KR20170043538A - 인슐린 내성의 치료에 사용하기 위한 랄스토니아 피케티에 대한 화합물, 및 인슐린 내성의 진단 방법 - Google Patents

인슐린 내성의 치료에 사용하기 위한 랄스토니아 피케티에 대한 화합물, 및 인슐린 내성의 진단 방법 Download PDF

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막스 니에우도르프
보스 바일렘 메인데르트 드
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아카데미쉬 메디쉬 센트륨
바게닝겐 유니버시테이트
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Abstract

본 발명은 피험체의 인슐린 내성, 비만 또는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 화합물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 항생제, 피험체에서 보호 면역 반응을 생성할 수 있는 면역원성 화합물, 및 랄스토니아 피케 티에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편으로 구성된 그룹에서 선택된다. 본 발명은 추가로 상기 피험체의 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티의 존재 또는 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 피험체에서 인슐린 내성, 비만 또는 제2형 당뇨병의 시험관내 진단 또는 예측 방법을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에서 랄스토니아 피케티의 항원, 랄스토니아 피케티 세포에 특이적으로 결합하는 항체, 및/또는 엄격한 조건하에 랄스토니아 피케티로부터의 핵산에 혼성화하는 핵산의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 항체, 상기 정의된 핵산을 포함하고, 선택적으로 랄스토니아 피케티 박테리아 또는 이의 핵산 또는 단백질을 포함하며, 또다른 시약 또는 종래의 키트 성분을 포함하는 키트의 용도를 제공한다.

Description

인슐린 내성의 치료에 사용하기 위한 랄스토니아 피케티에 대한 화합물, 및 인슐린 내성의 진단 방법 {COMPOUNDS AGAINST RALSTONIA PICKETTII FOR USE IN THE TREATMENT OF INSULIN RESISTANCE, AND METHOD OF DIAGNOSIS OF INSULIN RESISTANCE}
기술 분야
본 발명은 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)에 대해 효과적인 화합물, 가령, 면역원성 화합물, 항체 및 항생제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 및/또는 이들의 합병증의 치료에 사용하기 위한 제약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티의 존재 또는 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 결정하는 것을 포함하는, 피험체에서 인슐린 내성, 비만 또는 제2형 당뇨병의 진단 또는 예측 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 내장 지방 염증을 앓고 있는 피험체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 진단 방법에 사용하기 위한 화합물 및 시약 및 부품 키트에 관한 것이다.
배경
비만은 과량의 체지방으로 특징지어지는 상태이다. 과체중 및 비만의 유병률은 세계에서 중요한 공중 보건 문제로 고려된다. 대략 미국 성인의 3분의 2가 과체중 또는 비만 범주에 속한다. 실제로, 비만은 심혈관 질환 (CVD), 심실 기능이상, 울혈 심부전, 뇌졸중, 및 심장 부정맥에 있어 중요한 위험 인자이다. 더욱이 비만은 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 및 비-알콜성 지방간염 (NASH)과 밀접하게 연관된다.
제2형 당뇨병 (DM2), 또는 비 인슐린-의존성 당뇨병 (NIDDM)은 환자가 고혈당증을 나타냄과 동시에 인슐린을 생성하고 심지어 고인슐린혈증 (비-당뇨 피험체들과 비교하여 동일하거나 심지어 상승된 혈장 인슐린 수준)을 나타낸다는 사실로 특징지워진다. DM2를 앓고 있는 피험체들은 종종 "인슐린 내성"을 발달시켜, 주요 인슐린-민감성 조직들, 즉, 근육, 간 및 지방 조직에서의 포도당 및 지질 대사를 자극함에 있어서 인슐린의 효과가 감소되게 하므로, 이들 환자들은 심혈관 합병증, 예컨대, 죽상경화증, 관상 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 고혈압, 신장병, 신경병 및 망막병의 위험이 증가된다.
모든 비만 환자들의 약 33%는 인슐린 내성을 발달시키지만, 제2형 당뇨병 (악성 비만)은 아직 발달되지 않았으며, 이러한 피험체들은 또한 대사 증후군 발달 위험이 있다. 대사 증후군은 제2형 당뇨병의 선행-단계이며 종종 심혈관 질환들 (CVD)에 선행된다. 이는 복부 비만, 고인슐린혈증, 고혈압 및 낮은 고밀도 지질단백질 (HDL) 및 높은 초저밀도 지질단백질 (VLDL)/중성지방 혈장 콜레스테롤 수준과 함께 인슐린 내성으로 특징지워진다. 의학 분야에서 대사 증후군이라는 용어는 CVD 및 제2형 당뇨병에 대한 다수의 대사 위험 인자들이 존재하는 상태에 대해 쓸 수 있다는 합의가 있는 것으로 보인다. 대사 증후군을 앓고 있는 환자들은 대사 증후군이 없는 비만 피험체들에 비해 차후 5 내지 10년 이후에 CVD 발달 위험이 두 배이다. 또한, 대사 증후군은 제2형 당뇨병에 대한 위험을 5배 증가시킨다. 대사 증후군은 다음의 5가지 위험 인자들 중 임의의 3가지의 존재로 임상적으로 진단될 수 있다: 허리 둘레 증가, 중성지방 증가, HDL-C 감소, 혈압 증가, 및 공복 포도당 증가 (Alberti et al. 2009. Circulation 120:1640-1645).
선진국에서 비만이 많아짐에 따라, 간내 지방증, 또는 지방간의 유병률은 증가되었다. 미국 인구의 대략 ~1/3이 비만이고 (BMI >30) ~40%가 제2형 당뇨병 또는 당뇨병전기를 보유한다 (http://www.cdc.gov/diabetes/pubs/pdf/ndfs_2011.pdf). 혹사당한 지방 조직에 대한 반응으로, 인간의 간은 중성지방 (TGs)에 대한 축적 부위로서 보상을 하고자 한다. 이는 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)을 급속히 확산시켰으며, 미국에서 유병률은 최대 30%였다. 간에서의 과다 지방은 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 경화증을 비롯한 장기 병리학과 연관되며, 이는 간 부전을 초래할 수 있다.
비알콜성 간내 지방증은 일반적으로 대사 증후군을 보유한 비만 피험체들에서 발견된다. 최근의 연구들은 간내 지방증과 인슐린 내성 간의 강한 상관관계를 보고한 바 있다. 인슐린 내성과 연관된 그 외 대사 이상, 가령, 이상 내당능 (abnormal glucose tolerance), 고중성지방혈증의 유병률, 및 낮은 수준의 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 또한 NAFLD를 보유한 피험체에서 높다. 메트포르민은 인슐린 내성 및 제2형 당뇨병의 관리에서 첫번째 처방으로 고려된다. 메트포르민은 공복 및 식후 고혈당증을 감소시키기 위하여 식이 및 생활방식 변화에 대한 수정과 함께 종종 사용된다. 메트포르민은 또한 중성지방 수준을 감소시킬 수 있으며 적당한 체중 감량과도 연관되어 왔다.
메트포르민을 복용한 환자들에서 유해반응이 빈번하게 존재한다. 가장 주목할 만한 것은 위장관 부작용, 가령, 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복부 불쾌감 및 설사이다. 메트포르민 경구 복용 환자들의 최대 20%가 이러한 부작용들을 경험할 것이다. 이러한 효과들은 용량에 관련되어 있으나, 최대 5%는 상기 부작용들로 인해 치료를 중단하여야 할 것이다. 메트포르민을 복용한 환자들의 77%는 또한 비타민 B12 결핍이 발달할 것이다. 비타민 B12 결핍은 제2형 당뇨병에서 공통적으로 발견되는 말초 신경병과 연관되어 왔다. 현재, 메트포르민으로 이들 피험체들에서의 인슐린 내성을 치료하는 것은 이환율 및 사망률을 약 30%만큼 감소시킨다.
Vrieze et al. (2013. The role of gut microbiota in human metabolism)은 만성 내장 지방조직 염증을 보유한, 비만을 앓고 있으나 그 외에는 건강한 환자들이, 내독소혈증 증가 및 장 미생물군 조성 변형의 특징을 가졌는지 여부를 조사하였다. 18-45 kg/m2의 BMI를 가지는 한 무리의 47명의 환자들로부터, 가장 높은 지다당류 결합 단백질 (LBP) 혈장 수준을 보유한 12명의 환자들 및 가장 낮은 LBP 혈장 수준을 보유한 12명의 환자들을 선택하였으며, 이들 환자들 그룹에 대한 몇가지 매개변수들을 연구하였다 (표 1). 낮은 LBP 그룹에 비해 높은 LBP 그룹에 있는 환자들은 보다 높은 BMI, 보다 높은 백혈구 수, 그리고 보다 높은 CRP를 가졌음을 발견하였다.이들 두 그룹들의 배설물 덩어리들의 조성 간 현저한 차이가 전혀 검출되지 못했다. 추가적으로, 저자들은 내장 지방 조직에서 박테리아 DNA를 검사하였다. 그람-음성 랄스토니아 종들과 관련된 박테리아는 내장 지방 조직에 존재하는 아주 흔한 박테리아 종들인 것으로 확인되었다. 랄스토니아 DNA의 양은 높은 LBP 그룹에 비해 낮은 LBP 수준을 보유한 피험체들에서 현저히 증가되었다. 그러므로 높은 BMI를 보유한 환자들은 더 적은 양의 랄스토니아 DNA를 가졌다.
WO2012/131099는 대사 질환들, 가령, 당뇨병, 과체중 및 비만, 및 이들의 CVD 합병증에 관한 백신 개발, 치료 표적들의 식별, 및 예측 및/또는 진단을 위한 박테리아 무리의 사용과 관련된다. 기본적으로 30-65세 연령의 5212명의 성인들이 모집되었으며, 이들을 모집시 그리고 3-, 6-, 및 9-세 추적조사 방문시 당뇨병 발달에 대해 임상적으로 그리고 생물학적으로 평가하였다. 전체 추적조사 기간에 걸쳐 당뇨병이 발생한 경우로부터 그리고 당뇨병이 없는 대조군으로부터 모은 DNA 시료들에서 16S rDNA를 시퀀싱하였다. 많은 장 박테리아 문, 과 및 속들의 수준은 과체중, 비만, 또는 병적으로 비만인 피험체들에 비해 건강한 피험체들에서 상이한 것으로 밝혀졌다. 이들 장 박테리아 문, 과 및 속 중 어느 하나가 면역원성 또는 백신 조성물, 특히 대사 질환, 가령, 당뇨병, 과체중 및 비만, 및 이들의 CVD 합병증의 발병을 예방하기 위한 면역원성 또는 백신 조성물로서 사용될 수 있음이 제시되었다. 그러나 언급된 임의의 문, 과 및 속에 기반한 면역원성 또는 백신 조성물은 대사 질환들의 발병을 예방하는데 유용한 것으로 보이지 않는다. 사실상, 오직 테스트된 백신 조성물만이 고 지방 식이에 의해 당뇨를 앓게 된 마우스로부터 유래한, 초음파 불활성화 처리된 박테리아 (회장 혼합물(ileum mix))로 구성된 백신이었으며, 상기 불활성화 혼합물에서는 상기 문, 과 및 속 중 어떠한 존재도 확인되지 않았다.
인슐린 내성, 비만 또는 비만-관련 장애, 가령, DM2, 대사 증후군 및 비-알콜성 지방간 질환들 (NAFLD/NASH)을 치료 및/또는 예방하기 위한 대안이 필요하다.
요약
본 발명은 그람-음성 박테리아인 랄스토니아 피케티의 세포들이, 비만을 앓고 있는 환자들의 테스트 시료들에서 (배설물 및 장간막 내장 지방 조직 모두에서) 확인되었다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 또한, 발명자들은 랄스토니아 피케티 농도가 인슐린 내성의 임상적 및 역학적 특징들 모두와 상관관계가 있었음을 밝혀냈다. 더욱이, 랄스토니아 피케티 박테리아의 4주간의 일일 급식은 식이 유도된 비만 (DIO) 마우스에서 인슐린 내성을 유도하였다. 그러므로 발명자들은 랄스토니아 피케티 종들이 그리하여 장 미생물군 조성을 통해 인슐린 내성을 악성 비만으로 연결시키는 만성 염증의 잠재적 개시자일 수 있는 것으로 생각한다. 발명자들은 또한 랄스토니아 피케티에 대한 치료가 인슐린 내성의 임상 효과를 역전시키기에 효과적임을 밝혀냈다. 랄스토니아 피케티에 대한 외인성 다클론 항체 또는 백신접종을 이용한 DIO 마우스의 표적화 예비-치료는 인슐린 내성을 역전시킬 수 있었다. 장 랄스토니아 피케티에 대한 면역부스팅은 DIO 마우스에서 인슐린 내성 수준 그리고 후속적으로 내장-장간막 지방 조직 염증 수준에 상당히 영향을 주었다.
제 1 양상에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 화합물을 개시한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 랄스토니아 피케티에 대하여 효과적인 항생제, 피험체에서 랄스토니아 피케티 감염에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는, 랄스토니아 피케티로부터 유도가능한 면역원성 화합물, 바람직하게는 R. 피케티로부터 유도된 항원, 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 면역글로불린 (Ig)-유사 분자, 바람직하게는 항체, 또는 이의 결합 단편, 및 랄스토니아 피케티에 특이적인 박테리오파지로 구성된 그룹에서 선택된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 상기와 같은 화합물을 제공한다.
본 발명은 추가로 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 상기 정의된 화합물 및 제약상 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 동물에서 보호 면역 반응을 생성할 수 있는, 살아있는, 불활성화된, 또는 약독화된 랄스토니아 피케티 박테리아, 또는 이의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 백신 조성물은 종래의 백신이다.
