KR20170029459A - Anchovy calcium products of senior-friendly using oriental medicinal herb - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a senior-friendly and high-quality anchovy calcium product using medicinal herbs, capable of preventing calcium-related diseases (osteoporosis, atherosclerosis, heart diseases, colorectal cancer, and others), and minimizing side effects from calcium intake through the intake of the anchovy calcium product mixed with eco-friendly medicinal herbs. The present invention can provide senior-friendly functional food having improved functionality through the mixing with the anchovy calcium as an excellent calcium supply source, by comprising anchovy calcium powder and a medicinal herb extract of any one of Rehmannia glutinosa, Angelica gigas Nakai, Drynariae Rhizoma, Lycium chinense, Eucommia ulmoides, Achyranthes japonica, Japanese cinnamon, Phlomis Radix, Glycyrrhiza uralensis, and Cibotium barometz, or a medicinal herb extract of a mixture thereof.

Description

한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제{Anchovy calcium products of senior-friendly using oriental medicinal herb} Anchovy calcium products of senior-friendly using oriental medicinal herb

본 발명은 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 관한 것으로, 특히 칼슘과 깊은 관계가 있는 질병들(골다공증, 동맥경화, 심장질환, 대장암 등)에 대하여 친환경 한방소재가 배합된 멸치 칼슘제의 섭취를 통해 칼슘 관련 질병들을 예방하고 칼슘섭취에 대한 부작용을 최소화하는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 관한 것이다.The present invention relates to an age-friendly, high-quality anchovy calcium agent using a herbal material, and more particularly to an ingestion of anchovy calcium supplemented with an environmentally friendly herbal ingredient for diseases (osteoporosis, atherosclerosis, heart disease, colon cancer, etc.) To an aging-friendly high quality anchovy calcium agent using a herbal ingredient which prevents calcium related diseases and minimizes side effects on calcium intake.

칼슘은 뼈와 이의 성장과 유지, 혈액 응고, 근육의 수축 및 이완 등에 관여하며, 칼슘의 부족한 섭취는 골격과 치아조직의 성분변화를 가져오고 성장을 저하시키며, 뼈의 기형현상을 유발하기도 한다.Calcium is involved in the growth and maintenance of bones and teeth, blood clotting, and muscle contraction and relaxation. Inadequate intake of calcium leads to changes in skeletal and dental tissues, decreases growth, and causes bone malformations.

한국인의 영양섭취 실태조사 결과에 의하면 아직도 칼슘 섭취는 권장량에 못 미치는 것으로 나타나고 있다. 한국인 영양섭취기준(2010년, (사)한국영양학회)에 의하면 성인 남성의 경우 750mg(19~49세)에서 700mg(50세 이상), 성인 여성의 경우 650mg(1~49세)에서 700mg(50세 이상)으로 섭취 권장량을 규정하고 있으며, 사춘기(15~18세)에는 남녀 각각 900mg과 800mg으로 성인보다 많은 섭취량이 요구되나 실제 칼슘의 섭취 부족은 거의 모든 연령층에서 나타나고 있다. 특히, 칼슘부족과 관계가 깊은 골다공증은 중년기 이후의 여성에게 심각한 문제로 대두되고 있다. 골다공증을 일으키는 위험인자는 체중/신장비의 감소, 백인 또는 아시아인, 가족력, 칼슘 섭취의 저하, 운동부족, 미산부(nulliparity), 알콜중독, 흡연, 카페인 과량 섭취, 조기폐경, 무월경, 스테로이드 약물, 골절 병력, 갑상선, 질환, 암, 간, 대장, 신장의 질환 등과 같이 복합적인 것으로 알려져 있다.According to the results of the nutrition survey of Koreans, calcium intake is still below the recommended amount. According to the Korean Nutrition Survey (2010, Korean Nutrition Society), 700 mg (over 50 years old) for adults and 750 mg (for women aged 49 to 69 years) (Over the age of 50). In adolescents (15-18 years), men and women are required to consume 900 mg and 800 mg more than adults, but actual calcium intake is present in almost all age groups. In particular, osteoporosis, which is closely related to calcium deficiency, is becoming a serious problem for middle-aged women. The risk factors for osteoporosis are decreased body weight / height, white or Asian, family history, decreased calcium intake, lack of exercise, nulliparity, alcoholism, smoking, caffeine overdose, premature menopause, amenorrhea, Fracture history, thyroid gland, disease, cancer, liver, large intestine, kidney disease, etc.

칼슘은 체내에서 가장 많이 존재하는 무기질로, 보통 성인 체중의 1.52%인 1,000~1,500g 정도를 체내에 보유하고 있다. 체내 칼슘의 99% 정도는 골격과 치아를 형성하고 있으며 나머지 1% 정도만이 근육의 수축과 이완, 규칙적인 심장박동 혈액의 응고, 효소의 활성, 세포내 자극과 흥분의 전달과 같은 생리활성조절 기능을 담당하고 있다(Allen and Wood, 1994).Calcium is the most abundant minerals in the body and usually contains about 1, 500 to 1,500 g of body weight, 1.52%. About 99% of the body calcium forms the skeleton and teeth, and only about 1% of the body regulates physiological activity such as contraction and relaxation of muscle, coagulation of regular heartbeat blood, enzyme activity, delivery of intracellular stimulation and excitement (Allen and Wood, 1994).

이와 같이 다양한 생리활성 조절기능을 가지는 칼슘은 체내에서 항상 일정한 농도로 유지되어야 하는데, 만일 장기간 칼슘 섭취가 부족해지면 골다공증(osteoporosis), 구루병(rickets), 테타니와 같은 결핍증이 유발될 뿐만 아니라 골격과 관련지어져 그 중요성이 강조되고 있다.As such, calcium having a variety of physiological activity control functions should be maintained at a constant concentration in the body. If a long-term intake of calcium is insufficient, osteoporosis, rickets, and deficiency such as tetany may be induced, Its importance is emphasized.

최근 칼슘이 성장기, 성인기 이후의 골격질환과 순환기계 질환, 대장질환 등과 밀접한 관련이 있으나 정상 식사만으로는 충분한 칼슘을 얻지 못하는 실정이므로 칼슘 함유식품에 대한 수요가 증가하고 있어 이에 소뼈, 난각, 굴피분말 등을 소재로 한 칼슘 함유식품 등이 시판되고 있으나 가장 널리 사용되는 우골분은 광우병 발생으로 인한 안전성 문제 때문에 전량수입이 금지되어 새로운 칼슘 소재 개발이 시급한 실정이다.Recently, calcium is closely related to the growth period, post-adulthood skeletal disease, circulatory system disease, and bowel disease. However, because of the fact that sufficient calcium is not obtained only by the normal diet, the demand for calcium-containing foods is increasing. And calcium-containing foods are commercially available. However, the most widely used bones are banned from importing due to safety problems caused by mad cow disease, and it is urgent to develop new calcium materials.

또한, 고령화시대에 노인들에게 자주 발생하는 골다공증, 동맥경화, 심장질환, 대장암 등은 칼슘과 깊은 연관성을 가지는 질병들이며 특히, 여성의 경우 폐경기가 되면 여성호르몬인 에스트로겐의 분비가 감소되어 칼슘의 체내흡수가 감소하기 때문에 여성의 골다공증이환율은 남성에 비해 약 4배 높게 나타나 전체 인구 중 13%를 차지하고 있는 것으로 조사되고 있으며, 과거에 비해 지방질과 인산염의 섭취가 증가된 식생활로 인해 소장 내에서 칼슘의 섭취가 저해된다는 연구결과가 있다. In addition, osteoporosis, atherosclerosis, heart disease, and colon cancer, which frequently occur in aged people in the aging society, are deeply related to calcium, and in women, menopause causes secretion of estrogen, a female hormone, Because of the decrease in body absorption, women's osteoporosis rates are about four times higher than that of men, accounting for 13% of the total population. The dietary habits of increased fat and phosphate intake compared to the past, Studies have shown that intake of calcium is inhibited.

최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 여러 종류의 건강보조식품이 이용되고 있으며, 칼슘보조식품의 소비 또한 증가 추세에 있어 다양한 칼슘보충제가 수입되어 시판되고 있다. 그러나 칼슘성분은 용해도가 매우 낮아 제품생산에 많은 제약이 있으며, 칼슘보조제를 남용 및 오용할 경우에는 다른 무기질의 흡수방해, 위장장애, 변비, 결석증 등 부작용을 동반할 수 있다.Recently, as interest in health has increased, various kinds of health supplements have been used, and consumption of calcium supplements has also been increasing, and various calcium supplements have been imported and marketed. However, the calcium component has a very low solubility, so there are many restrictions on the production of the product. Abuse and misuse of the calcium supplements may cause side effects such as absorption of other minerals, gastrointestinal disorders, constipation, and sickling.

칼슘의 주요한 공급원 중 하나인 멸치(Engraulis japonicus)는 몸길이가 1∼15㎝에 이르는 다획성, 소형, 적색육 어류로서 전 세계 해역에서 고루 분포하지만 한국 연안에서는 연중 생산되는 주요 연근해 어류자원이다. 멸치의 서식 수온은 13∼23℃로서 우리나라에서는 동해, 서해, 남해의 모든 연안에 분포하나 주로 부산, 경남 및 전남지역의 해역에서 어획량이 많으며 계절적으로는 4∼6월 기간을 제외한 모든 기간에 기선권현망, 소형 정치망 및 근해유자망 어법으로 어획됨으로써 주요 연근해 어민의 소득원이 되고 있다.One of the major sources of calcium, anchovies ( Engraulis japonicus ) is a multipurpose, small, red fleshy fish having a body length of 1 to 15 cm, distributed evenly throughout the world, but is a major offshore fish resource produced throughout the year on the Korean coast. The temperature of the anchovy is in the range of 13 ~ 23 ℃, and it is distributed in all coastal areas of East Sea, West Sea and Namhae in Korea. However, the catch is high in Busan, Gyeongnam and Chonnam regions. Seasonally, It is being harvested as a source of income for major offshore fishermen by being caught in the Kwonhyeon network,

우리나라의 경우 멸치의 연간 어획량은 연평균 20∼30만톤 수준에 이르러 단일 어종으로서 어획량이 매우 많지만, 원료어는 쉽게 부패변질하기 때문에 어획 즉시 저장성이 있는 제품으로 가공해야 하는 문제가 있다. 기존의 멸치 가공이용방법은 전체 어획량의 30∼40% 수준만이 경제성 있는 건멸치 제품 형태로 소비되고 있으며 60∼70% 수준의 멸치 어획물은 일시 대량처리에 적합하다는 이유 때문에 모두 염장 발효시켜 저부가가치의 젓갈류 제품형태로 소비되고 있는 실정이다.In Korea, annual catch of anchovy is about 20 ~ 30 thousand tons per year, which is very large as a single species. However, since the raw fish is easily decomposed, it has to be processed into a product that is storable immediately after harvest. The existing anchovy processing methods are consumed in the form of anchovy products with economical efficiency of only 30 ~ 40% of the total catches, and the anchovy catches of 60 ~ 70% level are suitable for temporary mass processing, Of salted fish products.

