KR20170031428A

KR20170031428A - 치주질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170031428A
Application number: KR1020150128930A
Authority: KR
Inventors: 정용환; 이경후; 황은정; 함영민; 윤원종
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2017-03-21
Also published as: KR101733436B1

Abstract

본 발명은 치주질환 유발균의 생장을 억제하고, 치주조직 세포외기질을 파괴하는 MMP의 발현을 저해하며 조골세포의 골재생을 촉진하는 활성을 지닌 초피나무 에탄올 추출물을 이용한 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 개시한다.

Description

치주질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating periodontal disease}

본 발명은 초피나무(Zanthoxylum piperitum) 추출물을 이용한 치주질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

국민의 생활수준 향상과 의료기술 발달로 평균수명이 연장되면서 고령인구의 삶의 질을 높이기 위한 구강건강 관리의 중요성이 커지고 있다. 구강건강이 문제가 되어 발생할 수 있는 대표적인 질환으로 치아우식증과 치주질환이 있는데 특히 치주질환은 치은출혈과 종창, 치주낭의 형성, 부착치은의 상실, 치조골의 파괴 및 구취와 같은 다양한 임상적인 증상을 나타내며, 치아상실의 주된 원인이 되고 있다(Ali RW et al., J. Clin. Periodontol. 1997 24:830-835; Socransky SS et al., J. Clin.Periodontol. 1998 15;440-444). 치주질환은 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉠 수 있는데 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 치은출혈 등 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈(치조골) 주변까지 진행되어 치조골의 흡수 등이 일어나는 경우에는 치주염이라 한다(petersen and Ogawa, J Periodontol. 2005 76;2187-2193).

치주질환은 감염성 원인인 가장 일반적인 만성 질환 중 하나로, 진단 상태에 따르기는 하지만 10~60%의 성인이 갖고 있는 것으로 알려졌다(Xiong X et al., BJOG. 2006 113;135-143; Papapanou PN. Ann Periodontol. 1996 1:1-36; Albandar JM and Rams TE, Periodontol. 2002;29, 7-10). 치주질환은 구강 내 치태라는 생물막(biofilm)에 공존하는 미생물들과 염증작용을 유발하는 미생물 분비물들에 의해 발생하는 특이한 염증성 질환이며(Feng Z and Weinberg A, Periodontol. 2006, 40;50-76.) 미흡한 구강관리, 흡연, 고령화 등에 의해 촉발된다(Burt, J Periodontol. 2005 76;1406-1419). 최근 치주질환이 전신질환인 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸중, 당뇨병, 그리고 임신합병증의 발생과 연관성이 높다는 연구 결과가 알려졌으며(Desvarieux, M. et al., Circulation, 2005 111;576-582; Offenbacher S et al., J. Periodontol. 1996 67;1103-1113; Garcia RI et al., Periodontol. 2001 25;21-36; Champagne CM. et al., J. Int. Acad. Periodontol., 2000 2;9-13; Paquette DW., J. Int. Acad. Periodontol., 2002 4;101-119) 이에 따라 이미 발생한 치주질환의 치료뿐만 아니라 치주질환이 발생하기 전에 예방하기 위한 구강건강 관리의 중요성이 더욱 커지고 있다.

