KR20170052482A - 미세액적을 이용한 균주배양장치 및 이를 이용한 균주 배양방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세액적을 이용한 균주배양장치에 관한 것으로, 연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적을 생성하는 미세액적 생성유닛, 상기 미세액적 생성유닛과 연통되며 상기 미세액적이 이동되는 연결부 및 상기 연결부와 연통되며 상기 미세액적을 고정하는 복수 개의 미세챔버를 포함하는 미세액적 저장유닛을 포함할 수 있다.

Description

미세액적을 이용한 균주배양장치 및 이를 이용한 균주 배양방법{STRAINS CULTURE DEVICE USING MICRODROPLET AND STRAINS CULTURE METHOD USING THE SAME}
본 발명은 미세액적을 이용한 균주배양장치 및 이를 이용한 균주 배양방법에 관한 것이다.
미세조류는 식물플랑크톤(Phytoplankton)이라고 한다. 원래 뿌리, 줄기, 잎이 체계적으로 분화되지 않은 하등식물 중에서 엽록소로 광합성을 하는 식물을 조류라고 하며, 조류는 다시 단단한 구조물에 부착하여 서식하는 미역, 다시마와 같은 해조류와 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있으며 물속에서 자유로이 부유하며 살아가는 생물인 미세조류로 나뉘어진다. 이러한 미세조류는 크기가 50 ㎛ 이하의 단세포 조류이다. 또한 미세조류는 자연계의 먹이사슬에서 최하위에 위치하기 때문에 광합성을 통해 유기물을 생산하는 독립영양생물이다.
미세조류를 보다 구체적으로 살펴보면, 미세조류는 광합성이 가능한 원핵 또는 진핵 미세유기체로서 그들의 단세포적이거나 단순한 다세포적인 구조로 인해 혹독한 환경에서도 빠르게 성장이 가능하다. 또한 미세조류는 태양에너지를 화학에너지로 바꾸는 광합성을 이용해서 스스로 번식하고 수일 안에 전체의 성장주기를 완성한다. 이러한 과정 중에 태양에너지를 이용하여 이산화탄소 및 무기물을 후에 바이오디젤로 전환이 가능한 다량의 중성지질로 축적할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 화석연료 사용으로 급증하는 에너지자원 고갈문제 및 온실가스 배출문제를 해결할 수 있는 대안으로 주목 받고 있다.
미세조류를 바이오디젤 생산에 사용하는 것은 다른 바이오매스에 비해 여러 이점을 갖는다. 미세조류는 배양이 간편하여 특정한 영양분이나 충분한 공기 주입을 통해 성장 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 태양빛과 간단한 영양분이 공급되는 단순한 환경에서도 쉽게 성장할 수 있다. 특정 미세조류 종들은 다양한 환경적 조건에서 살 수 있도록 적응할 수 있다. 현재 바이오디젤의 공급 원료로 사용되는 대두, 해바라기, 야자수의 성장이 불가능한 특정 환경에서도 성장이 가능한 미세조류 종들을 발굴하는 것이 가능하다.
미세조류는 현재 보편적인 바이오디젤 공급원료들에 비해 성장 속도 및 생산성이 뛰어나고 더 적은 재배 면적이 필요하다. 미세조류를 활용한 바이오디젤은 황을 포함하지 않기 때문에 미세먼지, 일산화탄소, 탄화수소 그리고 황산화물의 배출을 억제하면서 석유에서 얻어낸 디젤만큼의 효과를 발휘할 수 있다. 미세조류의 생고정 능력을 이용하면 바이오디젤을 생산하면서 배출되는 온실가스 및 이산화탄소의 양을 줄일 수 있다.
미세조류는 폐수에 포함된 오염 물질을 영양분으로 활용할 수 있기 때문에 폐수처리에도 큰 도움이 된다. 또한, 바이오디젤 추출 후 결과물로 남은 미세조류 바이오매스는 에탄올, 메탄올, 유기 비료 등으로 사용될 수 있다.
잠재적 활용성이 높은 미세조류이지만 상업적으로 이를 활용하기 위해서는 현재 미세조류의 야생종에 비해 좀 더 성장성이 좋고 지질 축적량이 많은 균주가 필요하다. 그러나 미세조류는 대장균 같은 미생물과 달리 일반적인 유전자조작 방법으로는 균주 개량에 어려움이 있다. 현재는 임의로 유전자를 삽입해 다양한 균주들을 얻고 이를 실제 배양시키면서 원하는 목적에 맞는 균주들을 선별하는 방법으로 우수한 미세조류 균주를 획득하고 있다. 그러나 일반적인 균주 선별 방법은 시간이 오래 걸리고 노동집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 이를 해소하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.
피코리터 단위의 극도로 작은 부피를 갖는 하나의 미세액적 내부에는 단일 세포, 단일 입자 그리고 다양한 화학물질들이 포함될 수 있기 때문에 각각의 미세액적은 개별적인 반응기로 활용될 수 있다. 따라서 미세액적은 미세액적 내부에서 동시에 화학적, 생물학적 반응들의 개별적인 관찰이 용이하고 수~수백 Hz의 속도로 미세액적들을 생성하는 것이 가능하기 때문에 고속처리가 필요한 실험에도 적합하다. 또한, 마이크로 장치의 설계에 따라 미세액적에 다양한 기계적, 전기적 그리고 자기적 자극을 가할 수 있고 이에 따라 단일 세포 및 입자들의 반응을 관찰하기에도 용이하다. 미세액적은 그 부피 및 무게가 매우 작기 때문에 관성보다 표면장력이 더 지배적이고 작은 부피를 갖는 미세액적은 일반적인 환경에 비해서 열 및 물질 전달률이 매우 크기 때문에 개별 세포의 빠른 성장 및 화학물질들의 빠른 반응 속도를 유발할 수 있다.
예를 들어, 대한민국 공개특허 제10-2014-0106933호에서는 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용하여 목적 유용 효소 활성의 탐색 방법 등이 개시되어 있다.
미세조류는 상업적으로 잠재적 가치가 크기 때문에, 성장성 및 광합성 능력이 우수한 미세조류 균주를 배양해 상업적으로 활용하는 것이 중요함에도 불구하고, 이러한 균주를 배양하기 위한 노력은 많이 부족한 실정이다. 뿐만 아니라 상기 미세액적을 활용하여 성장성 및 광합성 능력이 우수한 미세조류 균주를 배양하기 위한 연구는 크게 부족한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로, 미세액적 내부에서 성장성 및 광합성 효율이 우수한 특성을 갖는 야생형 및 유전자 변이가 유발된 균주를 신속하고 효율적으로 배양하고 이러한 균주를 선별, 분석할 수 있는 미세액적을 이용한 균주배양장치와 이를 이용한 균주 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치는 연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적을 생성하는 미세액적 생성유닛, 상기 미세액적 생성유닛과 연통되며 상기 미세액적이 이동되는 연결부 및 상기 연결부와 연통되며 상기 미세액적을 고정하는 복수 개의 미세챔버를 포함하는 미세액적 저장유닛을 포함할 수 있다.
상기 미세액적 생성유닛은, 연속상의 유체를 주입하며 2 개의 출구를 갖는 제1유입부, 상기 제1유입부의 출구로부터 유출되는 연속상의 유체가 이동하는 제1이동채널부, 분산상의 유체를 주입하는 제2유입부, 상기 제2유입부로부터 유출되는 분산상의 유체가 이동하는 제2이동채널부, 및 상기 제1이동채널부를 이동하는 연속상의 유체와 상기 제2이동채널부를 이동하는 분산상의 유체가 만나 혼합되어 상기 미세액적을 생성하는 플로포커싱부를 포함할 수 있다.