한편, 멸치류의 어육은 일반적으로 다량의 칼슘을 함유하고 있어 대표적인 고칼슘 식품소재로만 인식되는 경향이 있으나 칼슘 이외에도 양질의 단백질과 EPA 및 DHA를 포함한 비교적 다량의 지방을 함유하고 있을 뿐 아니라 각종 유용한 비타민과 무기질 및 핵산 등 좋은 맛을 내는 정미성분들도 다량 함유하고 있어 영양 및 기호성을 특성으로 한 가공식품의 원료로서 잠재적 이용가치가 매우 높은 수산자원이다.On the other hand, anchovy fish generally contain a large amount of calcium, so it tends to be recognized only as a typical high calcium food material. In addition to calcium, it contains a high-quality protein, a relatively large amount of fat including EPA and DHA, And minerals and nucleic acids, as well as nutritive and palatable characteristics of the raw materials of processed foods, which have a very high potential value for use.

그러나 다른 어종에 비하여 부패속도가 빠르기 때문에 어획량의 대부분을 젓갈 및 액젓의 원료, 자건품의 원료로 사용되고 있고 있다(조영제 등, 2000). 멸치 액젓을 만들고 남은 부산물은 현재 폐기되거나 다양한 처리과정을 거쳐 사료 등으로 사용되고 있는 실정이므로 이를 활용하여 성장기나 노인기의 칼슘 영양을 극대화하기 위한 칼슘제의 개발이 필요하다.However, since the decay rate is faster than other fish species, most of the catches are used as raw materials for fermented seafood and fish sauce (Fig. It is necessary to develop a calcium supplement to maximize calcium nutrition in growing period and popularity by utilizing the byproducts which are made from anchovy sauce and are currently being used as feed or the like through various disposal processes.

이러한 멸치와 한방에 대한 기술의 일 예가 하기 문헌 1 및 2 등에 개시되어 있다.One example of such anchovy and herbaceous techniques is described in documents 1 and 2 below.

예를 들어, 하기 특허문헌 1에는 도 1에 도시된 바와 같이, 멸치를 30∼60메쉬(mesh)의 크기로 분쇄하여 분말화하는 단계, 멸치분말을 중량 대비 2∼10배의 주정에 넣고 20∼60℃에서 1∼5시간 침지한 다음 여과 및 수세하여 주정을 제거하는 단계, 주정을 제거한 멸치분말을 40∼50℃에서 1∼3시간 건조하는 단계, 건조한 멸치분말을 구연산, 사과산, 젖산, 초산 중에서 선택된 어느 하나 이상의 0.5∼1.5% 유기산에 넣고 20∼50℃에서 30분∼2시간 동안 침지한 다음 40∼50℃에서 1∼3시간 동안 건조하는 단계를 포함하는 멸치분말의 제조방법에 대해 개시되어 있다.For example, as shown in FIG. 1, an anchovy is pulverized into a powder having a size of 30 to 60 mesh, and anchovy powder is placed in a 2 to 10 times weight ratio Drying the dried anchovy powder at 40 to 50 ° C for 1 to 3 hours, filtering the dried anchovy powder with citric acid, malic acid, lactic acid, Acetic acid in an amount of 0.5 to 1.5% of organic acid, immersing the mixture at 20 to 50 DEG C for 30 minutes to 2 hours, and then drying at 40 to 50 DEG C for 1 to 3 hours. Lt; / RTI >

또 하기 특허문헌 2에는 비린내를 없애고 기혈보강의 한방처방을 멸치가공에 적용한 것으로 방약합편의 고진음자처방에 따라 한약재료를 열수추출하여 기능성 멸치가공용액을 제조하고, 준비된 한약재 추출용액을 멸치에 흡수, 도포하고, 도포 후 멸치를 자연건조하고, 자연건조된 멸치의 비린내 제거 및 향미성 증대를 위해 녹차추출물에 정치하며, 상품화를 위해 수분함양 10%이하로 건조시켜 비린내를 없애고 기혈을 보강하여, 기혈(氣血)의 부족에 의해 생기는 조열(潮熱), 자한(自汗), 설사, 해수, 담다(痰多)를 예방할 수 있는 한방처방에 따른 기능성 멸치 및 그의 가공방법에 대해 개시되어 있다.In addition, Patent Document 2 discloses that an anchovy preparation for eliminating fishy smell is applied to anchovy processing, and a functional anchovy processing solution is prepared by hot water extraction of the herbal medicine materials according to the prescription of the high grade excipients of the fragments, , Dried and dried anchovy naturally, dried in an green tea extract to remove the intestine and increase the flavor of naturally dried anchovy, dried to less than 10% of moisture for commercialization, A functional anchovy according to a herbal medicine prescription which can prevent the fever (tidal fever), self-sweating, diarrhea, seawater and dandruff caused by the lack of gye blood is disclosed and a processing method thereof .

대한민국 등록특허공보 제10-0705790호(2007.04.03 등록)Korean Registered Patent No. 10-0705790 (Registered on Apr. 03, 2007) 대한민국 등록특허공보 제10-0655148호(2006.12.01 등록)Korean Registered Patent No. 10-0655148 (Registered on December 01, 2006)

그러나 상술한 바와 같은 종래의 기술에서는 단순히 멸치에서 칼슘만 추출하거나 한방성분을 추가하는 기술에 대해서만 개시되어 있을 뿐, 멸치의 효율적인 칼슘의 추출에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않았다.However, in the conventional techniques as described above, only the technique of extracting only calcium from anchovy or adding a herbal ingredient has been disclosed, and no efficient extraction of calcium from anchovy has been disclosed.

또 상기와 같은 종래의 기술에서는 인체 내에서의 칼슘의 흡수에 대한 연구가 개시되어 있지 않으며, 항산화활성, 골 형성 등 노화활성을 억제하는 연구에 대해서도 전혀 개시되어 있지 않았다.In addition, studies on the absorption of calcium in the human body have not been disclosed in the above-mentioned conventional techniques, and no studies have been disclosed about inhibiting the aging activity such as antioxidant activity and bone formation.

본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 천연물질인 한방소재로부터 기능성 성분에 대한 최적의 추출 공정을 확립하고 이를 통해 얻어진 한방 추출물을 기반으로 하여 칼슘공급원으로 우수한 멸치 분말과의 배합에 의한 기능성 증진 및 고령친화적 멸치 칼슘제를 제공하는 것이다.The object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to establish an optimal extraction process for a functional ingredient from a natural herbal material and to provide an anchovy powder excellent in calcium source And an aging-friendly anchovy calcium agent.

본 발명의 다른 목적은 소재의 안전성 및 활용성을 확인하고 생체 내 칼슘 흡수율을 향상시키며 이와 함께 한방의 방제학적 원리에 입각하여 한방 천연물질을 배합한 인체에 부작용없는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to confirm the safety and usability of the material and to improve the absorption rate of calcium in the living body, and also, based on the principle of oriental medicine, a high-quality anchovy Calcium.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제로서, 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척으로 이루어진 한약재 추출물과 멸치 분말을 포함하고, 상기 한약재 추출물은 전체 중량 100%에 대해 숙지황 10~20중량%, 당귀 10~20중량%, 골쇄보 10~15중량%, 구기자 10~20중량%, 두충 10~15중량%, 우슬 3~7중량%, 육계 3~7중량%, 속단 3~7중량%, 감초 3~7중량% 및 구척 3~7중량%로 이루어지고, 상기 멸치 분말은 멸치 잔사를 자숙, 수세 및 탈수공정을 거쳐 건조된 후, 500mesh로 분쇄된 것이고, 상기 멸치 분말은 수분 3.3중량%, 조단백질 26.6중량%, 조지방 1.6중량%, 조회분 66.0중량% 및 탄수화물 2.5중량%로 이루어지고, 상기 한약재 추출물은 수분 18.1중량%, 조단백질 7.5중량%, 조지방 0.9중량%, 조회분 5.5중량% 및 탄수화물 68.0중량%로 이루어진 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the aging-friendly high-quality anchovy calcium agent using the herbal material according to the present invention is an aging-friendly high quality anchovy calcium agent using a herbal material, Wherein the herbal extract comprises 10 to 20% by weight of Sulfuric Acid, 10 to 20% by weight of Angelica gigantis, 10 to 15% by weight of bone turnover, 10 to 20% by weight of Gojiji, Wherein the anchovy powder comprises 10 to 15% by weight of mulberry, 3 to 7% by weight of wax, 3 to 7% by weight of broth, 3 to 7% by weight of speed, 3 to 7% by weight of licorice and 3 to 7% The dried anchovy powder contained 3.3 wt% of moisture, 26.6 wt% of crude protein, 1.6 wt% of crude fat, 66.0 wt% of crude fat and 2.5 wt% of carbohydrate. The dried anchovy powder was dried, The herbal medicine extract had a moisture content of 18.1% by weight, 7.5% by weight of crude protein, 0.9% by weight of crude fat, 5.5% by weight of whey protein and 68.0% by weight of carbohydrate.

또 본 발명에 따른 멸치 칼슘제에서, 상기 한약재 추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기를 이용하여 상기 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척의 혼합물 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축한 것을 특징으로 한다.In the anchovy calcium preparation according to the present invention, the herbal medicine extract was prepared by mixing 1 kg of a mixture of the above-mentioned Sukjipu, Angelica keiskei, Bombyx mori, Gugija, Bukchon, Wusu, broiler, The mixture was extracted at 105 ± 2 ° C for 7 hours, and then concentrated under reduced pressure in a rotary evaporator.