구강 내에는 350여 종이 넘는 미생물이 서식하는데 이중 치주질환의 진행에 관여하는 세균은 보통 5% 미만이다. 산소 접촉이 적고, 다량의 죽은 상피세포, 타액 단백질 및 음식물 찌꺼기 등이 존재하는 구강 내부는 특정 미생물이 서식할 수 있는 환경을 제공하며 이러한 미생물들이 질병을 일으키는 원인이 된다. 치주질환의 주요 원인균으로 치은을 중심으로 그 하방에 존재하는 치은연하치태(subgingival plaque)에 존재하는 미생물 중 소위 “red complex”라고 명명되는 군에 속한 Porphyromonas gingivalis , Tannerella forsythia , Treponema denticola와 Prevotella intermedia 등이 알려져 있다. 또한 초기에 형성된 치태가 병을 유발할 수 있는 다종의 미생물로 구성되는 후기 치태로 발전하는 과정에서 중요한 역할을 하는 세균으로는 Fusobacterium nucleatum 등이 알려져 있다(Loomer PM et al., Periodontol 2000. 2004;34:49-56). 이러한 미생물들은 숙주조직과 세포에 부착 또는 침투하는 과정에서 대사산물 또는 세포벽 구성성분인 리포폴리사커라이드(Lipopolysaccharide), nuclease, leukotoxin, 황화수소 등의 독소를 내어 주변 치주조직에 염증 반응을 일으킨다. 이때 숙주 세포에서 생산되는 사이토카인(cytokine), 그리고 사이토카인에 반응하여 생산된 면역계 물질이 치주조직을 더욱 파괴하게 된다(Noda D et al. J Periodontal Res. 2007 42(6): 566-571;Dong Chen et al.,2008 Pharmacology 82(4): 264-269). 치주세포에서 염증 반응이 유도되면 비활성형의 콜라게나제(collagenase)를 비롯한 매트릭스 메탈로프로테나제(matrix metalloproteinase, MMPs)의 활성이 높아지거나 이들의 분비가 자극된다. 메트릭스 매탈로프로테나제는 다형핵백혈구, 대식세포, 치은섬유아세포, 골세포와 같은 다양한 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존 펩티다제로 중성의 pH에서 작용하며, 기질로서는 다양한 세포외기질을 이용하는데 콜라게나제 등의 메트릭스 매탈로프로테나제는 치주조직의 기질인 콜라겐(collagen) 등을 분해하여 국소적인 조직파괴를 일으키며 잇몸 퇴축을 유발한다(Jeng AY et al., Bioorg Med Chem Lett 1998 8: 897.; Emingil G et al., J Clin Periodontol 2008 35(3): 221-229). 이와 같은 진행에 따라 결합조직의 부착상실 및 치조골 상실은 치아 상실로 이어지게 된다.

치주질환은 특정 세균의 작용, 숙주의 염증반응, MMP 작용 및 골 소실 등 여러 반응들이 만성화되며 나타난다. 치주질환 치료를 위하여 일반 소염제 또는 항균제를 지속적인 복용할 경우에 소화기장애, 과민반응, 신장독성, 구강내 독성, 치아변색 등 여러 부작용이 나타날 수 있기 때문에 치주질환에 특이적인 활성을 지니며 안전성이 높은 천연물질을 탐색하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 초피나무 추출물을 이용한 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예와 실험예에서 확인되는 바와 같이, 초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 치주질환 유발균과 치아우식균에 대한 초피나무 추출물의 항균 효과 확인 실험을 수행하였으며 본 발명의 추출물이 치주질환 유발균 특이적인 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 치주질환이 진행됨에 따라 치주질환 유발균에 의해 염증반응이 일어나게 되며, 염증반응에 의하여 유도될 수 있는 여러 단백질 중 MMP의 발현 또는 활성이 증가하여 치주조직 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 파괴하게 되는데, 본 발명의 초피나무 추출물은 치은섬유모세포인 HGF-1 세포에서 MMP의 발현을 감소시켰으며 MMP의 활성을 조절하는 TIMP1의 발현은 증가시켰다. 또한 초피나무 추출물은 조골세포의 골생성 관련 유전자의 발현을 조절하여 골재생 촉진 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 조성물은 치주질환을 일으키는 특정 미생물에 대한 항균 효과를 지니며 치주조직에 영향을 끼치는 MMP의 발현을 저해하고 골재생 촉진 활성을 지니고 있어, 치주질환 예방 또는 치료용 조성물로 제공될 수 있다.

전술한 바를 고려할 때 본 발명은 일 측면에서 초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물로 파악할 수 있고 다른 측면에 있어서는 초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 대한 항균용 조성물로 파악할 수 있다.