바람직하게는, 상기 백신 조성물은 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
한 구체예에서, 본 출원에 개시된 화합물은 세프트리악손, 이미페넴, 실라스타틴, 피페라실린, 타조박탐, 아미카신, 겐타마이신, 세포페라존-설박탐, 시프로플록사신, 콜리스틴, 및 세포탁심으로 구성된 그룹에서 선택된 항생제이다. 콜리스틴은 경구로 투여될 수 있다. 세포탁심 및 이미페넴은 정맥내 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 나노입자들을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 피험체에서 인슐린 내성, 비만 또는 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로부터 선택된 질환의 시험관내 진단 또는 예측 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: 상기 피험체로부터 유래한 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티 수준 또는 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 항체 수준을 결정하는 단계, 상기 존재를 기준값 또는 대조군 시료에서의 랄스토니아 피케티 수준 또는 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 항체 수준과 비교하는 단계 그리고 상기 비교에 기초하여 상기 질환을 진단 또는 예측하는 단계.
바람직하게는, 상기 피험체는 내장 지방 염증, 바람직하게는, 장간막 내장 지방 염증을 앓고 있는 환자이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 테스트 시료는 지방 세포들, 바람직하게는 내장 지방(adipose fat)으로부터, 더욱 바람직하게는 장간막 내장 지방(adipose fat)으로부터의 지방 세포들을 포함하는 배설물 시료 또는 시료로 구성된 그룹에서 선택되는데, 이들 시료들에서의 박테리아의 존재는 질환을 잘 나타내는 것이기 때문이다. 바람직하게는, 상기 방법은 상기 피험체의 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티의 박테리아 핵산, 바람직하게는 16S rRNA의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 출원에 개시된 진단 또는 예측 방법에서 랄스토니아 피케티, 랄스토니아 피케티 세포를 중성화할 수 있는 항체, 및/또는 엄격한 조건하에 랄스토니아 피케티로부터의 핵산에 혼성화하는 핵산의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 출원에 개시된 진단 또는 예측 방법에서 상기 항체, 상기 정의된 핵산, 또는 랄스토니아 피케티 박테리아 또는 이의 핵산 또는 단백질을 포함하며, 선택적으로 추가 시약 또는 종래의 키트 성분을 추가로 포함하는 키트의 용도를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 복강경수술을 받은, 비만이지만 그 외는 건강한 피험체들로부터의 장간막-내장 지방 조직에서 박테리아 DNA의 존재를 보여준다. (A) 인간 장간막 내장 지방 조직 표본 (n=12 피험체)에서 상이한 종들의 존재 (총 박테리아 DNA의 백분율)를 보여주는 파이로시퀀싱, 랄스토니아 종이 가장 풍부한 그람-음성 박테리아였음. (B) 장간막 내장 랄스토니아 종 DNA 함량과 HOMA-IR간의 상관관계, (C) 혈장 아디포넥틴 및 (D) 배설물 R. 피케티를 나타낸다. 또한, (E) 배설물 R. 피케티는 HOMA-IR과 상관관계가 있었다 (피어슨 상관계수).
도 2는 (A) 비만인 폐경후 여성에서 제2형 당뇨병 (T2D) (n=47) , 내당능장애 (IGT) (n=45) 및 정상 내당능 (NGT) (n=42) 발달에 있어서 배설물 16S rRNA 랄스토니아 피케티 수준의 예측값, 및 (B) 혈장 아디포넥틴과 배설물 랄스토니아 피케티 수준간의 관계를 보여준다.
도 3은 수컷 DIO C57Bl6 마우스에서 (치료 그룹 당 n=9-15마리 마우스) (A) 배설물 R. 피케티 농도, (B) 장간막 지방 조직 R. 피케티 농도, (C) 체중, (D) 섭식, (E) 경구 포도당 부하 (OGTT), 및 (F) OGTT의 iAUC에 대한 R. 피케티 처리 및 사전백신접종(prevaccination) 처리의 효과를 보여준다.
도 4는 랄스토니아 피케티의 용량을 증가시킴에 따른 결합 효능에 대한 (토끼에서 생성된) IgG 다클론 항체의 시험관내 용량-의존 효과를 보여준다.
도 5는 수컷 DIO C57Bl6 마우스에서 (치료 그룹 당 n=9-15마리 마우스), 글리세롤, 활성 R. 피케티, 열 불활성화된 R. 피케티 및 R. 피케티 추출물로 사전백신 접종한 4개 처리 그룹들에서의 (a) FASN/지방산 합성효소, (b) ACC/ 아세틸 CoA, 및 (c) MRP2/ATP 결합 카세트 단백질 C2 간 유전자 발현에 대한 R. 피케티 처리의 효과를 보여준다. 통계적으로 비교된 그룹들 간 분산은 유사하였다.
상세한 설명
정의
본 출원에서 사용되는 용어 "랄스토니아 피케티"는 습기있는 환경, 가령, 토양, 강 및 호수에서 발견되는 베타-프로테오박테리아에 속하는 그람-음성 간균을 의미한다. 분류학상의 개관은 IJSEM July 2003 vol. 53 no. 4 1075- 1080에 제공되어 있다. 랄스토니아 피케티에는 RefSeq (Assembly: GCF_000023425) 랄스토니아 피케티 12D 및 RefSeq (Assembly: GCF_000020205) 랄스토니아 피케티 12J 종들이 포함된다. 랄스토니아 피케티 시료들은 DSM No.: 6297, ATCC 27511, CIP 73.23, JCM 5969, NCTC 11149로 기탁되거나 이용가능하다. 랄스토니아 피케티 AU12-08의 드래프트 유전체는 NCBI GenBank에 등록번호 ASZV00000000로 기탁되어 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "인슐린 내성"은 환자들의 세포가 인슐린에 적절하게 또는 효과적으로 반응할 수 있는 능력이 없음을 의미한다. 이자는 세포 수준에서 더 많은 인슐린을 생성함으로써 이 문제에 대하여 반응한다 . 결국, 이자는 인슐린에 대한 신체의 요구를 따라잡을 수 없고 과량의 포도당이 혈류에서 축적된다. 인슐린 내성을 보유한 환자들은 종종 이들의 혈액내에서 동시에 순환하는 높은 수준의 혈당 및 높은 수준의 인슐린을 보유한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "비만"은 통상적으로 이해되는 의미, 가령, "지나치게 뚱뚱한"이라는 의미를 가지며 지원 또는 공중 보건 기구들의 의학 문헌 및 책자에 정의된 바와 같은 비만에 관해 임상적으로 지정된 의미를 포함한다. 예를 들면, Dorland's Illustrated Medical Dictionary (29th edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia USA.)는 신체에서 과량의 지방축적 결과 골격 및 물리적 요구조건들의 제한을 초과하는 체중의 증가로서 비만을 정의한다. 환자에 대한 본 발명의 화합물(들)을 이용한 환자 치료 적합성은 자격을 갖춘 전문의 또는 간병인들에 의해 결정되기 때문에, 환자가 본질적으로 적합한지 또는 비만인지를 관리 간병인이 생각한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "제2형 당뇨병"은 비-인슐린-의존성 당뇨병을 의미한다. 제2형 당뇨병은 내인성 인슐린 생성과 인슐린 필요량 간의 상대적 불일치가 존재하여, 간 포도당 생성 상승, 혈당 수준 상승, 부적절한 인슐린 분비, 및 말초 인슐린 내성을 초래하는 인슐린-관련 장애를 의미한다. 제2형 당뇨병은 비교적 분명한 질환 양상으로 간주되어 왔으나, 제2형 당뇨병은 종종 훨씬 더 광범위한 기저 장애에 관한 소견이며 (Zimmet et al (2001) Nature 414: 782-787), 이러한 기저 장애에는 대사 증후군 (증후군 X), 당뇨병 (예컨대, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신 당뇨병, 자가면역 당뇨병), 고인슐린혈증, 고혈당증, 내당능 장애 (IGT), 고혈당증, B-세포 부전, 인슐린 내성, 이상지질혈증, 죽종, 인슐린종, 고혈압, 응고항진성, 미세알부민뇨, 및 비만 그리고 비만-관련 장애, 가령, 내장 비만, 중심성 비만, 비만-관련 제2형 당뇨병, 비만-관련 죽상경화증, 심장 질환, 비만-관련 인슐린 내성, 비만- 관련 고혈압, 비만-관련 제2형 당뇨병으로 생성된 미세혈관병증 병변, 비만-관련 제2형 당뇨병을 보유한 비만 피험체에서 미세혈관병증에 의해 유발된 안구 병변, 및 비만-관련 제2형 당뇨병을 보유한 비만 피험체에서 미세혈관병증에 의해 유발된 신장 병변이 포함될 수 있다.
더욱 공통된 성인 발병 당뇨병 증상들 중 일부에는 피로, 갈증 과다, 빈뇨, 흐린 시력, 높은 감염률, 서서히 치유되는 상처, 기분 변화 및 생식 문제들이 포함된다. 이러한 공지 증상들에도 불구하고, 제2형 당뇨병의 발병은 종종 질환이 잘 발달할 때까지는 건강관리 전문가들에 의해 발견되지 않는다. 일단 확인되면, 환자에게서 제2형 당뇨병은 공복 혈당 수준 및/또는 일상 혈당 수준을 측정함으로써, 공복 혈장 인슐린 수준 및/또는 일상 혈장 인슐린 수준을 측정함으로써, 또는 경구 포도당 부하 테스트 또는 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 테스트를 실시함으로써 인지될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "인슐린 내성"은 피험체의 세포들이 순환 인슐린의 정상 수준에 반응하지 못하는 상태를 의미한다. 분자 수준에서 인슐린 내성은 인슐린 수용체 경로를 통해 비정상적으로 감소된 신호전달 및 대사 결과 (예컨대, 포도당 섭취, 대사, 또는 저장)에 관한 것이다. 인슐린 내성은 당뇨병 (예컨대, 제2형 당뇨병), 비만, 고혈당증, 고지질혈증, 급성 외상, 만성 감염 및 심혈관 질환들을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 수많은 의학적 상태들 (즉, 원인 또는 ~의 결과)과 연관된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항생제"는 일반적으로 인정된 의미에 부합되게, 한 미생물이 성장하는 동안 생성되며, 하나 이상의 기타 미생물들이 정상적으로 성장하는 배지에 높은 희석액으로 첨가될 경우 하나 이상의 기타 미생물들에 대해 길항성을 띠는 물질을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 면역 반응을 이끌어내는 화합물의 능력을 의미한다.
한 단백질에 대해 언급할 때, 한 항체에 대해 언급할 때 어구 "특이적으로 결합하는"은 이종 단백질 및 그 외 생물학적 분자들의 집단의 존재하에서 상기 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 그러므로 지정된 조건들 하에서, 특이적 리간드는 특정 단백질에 우선적으로 결합하며 시료에 존재하는 상당량의 그 외 단백질들에 결합하지 않는다. 한 단백질에 특이적으로 결합하는 분자 또는 리간드 (예컨대, 항체)는 103 M-1 또는 104 M-1 이상, 때때로 105 M-1 또는 106 M-1 이상, 그 외 경우에서 106 M-1 또는 107 M-1 이상, 바람직하게는 108 M-1 내지 109 M-1, 그리고 더욱 바람직하게는, 약 1010 M-1 내지 1011 M-1 또는 그 이상의 결합 상수를 가진다.
본 출원에서 사용되는 용어 "제약상 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제"는 대상이 되는 제약상 제제를 신체의 한 장기 또는 부분으로부터 신체의 또다른 장기 또는 부분으로 전달 또는 운반하는데 관여하는 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 운반체, 가령, 액체 또는 고체 충전물, 희석제, 부형제, 용매 또는 봉입 물질을 의미한다. 각각의 담체는 조성물의 그 외 성분들과 상용가능하며 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"하여야 한다.
용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보강제 (예컨대, 프로인드 보강제 (완전 및 불완전)), 부형제, 또는 운반체를 의미한다.
이러한 제약상 담체들은 멸균액, 가령, 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 물과 오일, 가령, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참기름 등을 비롯한 멸균액일 수 있다. 적합한 제약상 부형제들에는 전분, 포도당, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 엿기름, 쌀, 밀가루, 석회분말, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다.
용어 "제약상 허용가능한"은 적절한 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 그 외 문제 또는 합병증 없이, 인간, 동물 및 식물들의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 타당한 유익/유해 비율에 상응하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 의미하기 위해 본 출원에서 사용된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "불활성화된 박테리아"는 감염 및/또는 집락형성을 할 수 없으며 약독화 박테리아 뿐만 아니라 사멸 박테리아를 포함하는 랄스토니아 피케티 박테리아를 의미한다. "약독화 박테리아"는 감염 또는 질환을 복제할 수 있으나 유발할 수 없다. 박테리아의 불활성화는 해당 기술분야의 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 박테리아는 가령, 포르말린 고정에 의하여 화학적으로 불활성화되거나, 또는 가령, 열, 음파처리 또는 방사선조사에 의하여 물리적으로 불활성화되어, 질환을 복제 및/또는 감염 및/또는 유발할 수 없게 될 수 있다.
활성 백신의 유효량이 투여되는 것이 바람직하며, 이 때 "유효량"은 피험체에서 면역 반응을 생성할 수 있는 랄스토니아 피케티 박테리아 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체의 양으로 정의된다. 필요량은 사용된 항원, 가령, 박테리아, 단편, 또는 유도체의 항원성 및 백신접종될 피험체의 종 및 체중에 따라 달라질 것이며, 표준기술을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 바람직한 비-제한적 구체예들에서, 유효량의 백신은 항박테리아 항체 역가를 백신접종 이전 항체 역가의 적어도 2배까지 상승시킨다. 본 발명의 바람직한 특정 비-제한적 구체예에서, 대략 107 내지 1011개 박테리아 및 바람직하게는 108 내지 1010개 박테리아가 숙주에 투여된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "종래의 백신"은 (1) 살아있는, 약독화된 백신 성분들에 기초한 (보강되지 않음), 또는 (2) 사멸된 불활성화된 백신 성분들, 사멸된 전 세포, 예컨대, 미네랄 보강제를 사용하여 정제된 서브유닛 또는 펩타이드 성분들 (보강됨)에 기초한 주지의 백신들을 정의하기 위한 것이다.