또 본 발명에 따른 멸치 칼슘제에서, 상기 한약재 추출물과 멸치 분말은 중량비로서 1 : 1로 혼합된 것을 특징으로 한다.In the anchovy calcium preparation according to the present invention, the herb extract and the anchovy powder are mixed at a weight ratio of 1: 1.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 의하면, 천연물질인 한방소재로부터 기능성 성분에 대한 최적의 추출공정을 확립하고 이를 통해 얻어진 한방 추출물을 기반으로 하여 칼슘공급원으로 우수한 멸치 분말과의 배합에 의한 기능성 증진시키고, 고령친화적인 기능성 식품을 제공할 수 있다는 효과가 얻어진다.As described above, according to the age-friendly high-quality anchovy calcium agent using the herbal material according to the present invention, an optimal extraction process for functional ingredients from a natural herbal material is established, and based on the herbal extract obtained from the herbal extract, It is possible to improve the functionality by mixing with an excellent anchovy powder and to provide an aging-friendly functional food.

또, 본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 의하면, 초고령화 사회로의 진입, 골질환의 높은 이환율, 소비자들의 높은 관심도 등을 고려할 때, 기능성 한방소재를 결합한 고품질의 멸치 칼슘제를 개발하여 신성장동력산업으로 자리매김할 수 있으며, 이를 통해 국민 건강에 기여하고 농어민의 소득 창출을 통해 일자리 증대에 기여할 수 있다는 효과도 얻어진다.According to the age-friendly high-quality anchovy calcium preparation using the herbal material according to the present invention, considering an entry into an aging society, a high morbidity rate of bone disease, and a high degree of interest of consumers, a high quality anchovy calcium preparation It is also possible to contribute to the public health and contribute to the increase of jobs through income generation of farmers and fishermen.

도 1은 종래의 멸치분말의 제조방법의 공정도,
도 2는 본 발명을 적용하기 위해 실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위한 양측 난소 절제술을 나타내는 도면,
도 3은 8주간의 체중을 매일 일정한 시간에 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 체중 변화를 나타내는 그래프,
도 4는 각각의 실험군에서 8마리의 SD-rat을 이용하여 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 골밀도를 나타내는 도면,
도 5는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 실험 쥐의 대퇴골 무게(A), 대퇴골의 회분(B), 대퇴골의 칼슘(C와 D)에서 ANCA와 ANCA-OM 공급의 효과를 나타내는 그래프,
도 6은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여에 따른 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 나타내는 그래프,
도 7은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 APL 농도 상태를 나타내는 그래프,
도 8은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 칼슘 농도 상태를 나타내는 그래프,
도 9는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 GOT와 GPT를 측정한 결과를 나타내는 그래프,
도 10은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈액에서 HDL(A), LDL(B) 및 트리글리 세라이드(C)를 나타내는 그래프.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a flow chart of a conventional method of producing anchovy powder,
FIG. 2 is a view showing bilateral ovarian resection for artificially inducing osteoporosis by changing an experimental animal to a postmenopausal hormone secretion state in order to apply the present invention;
FIG. 3 is a graph showing changes in body weight in the Sham group, the OVX group, the OVX-AnCa group, and the OVX-AnCa-OM group when the 8-week body weight was measured at a constant time every day,
FIG. 4 is a graph showing bone mineral density in the Sham group, the OVX group, the OVX-AnCa group and the OVX-AnCa-OM group as measured by 8 SD-rats in each experimental group,
FIG. 5 shows the results of ANCA and ANCA-B in the femur weight (A), femoral ash (B), and femur calcium (C and D) of experimental rats in the Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX- Graph showing the effect of OM supply,
FIG. 6 is a graph showing osteocalcin concentration in serum according to administration of anchovy powder and combination herbal medicine extract in Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group,
FIG. 7 is a graph showing APL concentration in serum of experimental rats of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group,
FIG. 8 is a graph showing the calcium concentration status in serum of experimental rats of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group,
9 is a graph showing the results of measurement of GOT and GPT in the sera of experimental mice of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group,
FIG. 10 is a graph showing HDL (A), LDL (B) and triglyceride (C) in the blood of experimental rats of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group.

본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.These and other objects and novel features of the present invention will become more apparent from the description of the present specification and the accompanying drawings.

본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제는 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 중의 어느 하나의 한약재 추출물 또는 이들 혼합물의 한약재 추출물(한방 추출물)과 멸치 분말을 포함한다.The age-friendly and high-quality anchovy calcium agent using the herbal material according to the present invention can be obtained by extracting herbal medicine extracts (herbal extract) of any one of medicinal herb extracts such as Seokjanghwang, Angelica gigas, Boksoobo, Gugija, And anchovy powder.

본 발명에 적용하는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에서 칼슘 소재로 이용하기 위해 사용한 멸치(Engraulis japonicus)잔사는 2013년 10월에 부산광역시소재 부경수산으로부터 원료를 구입하였다. 구입한 원료 잔사는 이물질 및 나트륨 제거를 위하여 자숙, 수세 및 탈수공정을 35회 반복하였다. 열풍건조기에서 건조하고, 분쇄기로 500mesh가 되도록 분쇄하여 실험에 소포장하여 사용하였다.Ingredients of the anchovy ( Engraulis japonicus ) used for the calcium material in the aged-friendly high-quality anchovy calcium preparation using the herbal material applied to the present invention were purchased from Pukyong National Fisheries, Busan in October 2013. The purchased material residue was subjected to the processes of cooking, washing and dehydrating 35 times to remove foreign substances and sodium. Dried in a hot air drier, pulverized to a particle size of 500 mesh by a pulverizer, and packed in an experiment.

분석에 사용할 한방소재는 동의대 한의과대학 처방에 근거한 노인성 골다공증에 도움을 줄 수 있는 한방소재를 선택하였다. 한방추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기 DM-1000(Daehan Median Co., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 한방소재 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축하여 사용하였다.The oriental materials used for the analysis were oriental oriental materials which can help the geriatric osteoporosis based on the prescription of Oriental Medical College of Dong - Eui University. The herbal extracts were extracted with 1 kg of herbal ingredients and 4 L of water using a water-cooled cooling circulation extractor DM-1000 (Daehan Median Co., LTD, Seoul, Korea) and extracted at 105 ± 2 ° C for 7 hours. The extracts were concentrated under reduced pressure on a rotary evaporator Respectively.

일반성분은 상법에 따라 측정하였다. 즉, 수분은 상압가열 건조법, 조단백질은 semimicro Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet법, 조회분은 건식회화법으로 측정하였다. 탄수화물은 전체 100%에서 수분, 조단백질, 조지방과 조회분 함량을 제외한 값으로 계산하였다.The general components were measured according to the commercial method. That is, moisture was measured by atmospheric pressure heating drying method, semimicro Kjeldahl method for crude protein, Soxhlet method for crude fat, and dry method for inquiry. Carbohydrates were calculated as 100% of the total, excluding moisture, crude protein, crude fat and ash content.

대장균군수의 측정은 대장균군 측정용 3M 배지에 35±2℃에서 24±2℃시간 배양한 후 생성된 붉은 집락종 주위에 기포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군수를 산출하였다.The coliform count was calculated by counting the number of colonies forming bubbles around the red colonies produced after incubation at 35 ± 2 ℃ for 24 ± 2 ℃ in 3M medium for coliform counting and diluting multiples And the number of E. coli strains was calculated.

중금속의 정량으로서, 납 및 수은의 분석을 위해 시료의 분해는 식품공전의 식품 중 '7. 유해물질시험법'에서 건식회화법을 사용하여 시험용액을 조제하였으며, 유도결합플라즈마법을 이용하여 분석하였다. 비소의 분석을 위해 시료의 분해는 식품공전의 식품 중 '7. 유해물질시험법'에서 습식회화법을 사용하여 시험용액을 조제하였으며, 마이크로웨이브법을 이용하여 분석하였다. As for the determination of heavy metals, for the analysis of lead and mercury, Hazardous Substance Test Method ', the test solution was prepared by dry method and analyzed by inductively coupled plasma method. For the analysis of arsenic, the decomposition of the samples was carried out in foodstuffs' 7. Hazardous Substance Test Method ', the test solution was prepared using the wet method and analyzed by microwave method.

무기질의 정량으로서, 마그네슘의 정량은 질산(HNO3)을 이용하여 습식분해한 후 ICP(inductively coupled spectrophotometer : SPECTRO ARCOS-유도결합플라즈마분석기, SPECTROBLUE ICP-OES (Radial, Axial, Twin Interface)를 이용하여 분석하였다. 나트륨의 정량은 시료를 건식회화법을 이용하여 시험용액을 조제한 후 ICP, SPECTROBLUE ICP-OES를 이용하여 분석하였다. 인의 정량은 몰리브덴 청 비색법을 이용하여 분석하였다. The quantitative determination of magnesium was carried out by wet decomposition using nitric acid (HNO 3 ), and then by inductively coupled spectrophotometer (SPECTROBLUE ICP-OES (Radial, Axial, Twin Interface) The amount of sodium was determined by using ICP and SPECTROBLUE ICP-OES after the test solution was prepared by using the dry method of the sample, and the amount of phosphorus was analyzed by the molybdenum blue colorimetric method.

또한 칼슘 함량 측정에 대해서는 다음과 같이 실시하였다.The calcium content was measured as follows.

시료 투여 8주 후에 실험동물을 희생시키고 대퇴골을 절취하였다. 대퇴골에 잔류하고 있는 지방 및 주위조직을 제거하고 생리식염수로 세척한 후 105±5℃에서 건조하여 무게를 측정하여 실험동물의 체중으로 환산하였다. Experimental animals were sacrificed 8 weeks after the administration of the sample and the femur was cut. The fat and surrounding tissues remaining in the femur were removed, washed with physiological saline, dried at 105 ± 5 ° C and weighed to calculate the body weights of the animals.

건조된 대퇴골을 회분 도가니에 각각 담아 550~600℃에서 12시간 동안 완전히 회화시킨 다음 30분 방냉한 후 회분의 무게를 측정하였다. 회화된 회분은 1N HCl에 용해한 후 1% La2O3로 희석하여 원자흡광광도계(atomic absorption spectrometer, Perkin Elmer Co., Santa Clara, CA, USA)로 칼슘 함량을 측정하였다.The dried femur was placed in the ash crucible and thoroughly stirred at 550 to 600 ° C for 12 hours. After 30 minutes of cooling, the ash was weighed. Concentrated ash was dissolved in 1N HCl, diluted with 1% La 2 O 3 , and calcium content was measured with an atomic absorption spectrometer (Perkin Elmer Co., Santa Clara, CA, USA).