상기 제1유입부는 유입된 연속상의 유체를 에워싸는 형태로 배열되어 유입된 연속상의 유체로부터 불순물을 걸러내는 복수 개의 제1미세기둥을 포함할 수 있다.
상기 제2유입부는 유입된 분산상의 유체를 에워싸는 형태로 배열되어 유입된 분산상의 유체로부터 불순물을 걸러내는 복수 개의 제2미세기둥을 포함할 수 있다.
상기 플로포커싱부는 상기 미세액적을 분산상으로 생성하기 위해 지그재그 형상의 벤딩채널을 포함할 수 있다.
상기 미세액적 생성유닛은, 상기 플로포커싱부를 통과한 상기 미세액적이 모이는 집합부 및 상기 집합부 내에 상기 연결부와 연결되는 출부를 더 포함할 수 있다.
상기 제2유입부에 유입되는 유체는 세포현탁액으로 광합성 균주가 포함된 용액을 2.5 × 106 ~ 2.7 × 106 cells mL-1까지 희석시킨 용액을 포함하며, 상기 제1유입부로 유입되는 연속상의 유체의 유압은 180~220 mbar로 유입되며, 상기 제2유입부로 유입되는 분산상의 유체의 유압은 390~430 mbar로 유입되어 상기 미세액적이 80~120 ㎛의 직경을 갖고 30~80 Hz의 속도로 생성될 수 있다.
상기 연결부는 굽은 형태를 이루며 상기 미세액적이 일렬로 배열되어 흐를 수 있는 채널관을 포함할 수 있다.
상기 연결부는 상기 미세액적 생성유닛과 미세액적 저장유닛을 연통하는 길이가 4~6㎝ 인 채널관을 포함할 수 있다.
상기 미세챔버는 상기 미세액적을 고정시키고 상기 미세액적에 이산화탄소를 공급하는 복수 개의 제3미세기둥을 포함할 수 있다.
상기 제3미세기둥은 PDMS를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치는 상기 미세액적의 직경이 80~120 ㎛인 경우, 상기 미세챔버는 상기 제3미세기둥의 높이가 60~120 ㎛를 이루며 4개의 상기 제3미세기둥을 포함하여 직육면체 형태를 이룰 수 있다.
상기 미세액적 저장유닛은, 상기 연결부를 통해 유체가 유입되는 재유입부, 상기 재유입부를 통해 유입된 유체로부터 불순물을 걸러내는 필터부 및 상기 미세챔버로부터 유출된 유체가 배출되는 배출부를 포함하며, 상기 미세챔버는 상기 필터부를 통과한 상기 미세액적을 수용할 수 있다.
연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적을 생성하는 미세액적 생성유닛, 상기 미세액적 생성유닛과 연통되며 상기 미세액적이 이동되는 연결부, 및 상기 연결부와 연통되며 상기 미세액적을 고정하는 복수 개의 미세챔버를 포함하는 미세액적 저장유닛을 포함하며, 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법은 상기 미세액적 생성유닛은, 연속상의 유체를 주입하며 2 개의 출구를 갖는 제1유입부, 상기 제1유입부의 출구로부터 유출되는 연속상의 유체가 이동하는 제1이동채널부, 분산상의 유체를 주입하는 제2유입부, 상기 제2유입부로부터 유출되는 분산상의 유체가 이동하는 제2이동채널부, 및 상기 제1이동채널부를 이동하는 연속상의 유체와 상기 제2이동채널부를 이동하는 분산상의 유체가 만나 혼합되어 상기 미세액적을 생성하는 플로포커싱부를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치에 있어서, 상기 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법은 상기 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용하여 균주를 배양하고 분석할 수 있다.
균주 배양방법은, 상기 제1유입부와 제2유입부로 유체를 주입하는 유체주입단계, 상기 제1유입부와 제2유입부로 유입된 유체가 각각 상기 제1이동채널부와 제2이동채널부를 통해 이동하고 서로 만난 후, 상기 플로포커싱부를 통과하여 상기 미세액적을 생성하는 미세액적생성단계, 상기 플로포커싱부를 통해 생성된 상기 미세액적이 상기 연결부를 통해 이동하면서 하나의 균주를 포함하는 하나의 미세액적 비율을 증가시키는 이동단계, 및 상기 연결부를 통과한 상기 미세액적이 상기 미세챔버에 수용된 후, 상기 미세액적에 포함된 균주에 이산화탄소나 빛의 공급을 조절하여 균주를 배양하는 배양단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법은 미세액적을 유지하기 위하여 미리 정해진 습도를 유지하는 습도유지단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법은 미세액적을 상기 미세액적 저장유닛에 주입하기 전에 상기 미세챔버에 기름을 채우는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법은 피에이치(pH) 변화를 이용하여 상기 미세액적 내부로 전달되는 이산화탄소의 투과도를 분석하는 분석단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 미세액적을 이용하여 우수한 성장성 및 높은 광합성 효율을 갖는 균주를 배양하고 분석할 수 있다.
미세액적 생성유닛과 단일의 미세액적의 크기와 상응하는 직경을 갖고 긴 연결부를 통해 미세액적을 효율적으로 생산할 수 있다.
미세챔버 내의 제2미세기둥을 통해 미세액적에 이산화탄소 등을 효율적으로 공급하여 균주를 효율적으로 배양할 수 있다.
미세액적 내부에서 광합성 균주의 광독립 영양조건하에서의 성장성을 효율적으로 관찰하고 분석할 수 있다.
본 발명은 미세액적을 이용한 균주배양장치를 통해 세포 단위에서 모니터링이 용이하고, 미세액적을 이용한 균주배양장치를 통해 얻은 결과의 통계적 분석을 포함한 다양한 분석을 통하여 물리적 화학적 자극에 대한 우수 균주를 쉽게 선별할 수 있어, 이산화탄소 고정 효율과 성장성이 우수한 균주를 분석하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치 일실시예의 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치 일실시예의 미세액적 생성유닛의 구성도이다.
도 3은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치 일실시예의 제1유입부와 플로포커싱부의 확대도이다.
도 4는 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치 일실시예의 미세액적 저장유닛의 구성도이다.
도 5는 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치 일실시예의 하나의 미세챔버의 사시도와 측면도이다.
도 6은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치 일실시예의 제3미세기둥의 평면도이다.
도 7은 단일 광합성 균주 세포를 포함하는 미세액적의 비율과 서로 다른 습도 조건에서 미세액적의 부피 변화를 나타내는 개략도와 그래프이다.
도 8은 제3미세기둥 유무와 높이 등의 조건에 따라 미세액적의 이산화탄소 흡수량을 나타내는 개략도와 그래프이다.
도 9는 다양한 마이크로장치를 통해 미세액적으로 전달되는 이산화탄소의 투과도를 조사하기 위하여 pH 변화를 비색 및 형광 분석법을 이용해 측정한 개략도와 그래프이다.
도 10은 이산화탄소 농도와 광량 조건에 따른 광합성 균주의 광독립영양 성장성을 분석한 개략도와 그래프이다.
도 11은 5% 이산화탄소 농도 및 150 μmol photons m-2 s-1의 광량 조건에서 TAP-C 배지를 사용하여 광독립영양 배양에서 성장성을 분석한 그래프이다.