수동 백신에 적용되는 용어 "유효량"은 박테리아 질환 또는 감염을 예방 또는 약독화할 수 있는 항체의 양이다. 필요량은 항체 유형 및 항체 역가, 그리고 백신접종될 피험체의 종 및 체중에 따라 달라질 것이나, 표준 기술을 이용하여 확인될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "내장 지방" 또는 "내장 지방 조직"은 해당 기술 분야의 숙련된 기술자가 이해하는 바와 같은 통상적인 의미를 가지며 복막강 내부에 있는 복부 구역의 지방을 포함하므로, "피하 지방"과 구별된다. 내장 지방은 정성적으로 또는 정량적으로, 해당 기술분야의 숙련된 기술자에게 공지된 표준 분석법, 예를 들어, 컴퓨터 단층촬영 (CT), 자기공명영상 (MRI), 초음파촬영, 및/또는 피험체의 허리-엉덩이 측정비 결정에 의해 평가될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "지방세포(adipocyte 또는 adipose cell)"는 백색 지방 세포들 및 갈색 지방 세포들 모두를 포함한다.
본 출원에서 사용되는, "16S DNA"는 약 1500개 뉴클레오티드로 구성된 16S 리보솜 RNA (16S rRNA)를 인코딩하는 유전자를 의미하며, 이는 작은 원핵생물 리보솜 서브유닛 (30S)의 주요 성분이다. 16S DNA는 박테리아 중에서 매우 보존적이다. 기준 랄스토니아 피케티 16S rRNA 유전자 서열은 서열번호 7에 해당한다. 본 발명의 내용에서, 16S DNA는 그 외 박테리아 균주들에서 서열번호 7에 해당하는 임의의 서열을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "진단하는 방법" 또는 "진단 방법" 또는 "진단"은 질환을 앓고 있는지 여부를 결정하기 위한 방법을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "예측 방법"은 피험체가 질환을 발달시킬 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법을 의미한다.
본 발명의 내용에서, "피험체"는 인간 또는 비-인간 포유동물, 가령, 설치류 (래트, 마우스, 및 토끼), 영장류동물 (침팬지), 고양이과 동물 (고양이), 개과 동물 (개)을 의미한다. 바람직하게는, 피험체는 인간이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "테스트 시료" 또는 "생물학적 시료"는 생물학적 기원의 물질을 의미한다. 테스트 시료의 예에는 혈액 및 이의 성분들, 가령, 혈청, 혈장, 혈소판, 혈액 세포의 부분모집단 , 가령, 백혈구; 배설물, 및 조직, 가령, 지방 조직, 간 조직 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 내용에서, 해당 기술분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 용어 "혼성화하다" 또는 "혼성화"는 적합한 조건들 하에, 즉 엄격한 조건하에 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 핵산 분자의 결합을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건" 또는 "높은 엄격성 조건"은 결정된 수준의 상보성을 가지는 핵산들 간 결합쌍을 생성하기에는 적합하지만, 상기 결정된 수준보다 열등한 상보성을 보이는 핵산들 간 결합쌍을 형성하기에는 부적합한 조건에 해당한다. 엄격한 조건은 혼성화 및 세척 조건들 모두의 조합이며 서열 의존적이다. 이들 조건들은 해당 기술분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 방법들에 따라 변형될 수 있다 (Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). 일반적으로, 높은 엄격성 조건은 열 용융점 (Tm) 보다 낮은 약 50℃인 것으로, 바람직하게는 완전하게 염기-짝을 이룬 듀플렉스의 Tm에 근접한 온도에서 선택된다 (Andersen, Nucleic acid Hybridization, Springer, 1999, p. 54). 혼성화 절차는 해당 기술분야에 널리 공지이며 예를 들어 Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.D.,Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. eds. (1998) Current protocols in molecular biology. V. B. Chanda, series ed. New York: John Wiley & Sons에 기재되어 있다.
높은 엄격성 조건은 전형적으로 약 50℃ 내지 약 68℃의 5x SSC/5x 덴하르트 용액/1.0% SDS에서 혼성화하고, 약 60℃ 내지 약 68℃의 0.2x SSC/0.1% SDS에서 세척하는 것을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 표현 "특이적으로 혼성화하다"는 결정된 서열의 핵산이 표적 서열과 충분한 정도의 상보성을 보여서, 높은 엄격성 조건하에서 핵산과 표적 서열 간 안정한 결합을 형성하고 비-표적 서열과 비-특이적 결합을 하지 않음을 나타낸다. 상보성의 정도는 최적으로 정렬된 상기 핵산 서열을 상보적 표적 서열과 비교하고, 핵산 염기들이 상보적인 위치들의 수를 결정하여 상보적 위치들의 수를 산출하고, 이러한 상보적 위치들의 수를 표적 서열의 총 위치들의 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 상보성 정도를 산출함으로써 계산된다. 상보성 정도는 관례적으로 해당 기술분야에 공지된 BLAST 프로그램 (basic local alignment search tools, 기본 국소정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다 (Altschul et al., (1990) J. MoI. Biol. 215: 403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656).
본 출원에서 사용되는 "탐침자"는 핵산의 상보적 가닥에 염기-특이적 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명에 따른 탐침자들은 정제 또는 재조합 될 수 있다. 이 탐침자들은 검출가능한 모이어티, 즉, 검출가능한 신호, 가령, 방사능, 열량계, 형광, 화학발광 또는 전기화학발광 신호를 생성할 수 있는 모이어티로 표지될 수 있다. 수많은 이러한 검출가능한 모이어티들이 해당 기술 분야에 공지이다. 예로서, 상기 모이어티는 방사능 화합물 또는 검출가능한 효소 (예컨대, 홍당무과산화효소 (HRP)) 일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 탐침자는 약 10 내지 약 1000개 뉴클레오티드를 포함 또는 이러한 뉴클레오티드로 구성된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 표적 서열에 대한 어닐링 및 상기 표적 서열에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 증폭에 적합한 조건하에서 DNA 합성의 개시 지점으로서 기능할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
구체예들
화합물
제 1 양상에서, 본 발명은 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 화합물을 제공한다. 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 임의의 화합물이 사용될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "화합물"은 달리 동물용으로 지시되지 않은 임의의 제약상 화합물, 즉 약물, 전구약물, 또는 화합물, 뿐만 아니라 전술한 것의 제약상 허용가능한 염 및 광학이성질체를 의미한다. 본 내용에서 사용되는 용어 "효과적인"은 바람직하게는 이들 박테리아의 성장을 제한하거나 이들 박테리아를 사멸시킴으로써, 랄스토니아 피케티 박테리아 세포들에 대한 항박테리아 효과를 가지는 상기 화합물의 능력을 의미한다. 바람직하게는, 효과적임은 생존가능한 랄스토니아 피케티 박테리아의 수준을 감소시키는 및/또는 랄스토니아 피케티 박테리아의 생존력을 감소시키는 및/또는 랄스토니아 피케티 박테리아의 재현성을 감소시키는 능력을 의미한다. 화합물의 유효성, 예컨대, 특정 박테리아에 대한 화합물의 세균발육저지 또는 살균 효과를 테스트하는 방법들은 해당 기술분야에 공지이다. 그러므로 숙련된 기술자는 용이하게 그리고 과도한 실험을 하지 않고 랄스토니아 피케티에 대한 특정 화합물의 유효성을 테스트할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 화합물은 랄스토니 아 피케티의 장 전위를 억제한다. 본 출원에서 사용되는 박테리아 전위는 점막 상피를 통해 위장관 (GI)으로부터 그 외 부위들로, 가령, 장간막 림프절, 비장, 간 및 혈액으로의 생존가능 박테리아의 흐름(passage)으로서 정의된다.
바람직하게는, 효과적인 화합물은 피험체에서 안전한 유효량으로 치료하는데 사용될 수 있는 화합물이다. 본 출원에서 사용되는 용어 "안전한 유효량"은 적절한 의학적 판단 범위 내에서 처리될 감염 조건을 현저하게 긍정적으로 변형시키기에 충분히 많지만, 심각한 부작용들 (타당한 유익/유해 비율)을 없애기에 충분히 적은 양의 화합물 또는 조성물을 의미한다. 해당 기술 분야에 공지된 랄스토니아 피케티의 치료에 효과적으로 사용되는 화합물들은 항생제를 포함한다. 랄스토니아 피케티의 치료에 효과적인 바람직한 항생제는 Mikrobiyol Bul. 2009 Apr;43(2):331-4에 기재되어 있다. 바람직한 항생제에는 세프트리악손, 이미페넴, 실라스타틴, 피페라실린, 타조박탐, 아미카신, 겐타마이신, 세포페라존-설박탐 및 시프로플록사신 콜리스틴, 및 세포탁심이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 콜리스틴 투여량이 경구 투여되거나 세포탁심 및 이미페넴의 투여량이 정맥내, 바람직하게는 나노입자들을 사용하여 투여된다.
발명자들은 본 출원에서 능동 및 수동 면역성을 이끌어내는 화합물들 또한 본 발명에 따른 질환의 치료 또는 예방에 효과적임을 밝혀냈다. 그러므로 본 발명의 화합물은 랄스토니아 피케티로부터 유래한 항원들 및 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 항체를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 상기 화합물은 항원으로 또한 공지된, 피험체에서 보호 면역 반응을 생성할 수 있는 면역원성 화합물이다. 발명자들은 랄스토니아 피케티 세포들의 단편이 보호 면역 반응을 생성할 수 있음을 밝혀냈다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 불활성화된 랄스토니아 피케티 세포 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 숙련된 기술자는 랄스토니아 피케티 세포들 또는 이의 면역원성 단편들에 기초하여 항원을 생성할 수 있다. 살아있는, 약독화된 또는 불활성화된 랄스토니아 피케티 세포들은 상기 면역원성 화합물의 생성을 위한 공급원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 살아있는, 약독화된 또는 불활성화된 랄스토니아 피케티 세포들은 항원으로서 사용될 수 있다.
발명의 양상들에서, 랄스토니아 피케티 세포들은 포르말린을 사용하여 불활성화되거나 열 처리를 이용하여 박테리아를 불활성화시켜 불활성화된다. 바람직하게는, 상기 랄스토니아 피케티 세포들은 음파처리법을 사용하여 불활성화된다. 백신접종을 위한 박테리아 음파처리는 확립된 기술이며 미국 특허 US3862313, US4298597, 및 US4707543에 기재되어 있다. 바람직하게는, 박테리아 세포들은 US3862313에 기재된 바와 같이 음파처리 이전에 포르말린 사멸된다.
랄스토니아 피케티 의 박테리아 외막은 숙주-병원체 상호작용을 위한 경계면을 제공하는 것으로 생각되며 숙주 세포들에 대한 부착 및 숙주세포들의 침습, 포식작용에 대한 내성 및 숙주 세포들의 분해를 비롯한 다양한 중요한 역할들을 가지는 단백질 및 다당류를 번식시킨다. 표면 연관 단백질은 또한 구조적 완전성을 유지하는 그리고 숙주내 상이한 환경들에 대해 박테리아 병원체들을 적응시키는 역할을 한다. 이들이 숙주의 면역계에 노출되어 접근가능해 질 때, 외막 단백질 (OMP's)이 우수한 백신 후보들을 생성한다. 그러므로 바람직한 구체예에서, 상기 면역원성 화합물은 외막 단편, 또는 외막 소포이다. 박테리아의 외막 제조는 해당 분야에 공지이다. US4707543은 박테리아로부터 분리된 외막 복합체를 기재한다. Proc. Int. Pig Veter. Soc. 10 81 (1988)은 헤모필루스 플루로뉴모니에 (현재 악티노바실루스 플루로뉴모니에로 공지됨)로부터 유래된 돼지를 위한 외막 백신을 기재한다. 이 백신은 APP 외막을 함유하였다. 박테리아 외막들은 라이소자임-수크로스 처리된 세포들을 음파처리 한 후 수크로스 밀도 기울기 원심분리하여 제조될 수 있다. 음파처리는 바람직하게는 10-15초간 실시된다. 라이소자임은 펩티도글리칸 (세포벽)을 분해한다. 수크로스는 라이소자임으로 처리한 후 남는 세포막을 세포들이 음파처리 될 때까지 유지한다.
한 구체예에서, 상기 면역원성 화합물은 랄스토니아 피케티의 외막으로부터 유래된 단백질 또는 상기 단백질의 단편 또는 변이체를 포함하며, 여기서 단백질, 단편 또는 변이체는 피험체에서 보호 면역 반응을 생성할 수 있다. 랄스토니아 피케티 외막내에 존재하는 몇가지 단백질은 공지이며 BamB (Refseq ID YP_002981118.1. 및 NC_012856.1), Rpic12D_5148 외막 유출 단백질 (Refseq ID NC_012849.1), Rpic12D_5135 외막 유출 단백질 (Refseq ID NC_012849.1), Rpic12D_5289 외막 유출 단백질 (Refseq ID NC_012849.1), Rpic_4684 외막 유출 단백질 (Refseq ID NC_010678.1), Rpic12D_4293 (RefSeq-Pro:YP_002984208.1), Rpic12D_0604 (RefSeq-Pro:YP_002980581.1), Rpic_3640 (RefSeq-Pro:YP_001901191.1)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 랄스토니아 피 케티의 재조합 막 단백질은 공지이며, 예를 들어, 카탈로그 번호 MBS1169212의 외막 지질단백질 lolB (lolB)는 http://www.mybiosource.com/에서 구매가능하다.