또한, 본 발명에서 실험에 사용한 동물은 중앙실험동물(주)(서울시, 한국)로부터 구입한 4주령의 암컷 Sprague-Dawley(SD)계 흰쥐를 사용하였다. In addition, the animals used for the experiment in the present invention were female Sprague-Dawley (SD) rats of 4 weeks old, purchased from Central Experimental Animals (Seoul, Korea).

동의대학교 블루바이오소재 개발 및 실용화지원센터의 실험동물시설에서 1주일간 순화 적응시킨 후 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 건강한 동물을 선택하여 사용하였다. The animals were acclimated for one week at the experimental animal facility of the Center for Development and Practical Use of Blue Bio Materials at Dong - Eui University and the normal symptoms were observed and healthy animals without abnormalities were selected.

시험동물사육은 온도 23±2℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수 10~18회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경을 유지하였으며, 방사선 멸균된 실험동물용 고형사료와 고압 멸균한 1차 증류수를 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.The animals were kept at a temperature of 23 ± 2 ° C, a relative humidity of 50 ± 10%, a ventilation frequency of 10 to 18 times / hour, a lighting time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm) And sterilized radioactive sterilized animal feed and high pressure sterilized primary distilled water.

동물실험은 동의대학교 동물실험윤리위원회의 사전 심의를 받아 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.Animal experiments were conducted in accordance with the provisions of the Animal Experimental Ethics Committee under the prior deliberation of the Ethical Committee of Animal Experiments at Dong-Eui University.

실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위하여 양측 난소 절제술(ovariectomy, OVX)을 시행하였다. 무균 조작 하에 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 10% 포비돈 요오드로 수술부위 및 주위를 소독한 후, 양쪽 등의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 적출하고 절제부위는 흡수성 봉합사로 결찰 및 봉합하였다. Ovariectomy (OVX) was performed to artificially induce osteoporosis by changing experimental animals to postmenopausal hormone secretion. After sterilization, the skin and muscles and peritoneum of both sides were treated with 10% povidone iodine and the ovaries were exposed. The ovaries were removed and the resection site Were ligated and sutured with absorbable sutures.

투여용량 설정 및 투여방법은 다음과 같이 실행하였다.The administration dose setting and the administration method were carried out as follows.

강제경구 투여 전 4시간 동안 절식시킨 다음, 체중을 측정하고 체중 범위에 따른 무작위법에 의거하여 암컷 SD(Sprague-Dawley)계 흰쥐를 각각 32마리의 실험동물을 8마리씩 실험군을 분리하였다. 투여 용량은 이전의 보고(김향숙 등, 2013)를 참고하여 멸치 분말 시료의 용량을 정하였으며 한약재 복합 추출물 분말의 용량은 1:1 등비를 투여 2주 후 혈청의 칼슘변화량을 확인하여 한약재 복합 추출물 분말의 총 투여량을 200 mg/day, 멸치 분말 시료의 투여량을 100 mg/day로 용량을 설정하였다. The animals were fasted for 4 hours before the oral administration and then weighed and divided into 8 experimental rats of 32 male Sprague-Dawley rats according to the random method according to the weight range. The dose of anchovy powder was determined with reference to the previous report (Kim, Hyang-sook, etc., 2013). The dose of the herbal extracts was 1: 1, And the dose of anchovy powder sample was set at 100 mg / day.

실험군에 따라 정해진 용량을 경구투여용 스테인레스 재질 존데(sonde)를 이용하여 경구투여하였다. 1일 1회 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며, 음수는 제한 없이 계속 공급하였다. 실험군 1인 OVX-AnCa군에는 멸치 분말(100mg/day)을 멸균된 생리식염수에 현탁하여 투여하였으며, 실험군 2인 OVX-AnCa-OM군에는 멸치 분말과 복합한약재추출물을 표 3-4에 기술되어 있는 것과 같은 용량을 생리식염수 1 mL에 현탁하여 투여하였다. Sham군과 OVX군에는 생리식염수 동량을 같은 방법으로 투여하였다. 실험동물의 개별특성에 따라 한꺼번에 투여가 불가능할 경우에는 같은 날에 2회에 걸쳐 나누어 투여하였다. The dose determined according to the experimental group was administered orally using a stainless steel sonde for oral administration. Feeds were restricted for 2 hours after the test substance once daily, and negative water was continuously supplied without limitation. Anchovy powder (100 mg / day) was suspended in sterilized physiological saline and OVX-AnCa-OM group (2), anchovy powder and herbal medicinal herb extracts, were given in Table 3-4 The same dose was administered to 1 mL of physiological saline and suspended. The same amount of saline was administered to Sham group and OVX group. When the animals were unable to be administered at one time according to the individual characteristics of the animals, they were divided into two doses on the same day.

본 발명에서 혈액채취 및 부검은 다음과 같이 실시하였다.In the present invention, blood sampling and autopsy were carried out as follows.

실험동물을 희생시키기 전 12시간 절식시킨 후 데시케이터(desicator) 안에 디에틸 에테르를 적당량 취하여 마취시킨 뒤 하복부를 개복하고, 멸균주사기를 이용하여 심장 채혈법으로 혈액을 채취하였다. 혈액채취 후에 주요 내부 장기의 병변을 각 실험군과 대조군을 육안적으로 관찰하여 이상 유무를 확인하였다. The animals were fasted for 12 hours before sacrifice, and anesthetized with an appropriate amount of diethyl ether in a desiccator. The lower abdomen was opened and blood was collected by a cardiac syringe using a sterile syringe. After blood sampling, lesions of major internal organs were visually observed in each experimental group and control group to confirm the abnormality.

또한 관능 검사는 하기와 같이 실시하였다.The sensory test was carried out as follows.

조직감(texture), 풍미(flavor), 색(color), 맛(taste), 이물감(feeling of irritation), 전체적인 기호도(Overall acceptance)의 6개 검사항목으로 나누어 기호도가 낮으면 1, 가장 높으면 5의 점수를 주도록 하여 최고 5점, 최저 1점의 범위에 의해 평가를 실시하였다. 시료를 일회용 접시에 가로, 세로, 높이가 1.5 x 1.0 x 0.7cm3 크기로 잘라 2조각씩 제시하였으며, 시료의 평가는 제조 후 24시간 지난 것을 사용한다.There were 6 items of texture, flavor, color, taste, feeling of irritation, and overall acceptance. The degree of preference was 1, the highest was 5 The results were evaluated by the range of the maximum 5 points and the minimum 1 point. Samples were cut into a size of 1.5 x 1.0 x 0.7 cm 3 in the size, width, length and height in a disposable dish. The sample was evaluated 24 hours after the preparation.

상술한 바와 같은 실험으로부터 얻은 결과들의 실험군별 상호비교를 한 평균치는 평균표준오차(meanSD)로써 산출하였다. 실험군들 간의 통계처리는 Student's t-test를 하였고 P-value가 0.05 미만인 경우 유의한 것으로 판정하였다.The mean value of the results obtained by the above-mentioned experiment was compared with the mean standard deviation (mean SD). Statistical analysis was performed by Student's t-test and the P-value was judged to be significant when the value was less than 0.05.

본 발명에 따른 멸치 분말의 일반성분은 하기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 수분 3.3중량%, 조단백질 26.6중량%, 조지방 1.6중량%, 조회분 66.0중량% 및 탄수화물 2.5중량%였다. The general components of the anchovy powder according to the present invention are 3.3% by weight of moisture, 26.6% by weight of crude protein, 1.6% by weight of crude fat, 66.0% by weight of ash and 2.5% by weight of carbohydrate.

Figure pat00001
Figure pat00001

멸치 분말은 조회분의 함량이 66.0%로 가장 높은 함량을 보여 무기질의 공급원으로서의 가능성을 보여주었고, 그 다음으로 조단백질의 함량이 26.9%로 가장 높아 가공공정의 개선이 이루어진다면, 보다 많은 협잡물의 제거로 높은 무기질 함량의 증가를 꾀할 수 있으리라 기대된다. 반면 조단백질의 함량이 높은 것으로 나타나 멸치 분말은 단백질 공급원으로서 식품소재로의 이용 및 활용 가능성을 보여주고 있다.Anchovy powder showed the highest content of ash content (66.0%) as the source of minerals, followed by crude protein (26.9%), Which is expected to increase the inorganic content. On the other hand, the content of crude protein was high, indicating that the anchovy powder could be used as a food material and utilized as a protein source.

한편, 한약재 추출물(한방추출물)은 하기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 수분 18.1중량%, 조단백질 7.5중량%, 조지방 0.9중량%, 조회분 5.5중량% 및 탄수화물 68.0중량%였다. As shown in the following Table 2, the extracts of Oriental herbal medicine extracts were 18.1% by weight of water, 7.5% by weight of crude protein, 0.9% by weight of crude fat, 5.5% by weight of ash and 68.0% by weight of carbohydrate.

Figure pat00002
Figure pat00002

상기 한방추출물은 탄수화물분의 함량이 68.0%로 가장 높은 함량을 보였고, 그 다음으로 수분, 조단백질, 조회분, 조지방의 순으로 나타나 조회분의 함량이 가장 낮은 것으로 판명되었다.The contents of carbohydrate were 68.0%, followed by moisture, crude protein, crude fat and crude fat.

멸치 분말을 대상으로 무기질 함량을 분석한 결과는 표 3에 나타내었다.Table 3 shows the results of analyzing the mineral content of anchovy powder.

Figure pat00003
Figure pat00003

칼슘 24.4g/100g ash, 인 13.3g/100g ash으로 구성되어 있었고, 나트륨, 칼륨 및 마그네슘은 0.10.5g/100g ash으로 미량 함유되어 있었다. 중금속의 경우 납(0.1mg/kg ash), 비소(0.1mg/kg ash)와 수은(불검출 0.0mg/kg ash)은 원료 안전성에 전혀 문제가 되지 않은 것으로 조사되었다. 이는 멸치의 경우 청정해역으로 알려진 남해안에서 어획되어 오염 정도가 적은 것으로 판단되었다.Calcium, 24.4g / 100g ash, phosphorus 13.3g / 100g ash, and sodium, potassium and magnesium were contained in a small amount as 0.10.5g / 100g ash. In the case of heavy metals, lead (0.1 mg / kg ash), arsenic (0.1 mg / kg ash) and mercury (not detected 0.0 mg / kg ash) The anchovy was caught in the southern coast known as the clean sea area, and it was judged that the pollution degree was small.