초피나무(Zanthoxylum piperitum)는 운향과 낙엽관목으로 잎은 어긋나고 우상복엽이며 꽃은 주로 5~6월에 핀다. 한국, 일본, 중국에 분포하며 어린 잎은 식용, 열매를 약용 또는 향미료로 사용되며 열매의 껍질은 향신료로 쓰인다. 예로부터 초피나무 열매는 양기를 돕고 소화를 도우며 탈항을 방지하고 설사를 멈추는 등의 효과가 있어 해열, 해독, 구충, 진통 및 건위 약으로 많이 쓰여왔다. 열매 껍질은 두통이나 불면증에도 효과가 있다고 알려졌으며 잎은 식품 조리시에 어독 해독제로 사용되었다. 초피나무는 주로 정유성분에 대한 연구가 활발하게 진행되었으며 항암, 항산화, 항혈전, 항염증 효능 연구 결과가 알려져 있다(Aihara T. Yakugaku Zasshi 1950 70:409-411; Kim KK et al., J Life Sci 2007 17:1121-1128; Jang MJ et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 35:21-27).

상기 초피나무는 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매 및/또는 종자를 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잎 부위를 사용할 수 있다.

본 명세서에서 "추출물"은 추출 방법을 불문하고 추출대상인 초피나무를 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), 아세톤, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 1,3-부틸렌클리콜, 헥산, 디에틸에테르 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 얻어진 그 추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 영매로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 추출 방법을 불문하므로, 추출 대상을 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 상기 추출물은 바람직하게는 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 것으로서, 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미이다. 또한 더욱 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매(80% 에탄올)를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.

본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

한편 본 발명의 "치주질환 예방 또는 치료용 조성물"은 그 유효성분인 초피나무 추출물을 치주질환 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.900 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 숙취가 일으키는 증상의 예방, 개선, 치료, 또는 이러한 증상의 발현 지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 명세서에서, "치주질환"이란 풍치라고도 불리는데, 치은염과 치주염 등의 치아 주위 치은(잇몸), 치주인대, 골조직을 포함하는 치주조직에 발생한 질환으로 이해될 수 있다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 아니한 용어는 국어사전적 의미나 당업계에서 일반적으로 통용되는 의미를 따른다.

본 발명의 치주질환 예방 또는 치료용 조성물 및 항균용 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서, 그 제형은 치약, 액상의 구강세정제(mouthwash), 식이성 필름, 마우스 스프레이 또는 츄잉껌 등의 여러 제형을 모두 포함하며, 각각의 조성물은 통상적인 방법으로 제조 가능하다.

본 발명의 치주질환 예방 또는 치료용 조성물이 치약으로 제형화 되는 경우, 본 발명의 치약은 초피나무 추출물을 필수 성분으로 함유하고, 이외에 습윤제, 점증제, 기포제, 보존제, 감미제, 향료 및 기타 성분을 추가로 함유할 수 있다.

상기 치약의 성분 중 점증제는 조성물 내의 물에 불용성인 무기분말성분과 액상성분을 결합시켜 시간에 따른 상분리를 방지하며, 조성물에 점성을 부여하는 성분으로서, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 카라기난, 알킨산나트륨, 아라비아 고무, 잔탄검, 기타 검류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

기타 첨가제로서 치면 광택을 주는 인산칼슘 등의 연마제, 충치 억제 기능을 지니는 불소제, 산화티탄 등의 증백제, 청색1호와 같은 식용색소를 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물이 치약 형태로 제형화 되는 경우 기능성을 향상시키기 위하여 또 다른 성분을 추가로 포함할 수 있는데, 치은염 또는 치주염 예방을 위한 성분으로서, 아미노카프론산,알란토인, 알란토인클로로히드록시알루미늄, 트라넥사민산, 염산피리독신, 염화나트륨, 초산토코페롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 혼합하여 사용할 수 있으며 치석 침착 예방을 위한 성분으로서, 피로인산나트륨을 추가로 혼합하여 사용할 수 있다. 치태제거 효과를 지니는 치약 성분으로서, 인산수소칼슘, 무수인산수소칼슘, 침강탄산칼슘, 탄산칼슘, 인산삼칼슘, 콜로이드성이산화규소, 이산화규소, 무수인산칼슘, 함수이산화규소, 댄탈리타입실리카 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 치주질환 예방 또는 치료용 조성물이 구강세정제로 제형화 되는 경우, 본 발명의 구강세정제는 초피나무 추출물을 필수 성분으로 함유하고, 이외에 습윤제, 기포제, 보존제, 감미제, 향료 및 기타 성분 등을 함유할 수 있다.

