 확인하였다.
도 1 및 도 7은 알츠하이머 질병이 유도된 신경세포에 대한 백삼 유래의 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 신경보호 효과를 분석하기 위한 LC/MS/MS 기법 중 세포배양간 아미노산 안정동위원소 표지법(SILAC)을 도식화한 것이다.
도 1 및 도 7을 참조하면, 본 실험을 위해 신경세포의 기능연구에 많이 사용되고 있는 SH-SY5Y 세포주를 이용하여 세포주 내의 특정 아미노산이 충분히 치환될 수 있도록 5일간 배양하였으며, 5회 계대배양 하였다. 상기 세포주의 신경세포의 기능 조절에 관여하는 단백질의 발현 변화를 정량적으로 확인하고자 안정동위원소(Stable isotope)인 13C, 15N이 표시(labeling)된 특정 아미노산(Arg, Lys)을 이용하여 각기 상이하게 처리된 신경세포 내의 단백질 간 분자량의 차이를 측정하였으며, 이를 통해 단백질의 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, Light media(normal)에서 배양된 SH-SY5Y 세포에 백삼 Rb1 및 Rg1을 용해시킨 DMSO를 0.1% 이하로 24시간 처리하고 증류수에 용해시킨 베타 아밀로이드(beta-amyloid)를 24시간 처리하였다. 또한, 안정동위원소(Stable isotope)가 표시된 아미노산을 포함하는 Heavy media에서 배양된 SH-SY5Y 세포에는 DMSO를 0.1% 이하로 24시간 처리한 후 증류수에 용해시킨 베타 아밀로이드(beta-amyloid)를 24시간 처리하였다.
이어서 상기 각 배양된 세포를 분리한 후 세제(detergent)를 이용하여 4℃에서 충분히 융해시켰으며, 원심분리를 통하여 lysis되지 않은 세포 잔여물(cell debris)을 제거하고 신경세포 단백질이 포함된 용해물(lysates)를 회수하였다.
상기 회수한 용해물은 BSA assay를 통해 정량하였으며, Heavy lysate 와 Light lysate를 같은 농도로 한 개의 microtube에 혼합한 후 10%의 SDS-PAGE gel을 이용해 전기영동하여 단백질을 분자량에 따라 분리하고 Coomassie Brillian Blue G-250을 사용하여 분리된 단백질 밴드를 확인하였다.
실험예 1-2 : 신경세포 단백체의 펩타이드 분석시료 제조 및 분석
상기 실험에 1-2에서 분자량을 기준으로 10개로 분리된 단백질 시료에 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 5mg/ml 넣고 1시간 동안 반응시켜 시스테인(Cystein) 위치의 이황화결합(disulfide bond)이 환원되어 단백질이 변성(denaturation)되도록 하였다.
환원된 시스테인 잔기는 알킬화 시약(Iodoacetamide) 10mg/ml을 사용하여 암실, 실온에서 1시간 동안 반응시켰으며 이황화 결합부위가 다시 결합하지 못하도록 단절(blocking) 시켰다.
다음, 알킬화를 통해 시스테인 잔기가 보호된 단백질은 가수분해 효소인 트립신(Trypsin)에 의해 37℃에서 18시간 동안 처리되어 절단되었다.
가수분해된 펩타이드는 진공건조기(vacuum dryer)에서 건조되었으며, 10개의 분리된 시료가 동일한 농도가 되도록 동일한 부피의 용매에 용해시켜 시료를 제조하였다.
제조된 펩타이드 시료는 Agilent社의 1200 Nano-LC system과 연결된 chip-cube system에 트랩컬럼(C18, 300A, 160nl) 및 분석용컬럼(C18, 300A, 75㎛ X 15cm)이 포함된 Large-capacity chip을 사용하여 정제 및 분리되었다.
정제 및 분리된 시료는 Chip-cube system에 연결된 Agilent社의 전자 스프레이 이온화(electrospray ionization; ESI) 질량분석기인 6530 QTOF(quadruple TOF)에 의해 Nano LC-ESI-MS/MS 분석이 이루어졌다.
즉, 상기 각각의 시료를 가수분해하여 수득된 혼합 펩타이드는 질량분석기가 연결된 액체크로마토그래피(NanoLC-ESI-MS/MS)에 3㎕씩 동량 주입되었으며, 트랩컬럼(C18, 300A, 160nl)으로 이동되어 탈염화과정 및 농축과정을 거친 후, 분석 용컬럼(C18, 300A, 75㎛ X 15cm)에 의하여 소정의 펩타이드들이 분리되고, 각 시간대의 시료들은 질량분석기를 통하여 m/z 값으로 검출되었다.
실험예 2 : 진세노사이드 Rb1 의 예방 효과 규명
실험예 2-1 : 신경세포 단백체의 정량 및 정성 분석
실험에 사용된 시료들의 모든 단백질의 질량분석 결과는 취합된 후, TPP(Trans-Proteomic pipeline) 검색엔진 및 단백질 데이터베이스(Uniprot dB)에 의해 정성 분석되었다.