본 출원에서 사용되는 용어 "외층 단백질", "표면층 단백질" 및 "외막 단백질"은 호환적으로 사용될 수 있으며, 박테리아 세포 표면에 부분적으로 또는 전적으로 존재하며 영구적으로 또는 일반적으로 세포 표면에 위치한 단백질 및 박테리아로부터 세포 표면으로 가끔씩, 예를 들어, 세포가 스트레스하에 있을 때, 또는 일시적으로, 예를 들어, 세포의 생활주기 중 특정 시기에 있는 동안 배출되는 단백질 또한 포함하는 단백질을 의미한다.
본 출원에서 단백질에 관한 내용에서 사용되는 용어 "단편"은 완전한 아미노산 서열과 동일한 활성을 가지는 폴리펩타이드 또는 단백질의 주어진 아미노산 서열 중 임의의 일부분을 의미한다. 단편들은 적절하게 염기 서열로부터 최소한 5개 및 바람직하게는 최소한 10개 연속 아미노산을 포함할 것이며 이러한 단편들의 조합 또한 포함한다. 활성을 유지하기 위하여, 단편들은 적절하게 최소한 하나의 에피토프 구역을 포함할 것이다. 에피토프 구역들을 포함하는 단편들은 함께 융합되어 변이체를 형성할 수 있다.
본 발명의 내용에서 본 출원에서 사용되는 표현 "변이체"는 서열 내 하나 이상의 아미노산들이 그 외 아미노산들로 치환되어 있다는 점에서 아미노산 서열들을 유도하는 염기 서열과 상이한 아미노산 서열을 의미한다. 아미노산 치환은 아미노산이 광범위하게 유사한 성질을 가진 상이한 아미노산으로 치환된 경우 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다. "비-보존적" 치환은 아미노산이 상이한 유형의 아미노산들로 치환된 경우이다. 대체적으로, 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 보다 적은 비-보존적 치환이 가능할 것이다. 적절하게는 변이체들은 염기 서열에 75% 이상 동일, 바람직하게는 최소한 80% 동일, 더욱 바람직하게는 최소한 85% 동일, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 90% 동일할 것이다. 본 발명의 상세한 설명에 포함된 변이체들에는 또다른 유기체로부터의 유전체 서열과 실질적으로 동일한 서열을 가지는 변이체를 가져오는 치환을 제외시키고자 한다.
또다른 구체예에서, 상기 면역원성 화합물은 선택적으로 또다른 랄스토니아 피케티-특이적 항원들, 가령, 상기 언급된 항원들과 조합된, 랄스토니아 피케티 다당류, 가령, 협막 다당류 또는 지질다당류를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 면역원성 화합물은 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 및/또는 랄스토니아 피케티 세포 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는 Ig-유사 분자, 가령, 항체, 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항체"는 해당 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이 용어는 최소한 하나의 상보성 결정 구역 (CDR)과의 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 이 용어는 다클론 항체, 단클론 항체, 단일특이성 항체, 다중특이성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 및 단일-사슬 항체 (예컨대, VHH)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 내용에서, 용어 "항체"는 또한 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb와 같은 항체 단편들, 및 항원-결합 기능을 보유하는 CDR들을 포함하는 그 외 항체 단편들 또는 그 외 구조체들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 단편들은 항원-결합 도메인을 포함할 것이다. 상기 항체들은 임의의 공지된 항체 동종형 및 이들의 입체형태, 예를 들어, IgA, 가령, IgA1 또는 IgA2, IgD, IgE, IgG, 가령, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, 또는 IgM 클래스일 수 있거나, 또는 임의의 조합의 이의 혼합물, 가령, IgG1 및 IgG2a 클래스로부터의 항체 혼합물을 구성할 수 있다.
바람직한 항체는 랄스토니아 피케티 세포들을 중성화할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 결합 단편들은 다클론 또는 단클론일 수 있으며, 종래의 방법들을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 항체가 정제될 수 있는 항혈청을 높이기 위해 동물 (가령, 토끼, 래트, 염소, 말, 양 등)을 면역원성 단백질 또는 면역원성 서브유닛 또는 이의 단편으로 면역화함으로써 생성될 수 있다. 단클론 항체는 골수종세포로 면역화된 동물로부터 얻은 비장 세포들을 융합시키고, 적합한 항체를 분비하는 하이브리도마 세포들, 바람직하게는 Nat Med. 2010 Jan;16(1):123-8에 기재된 세포들을 선택함으로써 수득될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "결합 단편"은 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 및/또는 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합하는 Ig-유사 분자, 예컨대, 본 출원에 개시된 바와 같은 항체의 일부 또는 부위로서 이해된다. 결합 단편들 ("항원-결합 단편"으로도 언급됨)은 무손상 또는 완전한 Ig-유사 분자, 예컨대, 항체의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 대안적으로, 결합 단편들은 표준 분자 생물학 기술 및 프로토콜을 사용하여 수득될 수 있다. Ig-유사 분자들의 결합 단편들의 비-제한적 예들에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편들; 디아바디; 선형 항체 및 단일-사슬 항체 분자들이 포함된다.
또한, 박테리아 오염물을 특이적으로 제거하기 위해 박테리오파지를 사용하는 것이 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Dalmasso M., et al. Trends Microbiol. 2014 Jul; 22(7):399-405). 용해성 박테리오파지로 처리함에 의한 랄스토니아 세포들의 생물학적방제는 Fujisawa et al., Appl Environ Microbiol. 2011 Jun; 77(12):4155-62에 기재되어 있다. 그러므로 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 화합물은 랄스토니아 피케티에 대하여 효과적인 박테리오파지를 포함한다. 랄스토니 아 피케티 특이적 박테리오파지는 해당 기술 분야에 공지이며, 예를 들어, 시퀀싱된 랄스토니아 피케티 박테리오파지 p12J가 있다 (GenBank 등록 번호 NP_932302).
제약상 조성물
또다른 양상에서, 본 발명은 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 상기 정의된 바와 같은 화합물 및 제약상 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 피험체의 인슐린 내성, 비만 또는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제약상 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 제약상-허용가능한 담체내에 투여된다. 해당 분야에 공지된 임의의 적합한 담체가 사용될 수 있다. 화합물을 효율적으로 용해시키는 담체들이 바람직하다. 담체에는 고체, 액체, 또는 고체 및 액체의 혼합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 담체는 캡슐, 정제, 알약, 분말, 로젠지제, 현탁액, 유화액, 또는 시럽의 형태를 취할 수 있다. 담체는 착향제, 윤활제, 용해화제, 현탁화제, 결합제, 안정화제, 정제 붕해제, 및 봉입 물질들로서 작용하는 물질들을 포함할 수 있다.
제약상-허용가능한 담체들로서 기능할 수 있는 물질들의 비-제한적 예에는 다음이 포함된다: (1) 당, 가령, 락토오스, 포도당, 및 수크로스; (2) 전분, 가령, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 가령, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 엿기름; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 가령, 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 가령, 땅콩 오일, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 및 대두 오일; (10) 글리콜, 가령, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 가령, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 가령, 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 가령, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 발열원-제거수(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수, (18) 링거 용액, (19) 에틸 알콜; (20) 인산염 완충 용액; 및 (21) 제약학적 조성물에 사용되는 그 외 비-독성 상용성 물질.
본 발명의 조성물들은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있으며 제약 분야에 널리 공지된 임의의 방법들로 제조될 수 있다. 단일-투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 피험체, 특정 투여 방식, 및 치료될 특정 병태 등에 따라 달라질 것이다. 단일-투여 형태를 제조하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양이 될 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중에서, 이 양은 활성 성분의 약 1 퍼센트 내지 약 99 퍼센트, 바람직하게는 약 5 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 10 퍼센트 내지 약 30 퍼센트 범위가 될 것이다.
이들 조성물들을 제조하는 방법들은 본 발명의 화합물을 담체 그리고, 선택적으로, 하나 이상의 부 성분들과 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물들은 본 발명의 항생제 화합물을 액체 담체, 또는 시기적절하게 분할된 고체 담체들, 또는 이들 모두와 균일하게 그리고 밀도있게 조합한 다음, 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고체 투여 형태 (예컨대, 캡슐, 정제, 알약, 당제, 분말, 과립, 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 추가 성분들, 가령, 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 다음 중 임의의 것과 혼합된다: 충전제 또는 증량제, 가령, 전분, 락토오스, 수크로스, 포도당, 만니톨, 및/또는 규산 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 결합제, 가령, 카르복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐 파이롤리돈, 수크로스, 및/또는 아카시아 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 보습제, 가령, 글리세롤 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 붕해제, 가령, 한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카보네이트 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), 용액 지연제(solution retarding agents), 가령, 파라핀 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 흡수 촉진제, 가령, 4차 암모늄 화합물 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 습윤제, 가령, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 흡착제, 가령, 카올린 및 벤토나이트 점토 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 윤활제, 가령, 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이의 혼합물 (그러나 이에 제한되는 것은 아님); 그리고 착색제. 캡슐, 정제, 및 알약의 경우, 제약학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물들은 또한 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에 충전제로서 락토오스 또는 유당, 뿐만 아니라 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 이용하여 사용될 수 있다.
분말에서, 담체는 미세-분할된 고체이며, 이는 미세-분할된 제제의 유효량과 조합된다. 분말 및 스프레이는 본 발명의 화합물 이외에도, 부형제, 가령, 락토오스, 활석, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이러한 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 관례적인 추진제, 가령, 클로로플루오로하이드로카본 및 휘발성 비치환 탄화수소, 가령, 부탄 및 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
전신 경구 투여를 위한 정제는 하나 이상의 붕해제 (예컨대, 옥수수, 전분, 또는 알긴산, 결합제, 가령, 예를 들어, 젤라틴, 콜라겐, 또는 아카시아), 윤활제 (예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 스테아릭 애시드, 또는 활석), 비활성 희석제, 보존제, 붕괴제 (예컨대, 소듐 스타치 글리콜레이트), 표면-활성 및/또는 분산제와 함께, 해당 기술 분야에 공지된 하나 이상의 부형제, 가령, 예를 들어, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 당 (예컨대, 락토오스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨), 셀룰로오스 (예컨대, 메틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 검 (예컨대, 아라빅, 트라가칸트)을 포함할 수 있다. 정제는 선택적으로 하나 이상의 부 성분들과 함께 압축 또는 몰딩하여 제조될 수 있다.
용액, 현탁액, 유화액 또는 시럽에서, 유효량의 항생제 화합물은 담체, 가령, 멸균수 또는 유기 용매, 가령, 수성 프로필렌 글리콜에 용해 또는 현탁된다. 그 외 조성물들은 수성 전분 또는 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 용액 또는 해당 기술 분야에 공지된 적합한 오일에 상기 제제를 분산시켜 제조될 수 있다. 액체 투약 형태들은 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 가령, 예를 들어, 물 또는 그 외 용매들, 가용화제 및 유화제, 가령, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)을 함유할 수 있다.
비활성 희석제 이외에도, 경구 조성물들은 또한 보조제, 가령, 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미제, 착향제, 착색제, 향료, 및 보존제를 포함할 수도 있다.
현탁액들은 활성 화합물 이외에도 현탁화제, 가령, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물들을 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여를 위한 제약상 조성물들은 좌제로서 제공될 수 있는데, 이는 본 발명의 하나 이상의 화합물들을, 예를 들어, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체와 혼합하여 제조될 수 있으며, 좌제는 실온에서 고체이지만 체온에서 액체이므로 직장 또는 질강에서 용융하여 제제를 방출시키게 된다. 질 투여에 적합한 조성물들은 또한 적절한 것으로 해당 기술 분야에 공지된 담체들을 함유하는 질좌약(pessaries), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체 또는 스프레이 조성물들을 포함한다.
본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여용 투약 형태들에는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 활성 항생제 화합물은 멸균 조건하에서 제약상 허용가능한 담체와, 그리고 필요할 수 있는 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림, 및 겔은, 활성 화합물 이외에도, 부형제, 가령, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화 아연, 또는 이의 혼합물들을 함유할 수 있다.
경피 패치는 본 발명의 화합물을 신체로 제어하여 전달하는 추가 이점을 가진다. 이러한 투여 형태는 제제를 적절한 매질에 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 피부를 가로지르는 제제의 유동을 증가시키기 위해 흡수 증강제 또한 사용될 수 있다. 이러한 유동 속도는 폴리머 매트릭스 또는 겔에 항생제 화합물을 분산시키거나 속도 제어 막을 제공함으로써 제어될 수 있다.
활성 백신
한 바람직한 구체예에서, 상기 본 발명의 조성물은 본 출원에 개시된 면역원성 화합물을 포함하는 백신이다. 상기 면역원성 화합물은 랄스토니아 피케티 박테리아 또는 이의 단편의 특정 구체예들의 일부로 존재한다.
본 발명은 동물에서 보호 면역 반응을 생성할 수 있는 살아있는, 불활성화된, 약독화된 랄스토니아 피케티 박테리아 또는 이의 단편을 포함하는 백신 조성물을 추가로 제공한다. 불활성화된 전체 박테리아를 포함하는 백신이 바람직하다. 또다른 구체예에서, 상기 백신은 동물에서 보호 면역 반응을 생성할 수 있는 상기 랄 스토니아 피케티 박테리아의 단편을 포함한다. 상기 백신은 랄스토니아 피케티가 원인 물질인 임의의 치료에 사용하기에 적합하다. 바람직하게는, 상기 백신 조성물은 피험체에서 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 백신 조성물은 적합한 비독성 제약상 담체에 투여될 수 있거나, 마이크로캡슐에 포함될 수 있거나, 및/또는 제어된 방출, 예컨대, 서방형, 임플란트에 포함될 수 있다. 상기 본 발명의 백신은 그 외 살균 또는 세균발육저지 방법들, 바람직하게는 본 출원에 개시된 화합물 또는 조성물과 함께 사용될 수 있다.