이하 설명되는 본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고, 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 구분하여 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
이하에서는, 본 발명의 일실시예에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)에 대하여 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 일실시예의 개략도이고, 도 2는 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 일실시예의 미세액적 생성유닛(100)의 구성도이며, 도 3은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 일실시예의 제1유입부(110)와 플로포커싱부(150)의 확대도이고, 도 4는 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 일실시예의 미세액적 저장유닛(300)의 구성도이며, 도 5는 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 일실시예의 하나의 미세챔버(330)의 사시도와 측면도이고, 도 6은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 일실시예의 제3미세기둥(331)의 평면도이다.
본 발명의 일례에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)는 미세액적 생성유닛(100), 연결부(200), 미세액적 저장유닛(300) 등을 포함할 수 있다.
미세액적을 이용한 균주배양장치(400)는 연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적(10)을 생성하는 미세액적 생성유닛(100), 미세액적 생성유닛(100)과 연통되며 미세액적(10)이 이동되는 연결부(200), 및 연결부(200)와 연통되며 미세액적(10)을 고정하는 복수 개의 미세챔버(330)를 포함하는 미세액적 저장유닛(300)을 포함할 수 있다.
도 1의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 미세액적 생성유닛(100)은 연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적(10)을 생산하는 역할을 할 수 있으며, 미세액적 생성유닛(100)은 제1유입부(110), 제1이동채널부(120), 제2유입부(130), 제2이동채널부(140), 플로포커싱부(150)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 ‘연속상(continuous phase)의 유체’란 미세액적(10)을 만들기 위해 연속적으로 공급되는 유체를 의미하며, 이러한 연속상의 유체는 특별한 제한 없이 분산상의 유체와 섞이지 않는 모든 액체가 이에 포함될 수 있다. 또한 본 발명에서 ‘분산상(dispersed phase)의 유체’란 미세액적(10)을 구성하는 유체로서 분산상의 유체가 일정 부피로 시간차를 두고 끊어져서 흐르면서 미세액적(10)을 형성하기 때문에 분산상의 유체로 명명하였다.
일례로, 분산상의 유체는 특별한 제한 없이 연속상의 유체와 섞이지 않는 모든 액체가 이에 포함될 수 있다. 그러므로 본 발명의 바람직한 일실시예로서 연속상의 유체가 유성의 기름 용액인 경우 분산상의 유체는 물 또는 수용액일 수 있으며, 연속상의 유체가 물 또는 수용액인 경우 분산상의 유체는 유성의 기름 용액일 수 있다.
미세액적(10)은 미세조류 균주를 배양하여 성장 속도 등을 관찰하고, 이를 통해 성장성 및 광합성 능력이 우수한 미세조류 균주를 선별하는 역할을 할 수 있다. 미세액적(10)은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 연속상의 유체에 연속상의 유체와는 상이 다른 분산상의 유체를 주입하여 미세액적(10)을 형성할 수 있다.
균주는 크기가 대단히 작기 때문에 일반적인 관측 장비로는 균주의 성장성이나 광합성 능력이 우수한 균주를 정확하게 선별하는 것이 불가능하다. 그러나 미세액적(10)을 활용하는 경우에는 미세한 크기의 균주들 사이에서 성장 속도 등을 관측함으로써 그들 사이의 상대적인 성장성 등을 판단하는 것이 가능하다.
본 발명에서는 이러한 미세액적(10)을 활용하여 미세조류 균주들의 상대적인 성장성 및 광합성 능력을 관찰하고, 성장성 및 광합성 능력이 우수한 미세조류 균주를 배양할 수 있다. 특히 성장성 및 광합성 능력이 우수한 미세조류 균주를 배양하는데 있어서, 분산상의 유체 흐름에 따라 미세액적(10)을 이동시키면서 유체 흐름과는 수직인 방향으로 연속상의 유체를 공급하고, 서로 수직인 방향으로 흐르는 유체와 후술하는 플로포커싱부(150)를 이용하여 미세액적(10)을 생성할 수 있다.
미세액적 생성유닛(100)은 연속상의 유체를 주입하며 2 개의 출구(112)를 갖는 제1유입부(110), 제1유입부(110)의 출구(112)로부터 유출되는 유체가 이동하는 제1이동채널부(120), 분산상의 유체를 주입하는 제2유입부(130), 제2유입부(130)로부터 유출되는 유체가 이동하는 제2이동채널부(140), 및 제1이동채널부(120)를 이동하는 연속상의 유체와 제2이동채널부(140)를 이동하는 분산상의 유체가 만나 혼합되어 미세액적(10)을 생성하는 플로포커싱부(150)를 포함할 수 있다.
제1유입부(110)는 유체펌프(미도시)로부터 유입되는 연속상의 유체를 후술하는 제1이동채널부(120)로 주입하는 역할을 할 수 있으며, 제1미세기둥(111)과 2 개의 출구(112)를 포함할 수 있다.
도 2의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 제1미세기둥(111)은 제1유입부(110)로 유입된 연속상의 유체를 에워싸는 형태로 배열되어 유입된 연속상의 유체로부터 불순물을 걸러내는 역할을 할 수 있다. 일례로 복수 개의 제1미세기둥(111)이 원형으로 배열될 수 있으며, 제1미세기둥(111)은 사각기둥의 형태를 포함할 수 있다. 일례로 불순물은 먼지나 PDMS(Polydimethylsiloxane) 조각 등을 포함할 수 있다.
제1유입부(110)의 출구(112)는 외부에서 제1유입부(110)로 주입된 유체가 후술하는 제1이동채널부(120)로 유출되는 통로 역할을 할 수 있으며, 도 2의 예시에서 알 수 있는 바와 같이 2개의 출구(112)가 대칭되게 배치될 수 있다.
제1이동채널부(120)는 제1유입부(110)의 출구(112)로부터 주입되는 연속상의 유체가 이동하는 채널(수로) 역할을 할 수 있다.
제2유입부(130)는 유체펌프로부터 유입되는 분산상의 유체를 후술하는 제2이동채널부(140)로 주입하는 역할을 할 수 있으며, 제2미세기둥(131)을 포함할 수 있다.
도 2의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 제2미세기둥(131)은 제2유입부(130)로 유입된 분산상의 유체를 에워싸는 형태로 배열되어 유입된 분산상의 유체로부터 불순물을 걸러내는 역할을 할 수 있다. 일례로 복수 개의 제2미세기둥(131)이 원형으로 배열될 수 있으며, 제1미세기둥(111)은 사각기둥의 형태를 포함할 수 있다. 일례로 불순물은 먼지나 PDMS 조각 등을 포함할 수 있다.
제2이동채널부(140)는 제2유입부(130)로부터 주입되는 분산상의 유체가 이동하는 채널 역할을 할 수 있다.
일례로, 도 2의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 제1이동채널부(120)와 제2이동채널부(140)는 서로 수직으로 교차하게 배치되어 연속상의 유체와 분산상의 유체가 서로 수직으로 만나 혼합될 수 있다.
플로포커싱(flow-focusing)부(150)는 제1이동채널부(120)를 이동하는 연속상의 유체와 제2이동채널부(140)를 이동하는 분산상의 유체가 만나 혼합되어 미세액적(10)을 생성하는 역할을 할 수 있다.
연속상의 유체와 분산상의 유체는 서로 섞이지 않기 때문에 플로포커싱부(150)에서 연속상의 유체가 분산상의 유체를 둘러싸면서 분산상의 유체를 일정 단위로 끊어내어 미세액적(10)을 생성할 수 있다.
도 2의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 플로포커싱부(150)는 미세액적(10)을 분산상으로 생성하기 위해 지그재그 형상의 벤딩채널(151)을 포함할 수 있다. 지그재그 형상의 벤딩채널(151)은 미세액적(10)들이 시간차를 두고 이동되게 할 수 있어 균주가 미세액적에 보다 쉽게 수용될 수 있고 균주를 포함한 미세액적(10)에 대한 보다 정밀한 분석을 가능하게 할 수 있다.