상기 습윤제는 구강세정제 조성물 내의 물의 증발을 억제하기 위한 성분으로서, 글리세린, 소르비톨액, 비결성 소르비톨액, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등 다가 알코올으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 기포제는 구강세정제 조성물 내의 수용성 성분과 유용성 성분과의 유화 또는 가용화 효과를 지니며 구강 내에서 세정 효과를 갖도록 하는 성분으로서, 라우릴황산나트륨, N-라우로일살코실산나트륨, N-장쇄아실글루탐산염, 자당지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 소르비탄 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌코폴리머 등의 음이온 및 비이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 보존제는 구강세정제의 보존기간을 연장하기 위한 성분으로, 파라옥시안식향산메틸, 안식향산, 안식향산 나트륨 등을 사용할 수 있다.

상기 감미제 및/또는 향료는 제품 사용시 맛을 좋게 하고 뒷맛을 상쾌하게 하기 위한 성분으로서, 감미제로는 사카린나트륨, 아스파탐, 스테비오사이드, 감초산 등을 사용할 수 있고, 향료로는 페퍼민트, 스페아민트오일, 멘톨, 카르본, 아네톨, 오이게놀 등을 혼합하여 사용할 수 있다.

기타 첨가제로서 pH 조절을 위한 구연산나트륨 등의 안정제, 충치 억제 기능을 지니는 불소제, 염화아연 등의 수렴제, 청색1호와 같은 식용색소를 사용할 수 있다.

상기 구강세정제 조성을 위한 용제로 에탄올 등이 사용될 수 있으며 나머지 성분은 정제수로 이루어진다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 파악될 경우, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 산제, 정제, 캡슐제 등 형태의 식품 제제류가 될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능성 식품, 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 또다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등), 스프레이, 가글 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산 등을 들 수 있으며 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 적합한 담체와 제제에 대해서는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)]을 참조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 추가로 포함할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 초피나무 추출물을 유효성분을 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 치주질환 예방 또는 치료용 조성물은, 치약, 구강세정제(mouthwash), 식이성 필름, 마우스 스프레이 또는 츄잉껌 등으로 제품화되거나 약제학적 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 초피나무 추출물의 치주질환 균주 생장억제 효과를 확인한 결과이다.좌측은 0.2mg 농도로 처리한 군이며 우측은 2.0mg의 농도로 처리한 군이다. [A, P. gingivalis; B, F. nucleatum; C, S. mutans]
도 2는 HGF-1 세포에서 초피나무 추출물에 의한 HGF-1 세포의 TIMPs 및 MMPs mRNA 발현양상을 나타낸 결과이다.
도 3은 MG-63 세포에서 초피나무 추출물에 의한 골생성 마커의 발현 양상을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 초피나무 추출물의 제조

제주 지역에서 구매한 초피나무(Zanthoxylum piperitum) 잎 부위를 음건한 후 세절하여 사용하였다. 세절한 초피나무 건조물을 80% 에탄올에 넣고 48시간 동안 침지시켜 3회 초음파 파쇄로 반복추출하였다. 이러한 추출물을 여과, 감압 농축하고 용매를 제거한 후 동결 건조하여 분말상의 추출물을 얻었다. 추출수율은 건조시료 대비 21.3중량%이었으며 이후 실험을 위하여 상기 초피나무 추출물을 농도별로 사용하였다.

< 실험예 1> 초피나무 추출물의 치주질환 개선활성 확인

<실험예 1-1> 치주질환 유발균 생장억제 효과

본 발명의 초피나무 추출물이 치주질환 유발균의 생장에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 원판확산법(Disk diffusion assay)을 수행하였다.

Porphyromonas gingivalis(KCTC 5352), Fusobacterium nucleatum(KCTC 2640), Streptococcus mutans(KCTC 3065) 균주가 실험에 사용되었다. P. gingivalis는 성인의 치주질환에서 가장 대표적으로 관찰되는 만성치주염 균주로 알려져 있으며 F. nucleatum는 후기 치태로 발전하는 과정에서 중요한 역할을 하는 균주로 알려져 있다. S. mutans는 대표적인 치아우식균으로 알려져 있다.