백신 조성물에 사용될 수 있는 적합한 부형제 및 담체들은 해당 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 공지일 것이다. 이들은 고체 또는 액체 담체들을 포함할 수 있다. 적합한 액체 담체들에는 물 또는 식염수가 포함된다. 상기 조성물의 폴리펩타이드 및 단백질은 유화액으로 제형화 될 수 있거나 또는 대안적으로 생분해성 미세구 또는 리포좀에 또는 이들과 함께 제형화 될 수 있다. 적합하게는, 백신 조성물은 숙주의 면역 반응을 자극하는 항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함한다. 특히 적합한 보강제들에는 알하이드로겔, MPL+TDM 및 프로인트 불완전 항원보강제(Freunds Incomplete Adjuvant)가 포함된다. 프로인트 불완전 항원보강제가 가장 바람직하다.
불활성화된, 약독화된 또는 살아있는 박테리아 분리주들 이외에도, 상기 본 발명의 백신 조성물은 또한 하나 이상의 통상 사용되는 항원보강제들을 적절한 양으로 포함할 수 있다. 적합한 항원보강제들에는 다음이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다: 미네랄 겔, 예컨대, 알루미늄 하이드록사이드; 표면 활성 물질들, 가령, 리소레시틴(lysolecithin); 글리코시드, 예컨대, 사포닌 및 사포닌 유도체, 가령, Quil A 또는 GPI-0100; 양이온성 계면활성제, 예컨대, DDA (4차 탄화수소 암모늄 할로겐화물, 플루로닉 폴리올; 폴리음이온 및 다원자 이온; 폴리아크릴산, 비-이온성 블록 폴리머, 예컨대, 플루로닉 F-127 (B.A.S.F., USA); 아브리딘 및 란티딘(Avridine and Rantidine); 펩타이드; 재조합 돌연변이 표지 독소, 예컨대, 류코톡신 (LT) 또는 콜레라 독소 (CT); 화학적으로 결합되거나 매우 근접한 분자 운반체; 미네랄 오일, 예컨대, Montanide ISA-50 (Seppic, 파리, 프랑스), 카보폴(carbopol), 암피젠 (Hydronics, USA), Omaha, Neb. USA, 알하이드로겔, (Superfos Biosector, Frederikssund, 덴마크) 오일 유화액, 예컨대, 미네랄 오일의 유화액, 가령, BayolF/Arlacel A 및 물, 또는 식물성 오일의 유화액, 물 및 유화제 가령, 레시틴; 백반, 콜레스테롤 시토카인 및 항원보강제들의 조합물. 다원자 이온은 또한 분산, 증점 및 고결방지 제제로서 기능할 수 있으며, 이는 백신이 오랜 기간 가라앉은 후 단분산 현탁액으로서 재현탁되게 한다. 상기 항원보강제 조합물은 수성의, 캡슐화 (제어 또는 지연 방출) 또는 미세캡슐화 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 백신은 정맥내, 피하, 근육내, 질내, 복강내, 비강내, 경구 또는 그 외 점막 경로를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 해당 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 국소적으로 및/또는 전신적으로 투여될 수 있다. 상기 백신은 항체 수준을 지속시키기 위하여 여러가지 간격으로 바람직하게 투여될 수 있다.
항체
조성물의 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 및/또는 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 결합 단편 및 제약상 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함한다. 적합한 담체들은 해당 기술분야의 표준 참고문헌인 Remington's Pharmaceutical Sciences의 가장 최근 판본에 기재되어 있으며, 이는 본 출원에 참고문헌으로 첨부된다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예들에는 물, 식염수, 링거 용액, 포도당 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.본 발명의 제약상 조성물은 의도한 투여 경로와 상용가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예컨대, 정맥내, 진피내, 피하, 경구 (예컨대, 흡입), 경피 (즉, 국소), 점막경유, 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 진피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 가령, 주사용 물, 식염수 용액, 고정유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그 외 합성 용매; 항박테리아제, 가령, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 가령, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 가령, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충제, 가령, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성(tonicity) 조절을 위한 제제, 가령, 소듐 클로라이드 또는 포도당. pH는 산 또는 염기, 가령 염산 또는 소듐 하이드록사이드를 이용하여 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 투여 바이얼, 일회용 주사기 또는 앰플에 봉입될 수 있다. 주사용으로 적합한 제약상 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 (수용성) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체에는 생리식염수, 세균발육저지수, 크레모포어(Cremophor) EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)가 포함된다. 모든 경우에서, 상기 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사투여능이 존재하는 정도까지 유체이어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건들하에서 안정하여야 하며 미생물, 가령, 박테리아 및 진균의 오염작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들면, 코팅, 가령, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입경을 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살, 등에 의해 저해될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 가령, 만니톨, 소르비톨, 및 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 본 발명에 따른 필요량의 항체를 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합을 보유한 적절한 용매에 혼입시키고, 필요에 따라, 후속하여 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산물은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 필요한 그 외 성분들을 함유하는 멸균 운반체로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며 이 방법은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터의 원하는 임의의 추가 성분이 더해진 활성 성분의 분말을 산출한다. 흡입에 의한 투여를 위하여, 화합물들은 적합한 추진제, 예컨대, 기체, 가령, 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기 또는 분무기(nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 전신 투여는 또한 점막경유 또는 경피 수단들에 의한 것일 수 있다. 점막경유 또는 경피 투여를 위하여, 투과될 장벽에 적절한 침투액이 이 조성물에 사용된다. 이러한 침투액은 일반적으로 해당 기술 분야에 공지이며, 예를 들어, 점막경유 투여를 위해, 세제, 담즙산염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 점막경유 투여는 비강 스프레이 또는 좌제를 이용하여 이루어질 수 있다. 경피 투여를 위하여, 활성 화합물들은 해당 기술 분야에 일반적으로 공지된 연고(ointments), 연고제(salves), 겔, 또는 크림으로 제형화된다. 한 구체예에서, 활성 화합물들은 임플란트 및 미세캡슐화 전달계를 비롯하여, 화합물을 신체로부터의 급속한 제거에 대해 보호하게 할 담체, 가령, 제어된 방출 제형으로 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 가령, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형들의 제조 방법들은 해당 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 자명할 것이다. 이러한 물질들은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원들에 대한 단클론 항체를 보유한 감염 세포들에 대해 표적화된 리포좀 포함) 또한 제약상 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 해당 기술 분야에 공지된 방법들, 예를 들어, 미국 특허 제 4,522,811호에 기재된 방법들에 따라 제조될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물들을 투여 단위 형태로 제제화 하는 것이 특히 유리하다.
본 출원에 기재된 치료는 질환 예방, 증상 완화, 질환 진행 감속, 손상 회복, 또는 질환 치유를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 모든 조성물들은 투여에 관한 지시사항과 함께 용기, 펙, 키트, 또는 분배용기에 포함될 수 있다.
진단 및 예측 방법
발명자들은 그람 음성 박테리아 균주 랄스토니아 피케티의 박테리아가 비만을 앓고 있는 환자들의 테스트 시료, 배설물 및 장간막 내장 지방 조직 모두에서 증가된 수준으로 존재하였음을 밝혀냈다. 또한, 발명자들은 랄스토니아 피케티의 농도가 인슐린 내성에 관한 임상적 및 역학적 특징들 두가지 모두와 상관관계가 있었음을 밝혀냈다. 그러므로 본 발명은 피험체의 테스트 시료에서 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH의 진단 또는 예측 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 출원에 기재된 치료로부터 이점을 얻을 수 있는 피험체들의 그룹을 식별함에 도움을 준다.
본 출원에 기재된 방법들은 치료를 필요로하는 피험체를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 방법들은 치료를 필요로하는 포유동물을 식별하는 단계를 포함한다. 매우 바람직한 한 구체예에서, 상기 방법들은 치료를 필요로하는 인간을 식별하는 단계를 포함한다. 치료를 필요로하는 피험체를 식별하는 단계는 치료로부터 이점을 얻을 수 있는 피험체를 나타내는 임의의 수단들에 의해 이루어질 수 있다. 상기 방법들은 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH 또는 이들 질환들과 연관된 병태의 위험이 있는 또는 이를 앓고 있는 피험체를 식별하는 단계 그리고 상기 병태를 치료 또는 예방하는 유효량의 화합물을 피험체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 치료를 필요로하는 피험체를 식별하는 단계는 임상 진단, 실험실 테스트, 또는 해당 기술 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 그 외 수단들에 의해 이루어질 수 있으며 식별을 위한 수단들의 임의의 조합을 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 피험체의 테스트 시료, 바람직하게는 혈장 시료 내 아디포넥틴 수준의 결정을 추가로 포함한다. 낮은 수준의 아디포넥틴은 바람직하게는 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH가 발달할 위험 증가를 예측하기 위하여 사용된다. 또다른 바람직한 구체예에서, 백혈구의 양이 피험체의 테스트 시료에서 결정된다. 백혈구의 양 또한 상기 질환을 표시한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 테스트 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 백혈구, 대변(stool), 지방 조직 또는 간 조직 시료이다. 가장 바람직한 테스트 시료에는 대변(stool) 및 내장 지방 조직 시료들이 포함된다. 매우 바람직한 시료들에는 배설물 및 장간막 내장 지방 조직 시료들이 포함된다.
본 발명의 방법은 랄스토니아 피케티의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 박테리아의 존재는 해당 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 랄스토니아 피케티의 식별을 가능하게 하는 랄스토니아 피케티의 임의의 화합물, 분자 또는 세포 단편은 그 수준에 관한 생물표지자로서 사용될 수 있다. 테스트 시료에서 박테리아를 검출하는 적합한 방법들에는 랄스토니아 피케티의 핵산 또는 단백질의 검출이 포함된다. 랄스토니아 피케티의 유전체는 해당 기술 분야에 공지이다. 그러므로 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 엄격한 조건하에 랄스토니아 피케티 특이적 핵산으로 혼성화하는 핵산을 용이하게 과도한 실험없이도 설계할 수 있다. 예를 들면, 랄스토니아 피케티 식별에 도움을 주는 핵산을 증폭시킬 수 있는 프라이머가 설계될 수 있다. 이러한 기술은 해당 기술 분야에 널리 공지이며 본 출원에 기재되어 있다. 바람직하게는, 상기 핵산은 종 특이적이다. 랄스토니아 피케티에 대한 종 특이적 핵산들은 Ryan et al., BMC Microbiology 2011, 11:194에 개시되어 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 상기 수준을 대조군 시료에서의 기준값 또는 랄스토니아 피케티 수준 또는 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합한 항체의 존재와 비교하는 단계를 포함한다. 상기 대조군 시료는 양성 대조군 시료 또는 음성 대조군 시료일 수 있다. 상기 기준값은 대조군 시료에서 예정된 수준에 기초한 것일 수 있다. 상기 질환의 진단 또는 예측은 상기 비교에 기초한다. 상기 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티 수준 또는 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합한 항체의 수준은 본 발명의 질환을 나타내거나 예측한다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 랄스토니아 피케티의 16S DNA 검출을 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 랄스토니아 피케티의 16S rRNA 또는 16S rDNA (16S rRNA를 코딩하는 유전자) 검출을 포함한다. 바람직하게는, 종-특이적 PCR 프라이머는 랄스토니아 피케티의 16S DNA를 증폭하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 상기 프라이머들은 핵산 서열 ATGATCTAGCTTGCTAGATTGAT (서열번호 1)을 가지는 전방향 프라이머 및 핵산 서열 ACTGATCGTCGCCTTGGTG (서열번호 2)를 가지는 역방향 프라이머를 포함한다. 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 SILVA 데이터 베이스 (http://www.arb-silva.de/documentation/release-119/)에 기탁된 랄스토니아 피케티 균주들의 16S rRNA를 표적함에 유용하게 될 그 외 프라이머들도 개발하는 것이 유용할 것임을 알게 될 것이다. 유사하게, 랄스토니아 피케티의 유전체들 중 하나에 관한 프라이머들이 특이적 검출 방법을 개발하기 위하여 사용될 수 있다.
바람직하게는, 원핵생물 및 진핵생물 유래의 유전체 DNA는 Zoetendal et al. (16)에 따른 내장 지방 조직으로부터 분리된다. 간단하게는, 조직들은 먼저 55℃에서 SDS와 단백질분해효소 K의 혼합물로 처리되고 FAST 프렙-24 (MP Biomedical)에서 페놀 및 지르코니아 유리 비드 (1mm)의 존재하에서 기계적 파괴에 의하여 균질화된다. 방출된 유전체 DNA는 후속하여 수많은 페놀/클로로포름 추출물로 추가 추출되고 무수 에탄올의 존재하에서 침강될 수 있다. 바람직하게는, 종 특이적 PCR 프라이머들은 랄스토니아 피케티의 16S DNA를 증폭시키기 위하여 사용된다. 바람직하게는, 상기 프라이머들은 핵산 서열 ATGATCTAGCTTGCTAGATTGAT (서열번호 1)을 가지는 전방향 프라이머 및 핵산 서열 ACTGATCGTCGCCTTGGTG (서열번호 2)를 가지는 역방향 프라이머를 포함한다. 또다른 구체예에서, 범용 16S 프라이머들이 임의의16S 핵산을 증폭시키기 위하여 사용되며 랄스토니아 피케티 16S 핵산들을 추가로 증폭시키기 위하여 랄스토니아 피케티 16S에 특이적인 네스티드 프라이머(nested primer)가 사용된다. 본 발명의 내용에서, 용어 "범용(universal) 프라이머"는 본질적으로 임의의 유래의 16S 핵산에 혼성화 할 수 있는 서열을 포함하는 프라이머를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 범용 프라이머들은 서열 5'- GTTTGATCCTGGCTCAG - 3' (서열번호 3) 및 서열 5'- GCCCGGGAACGTATTCACCG -3' (서열번호 4)로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 프라이머들이다. 상기 구체예에서, 다음 프라이머들이 바람직하게는 사용된다: 전방향 (네스티드): CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGG (서열번호 5) 및 역방향 (네스티드): GCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC (서열번호 6). 증폭된 생성물들은 이들이 랄스토니아 피케티로부터 유래된 것인지 여부를 식별하기 위해 해당 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 상기 증폭된 생성물들을 시퀀싱함으로써 그리고 후속적으로 랄스토니아 피케티의 공지된 서열 데이터와 상기 단편들로부터의 서열 데이터를 비교함으로써 상기 핵산 서열이 랄스토니아 피케티로부터 온 서열인지 여부를 결정한다. 바람직하게는, 정량적 PCR법이 랄스토니아 피케 티로부터의 핵산의 양을 결정하기 위하여 사용된다.