미세액적 생성유닛(100)은 집합부(160)와 출부(170)를 더 포함할 수 있다.
집합부(160)는 플로포커싱부(150)의 벤딩채널(151)을 통과한 미세액적(10)이 모이는 곳으로, 생성된 미세액적(10)을 후술하는 미세액적 저장유닛(300)으로 이동시키기 위해 수집하는 역할을 할 수 있다.
도 2의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 출부(170)는 집합부(160) 내에 위치하는 것으로 후술하는 연결부(200)와 결합하는 역할을 할 수 있다.
단일 광합성 균주 세포가 단일 미세액적(10)에 포획되는 실험은 광합성 균주의 단일 세포 단위 특성 분석을 위해 중요하다.
일례로, 제2유입부(130)에 유입되는 유체는 세포현탁액으로 광합성 균주가 포함된 용액을 2.5 × 106 ~ 2.7 × 106 cells mL- 1 까지 희석시킨 용액을 포함하며, 제1유입부(110)로 유입되는 연속상의 유체의 유압은 180~220 mbar로 유입되며, 제2유입부(130)로 유입되는 분산상의 유체의 유압은 390~430 mbar로 유입되어 미세액적(10)이 80~120 ㎛의 직경을 갖고 30~80 Hz의 속도로 생성되는 것을 포함할 수 있다.
일례로, 세포현탁액이 2.63 × 106 cells mL-1의 농도일 때, 광합성 균주는 직경 90 ㎛, 부피 380 pL인 미세액적(10)에 단일 세포 단위로 포획되는 확률이 가장 높다. 이론적으로, 주입되는 세포현탁액의 세포들이 미세액적(10)에 임의로 포획될 때 k 마리의 세포가 미세액적(10)에 포함되는 확률은 푸아송 분포(λk exp(-λ)/(k!))를 따른다. 여기서 λ는 미세액적(10)에 평균적으로 포획되는 세포수이며 이 실시예의 경우 0.9994이다. 푸아송 분포(Poisson distribution)를 바탕으로 미세액적(10)에 광합성 균주가 포획되는 숫자의 분포를 계산하면 단일 광합성 균주를 포함하는 미세액적(10)의 이론적인 비율은 0.35이다.
증발로 인해 미세액적(10)이 줄어드는 현상이 발생할 수 있는데, 증발현상은 미세액적(10)의 움직임과 광합성 균주의 미세액적(10) 내 성장을 제한하기 때문에 오랜 시간동안 미세액적(10)에 수분을 공급하여 미세액적(10)의 부피를 유지시키는 것이 중요하다.
일례로, 가습기를 이용해 습도를 조절함으로서 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 내 미세액적(10)의 안정성을 조사할 수 있다.
일례로 도 7(c)와 도 7(d)를 참조하면, 두 습도 조건에서 미세액적(10)의 부피 변화는 습도가 40%(일반적인 대기 습도)일 때, 미세액적(10)의 직경은 24시간 동안 148 ㎛에서 79 ㎛로 빠르게 줄어들게 되어 미세액적(10)이 후술하는 제3미세기둥(331) 사이에 고정되지 못하게 되고 특정한 미세액적(10)의 추적은 불가능하게 된다. 그러나 습도를 90%까지 높였을 때, 미세액적(10)의 직경은 96시간 동안 148 ㎛에서 137 ㎛로 줄어들어 장시간 미세액적(10)을 같은 위치에서 추적하는 것이 가능하다.
연결부(200)는 미세액적 생성유닛(100)과 미세액적 저장유닛(300)을 연통하는 역할을 하는 것으로 미세액적 생성유닛(100)에서 생성된 미세액적(10)을 미세액적 저장유닛(300)으로 이동시키는 역할을 할 수 있으며 채널관(210)을 포함할 수 있다.
채널관(210)은 굽은 형태를 이루며 미세액적(10)이 일렬로 배열되어 흐를 수 있도록 하는 역할을 하는 것으로, 도 1의 예시에서 알 수 있는 바와 같이 미세액적(10)의 직경과 유사한 관의 직경을 포함할 수 있다.
일례로, 연결부(200)는 미세액적 생성유닛(100)과 미세액적 저장유닛(300)을 연통하는 길이가 4~6㎝ 인 채널관(210)을 포함할 수 있다.
일례로, 단일 광합성 균주 세포를 포함하는 미세액적(10)의 비율을 높이기 위해, 5 cm 길이의 매우 긴 채널관(210)이 제작될 수 있다. 채널관(210)을 통과하는 동안 광합성 균주 세포는 더 잘 퍼져 단일 세포로 포획되는 비율을 높일 수 있다.
도 7(b)에서 알 수 있는 바와 같이, 5 cm 길이의 채널관(210)은 단일 광합성 균주 세포를 포획하는 미세액적(10)의 비율을 0.5까지 증가시킬 수 있다. 긴 채널관(210)으로 미세액적(10)에 단일 세포가 포획되는 비율을 약 30% 향상시킬 수 있다.
미세액적 저장유닛(300)은 연결부(200)와 연통되며 미세액적(10)을 고정하여 미세액적(10)을 저장하는 역할을 하는 것으로, 복수 개의 미세챔버(330)를 포함할 수 있다.
미세액적 저장유닛(300)은, 연결부(200)를 통해 유체가 유입되는 재유입부(310), 재유입부(310)를 통해 유입된 유체로부터 불순물을 걸러내는 필터부(320), 필터부(320)를 통과한 미세액적(10)을 수용하는 미세챔버(330) 및 미세챔버(330)로부터 유출된 유체가 배출되는 배출부(340)를 포함할 수 있다.
재유입부(310)는 미세액적 생성유닛(100)으로부터 연결부(200)를 통해 유체가 유입되는 곳으로 후술하는 필터부(320)로 유체를 유출하는 역할을 할 수 있다.
도 1이나 도 4의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 재유입부(310)는 원기둥이나 다각기둥의 형태로 이루어질 수 있다.
필터부(320)는 재유입부(310)로 유입된 유체로부터 불순물을 여과하는 역할을 할 수 있다. 일례로 불순물은 먼지, PDMS 조각 등을 포함할 수 있다.
일례로 필터부(320)는 제1미세기둥(111)이나 제2미세기둥(131)과 같은 미세기둥을 포함할 수 있다.
도 4의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 필터부(320)는 재유입부(310)와 후술하는 미세챔버(330) 사이에 일자 형태로 위치하여 재유입부(310)의 유체가 필터부(320)를 통해 여과된 후에 미세챔버(330)로 유입되도록 할 수 있다.
미세챔버(330)는 미세액적(10)을 고정시키고 미세액적(10)에 이산화탄소 등을 공급하는 역할을 하는 것으로 복수 개의 제3미세기둥(331)을 포함할 수 있다.
도 5의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 미세챔버(330)는 후술하는 제3미세기둥(331)을 4개 포함하여 직육면체 형태를 갖는 것으로, 연결부(200)를 통해 미세액적 저장유닛(300)에 주입된 미세액적(10)들이 낮은 유체 역학 저항으로 복수 개의 제3미세기둥(331) 사이의 빈 공간을 채우게 되어 미세액적(10)을 수용하는 역할을 할 수 있다.
도 5나 도 6의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 제3미세기둥(331)은 미세액적 저장유닛(300)에 일정한 간격을 두고 규칙적으로 배열될 수 있으며, PDMS를 포함하는 재료로 구성될 수 있다.
배출부(340)는 미세챔버(330)로부터 유출되는 균주와 미세액적(10)을 포함하는 유체 등을 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 외부로 배출되게 하는 역할을 할 수 있다.