<균주 배양>

(가) P. gingivalis는 1ℓ 기준으로 Trypticase soy broth 30 g, 효모추출물 1 g, 5 ㎎/㎖ Hemin solution (Hemin 62.5 ㎎/0.125 ㎖ 1N NaOH + DW 12.5 ㎖) 1 ㎖, 1 ㎎/㎖ Menadione solution (menadione 20 ㎎/20 ㎖ EtOH) 1 ㎖이 포함된 배지에서 배양하였으며, 한천배지에서 배양할 경우 5%의 sheep blood와 1.5% 아가(agar)를 첨가하였다.

(나) F. nucleatum를 배양하기 위하여 1ℓ 기준으로 Brain heart infusion 37 g, 효모추출물 5 g, 5 ㎎/㎖ Hemin solution 1 ㎖, 1 ㎎/㎖ Menadione solution 10 ㎖를 첨가한 배지에서 배양하였으며, 한천배지에서 배양할 경우 5%의 sheep blood와 1.5% 아가를 첨가하였다.

(다) S. mutans는 1ℓ 기준으로 Brain heart infusion을 37 g 첨가한 배지에서 배양하였으며, 한천배지에서 배양할 경우 1.5% 아가를 첨가하였다.

각각의 미생물을 각각의 액체배지에서 혐기조건으로 배양하였으며, Gas pack은 2일마다 교환하였고, OD600 값이 0.8~1로 측정되면 계대배양을 실시하였다.

<원판확산법>

치주질환 유발균에 대한 항균활성을 확인하기 위하여 원판확산법을 실시하였다. 각 균주를 배지에서 배양 한 후 OD600의 값이 0.8 이상에 도달하였을 경우 멸균된 면봉을 이용하여 적당량을 취하고 도말하였다.

실시예의 초피나무 추출물을 10 mg/ml, 100 mg/ml의 농도로 제조한 후 8 mm paper disk (ADVANTEC, JAPAN)에 각 20 μl를 첨가하여 0.2, 2 mg의 농도가 되도록 paper disk를 준비하였다. 각 paper disk를 균이 도말된 배지에 올린 후 혐기배양조(OXOID, USA)에서 37℃의 혐기조건으로 48시간을 배양하고, 억제환의 지름을 측정하여 그 결과를 [표 1] 및 [도 1]에 나타내었다. 양성 대조군으로는 에리스로마이신(Erythromycin) 10㎍을 사용하였다.

<결과>

초피나무 추출물의 치주질환 유발균 생장억제 효과(단위:cm)

	양성 대조군	초피추출물 0.2mg	초피추출물 2.0mg
P. gingivalis	4.5	2.6	4.7
F. nucleatum	3.6	2.6	4.2
S. mutans	5.3	-	-

[표 1] 및 [도 1]에서 보이듯이, 초피나무 추출물의 치주질환 유발균 및 치아우식증 유발균에 대한 생장억제 효능을 측정한 결과 치아우식증 유발균인 S. mutans에서는 생육저지환이 관찰되지 않았으나, 치주질환 유발균인 P. gingivalis와 F. nucleatum에서는 농도의존적으로 생육저지환이 관찰되었다. 특히 고농도(2 mg)로 처리했을 경우 양성대조군인 에리스로마이신과 유사하거나 우수한 생장억제 효능이 관찰되었다. 이러한 결과를 통하여 본 실시예의 초피나무 추출물이 치주질환에 특이적인 효과를 나타낼 것으로 기대될 수 있다.

<실험예 1-2> 치주조직 세포의 MMP 발현억제 효과

치은염과 치주염은 치은연상과 치은연하에 인접한 치아 표면에 축적된 치태에 서식하는 치태 세균의 활동에 의해 발생한다. 치태 세균의 주요 항원인 lipolysaccharide (LPS)와 내독소(endotoxin)는 치은 조직에서 염증 반응을 일으키고, 이 염증반응을 제거하기 위해서 치은 조직 내부에서는 면역세포들에 의한 면역반응이 일어난다. 치주조직내에서 IL-1, TNF-α, TGF-α, β, IFN-γ 등의 염증인자가 일으키는 여러 작용 중 치주질환의 진행과 관련되어 MMP의 유전자의 발현을 조절하는 것이 알려져 있으며, MMP의 활동으로 인하여 치은 조직 내부의 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)의 파괴가 나타난다.이러한 MMP는 TIMP (tissue matrix metalloproteinases inhibitor)에 의해 활성이 차단되어 세포간질이 분해되는 것을 조절한다고 보고되어 있다((Birkedal-Hansen H1. J Periodontal Res. 1993 Nov;28(6 Pt 2):500-10.). 이에 본 연구에서는 초피나무 추출물이 인체 치은섬유모세포(human gingival fibroblast)인 HGF-1 세포에서 MMPs와 TIMPs의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