종래 기재된 바와 같이(17) 박테리아 cDNA의 분리 후 배설물 시료에서의 랄스토니아 수준이 적절하게 결정될 수 있으며 전체 박테리아 qPCR이 설명된 바와 같이 실시될 수 있다(21). 랄스토니아 피케티 특이적 DNA 증폭은 본 출원에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다.
본 발명의 방법의 또다른 구체예에서, 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티의 존재는 이 박테리아에 결합하는 특이적 항체를 사용하여 결정된다. 식별에 적합한 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법은 해당 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 항체는 숙련된 기술자에 의해 용이하게 생성될 수 있다.
이러한 방법은 랄스토니아 피케티 세포들을 함유할 것으로 예상되는 테스트 시료를 본 출원에 전술한 임의의 단백질에 대해 생성된 항체 또는 상기 항체의 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 이들간에 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
사용되는 검출 방법들에는 종래의 면역학적 방법들, 예를 들어, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 등이 포함된다.
적합하게는 항체 또는 결합 단편은 고체 지지체 상에, 예를 들어, ELISA 플레이트 상에 고정되나, 그 외 형태의 지지체, 예를 들어, 가령, 종래의 "딥스틱(dip-stick)" 테스트에서 이용되던 막들 또한 이용될 수 있다.
시료 내 표면층 단백질 및 상기 기재된 결합 모이어티 간의 복합체 검출은 종래의 방법들, 특히 면역학적 방법들, 가령, ELISA 법을 이용하여 검출될 수 있다. 분석 형식은 "샌드위치" 또는 "경쟁적" 유형을 비롯한 다양한 형태들을 취할 수 있다.
전형적인 샌드위치 분석법에서, 결합 모이어티는 지지체, 가령, ELISA 플레이트 상에 고정되며, 여기서 결합 모이어티는 랄스토니아 피케티 세포들을 함유할 것으로 예상되는 상기 테스트 시료와 접촉된다. 존재하는 경우, 이들 세포들은 결합 모이어티에 결합할 것이고 그리하여 순서대로 고정될 것이다. 그 후 지지체는 시료로부터, 예를 들어 세척에 의해 분리된다. 지지체 상에서의 상기 세포들의 존재는 이후 2차 항체 또는 이의 결합 단편들을 적용하여 검출될 수 있고, 이러한 2차 항체 또는 이의 결합 단편들은 세포들에 결합하며, 예를 들어, 이들은 예를 들면, 가시적 표지, 가령, 형광 표지, 또는 방사성표지로 표지되어 있기 때문에 검출 가능하지만, 이들이 가시적 신호를 생성하도록 개발될 수 있는 것이 바람직하다. 2차 항체의 특정 예는, 종래의 ELISA 방법론을 이용하여, 효소 기질을 추가함으로써 신호를 생성하기 위해 차후 이용될 수 있는 효소적 표지, 가령, 홍당무과산화효소를 운반하는 항체, 또는 결합 단편이다.
특정한 경쟁적 분석 형식에서, 본 발명의 결합 모이어티는 지지체 상에 고정된다. 이 예에서, 상기 세포들에 경쟁적으로 상기 결합 모이어티를 결합시키는 단백질은 지지체와 접촉시키기 이전에 시료에 추가된다. 시료 내 존재하는 임의의 세포들은 고정된 결합 모이어티에 대한 결합을 위하여 이러한 단백질과 경쟁할 것이다. 그러므로, 지지체 상의 펩타이드의 부재는 시료 내 세포들의 존재를 나타낸다.
이 경우에, 경쟁 단백질은 예를 들어, 가시적 표지, 가령, 형광 또는 방사성표지를 이용하여 용이하게 검출될 수 있도록 적절하게 표지된다. 대안적으로, 경쟁 단백질은 가령, 샌드위치 분석법과 관련하여 상기 논의한 바와 같이, 이러한 단백질에 결합하는 2차 항체 또는 이의 결합 단편을 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 방법의 또다른 구체예에서, 랄스토니아 피케티의 존재는 상기 피험체의 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재를 결정함으로써 간접적으로 검출된다. 공지된 항원들에 대한 역가 결정 방법들은 해당 기술 분야에 공지이다. 상기 피험체에 의해 유도된 항체를 수집하여 널리 공지된 기술들, 가령, 알콜 분획 및 컬럼 크로마토그래피에 의해, 또는 면역친화 크로마토그래피에 의해 원하는 정도까지 분리할 수 있는데; 즉, 면역친화 크로마토그래피는 Sephadex®와 같은 크로마토그래피 컬럼 패킹에 항원을 결합시키고, 컬럼을 통해 항혈청을 통과시킴으로써 특이적 항체를 보류시키고 다른 면역글로불린 (IgGs) 및 오염물질들을 분리한 다음, 카오트로픽제 (chaotropic agent)로 용리시키고, 선택적으로 후속하여 추가 정제함으로써, 예를 들어, 결합된 혈액 그룹 항원들 또는 다른 비-병원체 종들의 컬럼을 통해 통과시킴으로써 정제된 항체를 회수함에 의한다. 상기 항원들은 분획된 랄스토니아 피케티 세포들 또는 본 출원에 기재된 본 발명의 임의의 면역원성 화합물로부터 온 것일 수 있다. 본 절차는 랄스 토니아 피케티에 대해 발달된 항체 역가를 가지는 피험체들의 혈청 또는 혈장으로부터 원하는 항체를 분리하여, 항원에 결합할 수 있는 항체의 보류를 확보한 경우 바람직할 수 있다.
숙주에서 항체 또는 상기 박테리아를 검출하기 위한 본 발명의 방법들은 면역분석법을 포함할 수 있다. 이러한 면역분석법은 해당 기술 분야에 공지이며, 방사능면역분석법 (RIA), 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 형광 면역분석법, 및 형광 편광 면역분석법 (FPIA)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 박테리아 세포들의 수를 증가시키기 위하여 랄스토니아 피케티 박테리아를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 피험체의 테스트 시료에서 증가된 수준의 랄스토니아 피케티는 피험체가 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH를 앓고 있을 또는 발달시키게 될 가능성이 증가함을 나타낸다. 바람직하게는, 건강한 피험체들로부터 유래한 대조군 시료에 비해 증가된 수준의 랄스토니아 피케티를 보유한 것으로 확인된 환자들은 본 출원에 개시된 임의의 화합물 또는 조성물들을 사용하여 치료될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 질환 중증도의 평가 및 적절한 치료 방법에서 이용될 수도 있다. 랄스토니아 피케티의 (절대 또는 상대)양에 관한 분석이 실시되며 결과는 분석되는 시료의 성질, 및 구하고자 하는 정보에 따라 다양한 방식으로 해석될 수 있다.
테스트 시료에서 랄스토니아 피케티 박테리아의 양은 질환 상태의 중증도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 배설물 시료 내 랄스토니아 피케티 박테리아 부하량이 결정된다. 발명자들은 상기 피험체들의 테스트 시료 내 증가된 랄스토니아 피케티 박테리아 부하가 인슐린 내성의 발달을 잘 예측함을 밝혀냈다.
정량적 측정은 해당 기술 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 방법들에는 다음이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 항체/상동성 교차 반응성이지만 특이적인 시약들, 정량적 중합효소 연쇄 반응, 및 임의의 "샌드위치" 분석법 -항체 및 핵산 기반 모두. 표면 증강 라만 산란 (SERS) 기술을 이용하는 것을 비롯한 직접 항원 측정법 및 측면 유동 면역분석법이 추가로 포함된다.
랄스토니아 피케티 특이적 항체, 핵산, 키트의 용도
또다른 양상에서, 본 발명은 본 출원에 개시된 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH의 진단 또는 예측 방법에서 랄스토니아 피케티의 항원, 랄스토니아 피케티 세포 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 항체, 및/또는 엄격한 조건하에 랄스토니아 피케티로부터의 핵산에 혼성화하는 핵산의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서 본 발명은 본 출원에 개시된 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH의 진단 또는 예측 방법에서 랄스토니아 피케티의 항원, 랄스토니아 피케티 세포 또는 이의 면역원성 부분에 특이적으로 결합하는 상기 항체, 및/또는 엄격한 조건하에 상기 개시된 바와 같은 랄스토니아 피케티로부터의 핵산에 혼성화하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
한 바람직한 구체예에서, 엄격한 조건하에 혼성화하는 상기 핵산은 탐침자 또는 프라이머이다. 프라이머는 바람직하게는 증폭시 최대 효율을 위해 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머의 길이는 온도 및 프라이머의 서열을 비롯한 몇가지 인자들에 따라 달라지지만, 증폭 생성물의 합성을 개시하기에 충분히 길어야 한다. 바람직하게는 프라이머는 10 내지 35개 뉴클레오티드 길이이다. 더욱 바람직하게는, 프라이머는 15 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 가장 바람직하게는, 프라이머는 22 또는 29개 뉴클레오티드 길이이다. 프라이머는 증폭된 생성물의 검출, 고정화 또는 조작을 가능하게 하는 추가 특징들을 추가로 내포할 수 있다. 프라이머는 뿐만 아니라 공유-결합된 형광 염료를 포함할 수 있는데, 이는 프라이머 및 표적 서열 또는 형광 성질을 변화시키기 위한 이중-가닥 DNA/RNA와 상호작용 할 수 있는 비-공유 결합된 형광 염료들로 구성된 하이브리드에 특이적 형광 성질을 부여한다. 사용될 수 있는 형광 염료들에는, 예를 들어, SYBR-그린 또는 에티디움 브로마이드가 있다.
한 구체예에서, 상기 키트는 본 발명에 따른 상기 진단 또는 예측 방법을 수행하는데 필요한 필수 시약들 모두를 포함한다. 상기 키트는 필요한 시약들을 담고 있는 하나 이상의 용기들의 조합과 같은 시판 패키지 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 단클론 또는 다클론 항체를 몇가지 종래의 키트 성분들과 조합하여 포함한다. 상기 키트는 랄스토니아 피케티 박테리아를 대조군 시료로서 추가로 포함할 수 있다. 종래의 키트 성분들은 해당 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 용이하게 자명할 것이며 Antibodies A Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)를 비롯한 수많은 문헌들에 개시되어 있다. 종래의 키트 성분들은 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트, 분석 혼합물의 pH를 유지시키기 위한 완충액 (가령, Tris, HEPES, 등이나 이에 제한되지 않음), 공액된 제 2 항체, 가령, 과산화효소 공액된 항-마우스 IgG (또는 제 1 항체가 유래되었던 동물에 대한 임의의 항-IgG) 등, 및 그 외 표준 시약들과 같은 품목들을 포함할 수 있다.
랄스토니아 피케티 이외의 다른 랄스토니아 종들, 특히 랄스토니아 만니톨릴라이티카 (Ralstonia mannitolilytica) 및 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 종들 또한 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, NAFLD 또는 NASH의 원인이 될 수 있는 것으로 생각된다. 그러므로 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 본 출원에서 "랄스토니아 피케티 "가 언급되는 경우, 이 용어는 발명의 양상들에서 그 외 랄스토니아 종 또한, 그리고 특히 랄스토니아 만니톨릴라이티카 및 랄스토니아 유트로파도 언급하는 것으로 이해될 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로 다른 랄스토니아 종에 대하여 효과적인 화합물 또는 조성물, 피험체의 테스트 시료에서 랄스토니아 피케티의 존재 또는 다른 종의 랄스토니아에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 피험체에서 인슐린 내성, 비만 또는 제2형 당뇨병의 진단 또는 예측 방법, 그리고 다른 랄스토니아 종들의 검출을 위한 화합물의 용도 또는 키트 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 추가 목적, 이점, 및 신규한 특징들은 하기 실시예들의 시험시 해당 분야의 통상의 지식을 가진 기술자에게 자명해질 것이며, 이러한 실시예는 제한하고자 하는 것이 아니다. 또한, 상기 본 출원에 설명된 그리고 하기 청구범위에 기재된 본 발명의 다양한 구체예들 및 양태들 각각은 하기 실시예에 의해 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
참가자
담당 외과의에 의해 백인 피험체 (남성/폐경후 여성, 선택적 복강경 담낭절제술 예정)들이 선별되었다. 포함 기준은 18-75세의 연령 및 25-40 kg/m2의 체질량 지수 (BMI)였다. 제외 기준은 지난 3개월간 프로바이오틱스 및/또는 항생제의 사용 및 T2D로 공지된 악성, 전신 염증이었다. 모든 피험체로부터 사전 서면 동의를 받았다. 연구는 AMC 윤리 위원회로부터 승인받았으며 Flevo 병원 (Almere), Sint Lucas Andreas 병원 (Amsterdam) 및 Academic Medical Center (Amsterdam)에서 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 참가자는 그 자신의 식사를 계속할 수 있었으나, 열량 섭취를 모니터하기 위해 1주간 온라인 영양 섭취 일기(www.dieetinzicht.nl)를 작성하도록 하였다. 수술 전, 대사 매개변수들 중 공복 혈장 수준에 관한 인체측정 및 혈액 샘플링을 실시하였다. 총 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDLc), 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDLc) 및 중성지방 (TG)을 시판 구입 가능한 효소 분석법 (Randox, USA 및 Wako, USA)을 이용하여 측정하였다. 모든 분석은 Cobas Mira 자동분석장치 (Horiba, 프랑스)를 사용하여 실시되었다. C-반응성 단백질 (CRP, Roche Diagnostics) 및 총 아디포넥틴 (Linco사의 RIA 및 Abcam사의 DIWA 연구 ELISA)이 결정되었다. 항상성 모델 평가 (HOMA-IR)를 사용하여 인슐린 내성을 계산하였다 (표 1 참조). 마지막으로, 이른 아침 대변(stool) 시료를 DNA가 추출될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 멸균 복강경 외과수술 과정 동안 장간막-내장 (횡행 결장), 망(omental) (우상측 사분역 복부) 및 피하 지방 (하부검상 복강경 입구) 조직검사는 모든 환자들의 동일한 위치에서 이루어졌으며, 차후 분석을 위해 멸균 RNase-, DNase- 및 발열원 없는 미세관 (Eppendorf)에 곧바로 수집되고, 즉시 액체 질소에서 동결되었으며 -80℃ 냉동고로 옮겨졌다. 배설물 DNA를 표준 방법들 (8)을 사용하여 추출하였다.