도 4의 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 미세액적 저장유닛(300)은 재유입부(310)와 대칭되는 배출부(340)를 포함하여 좌우 대칭의 외형을 포함할 수 있다.
마이크로 시스템에 쓰이는 고분자물질인 PDMS는 생물체에 대한 독성이 없고 다공성으로 생물활성에 필요한 물질전달이 용이하다. PDMS를 이용한 마이크로 시스템은 분석하고자 하는 대상과 목적에 적합한 환경을 위한 맞춤설계가 가능하다. 특히 높은 투명도 및 미세구조를 기반으로 광학현미경을 통한 개별 세포에 대한 지속적이고 자세한 모니터링 및 효율적인 고속선별을 가능하게 함으로써 성장성과 광합성 효율이 우수한 균주를 선별하는데 기여할 수 있다.
일례로, 미세액적(10)의 직경이 80~120 ㎛인 경우, 미세챔버(330)는 제3미세기둥(331)의 높이가 60~120 ㎛를 이루며 4개의 상기 제3미세기둥(331)을 포함하여 직육면체 형태를 이룰 수 있다.
도 8(a)에서 알 수 있는 바와 같이, 미세액적 저장유닛(300) 내부에 특별한 구조가 없는 경우 미세액적(10)은 자유롭게 움직일 수 있어 다른 미세액적(10)과 융합될 수 있다. 미세액적(10)들이 융합하면 특정한 미세액적(10)을 추적하기 어렵기 때문에 미세액적(10)들의 융합을 방지하기 위해 제3미세기둥(331)을 배열하여 미세액적(10)을 제3미세기둥(331) 사이에 고정시키고 특정한 미세액적(10)을 장시간 추적할 수 있다.
PDMS로 이루어진 제3미세기둥(331)은 기체 투과성이 우수하여 광합성 균주의 성장에 도움을 주는 이산화탄소를 원활하게 공급할 수 있다. PDMS를 포함하는 제3미세기둥(331)을 통해 이산화탄소가 미세액적(10)으로 공급되는지 여부를 조사하기 위해 3 종류의 미세액적을 이용한 균주배양장치를 비교하였다.
3 종류의 미세액적을 이용한 균주배양장치는 첫째, 기둥 구조를 포함하는 장치 둘째, 기둥 구조를 포함하지 않는 장치 셋째, 대조군으로 기둥 구조를 포함하지만 테이프로 기체 투과성을 차단한 마이크로장치이다. 3 종류의 균주배양장치는 각각 이산화탄소의 투과성이 다르고 이에 따라 미세액적(10) 내 광합성 균주의 성장성에도 차이를 나타내었다.
도 8(b)를 참조하면, 제3미세기둥(331)을 포함하는 균주배양장치가 미세액적(10)과 접촉하는 면적이 넓어 다른 균주배양장치에 비해 미세액적(10)에 이산화탄소를 더 잘 전달할 수 있어 광합성 균주의 성장이 우수하다는 것을 알 수 있다. 이는 제3미세기둥(331)의 배열이 미세액적(10)과의 접촉면적을 증가시키고 이를 통해 효율적으로 미세액적(10)에 이산화탄소를 공급하여 광합성 균주의 성장성이 증가한다는 것을 나타낸다.
미세액적(10)이 공간 제약 없이 슬라이드 글라스 위에 놓여 있을 때 직경은 약 90 ㎛이다. 도 8(c)에서 알 수 있는 바와 같이, 미세챔버(330)의 높이가 90 ㎛ 이하일 경우 미세액적(10)이 눌리게 되어 미세챔버(330) 표면과 미세액적(10) 사이의 접촉면적이 변하게 된다.
미세챔버(330)의 높이를 30 ㎛에서 100 ㎛까지 조절하면서 이산화탄소 투과도에 영향을 미칠 수 있는 미세챔버(330) 표면과 미세액적(10) 사이의 접촉 면적을 변화시키면, 다른 높이 조건과 비교하여 80 ㎛ 높이의 미세챔버(330)에서 광합성 균주의 성장성이 우수함을 알 수 있다. 이러한 결과는 눌린 미세액적(10)에 의해 증가된 접촉면적이 이산화탄소의 공급에 영향을 미친다는 사실을 나타낸다. 그러나 미세챔버(330)의 높이가 30 ㎛ 이하일 경우 세포 성장성이 급격하게 저하되는 현상을 관찰할 수 있는데 이는 넓어진 접촉면적으로 인해 이산화탄소가 빠르게 공급되면서 pH가 급격하게 낮아져 일어나는 현상으로 해석할 수 있다.
도 9는 다양한 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 통해 미세액적(10)으로 전달되는 이산화탄소의 투과도를 조사하기 위하여 pH 변화를 비색 및 형광 분석법을 이용해 측정한 것이다. 이산화탄소 농도가 증가함에 따라 탄산수소염(hydrogencarbonate) 지시약은 보라색(pH 8.8 이상)에서 노란색(pH 7.6 이하)까지 색이 변화한다.
도 9(b)에서 알 수 있는 바와 같이, 균주배양장치의 구조와 상관없이 대기 중 이산화탄소 농도(0.03% (v/v))에서는 60분 동안 탄산수소염 지시약을 포함하는 미세액적(10)의 색 변화가 거의 없다. 반면에 5% 이산화탄소 농도조건에서 다양한 균주배양장치 구조에 따라 서로 다른 색 변화를 나타낸다. 테이프로 균주배양장치의 이산화탄소 투과를 차단한 경우 초기의 색은 48분 동안 유지되나, 기둥구조가 없는 균주배양장치는 24분 후에 색 변화가 발생한다. 대조적으로 기둥구조를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)는 30 ㎛, 80 ㎛, 100 ㎛ 높이의 미세챔버(330)에서 12분 안에 모두 색 변화가 관찰된다. 이러한 결과는 미세액적(10)과 미세챔버(330) 표면의 접촉면적에 따라 이산화탄소 투과도가 달라진다는 것을 나타낸다.
형광 기반의 분석법을 활용해 미세액적에 대한 이산화탄소 투과도를 정량적으로 분석할 수 있다. 미세액적(10)으로 유입되는 이산화탄소의 양이 증가함에 따라 pH는 감소하고 피라닌(pyranine)의 형광 세기는 증가한다. 여기서 피라닌은 형광 표지자이다.
도 9(c)에서 알 수 있는 바와 같이, 초기와 나중 형광세기는 대기 중 및 5% 이산화탄소 농도 조건에서 24시간 동안 측정되었다. 도 9(d)를 참조하면, 대기 중 이산화탄소 농도 조건에서는 초기 형광세기로부터 7%에서 9%로 형광세기가 감소한다. 반면에 5% 이산화탄소 농도 조건에서는 대기 중 조건과 비교했을 때 형광세기가 급격하게 감소한다. 특히, 미세기둥 구조를 포함하면서 80 ㎛ 높이의 미세챔버(330)에서 형광세기의 감소가 가장 컸고 이를 통해 미세액적(10) 직경이 90 ㎛인 경우 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)가 이산화탄소 투과에 가장 최적화된 장치임을 알 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 일실시예에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용한 균주 배양방법에 대하여 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용하여 균주를 배양하고 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용하여 균주를 배양하는 균주 배양방법은, 제1유입부(110)와 제2유입부(130)로 유체를 주입하는 유체주입단계(S1 단계), 제1유입부(110)와 제2유입부(130)로 유입된 유체가 각각 제1이동채널부(120)와 제2이동채널부(140)를 통해 이동하고 서로 만난 후, 플로포커싱부(150)를 통과하여 미세액적(10)을 생성하는 미세액적(10)생성단계(S2 단계), 플로포커싱부(150)를 통해 생성된 미세액적(10)이 연결부(200)를 통해 이동하면서 하나의 균주를 포함하는 하나의 미세액적(10) 비율을 증가시키는 이동단계(S3 단계), 연결부(200)를 통과한 미세액적(10)이 미세챔버(330)에 수용된 후, 미세액적(10)에 포함된 균주에 이산화탄소와 빛의 공급을 조절하여 균주를 배양하는 배양단계(S4 단계)를 포함할 수 있다.