<세포독성 확인 실험>

치은섬유모세포에서 초피나무 추출물의 독성 여부를 확인하기 위하여 ATCC에서 구매한 HGF-1 (human gingival fibroblast) 세포는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% antibiotics를 첨가하여 37℃, 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포는 96 well plate에 1×104 cells/well 농도로 seeding하였으며, 24시간 후 초피 추출물을 농도별 (0~100 μg/ml)로 처리하였으며 24시간 후 MTT 용액을 처리하여 ELISA reader로 540 nm에서 측정하였다.

< MMP 조절 확인 실험>

HGF-1 세포를 6 well plate에 1×10^6 cells/well로 seeding 하고 24시간 후 LPS (10 μg/ml)와 시료 (초피 25, 50, 100 μg/ml)를 각각 처리하였다. 그 후 트리졸(trizol)을 이용하여 각각의 세포에서 total RNA를 추출하였으며, 이를 Nanodrop을 이용하여 정량하였다. 최종 정량된 total RNA는 cDNA synthesis Kit (TaKaRa)를 사용하여 cDNA로 합성하였으며, 합성된 cDNA는 각 primer와 SYBR green을 넣고 95℃ 10분 반응시킨 뒤 95℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 30초를 40cycle 반복하여 상대정량화 하였다. 염증반응 유도에 따른 MMP 발현량을 확인하기 위하여 사용한 프라이머(primer)는 [표 2]에 기재하였으며 해당 결과는 [도 2]에 나타내었다.

프라이머 서열

Gene name	Primer sequences (5'-3')
GAPDH	5-GCTTAAGAGACAGCCGCATCT-3 (sense) 5-CGACCTTCACCATTTTGTCTACA-3 (antisense)
MMP-2	5-TCCCGAGATCTGCAAGCAAG-3 (sense) 5-AGAATGTGGCCACCAGCAAG-3 (antisense)
MMP-3	5-TGATGGGCCTGGAATGGTC-3 (sense) 5-TTCATGAGCAGCAACCAGGAATAG-3 (antisense)
MMP-7	5-GACATTGCAGGCATCCAGAAGTTA-3 (sense) 5-AGGGCGTTTGCTCATTCCAG-3 (antisense)
MMP-9	5-AGCCGGGAACGTATCTGGA-3 (sense) 5-TGGAAACTCACACGCCAGAAG-3 (antisense)
MMP-13	5-CCCTGGAATTGGCGACAAAG-3 (sense) 5-GCATGACTCTCACAATGCGATTAC-3 (antisense)
TIMP-1	5-CATCTCTGGCCTCTGGCATC-3 (sense) 5-CATAACGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3 (antisense)
TIMP-2	5-GACACGCTTAGCATCACCCAGA-3 (sense) 5-CTGTGACCCAGTCCATCCAGAG-3 (antisense)

<결과>

세포독성 실험 확인 결과, 초피나무 추출물은 모든 농도에서 치은섬유모세포인 HGF-1 세포에 대한 독성을 나타내지 않았다(IC₅₀≥100). 이에 따라 치은섬유모세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하였으며 초피나무 추출물에 의한 MMP의 발현을 확인하였다.

HGF-1 세포에 대한 초피나무 추출물의 MMPs, TIMPs mRNA 발현 효과를 측정한 결과, TIMP1의 발현은 농도 의존적으로 증가하는 양상을 나타내었으며, MMP1, 2, 9의 발현은 감소하였다. 그러나 TIMP2의 발현은 약간 감소하는 추세를 나타내었으며, MMP3와 7에 대해서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 사람 구강건강 및 치주염에서 가장 중요한 역할을 하는 MMP는 MMP1, 2, 9로 알려져 있으며 (Makela M et al., J Dent Res. 1994 73: 1397-1406.; Seguier S et al.,J Periodontol. 2001 72:1398-1406.; Ejeil AL et al., J Periodontol. 2003 74: 188-95), 이에 따라 본 발명의 초피나무 추출물이 염증 및 세포외기질파괴를 억제하여 치주질환 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.