상기 분석된 데이터를 기반으로 펩타이트를 정량하기 위해 TPP의 프로그램을 사용하였다.
TPP 정량분석은 표시된 펩타이드의 Peak Area값을 추출하고 Ratio를 비교 분석하여 정량하는 방법으로 EIC(Extracted ion chromatography)에 따르면 Tubulin beta-2A chain peptide인 YLTVAAIFR2 + Peak Area값의 Ratio가 1로 분석되어 처리군 및 대조군이 동일비율로 혼합된 것을 확인할 수 있으며, double charge를 가지는 펩타이드 중에 R에 labeling되어 질량값이 3Da 차이나는 점에 비추어 Labeling이 적절하게 이루어졌음이 확인되었다(도 2).
상기 TPP 정량분석은 Light labeling(백삼 Rb1+Beta-Amyloid Treat)된 펩타이드 및 Heavy labeling(DMSO+ Beta-Amyloid Treat)된 펩타이드의 질량차에 따른 피크(Peak) 분포를 분석하고 실제 상대적인 양을 결정하기 위해 Peak Area 값으로부터 Ratio를 분석한다.
3회의 반복실험에 의해 분석된 데이터는 TPP에 의해 각각 1707개, 1829개, 1828개의 단백질로 확인되었으며, 3회 반복실험에서 중복하여 도출된 1231개의 단백질에 대한 결과를 분석하였다(도 3A).
TPP를 이용하여 정량 분석된 데이터를 정성 분석한 결과 3회 반복된 실험에서 공통적으로 발현되는 단백질 중 1.5 배 이상 증가 또는 감소한 단백질은 39개로 확인되었다(도 3B).
발현이 1.5 배 이상 변화된 상기 단백질에 대해 다비드(DAVID)의 Gene Ontology를 이용하여 Cellular component를 분석한 결과, 상기 단백질들은 Intracellular organelle part에 가장 많은 분포를 이루었으며, 상기 Intracellular organelle part에 속한 단백질 23개를 다시 생물학적 기능을 분석하는 Biological process로 분석한 결과, Organelle organization이 가장 높은 비중을 차지하였다(도 4).
실험예 2-2 : 신경세포 단백체의 단백질 상호관계 분석
상호관계 단백질 데이터 베이스인 STRING을 통해 신경세포 단백체의 단백질 간 상호관계를 분석하였다.
도 5는 Intracellular organelle part에 속한 단백질의 상호 네트워크를 도식화한 것이며, 작은 원형의 색이 붉은색에 근접할수록 상향 조절(처리군/대조군의 Log2 Ratio)된 단백질이고 녹색에 근접할수록 하향 조절된 단백질이다. 파란타원은 Biological process 중 제일 비중이 큰 Organelle organization에 속한 단백질이며, 이 중 상호네트워크 및 유의성이 큰 것으로 분석된 세포골격 단백질을 점선의 타원으로 표시하였다.
도 5에서 Cellular component 중 Intracellular organelle part에 속한 단백질의 상호 네트워크로서 원과 선은 단백질 간 상호관계를 의미하며, 또한 선의 명도는 밀접성에 비례한다. 또한, 파란색의 타원은 Biological process 중 비중이 가장 높은 Organelle organization에 속한 단백질을 지칭하며, 점선의 타원은 세포골격에 속하는 단백질로서 기능 분석에 있어서 유의성 및 비중이 가장 높은 단백질을 의미한다.
최근, 세포골격 단백질은 알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환과의 밀접한 관련이 있음이 밝혀졌으며, 퇴행성 신경질환에서 CAP1 단백질의 발현 수준의 변화가 확인되었다. 또한, 상기 CAP1 단백질은 CFL1(Cofilin-1) 단백질의 인산화와 밀접한 관련성이 밝혀진 바 있다.
본 발명자들은 진세노사이드 Rb1 처리에 따라 퇴행성 신경질환의 발병과 관련성이 높은 CFL1 단백질의 발현 수준의 변화를 확인하였으며, CAP1과 밀접한 관련성이 있는 CFL1 또한 교집합 단백질에서 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 Intracellular organelle part에 속한 단백질의 상호작용을 분석한 결과(도 6), CFL1 단백질을 포함하는 세포골격 단백질 및 미토콘드리아 단백질을 확인하였다.
상기 결과는 진세노사이드 Rb1가 알츠하이머병을 포함하는 퇴행성 신경질환에 있어서 세포골격 단백질 및 미토콘드리아 단백질의 발현에 영향을 미쳐 세포보호 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.
실험예 3 : 진세노사이드 Rg1 의 치료 효과 규명
실험예 3-1 : 신경세포 단백체의 정량 및 정성 분석
실험예 2-1과 동일한 방법으로 진세노사이드 Rg1에 의한 신경세포 단백체의 변화를 정량 및 정성 분석하였다.