한방추출물을 대상으로 무기질 함량을 분석한 결과는 표 4와 같다. Table 4 shows the results of analyzing the mineral content of the herbal extracts.

Figure pat00004
Figure pat00004

칼슘분말에 비하여 소량이였지만 칼슘 4.3mg/100g ash, 인 11.2mg/100g ash으로 구성되어 있었고, 마그네슘은 8.1mg/100g ash으로 미량 함유되어 있었다. 중금속의 경우 납(0.1mg/kg ash)과 수은(불검출0.0mg/kg ash)은 검출되지 않아 원료 안전성에 전혀 문제가 되지 않은 것으로 분석되었다. 이는 국내산 및 수입산 모두 규격에 통과한 한방소재를 선택하므로 식품안전성에는 큰 문제가 없는 것으로 판단된다.It was composed of calcium 4.3mg / 100g ash and phosphorus 11.2mg / 100g ash though it was a small amount compared with calcium powder, and magnesium contained 8.1mg / 100g ash in trace amount. In the case of heavy metals, lead (0.1mg / kg ash) and mercury (0.0mg / kg ash not detected) were not detected, so it was analyzed that the safety of raw materials was not a problem at all. It is considered that there is no big problem in food safety because it selects the herbal materials which passed both the domestic and imported standards.

납(Pb: Lead)에 의한 오염은 살충제 농약인 비산납 등이 토양을 오염시켜 축적되고 있다(김덕웅, 2005). 납 중독시, 신경, 평활근 장애와 적혈구 중의 헤모글로빈을 감소시켜 빈혈을 유발하며 빈혈, 뇌손상마비, 신장 장애 등의 급성독성 증상과 창백한 피부, 두통, 식욕 감퇴 등의 만성 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Concon, 1988; Choi, 1995; Conor, 1991). 건강기능식품공전에서 기준규격으로 제시한 칼슘 중 납의 허용기준치인 0.3 mg/kg을 충족하는 결과로서 규격보다 3배 정도 낮게 검출되어 납의 안전성에 대해 확인할 수 있었다. Lead (Pb) lead contamination is accumulating due to contamination of soil by insecticide pesticides (Kim Duk-woong, 2005). Lead poisoning is known to cause nervous, smooth muscle disorders and hemoglobin in red blood cells, leading to anemia, causing chronic symptoms such as acute toxic symptoms such as anemia, cerebral palsy, kidney disorder and pale skin, headache, and loss of appetite Concon, 1988; Choi, 1995; Conor, 1991). It was detected as 3 times lower than the standard value as 0.3 mg / kg, which is the limit value of lead in calcium given in the standard of health functional foods.

비소(As: Arsenic)는 특히 토양, 물 및 동식물에 함유되어 있으나 식품에 함유되어 있는 형태는 대부분 독성이 적은 유기 비소 형태로 알려져 있다(유춘철 외, 2005). 섭취시 구토, 혈뇨성 설사를 일으키고 장기간 노출시 식욕부진, 체중감소, 안면부종, 폐색성 황달, 신경염이나 피부각화증을 유발할 수 있다(김미혜 외, 2004.). 멸치 분말 및 한방추출물 모두 낮은 수준의 함량을 보였다.Arsenic (As: Arsenic) is especially found in soils, water, and plants and animals, but the form contained in foods is known to be mostly toxic organic arsenic (Yu, Chuncheol et al., 2005). Ingestion may cause vomiting, hematuria, diarrhea and prolonged exposure may cause anorexia, weight loss, facial edema, obstructive jaundice, neuritis or skin keratosis (Kim, Mi Hye et al., 2004.). Anchovy powder and herbal extracts showed low level contents.

수은(Hg: Mercury)의 경우는 화장품, 의약품, 도료 등에 사용되어온 금속으로 수은광산, 화학공장, 아말감, 체온계, 수은 전지 등에서 오염되며, 오늘날 농작물에 대한 오염원으로는 페닐초산 수은 등 수은계 농약의 토양오염, 공장폐수, 도시하수의 농경지로의 유입을 들 수 있다. 특히 일본에서 발생한 유기 수은 중독인 Minamata병은 어패류 오염으로 중추신경 마비 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다. WTO의 자료에 의하면 식품에서 무기 형태로 존재하는 수은 함량은 20 g/kg 이하로 알려져 있다(Concon, 1988; Choi, 1995; Conor, 1991). 본 발명에 적용되는 멸치 분말 및 한방추출물 모두 검출되지 않아 중금속에 의한 안전성의 문제에 만족할 수준의 분석 결과를 보였다.In the case of mercury (Hg: Mercury), metals used in cosmetics, medicines, and paints are contaminated in mercury mines, chemical plants, amalgam, thermometers, and mercury batteries. Today, contamination sources of agricultural products include mercuric pesticides Soil contamination, industrial wastewater, and urban sewage into farmland. Minamata disease, an organic mercury poisoning in Japan, is known to cause central nerve paralysis due to fish and shell contamination. According to the WTO data, the mercury content present in the form of an inorganic substance in food is less than 20 g / kg (Concon, 1988; Choi, 1995, Conor, 1991). The anchovy powder and the herbal extract applied to the present invention were not detected, and the results of the analysis were satisfactory enough to satisfy the problem of safety by heavy metals.

대장균군은 복합 한약제 추출물과 멸치 분말 모두 음성으로 나타나 건강기능식품공전에서 칼슘의 기준규격으로 제시한 기준을 충족하여 대장균군에 의한 안전성 문제를 확보하였다.The coliform group was negative in both herbal extracts and anchovy powder, and the safety criteria of coliform group was secured by satisfying the criteria set forth in the standard of calcium in the functional food of the health food.

다음에 본 발명에 따른 한방소재 기능성 성분의 최적 추출방법 확립에 대해 설명한다.Next, the establishment of an optimal extraction method of the functional ingredient of the herbal material according to the present invention will be described.

복합 한약제 추출물 조제방법은 동의대학교 한의과대학 및 블루바이오 소재개발 및 실용화 지역혁신센터의 자료에 근거한 노인성 골다공증에 도움을 줄 수 있는 한방소재를 선택하였다. 한방추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기(DM-1000, Daehan Median CO., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 한방소재 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축하여 사용하였다. 사용된 한방소재는 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 거사, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 등으로 골질환 예방 치료 및 치료용으로 알려져 있는 한방소재를 적당한 비율로 혼합하여 사용하였다. Based on data from Dong Eui University and Blue Bio Material Development and Practical Area Innovation Center, we selected herbal ingredients that can help with osteoporosis. The herbal extracts were extracted with 1 kg of herbal ingredients and 4 L of water using a water-cooled circulation extractor (DM-1000, Daehan Median CO., LTD, Seoul, Korea) and extracted at 105 ± 2 ° C for 7 hours. Respectively. The oriental herbal materials used were mixed with oriental herb, which is known for the prevention and treatment of bone disease, such as Sukjunghwang, Angelica gigas, Bogwoji, Gugija, Giugi, Daejang,

본 발명에 적용되는 한방 추출물과 멸치 분말의 제조 방법은 다음과 같다.The method of preparing the herbal extract and anchovy powder according to the present invention is as follows.

본 발명에서는 폐경기 후의 골다공증은 폐경이라는 물리적 현상과 직접적인 관계를 갖고 있으므로, 폐경기 여성의 골다공증 치료에 접근하기 위해서는 노화라는 거시적 관점에서 접근했다.In the present invention, since postmenopausal osteoporosis has a direct relationship with the physical phenomenon of menopause, approach to the treatment of osteoporosis in postmenopausal women was approached from the macro perspective of aging.

폐경(menopause)이란 월경이 완전히 끝난 것을 말하며 폐경이 되는 시기는 대개 49세 전후이다. 폐경은 자궁이나 난소 등이 인위적으로 제거되어도 나타나며 폐경 부인의 75%는 증상이 없으나 약 25%의 경우에서 초기에는 홍조, 작열감, 불면증, 냉한 등의 혈관 운동계 증상이 주로 나타나며 점차 동맥경화증, 재발성 요도염, 골다공증, 비뇨생식기 위축 등이 나타나고 자율신경 계통의 불균형으로 인한 피로감, 의기소침, 현기증, 홍조, 불면, 불쾌감, 집중력 감퇴, 호흡곤란감, 정서불안, 긴장감 등이 함께 나타난다. Menopause is the complete termination of menstruation, and menopause is usually around age 49. In menopause, the uterus or ovaries are removed artificially. 75% of menopausal women have no symptoms, but in about 25%, symptoms of vasomotor system such as flushing, burning sensation, insomnia, Urticaria, osteoporosis, genitourinary atrophy, and fatigue due to imbalance of the autonomic nervous system, depression, dizziness, flushing, insomnia, discomfort, loss of concentration, dyspnea, emotional anxiety, and tension.

의학적인 치료에 있어서는 특별한 금기증상, 예컨대 에스트로겐(estrogen) 의존성 종양, 유방암, 원인 불명의 자궁출혈, 자궁암, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈전 색전성질환 등이 없다면 에스트로겐을 우선적으로 처방한다. 골다공증의 발생빈도를 보더라도 에스트로겐을 투여하지 않은 40대 이후의 부인들은 1,000명 중 75명 꼴이었으나 에스트로겐 투여 후에는 25명 정도로 감소한다.In medical treatment, estrogen is preferentially prescribed in the absence of special contraindications such as estrogen dependent tumors, breast cancer, unexplained uterine bleeding, uterine cancer, stroke, arteriosclerosis, thromboembolic disease, and the like. The prevalence of osteoporosis is estimated to be about 75 out of 1,000 women in their 40s who did not receive estrogen, but to about 25 after the administration of estrogen.

에스트로겐 치료에는 위험성이 내포되어 있는데, 에스트로겐의 발암성이 그것이다. 수년 전에는 프로제스틴 병용요법이 권장되기도 하였지만 최근에는 오히려 유방암을 심화시킨다는 보고가 있다(Schairer et. al., 2000; Stephens et. al, 2000).Estrogen therapy involves a risk, which is the carcinogenicity of estrogen. Although progestin therapy has been recommended several years ago, it has recently been reported to exacerbate breast cancer (Schairer et al., 2000; Stephens et al., 2000).