DIWA 연구에 있어, 다른 문헌에 기재된 바와 같이(8) 70세 연령의 여성들이 제2형 당뇨병 (T2D), 내당능 장애 (IGT) 또는 정상 내당능 (NGT)을 가졌을 경우 포함되었다. 제외 기준은 만성 염증성 질환 및 이전 3개월 동안 항생제 치료였다. 모든 피험체들은 사전 동의를 제공하였으며 이른 아침 대변(stool) 시료를 제공하였다.
표 1. 연구 피험체의 기준 특성


(N=12)
남성/여성 7/5
연령 (세) 41 (35-46)
체질량 지수 (kg/m2) 26.0 (23-37)
항상성 모델 평가 4.7 (2.4-9.0)
콜레스테롤 (mmol/리터) 5.1 (4.5-5.5)
HDLc 1.2 (0.9-1.5)
LDLc 3.2 (2.5-3.5)
TG 1.6 (1.0-7.4)
CRP (mg/L) 2.6 (1.0-7.4)
열량 섭취 (kcal/일) 1815 (1585-3190)
데이터는 평균(범위)로 제공된다
박테리아 DNA 분리 및 시퀀싱
원핵생물 및 진핵생물 두가지 유래의 유전체 DNA를 Zoetendal et al. (16)에 따라 내장 지방 조직으로부터 분리하였다. 간단하게는, 조직들을 먼저 SDS와 단백질분해효소 K의 혼합물로 55℃에서 처리하고 FAST 프렙-24 (MP Biomedical)에서 페놀 및 지르코니아 유리 비드 (1mm)의 존재하에서 기계적으로 파괴하여 균질화시켰다. 방출된 유전체 DNA는 수많은 페놀/클로로포름 추출물로 추가 추출되었으며 무수 에탄올의 존재하에 침강되었다. 원핵생물 분획을 다양한 16S rRNA 유전자 특이적 프라이머 및 분석법들을 사용하여 연구하였다. 극미량의 박테리아 유전체 DNA로부터, 전장16S rDNA 앰플리콘이 Rajilic- Stojanovic et al (17)에 기재된 PCR 조건들을 사용하여 프라이머 Bact-27F (5'GTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 Prok-1392R (5'GCCCGGGAACGTATTCACCG-3')을 사용하여 PCR에서 생성되었다. 생성된 앰플리콘은 프라이머 968-GC-F (5'CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGG- GCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC) 및 1392R (18)을 사용하는 네스티드 PCR에 있어 입력값으로 사용되었으며, 생성된 단편들은 Heilig et al. (19)에 의해 기재된 조건들을 사용하는 DGGE (변성 유전자 겔 전기영동)에 의한 다양성 분석에 적합하였다. DGGE 분석에서 나타나는 우세 밴드는 제조업자들의 지시사항에 따라 pGEM-T easy 벡터 (Promega, Leiden, 네덜란드)에서 DGGE 앰플리콘을 클로닝하고 이들을 Stratagene E. coli XL-1 Blue 경쟁적 세포들에 대해 형질변환시킴으로써 확인되었다 (Agilent Technologies, Amstelveen, 네덜란드). 정확한 크기의 인서트를 함유하며 DGGE 겔에서 우세 밴드와 동일한 위치로 이동하는 클론들을 Sanger 서열 분석 (GATC Biotech, Konstanz, 독일)하였다. BLAST 검색을 실시하여 서열들을 확인하였다 DGGE에서 나타나는 우세 밴드의 서열 분석은 랄스토니아 종들의 서열과 가장 높은 유사성을 보였다. 총 박테리아 분획 내 랄스토니아 -유사 박테리아를 추정하기 위하여, 앞서 생성된 16S rDNA 앰플리콘에 대한 2번의 네스티드 정량 PCR 분석이 실시되었다. 4개의 상이한 박테리아 하위그룹들로 구성된 부르크홀데리아목(Burkholderiales) 그룹의 구성원인 랄스토니아가 검출되었다(20).
상기 언급한 피험체들 및 DIWA 연구 (8)로부터의 피험체들 모두에서 얻은 배설물 시료 내에서 랄스토니아 종을 정량하고, 전체 박테리아 qPCR을 실시하였다 (21). 배설물 랄스토니아-특이적 검출에 사용된 프라이머들은 다음과 같았다: 랄스토니아 피케티 : 전방향: ATGATCTAGCTTGCTAGATTGAT 역방향: ACTGATCGTCGCCTTGGTG. 랄스토니아 만니톨릴라이티카 : 전방향 GGGAAAGCTTGCTTTCCTGCC 역방향: TCCGGGTATTAACCAGAGCCAT. 랄스토니아 인시디오사 ( Ralstonia insidiosa ): 전방향 ATGATCTAGCTTGCTAGATTGAT 역방향 CACACCTAATATTAGTAAGTGCG. 랄스토니아 유트로파 : 전방향 ACCCCGGGGTCGATGACGGTA 역방향 GCCTTGCAGTCACAAGCGCC) (22).
DIO 마우스에서 랄스토니아 피케티 접종 실험
인과성을 증명하고 오염 가능성을 배제시키기 위하여, 우리는 식이 유도 비만 (DIO)을 유도하기 위해 60% 고 지방 식이 (Harlan Tek)를 제공한 4주령의 수컷 C56BL6/J 마우스에서 접종 연구를 실시하였다. 마우스들은 제어된 온도 및 습도로 일정한 12-시간 명암 주기하에 있었으며 식사 (고 지방 식이) 및 물에 수시로 접근이 허용되었다. 체중 및 섭식을 주 1회 측정하였다. 12주령에서 시작하여, 4주간 열 불활성화 랄스토니아 피케티 (DSM 6297)의 제 1 대조군 그리고 10% 글리세롤 운반체의 제 2 대조군 (각 그룹 당 n=10마리 마우스)에 대조하여 100 μl 글리세롤 운반체 (20mM)에서의 106 CFU 랄스토니아 피케티 (DSM 6297)를 매일 위장관 급식시켰다. 17주에, 경구 포도당 부하 테스트 (2g 포도당/kg 체중)를 실시한 후 2시간 동안 매 30분마다 혈액 샘플링하였다. 혈액을 t=0, 10, 20, 30, 60, 90, 및 120분에 꼬리 출혈을 통해 수집하였다. 동물들을 소듐 펜토바르비탈 및 경부 탈구에 의해 희생시켰다. 포도당/인슐린 수준을 비롯한 차후 분석을 위해 심장 천자하여 혈장을 수집하였다. HOMA-IR은 [공복 혈장 인슐린 (μU/mL) * 공복 혈당 (mmol/L)] /22.5로 정의되었다. 랄스토니아 농도에 관한 차후 분석(22)을 위해 맹장 및 결장으로부터 배설물을 수집하였다. 또한, TLR 유전자 발현을 비롯한 차후 분석을 위해 내장 장간막 (small intestine), 신장 및 정소상체 지방 조직의 지방 조직 표본을 수집하고, 계량하고, 액체 질소에서 스냅 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다.
랄스토니아 피케티 백신의 제조
랄스토니아 피케티 세포들을 5000rpm에서 10분간 원심분리하였다 (Eppendorf 5415R). 후속하여, 박테리아를 함유하는 펠릿을 10x 펠릿 부피인 PBS의 시료 부피에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포들을 최대 설정의 Branson Sonic Power Company B12 음파처리기를 이용하여 30초간 5회 음파처리하였다. 음파처리 단계들 사이에, 시료들을 0 ℃에서 냉각시켰다. 음파처리 후, 무손상 박테리아 세포들을 4 ℃에서 5분간 1000g으로 원심분리하여 제거하였다 (Eppendorf 5415R). 생성된 R. 피케티 추출물을 프로인드 불완전 보강제 (피하/복강내 용도) 또는 3% NaHCO3 완충액 (경구 용도)에 용해시켰다.
항체 치료 및 백신접종을 이용한 가역성 실험
10주령에서 시작하여 항-랄스토니아 항체 (Thermo Fisher사에 의해 상업적으로 제조되는 토끼 다클론 항체)를 주 1회 6주간 피하 또는 복강내 (10 μg/kg) 주사한 후, 12주에 랄스토니아 피케티를 매일 위관 급식시켰다. 또한, 또다른 그룹의 마우스를 불완전 프로인드 보강제에서의 200 μg 109 CFU의 음파처리된 R. 피케티 추출물을 포함하는 랄스토니아 백신으로 10-11주령에 주 1회 복강내 접종하여 치료하거나 또는 300 μl 3 % 소듐 하이드로젠 카보네이트 완충액에서의 200 μg 109 CFU R. 피케티 추출물을 10주 및 11주령에 위장관내 투여한 후 12주에 매일 랄스토니아 피케티를 위관 급식시켰다 (23). 17주에 경구 포도당 부하 테스트를 반복하고 동물들을 희생시켰다. 모든 실험들은 기관 동물 실험 윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)로부터 승인받았다.
결과
인간 내장 지방 조직에서 박테리아 DNA 분리
내장 (장간막), 망 및 피하 지방 조직 표본 (멸균조건하에 수득)으로부터 cDNA를 분리하였다. 박테리아 DNA는 DGGE를 사용하여 오직 내장 (장간막), 및 망 표본들에서만 검출되었다. 클로닝 및 후속 Sanger 시퀀싱 시 우리는 7가지 관련 박테리아를 확인하였는데, 그 중 그람-음성 랄스토니아 종들은 내장-장간막 지방 조직에 흔한 박테리아 종들인 것으로 밝혀졌다 (도 1). 그람-양성 악티노박테리아에 속하는 16S DNA 이외에도, 또한 다른 두 가지 그람-양성 박테리아 속, 스타필로코 쿠스 및 스트렙토코쿠스가 발견되었던 반면, 6가지 그람-음성 박테리아 분류군들의 16S DNA가 검출되었으며 (랄스토니아, 메틸로박테리아, 루브리비박스 뿐만 아니라 스핑고모나다세아, 리켓시알레스 및 악티노박테리아 속 포함), 랄스토니아는 가장 풍부한 그람-음성균이었다. 랄스토니아는 병원체로서 인간 장에 살고 있는 것으로 공지된 편모-보유 그람-음성 조건적 (무)산소성 간균 (프로테오박테리아 문에 속함)이다 (22). 그리하여 우리는 인간 질환과 연관된 4가지 공지된 랄스토니아 균주들 (R. 인시디오사, R. 유트로파, R. 피케티 및 R. 만니톨릴라이티카)에 대하여 배설물 qPCR을 실시하였다 (22). 흥미롭게도, 우리는 이들 12마리 피험체의 배설물에서 R 피케티 및 R. 만니톨릴라이티카의 신호만을 검출하였다. 장간막 지방 조직에서 과다 랄스토니아 종만이 HOMA-IR (r=0.7, p<0.05)과 강하게 상관관계를 가지고 있었으며 지방 조직 염증의 중요한 표지자인 혈장 아디포넥틴 수준과 역관계 (r=-0.6, p<0.05)를 보여주었다 (도 1B 및 1C). 배설물 R. 피케티 농도와 내장 지방 조직 랄스토니아 함량 간에 현저한 상관관계가 발견되었는데 (r =0.7, P<0.05; 도 1D) 이는 랄스토니아 피케티가 장간막 내장 지방 조직에 존재하는 가장 풍부한 장 랄스토니아 종들임을 강조하는 것이다.