TPP 정량분석 결과, 표시된 Destrin 단백질의 AVIFCALSADKK3 + 펩타이드의 EIC(Extracted ion chromatography)에 따르면 Peak Area값의 Ratio가 거의 1에 근접하여 처리군 및 대조군의 단백질이 동일비율로 혼합된 것을 확인할 수 있으며, triple charge를 가지는 펩타이드 중에 K에 labeling되어 질량값이 5.3Da 차이나는 점에 비추어 Labeling이 적절하게 이루어졌음이 확인되었다(도 8).
3회의 반복실험에 의해 분석된 데이터는 TPP에 의해 각각 1861개, 1501개, 1909개의 단백질로 확인되었으며, 3회 반복실험에서 중복하여 도출된 1149개의 단백질에 대한 결과를 분석하였다(도 9).
TPP를 이용하여 정량 분석된 데이터를 정성 분석한 결과 3회 반복된 실험에서 공통적으로 발현되는 단백질 중 1.5 배 이상 증감한 단백질은 49개(증가 45개, 감소 4개)로 확인되었다(도 10).
도 11은 백삼추출물 Rg1에 의해 1.5배 이상 변화한 단백질 49개의 조성물과 그 변화량을 나타낸 것이다.
도 11을 참조하면, 단백질의 Accession No.는 단백질 DB인 Uniprot의 protein accession No.를 의미하고, Gene name은 공식 명명된 유전자 이름을 지칭하며, Protein description은 공식 명명된 단백질의 이름을 지칭하고, Log2 Ratio(Treat/Control)는 베타 아밀로이드 및 진세노사이드 Rg1 처리군과 베타 아밀로이드 및 DMSO 처리군의 비교 결과를 Log2 값으로 변환하고 변화량을 나타낸 것이다.
상기 발현이 1.5 배 이상 증감된 상기 단백질에 대해 다비드(DAVID)의 Gene Ontology를 이용하여 단백질의 세포 기능별, 세포 구성별, 생물학적 과정에 대한 분석을 수행하였다(도 12).
실험예 3-2 : 신경세포 단백체의 단백질 상호관계 분석
상호관계 단백질 데이터 베이스인 STRING을 통해 신경세포 단백체의 단백질 간 상호관계를 분석하였다.
도 13은 백삼추출물 Rg1에 의해 1.5배 이상 변화한 단백질에 대한 단백질과 단백질 간의 상호관계 분석(Protein-Protein Interaction analysis)을 도식화한 것이다.
도 13을 참조하면, 각 원은 단백질을 지칭하는 것으로 파란선의 명도는 단백질 간의 밀접한 상호 관련성을 의미한다. 백삼의 Rg1에 의해 발현이 증감한 단백질은 미토콘드리아, 스플라이싱 조절, 리보좀 단백질과 관련성이 높은 것으로 확인되었다.
단백질 간 상호관계를 분석한 결과 미토콘드리아 관련 단백질이 다수 포함되었으며, 미토콘드리아 관련 단백질의 증감율은 상대적으로 큰 것으로 확인되었다(도 14). 특히, 미토콘드리아 관련 단백질 중에서 TOMM40단백질의 발현이 가장 크게 증가하였으며, 본 결과는 TOMM40의EIC(Extracted ion chromatography) 및 펩타이드 MS peak값에 의해 확인되었다(도 15).
도 16은 신경세포 사멸 환경에서 백삼추출물 Rg1에 의하여 1.5배 이상 변화한 미토콘드리아 관련 단백질의 상호관계와 변화량을 도식화한 것이다. 상기 TOMM40 단백질을 중심으로 한 단백질 간의 상호작용을 분석하여 Rg1에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 효과를 예측할 수 있다.
상기 결과와 같이 진세노사이드 Rg1은 퇴행성 신경질환의 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 TOMM40 단백질 등 미토콘드리아 단백질의 발현에 영향을 미쳐 세포보호 역할을 수행할 수 있을 것으로 사료된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rg1 또는 그 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신경세포 보호용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rb1 및 진세노사이드 Rg1은 백삼추출물로부터 단리된 신경세포 보호용 조성물.
  3. 제2항에 있어서
    상기 진세노사이드 Rb1은 세포골격(actin cytoskeleton) 단백질 및 미토콘드리아(mitochondria) 단백질의 발현을 상향 조절하는 신경세포 보호용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포골격(actin cytoskeleton) 단백질은 DSTN(Isoform 2 of destrin), CAPZB(Isoform 2 of F-actin-capping protein subunit beta), CAP1(Adenylyl cyclase-associated protein 1), 및 CFL1(Cofilin 1) 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 신경세포 보호용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 단백질은 TOMM40(Mitochondrial import receptor subunit TOM40 homolog) 단백질인 신경세포 보호용 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rg1은 미토콘드리아(mitochondria) 단백질의 발현을 상향 조절하는 신경세포 보호용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 단백질은 TOMM40(Mitochondrial import receptor subunit TOM40 homolog) 단백질인 신경세포 보호용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 또는 치매(dementia)인 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여되는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
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