< 실험예 2> 초피나무 추출물의 골재생 효과 확인

치주질환에 의해 치조골 흡수가 일어날 수 있으며 계속 진행된다면 치아 손실이 발생하게 된다. 따라서 치주질환의 진행을 억제하고 치아 손실을 방지하기 위한 골재생 활성 확인 실험을 수행하였다.

RANKL은 TNF-α ligand family로써 조골세포에 존재하며, 파골세포의 형성 및 전구세포로부터의 활성을 유도한다(Lossdorfer et al., Calcif Tissue Int. 2002 Jul;71(1):45-52). 이러한 RANKL은 OPG에 의해 활성이 억제되며, RNAKL과 OPG의 상대적인 비율은 파골세포의 형성에 영향을 미쳐 골형성을 조절한다(Simonet et al., Cell. 1997 Apr 18;89(2):309-19.). 이러한 이유로 본 연구에서는 MG-63 조골세포에 대한 초피나무 추출물의 골생성 마커 OPG, RNAKL의 발현양상을 측정하였으며 그 결과를 [도 3]에 나타내었다.

< 골생성 확인 실험>

조골세포인 MG-63 세포에서 초피 추출물의 골생성 여부를 판단하기 위해 골생성 바이오마커인 OPG와 RANKL의 mRNA level을 측정하였다. MG-63 세포를 6 well plate에 1×106 cells/well로 seeding 하고 24시간 후 시료 (초피 25, 50, 100 μg/ml)를 각각 처리하였다. 그 후 트리졸(trizol)을 이용하여 각각의 세포에서 total RNA를 추출하였으며, 이를 Nanodrop을 이용하여 정량하였다. 최종 정량된 total RNA는 cDNA synthesis Kit (TaKaRa)를 사용하여 cDNA로 합성하였으며, 합성된 cDNA는 각 primer와 SYBR green을 넣고 95℃ 10분 반응시킨 뒤 95℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 30초를 40cycle 반복하여 상대정량화 하였다. OPG와 RANKL 발현량을 확인하기 위하여 사용한 프라이머(primer)는 [표 3]에 기재하였으며 해당 결과는 [도 3]에 나타내었다.

프라이머 서열

Gene name	Primer sequences (5'-3')
OPG	5-CAATTTGCCTGGCACCAAAG-3 (sense) 5-AGGTGAGGTTAGCATGTCCA-3 (antisense)
RANKL	5-TGGATGCCTTGAATAATAAG-3 (sense) 5-AATTTGCGGCACTTGTGGAA-3 (antisense)

<결과>

MG-63 조골세포에 대한 초피나무 추출물의 골생성 효과를 확인하였다. 골생성 마커로 OPG와 RNAKL를 사용하였으며 그 결과를 [도 3]에 나타내었다. OPG와 RANKL는 초피나무 추출물을 처리하였을 때 모두 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며 OPG의 발현 비율이 RANKL 보다 더 높게 측정되었으므로 초피나무 추출물은 골흡수가 아닌 골생성을 촉진함을 알 수 있다. 초피나무 추출물의 골생성 활성은 치주질환의 진행 과정을 억제할수 있을 뿐 아니라 치주질환으로 이미 소실된 치주조직 및 치아를 복구하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 실시예와 같이 제조한 초피나무 추출물의 골재생 활성은 치주질환 뿐만 아니라 골다공증을 비롯한 다양한 골질환의 치료에 이용될 수 있을 것이다.

Claims

초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 또는 2항에 있어서,
상기 초피나무 추출물은 80% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 제형이 치약, 구강세정제(mouthwash), 식이성 필름, 마우스 스프레이 또는 츄잉껌인 것을 특징으로 하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물.
초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 또는 예방용 조성물.
초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 대한 항균용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물의 제형이 치약, 구강세정제(mouthwash), 식이성 필름, 마우스 스프레이 또는 츄잉껌인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.