배설물 랄스토니아 피케티 및 인슐린 내성 발달 간의 연관성
인슐린 내성 및 DM2의 발달과 배설물 랄스토니아 피케티의 연관성을 연구하기 위하여, 우리는 앞서 기재했던 스웨덴 DIWA 코호트를 사용하여 랄스토니아 종들과 인슐린 내성 발달 간의 상관관계를 연구하였다 (8). 우리는 오직 랄스토니아 피케티만이 배설물에서 검출될 수 있었으며; 대조군들 (정상 내당능 (NGT); n=42)에 비해 공복 혈당 장애 (내당능 장애 (IGT); n=45) 및 명시적인 DM2 (제2형 당뇨병 (T2D); n=47)가 발달한 비만 피험체들에서 랄스토니아 피케티 수준이 상당히 증가되었음을 발견하였다 (도 2A 참조). 더욱이, 우리는 인슐린 내성 수준 범위를 가지는 피험체들에서, 혈장 아디포넥틴은 또한 배설물 랄스토니아 피케티 수준에 대해 역의 관계에 있었음을 발견하였다 (도 2B 참조).
인슐린 내성에 있어서 랄스토니아 피케티의 원인 역할
비만과 인슐린 내성의 발달에 있어서 잠재적인 인과성을 검토하고 R. 피케티에 대한 사전-백신접종의 효과를 연구하기 위하여, 우리는 DIO 마우스에 4주간 R. 피케티 를 매일 위관 급식시켰다. 매일의 위관 급식은 글리세롤 및 열-불활성화 대조군에 비해 배설물 및 장간막 지방 조직의 R. 피케티 DNA 수준을 현저히 증가시켰다 (도 3A 및 B 참조). 더욱이, 사전-백신접종은 매일 접종시 총 박테리아 부하 및 장의 R. 피케티를 현저히 증가시켰으나, 장간막 지방 조직의 R. 피케티는 전혀 증가하지 않았는데 이는 감소된 박테리아 전위로 나타난다. 체중 및 매일의 섭식은 R. 피케티 처리된 DIO 마우스에서 현저히 증가되었던 반면, 사전-백신접종은 이러한 대사 이상을 완전히 제거하였다 (도 3C 및 D). 살아있는 R. 피케티는 열-불활성화 R. 피케티 또는 글리세롤로 처리된 DIO 마우스에 비해 DIO 마우스에서의 내당능을 상당히 손상시켰다. 유사하게, R. 피케티 추출물로의 사전-백신접종은 R. 피케티-유도 포도당 불내성을 완전히 제거하였다 (도 3E 및 F). 마지막으로, 선천적 면역계 활성화의 표지자로서, 우리는 장간막 지방 조직에서의 톨-유사 수용체(Toll-like receptors) (Tlr)의 유전자 발현 수준에 대한 R. 피케티 투여 효과를 연구하였다. TLR은 박테리아 세포벽 성분들과 상호작용하는 패턴 인식 수용체 (PPRs)로, 후속적으로 염증 반응을 유도할 수 있다. Tlr5 발현은 열-불활성화 R. 피케티 또는 글리세롤-처리 대조군들에 비해 살아있는 R. 피케티로 처리된 마우스의 장간막 지방 조직에서 상당히 상향조절 되었다. 또한, R. 피케티 사전-백신접종은 Tin 장간막 내장 지방 조직에서 lr4 및 Tlr5 발현을 감소시켰다.
마지막으로, 가역성을 연구하기 위하여, 우리는 DIO 마우스에서 선천성 면역계의 수동 (랄스토니아 항체 IP) 부스팅을 실시하였으며 인슐린 내성에 대한 효과를 조사하였다. 장 랄스토니아 피케티에 대한 면역부스팅은 DIO 마우스에서 인슐린 내성 수준 그리고 후속적으로 내장-장간막 지방 조직 염증 수준에 상당히 영향을 주었다 (도 4).
결론적으로, 상기 번역 연구는 인간 장간막 내장 지방 조직에서 가장 우세한 종으로 그람-음성 랄스토니아 종들이 확인됨을 나타낸다. 더욱이, 비만 피험체들의 배설물에서 증가된 랄스토니아 박테리아 부하는 비만 피험체들의 좋은 표현형(well phenotyped)의 코호트에서 인슐린 내성 발달을 예상하게 하였다. 마지막으로, 랄스 토니아 감염은 인슐린 내성을 유도했던 반면, 랄스토니아에 대한 다클론 항체 및 백신접종 모두로의 처리는 이러한 표현형을 역전시켰다.
NAFLD/NASH에 관여하는 간 유전자에 대한 R. 피케티의 효과
우리는 후속하여 NAFLD/NASH 발달에 관여하는 간 유전자들이 랄스토니아 피케티 백신접종시 변형되었는지 여부를 연구하였다. 그러므로 우리는 아세틸 CoA (ACC), 지방산 합성효소 (FASN, 아세틸-CoA로부터 장쇄 포화 지방산 합성에 관여하는 유전자, Figarola JL PLoS One. 2013; 8(12): e83801 참조) 및 MRP2 (NAFLD/NASH의 발달에 관여하는 유전자, Sookoian S Nutr Biochem. 2009 Oct; 20(10): 765-70 참조)를 비롯한 간 지방 대사에 관여하는 유전자들의 발현을 분석하였다. 세가지 유전자들 모두 간 중성지방 (지방)의 중요한 조절인자들이며 NAFLD/NASH의 발달과 연관된다. 매일 4주간의 활성 랄스토니아 피케티 급식 처리는 DIO 마우스의 간 조직에서 아세틸 CoA (ACC), 지방산 합성효소 (FASN) 및 ATP 결합 카세트 단백질 C2 (MRP2)의 발현을 상당히 증가시켰음이 밝혀졌다. 역으로, 랄스토니아 피케티 복강내 백신접종으로 사전처리된 DIO 마우스는 또한 글리세롤 또는 열 불활성화 대조군 매일 급식 처리 그룹에서 나타나는 바와 같이 이들 유전자들의 발현을 정상화시켰다 (도 5 참조).
R. 피케티 백신접종은 DIO 마우스에서 포도당 대사, 내장 지방 조직 염증 및 NAFLD/NASH에 대하여 유익한 효과를 가지는 것으로 결론 내릴 수 있다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Academisch Medisch Centrum Wageningen Universiteit <120> Treatment of insulin resistance <130> INV-00414WO <160> 13 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..23 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="16S forward primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 1 atgatctagc ttgctagatt gat 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..19 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="16S reverse primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 2 actgatcgtc gccttggtg 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..17 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="universal primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 3 gtttgatcct ggctcag 17 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..20 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="universal primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 4 gcccgggaac gtattcaccg 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..30 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="forward nested primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 5 cgcccggggc gcgccccggg cggggcgggg 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..27 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="reverse nested primer" /organism="Artificial Sequence" <400> 6 gcacgggggg aacgcgaaga accttac 27 <210> 7 <211> 1639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..1639 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="N234_18635 16S ribosomal RNA" /organism="Artificial Sequence" <400> 7 ccgataagtg tgaacgctag gcttgagaca caagcctctg gaaaggaggt gatccagccg 60 caccttccga tacggctacc ttgttacgac ttcaccccag tcatgaaccc tgccgtggta 120 atcgccctcc ttgcggttag gctaactact tctggcaaaa cccactccca tggtgtgacg 180 ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 240 cgattccagc ttcacgtagt cgagttgcag actacgatcc ggactacgat gcgttttctg 300 ggattagctc cccctcgcgg gttggcaacc ctctgtacgc accattgtat gacgtgtgaa 360 gccctaccca taagggccat gaggacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 420 cggcagtctc tctagagtgc tcttgcgtag caactaaaga caagggttgc gctcgttgcg 480 ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac ctgtgtccac 540 tttccctttc gggcacctaa tgcatctctg cttcgttagt ggcatgtcaa gggtaggtaa 600 ggtttttcgc gttgcatcga attaatccac atcatccacc gcttgtgcgg gtccccgtca 660 attcctttga gttttaatct tgcgaccgta ctccccaggc ggtcaacttc acgcgttagc 720 tacgttactg aagaaatgaa tccccaacaa ctagttgaca tcgtttaggg cgtggactac 780 cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgtgca tgagcgtcag tgacgtccca 840 gggggctgcc ttcgccatcg gtattcctcc acatctctac gcatttcact gctacacgtg 900 gaattctacc cccctctgac atactctagc cttgcagtca caagcgccat tcccaagtta 960 agctcgggga tttcacgcct gtcttacaaa accgcctgcg cacgctttac gcccagtaat 1020 tccgattaac gctcgcaccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccggtgc 1080 ttattcttcc ggtaccgtca tcgacccggg gtattatccc aggccatttc tttccggaca 1140 aaagtgcttt acaacccgaa ggccttcttc acacacgcgg cattgctgga tcagggttgc 1200 ccccattgtc caaaattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc 1260 ccagtgtggc tgatcgtcct ctcagaccag ctactgatcg tcgccttggt aggctcttac 1320 cccaccaact agctaatcag acatcggccg ctcctgtagc gcgaggcctt gcggtccccc 1380 gctttcaccc tcaggtcgta tgcggtatta gctaatcttt cgactagtta tcccccacta 1440 cagggcacgt tccgatgtat tactcacccg ttcgccactc gccaccaggc cgaagcccgt 1500 gctgccgttc gacttgcatg tgtaaggcat gccgccagcg ttcaatctga gccaggatca 1560 aactcttcag ttcaatctct gtgtggaccc tcgcgggtcc tcgctctttc gagcggtcgc 1620 tcactctcag aaaactgac 1639 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="forward primer Ralstonia mannolitytica" /organism="Artificial Sequence" <400> 8 gggaaagctt gctttcctgc c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="reverse primer Ralstonia mannolitytica" /organism="Artificial Sequence" <400> 9 tccgggtatt aaccagagcc at 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..23 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Forward primer Ralstonia insidiosa" /organism="Artificial Sequence" <400> 10 atgatctagc ttgctagatt gat 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..23 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="reverse primer Ralstonia insidiosa" /organism="Artificial Sequence" <400> 11 cacacctaat attagtaagt gcg 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Forward primer Ralstonia eutropha" /organism="Artificial Sequence" <400> 12 accccggggt cgatgacggt a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..20 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="reverse primer Ralstonia eutropha" /organism="Artificial Sequence" <400> 13 gccttgcagt cacaagcgcc 20

Claims (17)

  1. 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 랄스토니아 피케티에 대해 효과적인 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서, 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 화합물:
    a) 피험체에서 랄스토니아 피케티 감염에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는, 랄스토니아 피케티로부터 유래된 항원,
    a) 동물에서 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 항체
    b) 랄스토니아 피케티에 대하여 효과적인 항생제, 그리고
    c) 랄스토니아 피케티에 특이적인 박테리오파지.
  3. 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 청구항 1 또는 청구항 2에 정의된 랄스토니아 피케티에 효과적인 화합물 및 제약상 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  4. 피험체에서 면역 반응을 생성할 수 있는 살아있는, 불활성화된, 또는 약독화된 랄스토니아 피케티 박테리아, 또는 이의 단편, 및 제약상- 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함하는, 동물의 치료에 적합한 백신 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 단편은 외막 단편, 외막 소포, 외막 단백질 또는 이의 용해성 변이체, 또는 랄스토니아 피케티 다당류, 가령, 협막 다당류 및 지질다당류로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서, 약제로 사용함을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  7. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서, 피험체의 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 치료 또는 예방에 사용함을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  8. 다음 단계들을 포함하는, 피험체에서 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로부터 선택된 질환 또는 병태의 시험관내 진단 또는 예측 방법:
    a) 상기 피험체로부터 유래된 테스트 시료 내 랄스토니아 피케티 수준을 결정하는 단계,
    b) 상기 테스트 시료 내 랄스토니아 피케티 수준을 대조군 시료에서의 랄 스토니아 피케티 수준 또는 기준값과 비교하는 단계, 및
    c) 상기 비교에 기초하여 상기 질환을 진단 또는 예측하는 단계.
  9. 다음 단계들을 포함하는, 피험체에서 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로부터 선택된 질환 또는 병태의 시험관내 진단 또는 예측 방법:
    a) 상기 피험체로부터 유래된 테스트 시료 내 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 항체 수준을 결정하는 단계,
    b) 상기 테스트 시료 내 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 상기 항체 수준을 대조군 시료에서의 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 상기 항체 수준 또는 기준값과 비교하는 단계, 및
    c) 상기 비교에 기초하여 상기 질환을 진단 또는 예측하는 단계.
  10. 청구항 8 또는 청구항 9에 있어서, 상기 피험체는 내장 지방 염증을 앓고 있음을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 테스트 시료는 지방 세포들, 바람직하게는 내장 지방(adipose fat)을 포함하는 시료 또는 배설물 시료로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 테스트 시료는 혈액 시료임을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 8-11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 시료 내 랄스토니아 피케티의 핵산 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 핵산은 16S rRNA임을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 대조군 시료에 비해 증가된 상기 테스트 시료 내 R . 피케티 수준은 상기 피험체에서 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)에서 선택된 질환 또는 병태의 진단 또는 예측을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 대조군 시료에 비해 증가된 상기 테스트 시료 내 상기 랄스토니아 피케티를 중성화시킬 수 있는 항체 수준은 상기 피험체에서 인슐린 내성, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)에서 선택된 질환 또는 병태의 진단 또는 예측을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  16. 동물에서 랄스토니아 피케티 , 랄스토니아 피케티 세포 또는 이의 일부를 중성화시킬 수 있는 항체, 및/또는 엄격한 조건하에 랄스토니아 피케티로부터의 핵산에 혼성화하는 핵산으로 구성된 그룹에서 선택된 화합물의, 청구항 8의 방법에서의 용도.
  17. 청구항 16에 정의된 최소한 하나의 화합물을 포함하고, 선택적으로 또다른 시약 또는 종래의 키트 성분을 포함하는 키트의, 청구항 8-15 중 어느 한 항의 방법에서의 용도.
KR1020177004574A 2014-08-28 2015-08-28 인슐린 내성의 치료에 사용하기 위한 랄스토니아 피케티에 대한 화합물, 및 인슐린 내성의 진단 방법 KR20170043538A (ko)

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