따라서 한방부인과학에서는 골다공증을 만성 갱년기 장애의 한 유형으로 보고 폐경기 질환의 범주에서 다루고 있다. 따라서 폐경의 전반적인 신체변화를 중심으로 신장과 간이 허약해져서 부인과질환이 올 경우에는 육미지황탕과 우귀환을 가미하여 활용한다는 보고가 있다(한방부인과학, 2001).Therefore, in Oriental gynecology, osteoporosis is regarded as a type of chronic menopausal disorder and is dealt with in the category of postmenopausal disease. Therefore, it has been reported that when the kidney and liver are weakened due to the general physical changes of menopause, gynecologic diseases come to be used with the addition of the Korean herbivorous ginseng and the feathers.

또한, 단독 또는 2가지 정도의 한약재와 칼슘의 병용 보고 논문 및 골다공증에 대한 발표 논문, 특허, 보고서 등을 종합하여 표와 같은 복합한방추출물 레시피를 마련하였다. In addition, a combined herbal extract recipe such as a table was prepared by collecting reports on the use of single or two herbal medicines and calcium, and published papers, patents, and reports on osteoporosis.

숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 등을 주요성분으로 한약재를 배합하고 추출물의 분말을 제조하였다. 구체적인 배합비는 표 5와 같다. Extract powder was prepared by blending medicinal herbs with main ingredients such as Sukjanghwang, Angelica gigas, Bokseongbo, Gugija, Quail, Wassle, Broiler, Velvet, Licorice, The specific compounding ratios are shown in Table 5.

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숙지황은 Scrophulariaceae과에 속하는 지황(Rehmannia glutinosa var. purpurea)의 뿌리를 9번 증숙하여 건조한 것으로 본초학적으로 생식기능감퇴와 노화성으로 온 골다공증에 효능이 있는 것으로 화학성분으로는 tyrosine, ajugol, 8-epi-Loganic acid, Alanine, Aucubin, Catalpol, Glutamic acid, Isoleucine, Rehmaionoside 이 중 aucubin은 콜라겐(collagen) 합성 촉진작용을 한다.Sukjipheong belongs to the genus Scrophulariaceae ( Rehmannia There is glutinosa . purpurea), which has been shown to be effective for osteoporosis, which has lost its reproductive function and aging, has been used as a herb. It has been known that tyrosine, ajugol, 8-epi-Loganic acid, Alanine, Aucubin, Catalpol, Glutamic acid, Isoleucine, Rehmaionoside Among these, aucubin promotes collagen synthesis.

당귀는 미나리과에 속하며 여성을 위한 약초라고 할 만큼 부인병에 효과적으로 방풍의 대용으로 쓰기도 한다. 뿌리가 약재로 쓰이는데, 뿌리의 주요 성분으로는 pyranocoumarin계 decursin, decursinol의 AChE 억제작용 등이 보고되어 있고 방향성 정유와 당류와 비타민 E 등이 함유되어 있다. Niwa 등(2001)은 당귀의 brefeldin A가 p53 의존성 기전에 의해 파골세포의 apoptosis를 유도함으로써 osteoclastic bone resorption를 저해하는 것으로 보고하였다. Angelica is a herbaceous plant belonging to the family, and can be used effectively as a substitute for windsurfing for women. Roots are used as medicinal materials. The main components of the roots are pyranocoumarin type decursin and decursinol, AChE inhibitory action, and aromatic essential oil, saccharides and vitamin E. Niwa et al. (2001) reported that angelfish brefeldin A inhibited osteoclastic bone resorption by inducing osteoclast apoptosis by a p53-dependent mechanism.

골쇄보는 고란초과의 뿌리를 건조한 것으로 근육과 뼈를 강하게 하며 통증을 억제하고 소염, 강장작용, 타박상 등의 염증을 완화 효능이 있는 것으로 알려져 있다. Yamaguchi(1999) 등은 난소절제로 유발한 골다공증 마우스에 대해 골쇄보가 골무게의 손실을 유의성 있게 억제하였다고 보고하였다(Yamaguchi K., 1999). 또한 골쇄보는 한의학적으로 신양을 보함으로써 비뇨생식기뿐만 아니라 근골을 강화는 효능이 있음이 알려져 있다.It is said to be effective in relieving inflammation such as inflammation, tonic action, bruise, etc. It suppresses pain and strengthens muscles and bones by drying roots of gonorrhoeae. Yamaguchi et al. (1999) reported that bone grafting significantly inhibited bone loss in osteoporotic osteoporotic mice (Yamaguchi K., 1999). It is also known that the hernia can be strengthened not only in the genitourinary system but also in the muscularis by viewing Xinyang as a medicinal herb.

구기자는 가지과에 속하는 구기자나무(Lycium chinense , L. barbarum)의 열매(Lycii fructus)를 말한다. 본초학에서는 화학성분으로는 phenol류와 sterol류, enol류, betaine, diosgenin, kukoamine A, lyciumamide, lyciumin, stigmasterol, sugiol, beta-amyrin, beta-Sitosterol 등이 검정되어 있는데, 구기자의 약리연구에 대해서는 주로 간세포보호작용과 방사선 보호작용에 대한 연구들이 있는데 이는 모두 손상 및 노화된 세포의 재생 효능 작용에 의한 것으로 밝혀져 있다. The Gugija belongs to the family Gugija ( Lycium chinense , L. barbarum ) ( Lycii fructus ). In herbal medicine, phenol and sterols, enol, betaine, diosgenin, kukoamine A, lyciumamide, lyciumin, stigmasterol, sugiol, beta-amyrin and beta-sitosterol have been tested as chemical components. There are studies on hepatocyte protection and radiation protection, all of which have been shown to be due to the regenerative action of damaged and senescent cells.

두충은 두충과에 속한 두중(Eucommia ulmoides)의 나무껍질을 건조한 것이다. 간과 신장을 보호하고, 근골격계 질환을 예방하는 효능을 갖고 있어서 골격기능과 호르몬 기능 유지와 관련된 작용을 한다. 화학성분으로는 ajugoside, aucubin, betulin, caffeic acid, eucommioside III, genipin, geniposide, geniposidic acid, syringin, syringoside, alyposide, ligustrin, beta-Sitosterol 등이 밝혀져 있다. 두충의 약리작용은 활성산소를 제거하여 항산화작용을 갖는 한편 Li 등(1998)은 geniposidic acid와 aucubin(Monoterpenoid)이 collagen 합성을 촉진함으로써 근육과 뼈를 강화시키는 작용을 한다고 보고하였다.It is a dried bark of Eucommia ulmoides , which belongs to the genus Duchamp . It protects the liver and kidneys, and has the effect of preventing musculoskeletal diseases, so it plays an important role in maintaining skeletal function and hormone function. It has been found that the chemical components are ajugoside, aucubin, betulin, caffeic acid, eucommioside III, genipin, geniposide, geniposidic acid, syringin, syringoside, alyposide, ligustrin and beta-Sitosterol. Liu et al. (1998) reported that geniposidic acid and aucubin (Monoterpenoid) act to strengthen muscles and bones by promoting collagen synthesis.

우슬은 비름과인 쇠무릎(Achyranthes bidentata , A. japonica)의 뿌리를 지칭한다. 효능은 어혈을 제거하고 진통효과가 있으며, 간과 신장을 보호하고, 근골격계 질환을 예방하는 효능 작용을 하여 노화성 골질환에 효능이 있다. 화학성분으로는 tyrosine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, inokosterone, leucine, oleanolic acid, phenylalanine, proline, serine 등이 있다. 우슬에 대해 Xie 등(2001)은 SOD 활성을 증가시키고 ALT와 AST를 저하시켜 산소라디칼을 제거함으로써 항산화 및 항노화활성을 가지며, 혈액순환과 어혈제거를 촉진하여 만성 간손상을 회복시킨다고 하였다. The whistle is called the Achyranthes bidentata , A. japonica ). The efficacy is efficacious for aging bone disease by eliminating eosinophilia, analgesic effect, protection of liver and kidney, and efficacy to prevent musculoskeletal diseases. The chemical components are tyrosine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, inokosterone, leucine, oleanolic acid, phenylalanine, proline and serine. Xie et al. (2001) reported that SOD activity was increased and ALT and AST were lowered to remove oxygen radicals, and thus, it has antioxidant and anti-aging activity, and promotes blood circulation and eosinophilia to restore chronic liver damage.

육계는 녹나무과에 속하며 나무껍질을 건조시킨 약제로 위를 따뜻하게 하여 근육과 뼈를 강화하며, 혈류 개선을 통한 모든 약제의 흡수를 증진시는 효능이 있다. 또 육계는 중추억제, 진정, 진통, 해열, 관상동맥 혈류량 증가 및 허리와 무릎 연약증 등 약리작용이 있다.Broiler cabbage belongs to the camphoraceae family, and it is a medicine that dried the bark and warms the stomach to strengthen muscles and bones, and it has the effect of improving absorption of all medicines through improvement of blood flow. Broilers also have a pharmacological effect such as central suppression, sedation, analgesia, fever, increased blood flow to the coronary arteries, and weakness in the back and knee.

속단은 꿀풀과에 속하는 속단의 뿌리로서 한국생약규격집에는 Phlomis umbrosa라 규정하고 있다. 화학성분으로는 betonicine이 있는데 이는 항염증활성을 갖고 있으며 succinic acid 및 asperosaponin FH1, cantleyine, daucosterol, venoterpine, -sitosterol 등이 함유되어 있다. 노화로 인한 비뇨생식기능 감퇴, 골격약화, 골절 등 예방에 효능이 있다.The genus is the root of the conifers belonging to the Lamiaceae family, and it is defined as Phlomis umbrosa in the Korean herbal medicine standard collection. The chemical component is betonicine, which has anti-inflammatory activity and contains succinic acid and asperosaponin FH1, cantleyine, daucosterol, venoterpine, and -sitosterol. It has efficacy in prevention of urogenital dysfunction caused by aging, weakening of skeleton, fracture.

감초는 콩과에 속하는 Glycyrrhiza속으로, 주성분은 triterpenoid계 saponin, glycyrrhizin 등이 주성분으로 분해산물인 glucuronic acid는 인체 해독작용, 항산화작용, 항염증작용 및 부신피질호르몬작용 등의 효능이 있어 칼슘제 복용 시 위에 부담과 부작용을 최소화하는 제재로 이용할 수 있다. Glycyrrhiza belonging to the soybean is the main component of licorice, Glycyrrhiza is the major component of the triterpenoid saponin, glycyrrhizin and the main component of degradation products, such as glucuronic acid has the effects of detoxification, antioxidant, antiinflammatory and corticosteroid hormones, It can be used as a material to minimize burdens and side effects.