S1 단계는 전술한 제1유입부(110)로 연속상의 유체를 주입하고 제2유입부(130)로 분산상의 유체를 주입하는 유체주입단계이다.
S2 단계는 제1유입부(110)로 유입된 연속상의 유체가 제1이동채널부(120)를 통해 이동하고 제2유입부(130)로 유입된 분산상의 유체가 제2이동채널부(140)를 통해 이동한 후, 제1이동채널부(120) 및 제2이동채널부(140)를 통해 이동한 유체가 서로 수직으로 만나 혼합되어 플로포커싱부(150)를 통과하면서 미세액적(10)을 생성하는 미세액적(10)생성단계이다.
S3 단계는 플로포커싱부(150)를 통해 생성된 미세액적(10)이 집합부(160)에 모이고 연결부(200)를 통해 미세액적 저장유닛(300)으로 이동하면서 하나의 균주를 포함하는 하나의 미세액적(10) 비율을 증가시키는 이동단계이다.
S4 단계는 연결부(200)를 통과한 미세액적(10)이 미세챔버(330)에 수용된 후, 미세액적(10)에 포함된 균주에 이산화탄소나 빛의 공급을 조절하거나 이산화탄소와 빛의 공급을 조절하여 균주를 배양하는 배양단계이다.
미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용한 균주 배양방법은 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 내의 미세액적(10)의 부피를 유지하기 위하여 미리 정해진 습도를 유지하는 습도유지단계를 더 포함할 수 있다.
미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용한 균주 배양방법은 미세챔버(330)에 미세액적(10)이 달라붙지 않도록 미세액적(10)을 상기 미세액적 저장유닛(300)에 주입하기 전에 미세챔버(330)에 기름을 채우는 단계를 더 포함할 수 있다.
미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용한 균주 배양방법은 피에이치(pH) 변화를 이용하여 미세액적(10) 내부로 전달되는 이산화탄소의 투과도를 분석하는 분석단계를 더 포함할 수 있다.
또한 유체펌프를 이용해 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)에 유체를 주입할 때 완전한 연결을 위해 파라필름으로 실리콘 관 끝을 감싸고, 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 입구와 연결하는 부위에 화이트 팁을 꽂는 단계를 더 포함할 수 있다.
오염 방지 및 먼지에 의해 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 관이 막히지 않게 하기 위해 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 입구와 연결하는 부위에 꽂는 화이트 팁과 유체가 이동하는 관들을 알코올로 세척하고 질소로 먼지를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
외부로부터 유입되는 공기를 막기 위해 테이프를 사용해 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 입구(110, 130)와 출구(340)를 막는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 이용한 균주 배양방법의 일례로, 도 10(a)에서 알 수 있는 바와 같이, 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 활용하여 이산화탄소 농도와 광량 조건에 따른 광합성 균주의 광독립영양 성장성을 분석하였다. 도 10(b)는 광합성 균주가 직경 90 ㎛의 미세액적(10)과 80 ㎛의 높이를 갖는 미세챔버(330) 및 미세기둥 구조를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)에서 120시간 동안 23 ℃ 온도, 55 μmol photons m-2 s-1의 광량, 서로 다른 이산화탄소 농도 조건에서 배양되는 모습을 나타낸다. 대기 중 이산화탄소 농도(0.03% (v/v))에서 성장성은 다른 조건들의 성장성 보다 낮다.
표 1은 다양한 이산화탄소 농도 및 광량 조건에서 광합성 균주의 성장성 지표를 나타내는 것으로, 표 1을 참고하면 이산화탄소 농도가 5%(v/v)까지 증가함에 따라, 배가 시간(doubling time)은 감소하고 최대 세포 농도는 증가함을 알 수 있다.
Figure pat00001
도 10(c)를 기준으로 대기 중 이산화탄소 농도와 비교했을 때 5% 이산화탄소 농도 조건에서 배가 시간은 17% 감소하고 최대 세포 농도는 84%까지 증가한다. 이는 이산화탄소 농도 증가가 제3미세기둥(331)을 통해 미세액적 저장유닛(300) 내부로 확산되는 이산화탄소의 양을 증가시켜 광합성 균주의 성장성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 그러나 7.5% 이산화탄소 농도 조건에서는 오히려 성장성이 저하되는 현상을 확인할 수 있는데 이는 과도한 이산화탄소 공급으로 인한 광합성 균주 세포 내부의 산성화 현상으로 해석할 수 있다.
대기 중 이산화탄소 조건에서 광량이 미세액적(10) 내부 광합성 균주의 성장성에 미치는 영향을 조사할 수 있다. 도 10(d)와 표 1을 참고하면 150 μmol photons m-2 s-1까지 광량이 증가함에 따라 광합성 균주는 최소의 배가 시간(8.023 시간)과 최대의 세포 농도(1.98 × 108 cells mL-1)에 도달한다. 35 μmol photons m-2 s-1 광량 조건과 비교하여 150 μmol photons m-2 s-1 광량 조건에서 배가 시간은 13%까지 감소하고 최대 세포 농도는 36%까지 증가한다. PDMS의 투명한 특성 때문에 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 내 광합성 균주는 광량이 증가함에 따라 더 많은 빛 에너지를 흡수할 수 있다. 그러나 200 μmol photons m-2 s-1 광량 조건에서는 성장 저하가 일어나는데 이는 광저해(photoinhibition) 현상으로 해석할 수 있다.
Figure pat00002
표 2는 광혼합영양 및 광독립영양 배양에서 광합성 균주의 플라스크와 미세액적(10) 내에서의 성장성 지표를 나타내는 것으로, 본 발명인 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)와 보편적인 플라스크 배양 조건에서 배가 시간과 최대 세포 농도를 비교한 것이다.
벌크 시스템에서 광합성 균주는 100 mL 플라스크, 23 ℃온도, 55 μmol photons m-2 s-1의 광량 조건에서 TAP-C 배지(광독립영양 배양, 5% 이산화탄소 농도)와 TAP 배지(광혼합영양 배양, 대기 중 이산화탄소 농도)를 활용하여 배양된다. 광독립영양 배양 조건에서 미세액적(10) 배양은 벌크 시스템에 비해 25.1% 감소된 배가 시간과 35.9% 향상된 최대 세포 농도를 갖는다. 유기 탄소를 포함하는 TAP 배지를 사용한 광혼합영양 배양에서는 벌크 시스템에 비해 29.3% 감소된 배가 시간과 51.6% 향상된 최대 세포 농도를 보인다.
이러한 현상은 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)가 벌크 시스템에 비해 가리움 효과(shading effect)가 감소하고 상대적으로 넓은 표면적으로 인해 물질 전달이 증가하여 발생한 것으로 해석할 수 있다. 그러므로 광독립영양 및 광혼합영양 배양에서 개발된 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 활용하면 신속하게 균주를 배양하고 신속 정확하게 광합성 균주의 성장성 분석이 가능하다.