구척은 뿌리가 길고 잔가지가 많아 개의 등골뼈와 같아 붙여진 이름으로 허리와 다리를 튼튼하게 하며 관절의 움직임을 용이하게 하여 요통, 관절염, 하체무력증에 효능이 있는 것으로 보고되고 있다(박종희 등, 2009).It has long been reported that the roots are long and have many twigs so that they strengthen the back and legs with the same name as the spine bones of the dogs and facilitate the movement of the joints and thus have efficacy for back pain, arthritis and lower incompetence (Jong Hee Park, 2009).

다음에 본 발명에 따른 한방추출물과 멸치 분말 혼합물의 골격대사능 평가하였다.Next, the skeletal metabolism of the herbal extract and anchovy powder mixture according to the present invention was evaluated.

(1) 난소적출로 골다공증을 유도한 Sprague-Dawley (SD) rat을 이용한 in vivo 동물실험(1) in vivo using animals Sprague-Dawley (SD) rat induced osteoporosis in ovariectomized test

1) 실험동물1) Experimental animals

실험에 사용한 동물은 중앙실험동물(주)(서울시, 한국)로부터 구입한 4주령의 암컷 Sprague-Dawley (SD)계 흰쥐를 사용하였다. The animals used in the experiment were female Sprague-Dawley (SD) rats of 4 weeks old, purchased from Central Laboratory Animals Co., Ltd. (Seoul City, Korea).

동의대학교 블루바이오소재개발 및 실용화지원센터의 실험동물시설에서 1주일 간 순화 적응시킨 후 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 건강한 동물을 선택하여 사용하였다.The animals were acclimated for one week at the experimental animal facility of the Center for Development and Commercialization of Blue Bio Materials at Dong - Eui University and the normal symptoms were observed.

시험동물사육은 온도 23±2℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수 10~18회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경을 유지하였으며, 방사선 멸균된 실험동물용 고형사료와 고압멸균한 1차 증류수를 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. The animals were kept at a temperature of 23 ± 2 ° C, a relative humidity of 50 ± 10%, a ventilation frequency of 10 to 18 times / hour, a lighting time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm) And sterilized radioactive sterilized animal feed and high pressure sterilized primary distilled water.

동물실험은 동의대학교 동물실험윤리위원회의 사전 심의를 받아 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.Animal experiments were conducted in accordance with the provisions of the Animal Experimental Ethics Committee under the prior deliberation of the Ethical Committee of Animal Experiments at Dong-Eui University.

2) 난소절제술 및 분류2) Ovarianectomy and classification

실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위하여 도 2에 도시된 바와 같이, 양측 난소 절제술(ovariectomy, OVX)을 시행하였다. 도 2는 본 발명을 적용하기 위해 실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위한 양측 난소 절제술을 나타내는 도면이다.In order to artificially induce osteoporosis by changing the experimental animals to postmenopausal hormone secretion state, ovariectomy (OVX) was performed as shown in FIG. FIG. 2 is a view showing a bilateral ovariectomy for artificially inducing osteoporosis by changing an experimental animal to a postmenopausal hormone secretion state in order to apply the present invention.

무균 조작 하에 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 도 2에 도시된 바와 같이, 10% 포비돈 요오드로 수술부위 및 주위를 소독한 후, 양쪽 등의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 적출하고 절제부위는 흡수성 봉합사로 결찰 및 봉합하였다. As shown in FIG. 2, after sterilization, the surgical site and surrounding area were disinfected with 10% povidone iodine, and then skin, muscle, and peritoneal incisions were performed on both sides of the ovary to expose both ovaries The ovaries were removed and the ablation site was ligated and sutured with an absorbable suture.

난소절제술의 영향을 배제하기 위하여 난소절제술과 동일하게 수술하였지만 난소를 제거하지 않은 대조군(sham-operation, Sham군)과, 난소적출군(OVX), 난소적출 후 멸치 분말 투여군(OVX-AnCa), 난소적출 후 표 6 및 표 7에 도시된 바와 같이, 멸치 분말+한약재투여군(OVX-AnCa-OM) 등 4개 군으로 분류하였다. (OVX-AnCa), ovariectomized group (OVX-AnCa), ovariectomized group (OVX-AnCa), ovariectomized group (OVX-AnCa), and ovariectomized group were excluded from ovariectomy. After ovariectomy, as shown in Table 6 and Table 7, they were divided into four groups such as anchovy powder + herbal medicine group (OVX-AnCa-OM).

Figure pat00006
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Figure pat00007
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3) 시험물질의 추출 및 조제3) Extraction and preparation of test materials

실험에 사용한 한약재들은 (주)대한생약제품(부산시 소재)에서 구입하여 사용하였다. 표 5의 함량비와 같이 건조중량을 각각 달아 4배의 증류수를 가하여 105±2℃에서 7시간 동안 열수 추출하였다. 추출액은 부직포와 Whattman paper No. 1 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 여과한 다음 감압 농축하였으며, 동결건조기(FDU-2000, EYELA, Japan)를 이용하여 동결건조 후 복합한약재추출물 분말을 얻었다. 멸치 분말은 지에스피(주)에서 제공한 것을 사용하였다. 멸치 분말과 한약재 복합 추출물을 1:2 (g/g)의 비율로 균일하게 혼합하여 -80℃의 냉동고에 보관하면서 본 연구의 시료로 사용하였다. The medicinal herbs used in the experiment were purchased from Korean herbal medicine products (Busan city). The same dry weight as that of Table 5 was added, and 4 times of distilled water was added, followed by hot extraction at 105 ± 2 ° C. for 7 hours. The extract solution was a nonwoven fabric and Whattman paper No. 1. And then concentrated under reduced pressure. After lyophilization using a freeze drier (FDU-2000, EYELA, Japan), the herbal extract powder was obtained. The anchovy powder was supplied by JISPI Co., Ltd. Anchovy powder and herbal extracts were mixed uniformly at a ratio of 1: 2 (g / g) and stored in a freezer at -80 ℃ for use as a sample.

4) 투여용량 설정 및 투여방법4) Setting dose and method of administration

강제경구 투여 전 4시간 동안 절식시킨 다음, 체중을 측정하고 체중 범위에 따른 무작위법에 의거하여 암컷 Sprague-Dawley (SD)계 흰쥐를 각각 32마리의 실험동물을 8마리씩 실험군을 표 8과 같이 분리하였다. The mice were fasted for 4 hours before the forced oral administration and the body weights were measured. Then, the female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 8 experimental animals of 32 animals each according to the weight range Respectively.

Figure pat00008
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투여 용량은 이전의 보고(김향숙 등, 2013)를 참고하여 멸치 분말 시료의 용량을 정하였으며 한약재 복합 추출물 분말의 용량은 1:1 등비를 투여 2주 후 혈청의 칼슘변화량을 확인하여 한약재 복합 추출물 분말의 총 투여량을 200 mg/day 멸치 분말 시료의 투여량을 100 mg/day로 용량을 설정하였다. 실험군에 따라 정해진 용량을 경구투여용 스테인레스 재질 존데를 이용하여 경구투여 하였다. 1일 1회 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며, 음수는 제한 없이 계속 공급하였다. 실험군 1인 OVX-AnCa군에는 멸치 분말(100 mg/day)을 멸균된 생리식염수에 현탁하여 투여하였으며, 실험군 2인 OVX-AnCa-OM군에는 멸치 분말과 복합한약재추출물을 표 8에 기술되어 있는 것과 같은 용량을 생리식염수 1 mL에 현탁하여 투여하였다. Sham군과 OVX군에는 생리식염수 동량을 같은 방법으로 투여하였다. 실험동물의 개별특성에 따라 한꺼번에 투여가 불가능할 경우에는 같은 날에 2회에 걸쳐 나누어 투여하였다. The dose of anchovy powder was determined with reference to the previous report (Kim, Hyang-sook, etc., 2013). The dose of the herbal extracts was 1: 1, The dose of 200 mg / day anchovy powder was set at 100 mg / day. The dose determined according to the experimental group was orally administered using a stainless steel sonde for oral administration. Feeds were restricted for 2 hours after the test substance once daily, and negative water was continuously supplied without limitation. Anchovy powder (100 mg / day) was suspended in sterilized physiological saline and OVX-AnCa-OM group 2 was administered to the experimental group 1 OVX-AnCa group. Was suspended in 1 mL of physiological saline and administered. The same amount of saline was administered to Sham group and OVX group. When the animals were unable to be administered at one time according to the individual characteristics of the animals, they were divided into two doses on the same day.

5) 일반증상 관찰 및 체중측정5) General symptom observation and weight measurement

투여 당일에는 투여 직후 30분 동안에는 이상증상 유무에 대해 지속적으로 관찰하였고, 투여 후 6시간까지 매시간, 투여 후 1일부터 14일까지는 1일 1회 일정한 시간에 일반 상태의 변화, 중독 증상의 발현, 사망 동물의 유무 및 기타 이상 증상에 대하여 관찰하였다. On the day of dosing, the presence or absence of abnormal symptoms was observed continuously for 30 minutes immediately after administration. Changes in the general state, manifestation of poisoning symptoms, and the like were observed at a certain time once a day from day 1 to day 14, Presence of dead animals and other abnormal symptoms were observed.

체중변화 관찰은 모든 동물에 대하여 12시간 동안 절식시킨 다음 실험동물용 저울을 이용하여 1주일에 1회, 실험 일정상 정해진 시간에 측정하였다.Observations of changes in body weight were performed on all animals for 12 hours and then measured once a week using a laboratory animal scale at the normal time of day.

8주간의 체중을 매일 일정한 시간에 측정한 결과, Sham군의 경우에는 체중이 정상적으로 증가한 반면, 난소를 적출하여 골다공증이 유발된 OVX군의 경우에는 지속적인 체중이 증가하였다. OVX 처리를 한 후 시료를 투여한 실험군 2개 군인 OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 경우에는 OVX군에 비해서는 도 3에 도시된 바와 같이, 유의한 차이의 체중 감소의 경향을 보였다. 도 3은 8주간의 체중을 매일 일정한 시간에 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 체중 변화를 나타내는 그래프이다.The 8-week body weight was measured at regular intervals over a period of time. As a result, the body weight of the Sham group was increased normally while the OVX group, which was ovariectomized and ovariectomized, continued to gain weight. The OVX-AnCa group and the OVX-AnCa-OM group, which were two experimental groups after OVX treatment, showed a significant difference in weight loss as shown in FIG. 3 as compared to the OVX-AnCa-OM group . FIG. 3 is a graph showing changes in body weight in the Sham group, the OVX group, the OVX-AnCa group, and the OVX-AnCa-OM group as a result of measuring the body weight for 8 weeks at a constant time every day.