일례로, 미세액적(10) 기반의 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)는 다양한 광합성 균주들 (Chlorella vulagaris (UTEX 2714), Chlorella sorokiniana (UTEX 1230), Chlorella protothecoides (UTEX 256), Neochloris oleoabundans (UTEX 1185))의 성장성 분석에 활용될 수 있다.
본 실험에서 사용된 균주들은 5% 이산화탄소 농도 및 150 μmol photons m-2 s-1의 광량 조건에서 TAP-C 배지를 사용하여 광독립영양 배양에서 성장성을 분석하였고 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비슷한 배가 시간과 최대 세포 농도를 보인다. 따라서 본 발명에 따른 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 사용하면 동시에 다양한 광합성 균주들의 광독립영양 성장성을 신속하게 분석 및 평가가 가능하다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 제작
미세액적(10)의 생성과 배양을 위한 도 1의 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)는 AutoCAD 프로그램을 이용해 디자인되었고 포토마스크 필름으로 인쇄한다. 두 개의 마스터 몰드는 실리콘 웨이퍼 및 네거티브 감광제(negative photoresist)인 SU-8 50을 사용하여 일반적인 포토리소그래피(photolithography) 기법을 적용해 제작한다. 미세액적(10)을 가두고 배양하기 위한 원형의 미세기둥은 60 ㎛의 직경을 갖고 기둥 사이의 간격은 100 ㎛이다.
Sylgard 184와 경화제(Dow Corning, USA)를 10:1의 질량비로 혼합하여 SU-8 마스터몰드에 붓고 진공 펌프를 사용하여 혼합물에 포함된 공기를 빼낸다. 80 ℃ 오븐에서 12 시간 이상 경화시킨 후, PDMS 판을 실리콘 웨이퍼에서 떼어내고 바이옵시 펀치(biopsy punch)로 직경 1 mm의 입구와 출구를 만든다. 다음으로 산소 플라즈마(oxygen plasma) 처리를 통해 슬라이드 글라스와 PDMS판을 화학적으로 결합시키고, 채널 표면의 소수성을 증대시키기 위해 완성된 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)를 120 ℃ 오븐에서 하룻밤 이상 보관한다.
실시예 2. 균주의 준비
실험에 사용된 광합성 균주는 Culture Collection of Algae at the University of Texas에서 구매한 Chlorella vulgaris (UTEX 2714), Chlorella sorokiniana (UTEX 1230), Chlorella protothecoides (UTEX 256), Neochloris oleoabundans (UTEX 1185) 이다. 광합성 균주는 멸균된 100 mL 플라스크에서 TAP-C 혹은 TAP 배지를 이용하여 50 μmol photons m-2 s-1의 광도 및 23 ℃의 온도를 유지하며 5% CO2 (v/v) 혼합공기를 주입하여 배양한다.
광합성 균주가 지수기(exponential phase)에 도달하였을 때 1 mL의 세포현탁액(cell suspension)을 3000 rpm 조건에서 10분 동안 원심분리하여 기존의 배지를 제거하고 신선한 TAP-C 혹은 TAP 배지에 옮긴다. 미세액적(10)의 생성을 위해 세포현탁액과 플루오로카본유(fluorocarbon oil)를 각각 분산상 및 연속상으로 사용한다. 그리고 광합성 균주가 오염되는 것을 막기 위해 모든 배양은 무균 상태를 유지하며 진행한다.
표 3은 TAP-C 배지의 구성성분을 나타내고, 표 4는 TAP 배지의 구성성분을 나타낸다.
TAP -C Medium
성분 함량 ( in 1L water )
TAP salts ( in 1L water )

25 ml
NH 4 Cl 15.0 g
MgSO 4 ·7 H 2 0 4.0 g
CaCl 2 ·2 H 2 O 2.0 g
Phosphate solution ( in 100 ml water )
0.375 ml
K 2 HPO 4 28.8 g
KH 2 PO 4 14.4 g
Hutner ’s trace elements



1.0 ml
EDTA disodium salt 50 g (250 ml water )
ZnSO 4 ·7 H 2 O 22 g (100 ml water )
H 3 BO 3 11.4 g (200 ml water )
MnCl 2 ·4 H 2 O 5.06 g (50 ml water ))
CoCl 2 ·6 H 2 O 1.61 g (50 ml water )
CuSO 4 ·5 H 2 O 1.57 g (50 ml water )
( NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4 H 2 O 1.10 g (50 ml water )
FeSO 4 ·7 H 2 0 4.99 g (50 ml water )
Tris base 2.42 g
HCl 1.0 ml
TAP -C Medium
성분 함량 ( in 1L water )
TAP salts ( in 1L water )

25 ml
NH 4 Cl 15.0 g
MgSO 4 ·7 H 2 0 4.0 g
CaCl 2 ·2 H 2 O 2.0 g
Phosphate solution ( in 100 ml water )
0.375 ml
K 2 HPO 4 28.8 g
KH 2 PO 4 14.4 g
Hutner ’s trace elements



1.0 ml
EDTA disodium salt 50 g (250 ml water )
ZnSO 4 ·7 H 2 O 22 g (100 ml water )
H 3 BO 3 11.4 g (200 ml water )
MnCl 2 ·4 H 2 O 5.06 g (50 ml water ))
CoCl 2 ·6 H 2 O 1.61 g (50 ml water )
CuSO 4 ·5 H 2 O 1.57 g (50 ml water )
( NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4 H 2 O 1.10 g (50 ml water )
FeSO 4 ·7 H 2 0 4.99 g (50 ml water )
Tris base 2.42 g
Glacial acetic acid 1.0 ml
실시예 3. 미세액적(10) 의 생성
미세액적(10) 생성을 위해 플루오로카본유 계열의 FC-40와 perfluorinated polyethers(PFPE)-polyethyleneglycol(PEG) block copolymer 계면활성제를 2%의 질량비로 혼합해서 사용한다. 여기서 계면활성제는 에멀전(emulsion)의 안정성을 증가시킴으로서 미세액적(10)의 융합을 막는 역할을 한다.
광합성 균주가 단일 세포 단위로 미세액적(10)에 포획될 수 있도록 세포현탁액은 광합성 균주가 포함된 용액을 2.63 × 106 cells mL- 1 까지 희석시켜 준비한다. 준비된 유상과 세포현탁액은 각각 1.5 mL의 저장소(reservoir)에 저장되고 연결된 pressure-driven pump(Fluigent, France)에 의해 도 2의 폭 20 ㎛, 높이 50 ㎛의 플로포커싱 구조를 갖는 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 내부로 주입되어 미세액적(10)을 생성한다.
광합성 균주의 오염을 막기 위해, 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)와 연결용 관은 자외선 처리와 에탄올 세척을 통한 멸균 과정을 거친다. 미세액적(10)은 약 90 ㎛의 직경을 갖고 40 Hz의 속도로 생성되며 이때 연속상과 분산상은 각각 190 mbar와 400 mbar의 압력으로 미세유체 채널 내부로 주입된다.
실시예 4. 미세챔버로의 미세액적 재주입 및 미세액적의 보관
안정적으로 만들어진 미세액적(10)은 폴리에틸렌(PE) 튜빙(tubing)으로 된 연결부(200)를 통해 도 1의 가로 5.0 mm, 세로 3.6 mm이고, 높이가 각각 30 ㎛, 80 ㎛ 그리고 100 ㎛인 직육면체 형태의 미세챔버(330)에 재주입된다. 미세챔버(330) 내에는 직경 60 ㎛의 미세기둥이 채워져 있어 약 1,400개 이상의 미세액적(10)을 포획하는 것이 가능하다. 미세액적(10)이 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 내부로 유입된 후에는 외부로부터 미세액적을 이용한 균주배양장치(400) 내부로 공기가 유입되는 현상을 방지하기 위해 미세액적을 이용한 균주배양장치(400)의 입구와 출구는 투명한 Scotch 테이프로 막아준다.
실시예 5. 이산화탄소 전달 분석을 위한 pH 지시약의 활용
미세액적(10) 내부로 확산되는 이산화탄소의 전달 속도 분석을 위해 pH 변화에 따라 형광의 세기가 달라지는 형광 염료인 pyranine(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)을 1 mM의 농도로 탈염수에 녹여 형광 분석법에 사용한다. 형광 이미지는 575 nm 파장 조건에서 형광 현미경과 ScopeLite 200 Microscope Illumination System(HORIBA Scientific Optical Building Blocks, NJ)을 사용하여 얻는다. 형광 이미지는 광퇴색(photobleaching)을 최소화하기 위해 짧은 순간에 DSLR 카메라(Canon EOS 700D)로 촬영한다. 또한, 현미경 이미지의 형광 세기는 ImageJ 프로그램의 densitometry에 의해 정량화한다.
한편, 본 도면에 개시된 실시예는 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
10 : 미세액적 100 : 미세액적 생성유닛
110 : 제1유입부 111 : 제1미세기둥
112 : 출구 120 : 제1이동채널부
130 : 제2유입부 131 : 제2미세기둥
140 : 제2이동채널부 150 : 플로포커싱부
151 : 벤딩채널 160 : 집합부
170 : 출부 200 : 연결부
210 : 채널관 300 : 미세액적 저장유닛
310 : 재유입부 320 : 필터부
330 : 미세챔버 331 : 제3미세기둥
340 : 배출부 400 : 균주배양장치

Claims (18)

  1. 연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적을 생성하는 미세액적 생성유닛;
    상기 미세액적 생성유닛과 연통되며 상기 미세액적이 이동되는 연결부; 및
    상기 연결부와 연통되며 상기 미세액적을 고정하는 복수 개의 미세챔버를 포함하는 미세액적 저장유닛;을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미세액적 생성유닛은,
    연속상의 유체를 주입하며 2 개의 출구를 갖는 제1유입부;
    상기 제1유입부의 출구로부터 유출되는 연속상의 유체가 이동하는 제1이동채널부;
    분산상의 유체를 주입하는 제2유입부;
    상기 제2유입부로부터 유출되는 분산상의 유체가 이동하는 제2이동채널부; 및
    상기 제1이동채널부를 이동하는 연속상의 유체와 상기 제2이동채널부를 이동하는 분산상의 유체가 만나 혼합되어 상기 미세액적을 생성하는 플로포커싱부;를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1유입부는 유입된 연속상의 유체를 에워싸는 형태로 배열되어 유입된 연속상의 유체로부터 불순물을 걸러내는 복수 개의 제1미세기둥을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제2유입부는 유입된 분산상의 유체를 에워싸는 형태로 배열되어 유입된 분산상의 유체로부터 불순물을 걸러내는 복수 개의 제2미세기둥을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 플로포커싱부는 상기 미세액적을 분산상으로 생성하기 위해 지그재그 형상의 벤딩채널을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  6. 제2항에 있어서, 상기 미세액적 생성유닛은,
    상기 플로포커싱부를 통과한 상기 미세액적이 모이는 집합부; 및
    상기 집합부 내에 상기 연결부와 연결되는 출부;를 더 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 제2유입부에 유입되는 유체는 세포현탁액으로 광합성 균주가 포함된 용액을 2.5 × 106 ~ 2.7 × 106 cells mL-1까지 희석시킨 용액을 포함하며,
    상기 제1유입부로 유입되는 연속상의 유체의 유압은 180~220 mbar로 유입되며, 상기 제2유입부로 유입되는 분산상의 유체의 유압은 390~430 mbar로 유입되어 상기 미세액적이 80~120 ㎛의 직경을 갖고 30~80 Hz의 속도로 생성되는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 연결부는 굽은 형태를 이루며 상기 미세액적이 일렬로 배열되어 흐를 수 있는 채널관을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 연결부는 상기 미세액적 생성유닛과 미세액적 저장유닛을 연통하는 길이가 4~6㎝ 인 채널관을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 미세챔버는 상기 미세액적을 고정시키고 상기 미세액적에 이산화탄소를 공급하는 복수 개의 제3미세기둥을 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제3미세기둥은 PDMS를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 미세액적의 직경이 80~120 ㎛인 경우, 상기 미세챔버는 상기 제3미세기둥의 높이가 60~120 ㎛를 이루며 4개의 상기 제3미세기둥을 포함하여 직육면체 형태를 이루는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  13. 제1항에 있어서, 상기 미세액적 저장유닛은,
    상기 연결부를 통해 유체가 유입되는 재유입부;
    상기 재유입부를 통해 유입된 유체로부터 불순물을 걸러내는 필터부; 및
    상기 미세챔버로부터 유출된 유체가 배출되는 배출부;를 포함하며,
    상기 미세챔버는 상기 필터부를 통과한 상기 미세액적을 수용하는 미세액적을 이용한 균주배양장치.
  14. 연속상의 유체와 분산상의 유체를 사용하여 미세액적을 생성하는 미세액적 생성유닛, 상기 미세액적 생성유닛과 연통되며 상기 미세액적이 이동되는 연결부, 및 상기 연결부와 연통되며 상기 미세액적을 고정하는 복수 개의 미세챔버를 포함하는 미세액적 저장유닛을 포함하며,
    상기 미세액적 생성유닛은, 연속상의 유체를 주입하며 2 개의 출구를 갖는 제1유입부, 상기 제1유입부의 출구로부터 유출되는 연속상의 유체가 이동하는 제1이동채널부, 분산상의 유체를 주입하는 제2유입부, 상기 제2유입부로부터 유출되는 분산상의 유체가 이동하는 제2이동채널부, 및 상기 제1이동채널부를 이동하는 연속상의 유체와 상기 제2이동채널부를 이동하는 분산상의 유체가 만나 혼합되어 상기 미세액적을 생성하는 플로포커싱부를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치에 있어서,
    상기 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용하여 균주를 배양하고 분석하는 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법.
  15. 제14항에 있어서, 균주 배양방법은,
    상기 제1유입부와 제2유입부로 유체를 주입하는 유체주입단계;
    상기 제1유입부와 제2유입부로 유입된 유체가 각각 상기 제1이동채널부와 제2이동채널부를 통해 이동하고 서로 만난 후, 상기 플로포커싱부를 통과하여 상기 미세액적을 생성하는 미세액적생성단계;
    상기 플로포커싱부를 통해 생성된 상기 미세액적이 상기 연결부를 통해 이동하면서 하나의 균주를 포함하는 하나의 미세액적 비율을 증가시키는 이동단계; 및
    상기 연결부를 통과한 상기 미세액적이 상기 미세챔버에 수용된 후, 상기 미세액적에 포함된 균주에 이산화탄소나 빛의 공급을 조절하여 균주를 배양하는 배양단계;를 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 미세액적을 유지하기 위하여 미리 정해진 습도를 유지하는 습도유지단계를 더 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 미세액적을 상기 미세액적 저장유닛에 주입하기 전에 상기 미세챔버에 기름을 채우는 단계를 더 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법.
  18. 제15항에 있어서,
    피에이치(pH) 변화를 이용하여 상기 미세액적 내부로 전달되는 이산화탄소의 투과도를 분석하는 분석단계를 더 포함하는 미세액적을 이용한 균주배양장치를 이용한 균주 배양방법.












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