난소를 절제한 실험동물은 에스트로겐의 결핍 때문에 전반적으로 체중이 증가하는 것으로 알려져 있다(Mobasseri S et. al., 2004). 난소를 적출하여 골다공증을 유발한 OVX군의 체중증가는 이와 같은 갱년기 여성에 있어 체중증가가 일어나는 현상과 일치한다. 한편 실험군 2개 군에서의 상대적 체중감소는 이러한 갱년기 이후에 동반되는 골다공증에 대한 개선효과를 반증하는 결과이다.The ovariectomized experimental animals are known to have an overall increase in body weight due to estrogen deficiency (Mobasseri et al., 2004). The weight gain of the OVX group, which has been induced by ovariectomy to induce osteoporosis, is consistent with the phenomenon of weight gain in these menopausal women. On the other hand, relative weight loss in the two experimental groups disproved the improvement in osteoporosis associated with these menopausal years.

6) 혈액채취 및 부검6) Blood collection and autopsy

실험동물을 희생시키기 전 12시간 절식시킨 후 데시케이터 안에 디에틸 에테르를 적당량 취하여 마취시킨 뒤 하복부를 개복하고, 멸균주사기를 이용하여 심장 채혈법으로 혈액을 채취하였다. The animals were fasted for 12 hours before sacrifice, and then anesthetized with an appropriate amount of diethyl ether in a desiccator. The lower abdomen was opened and blood was collected by a cardiac syringe using a sterile syringe.

혈액채취 후에 주요 내부 장기의 병변을 각 실험군과 대조군을 육안적으로 관찰하여 이상 유무를 확인하였다. After blood sampling, lesions of major internal organs were visually observed in each experimental group and control group to confirm the abnormality.

4개의 실험군 모두에서 주요 내부 장기들의 특이한 이상함은 관찰되지 않았으나, 뚜렷한 체중증가가 이루어진 OVX군과 OVX-AnCa군, OVX-AnCa-OM군에서는 내장지방이 Sham군에 비해 상대적으로 많이 관찰되었다.No significant abnormalities were observed in the major internal organs in all four experimental groups, but visceral fat was relatively higher in the OVX, OVX-AnCa, and OVX-AnCa-OM groups than in the Sham group.

다음에 골밀도를 측정하였다.Next, bone mineral density was measured.

8주간의 투여 후 실험동물을 희생시키고 양쪽의 대퇴골을 분리하여 적출한 다음 골격에 붙어있는 근육, 인대 및 지방을 제거하고 생리식염수로 세정한 후, 50℃에서 건조하여 대퇴골 시료를 준비하였다. After 8 weeks of administration, the experimental animals were sacrificed and both femurs were separated and removed. The muscle, ligament and fat attached to the skeleton were removed, washed with physiological saline, and dried at 50 ° C to prepare a femur bone sample.

소동물용 에너지 방사선 골밀도 측정기(pDEXA X-ray bone densitometer, Norland medical systems Inc., USA)를 사용하여 대퇴골의 골밀도를 측정하였다. 해상도는 1.0×1.0 mm, 스피드는 20 mm/sec, 샘플의 길이는 1.60 cm, 폭(너비)은 3.90 cm로 설정하여 측정하였다.The bone mineral density of the femur was measured using a pDEXA X-ray bone densitometer (Norland medical systems Inc., USA) for small animals. The resolution was 1.0 × 1.0 mm, the speed was 20 mm / sec, the length of the sample was 1.60 cm, and the width was 3.90 cm.

각각의 실험군에서 8마리의 SD-rat을 이용하여 측정한 결과, Sham군과 OVX군의 경우에는 상대적으로 낮은 골밀도를 나타내었으며, OVX-AnCa 및 OVX-AnCa-OM 등 실험군 2개군의 경우에는 표 9 및 도 4에 도시된 바와 같이, 골밀도의 증가가 통계적으로 유의미하게 나타났다. 도 4는 각각의 실험군에서 8마리의 SD-rat을 이용하여 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 골밀도를 나타내는 도면이다.In the experimental group, 8 SD-rats showed relatively low bone density in the Sham group and OVX group. In the two experimental groups such as OVX-AnCa and OVX-AnCa-OM, 9 and Fig. 4, the increase in bone density was statistically significant. FIG. 4 is a graph showing the bone mineral density in Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group as measured by 8 SD-rats in each experimental group.

Figure pat00009
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Sham군은 평균 0.186 g/㎠, 난소적출을 실시하여 골다공증을 유발한 OVX군은 평균 0.170 g/㎠으로 수치상으로는 약간의 차이를 보였지만, t-test로 유의성을 검증한 결과 유의미한 차이를 나타내었다. 이는 OVX군에서 난소적출로 인해 골다공증이 유발되고 대퇴골의 골밀도가 유의하게 감소되었다는 것을 의미한다.Sham group had 0.186 g / ㎠ and OVX group with osteoporosis showed average 0.170 g / ㎠. However, t-test showed significant difference. This suggests that ovariectomy results in osteoporosis in the OVX group and a significant decrease in femur bone mineral density.

한편 멸치 분말만 투여한 OVX-AnCa 실험군에서는 평균 0.270 g/㎠의 골밀도를, OVX-AnCa-OM 실험군에서는 0.310 g/㎠의 골밀도를 나타내었다. 두 실험군 모두에서 OVX군에 비교하여 높아진 골밀도를 나타내었으며, 복합한약재 추출물을 투여한 OVX-AnCa-OM군에서 가장 높은 골밀도를 나타내었다. On the other hand, mean OVX-AnCa group showed 0.270 g / ㎠ bone density and OVX-AnCa-OM group showed 0.310 g / ㎠ bone density. The OVX-AnCa-OM group showed the highest bone mineral density compared to the OVX group in both experimental groups.

이소플라본, 녹각, 상표소, 젤라틴 등의 골다공증에 대한 영향을 본 다른 보고들의 경우, 정도의 차이는 있지만 골다공증이 유도된 실험동물의 경우에 골밀도가 정상군에 비해 상대적으로 저하되며, 시료를 투여한 실험군의 경우에는 증가하는 현상과 일치하는 경향을 나타내었다(김계엽 등, 2009; 황정수 등, 2010; 이재우 등, 2009; 박정은 등, 2012). Other reports of effects on osteoporosis, such as isoflavones, osteoblasts, osteoblasts, gelatins, etc., show a decrease in bone mineral density relative to the normal group in the case of osteoporosis-induced experimental animals, The results of this study are as follows: (1) In the case of an experimental group, the trend is consistent with the increasing phenomenon (Kim, Kee-Yup, et al., 2009;

다음에 골 칼슘 함량을 측정하였다.Next, bone calcium content was measured.

시료 투여 8주 후에 실험동물을 희생시키고 대퇴골을 절취하였다. 대퇴골에 잔류하고 있는 지방 및 주위조직을 제거하고 생리식염수로 세척한 후 105±5℃에서 건조하여 무게를 측정하여 실험동물의 체중으로 환산하였다. Experimental animals were sacrificed 8 weeks after the administration of the sample and the femur was cut. The fat and surrounding tissues remaining in the femur were removed, washed with physiological saline, dried at 105 ± 5 ° C and weighed to calculate the body weights of the animals.

건조된 대퇴골을 회분 도가니에 각각 담아 550~600℃에서 12시간 동안 완전히 회화시킨 다음 30분 방냉한 후 회분의 무게를 측정하였다. 회화된 회분은 1 N HCl에 용해한 후 1% La2O3로 희석하여 원자흡광광도계(atomic absorption spectrometer, Perkin Elmer Co., Santa Clara, CA, USA)로 칼슘 함량을 측정하였다.The dried femur was placed in the ash crucible and thoroughly stirred at 550 to 600 ° C for 12 hours. After 30 minutes of cooling, the ash was weighed. Concentrated ash was dissolved in 1 N HCl, diluted with 1% La 2 O 3 , and calcium content was measured with an atomic absorption spectrometer (Perkin Elmer Co., Santa Clara, CA, USA).

대퇴골 건조무게는 OVX군에서 유의적으로 낮게 나타났으며, 2개 실험군에서는 Sham군 대퇴골 무게보다 약간씩 증가하는 경향을 나타내었다. 이러한 대퇴골 무게가 골다공증 이전으로의 복귀현상은 젖산칼슘, 우골칼슘, 탄산칼슘 등의 공급에서도 유사한 현상이 나타났다는 이전 주관기관의 보고와 일치한다. Dry weight of the femur was significantly lower in the OVX group and slightly higher than that of the Sham group in the two experimental groups. This return of the femur weight to the pre-osteoporosis state is consistent with previous reports of a similar phenomenon in the supply of calcium lactate, bovine calcium, and calcium carbonate.

대퇴골의 회분 함량의 변화를 보면, OVX군에서는 299.6mg으로 Sham군의 317.8mg에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 반면에 멸치 분말 투여군이나 복합한약재분말 투여군에서는 표 10 및 도 5에 도시된 바와 같이, 323.0mg 과 319.6mg으로 OVX군과 Sham군에 비하여 증가하였으며, 이는 대퇴골 건조무게와 비례하는 경향을 나타내었다. 도 5는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 실험 쥐의 대퇴골 무게(A), 대퇴골의 회분(B), 대퇴골의 칼슘(C와 D)에서 ANCA와 ANCA-OM 공급의 효과를 나타내는 그래프로서, 모든 값은 평균은 SD이다.Changes in the ash content of the femur were 299.6 mg in the OVX group and 317.8 mg in the Sham group. On the other hand, as shown in Table 10 and FIG. 5, in anchovy powder administration group or mixed herbal medicine powder administration group, 323.0 mg and 319.6 mg were increased compared with OVX group and Sham group, which showed a tendency to be proportional to femur dry weight. FIG. 5 shows the results of ANCA and ANCA-B in the femur weight (A), femoral ash (B), and femur calcium (C and D) of experimental rats in the Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX- As a graph showing the effect of OM supply, all values are average SD.

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대퇴골 회분 내의 칼슘함량 또한 유사한 경향을 보였는데, OVX군에서는 217.9mg을 보인 반면에 정상군인 Sham군에서는 141.8mg을, 실험군 2개 군에서도 144.2mg과 46.3mg으로 나타났다. 이는 대퇴골건조무게에 대한 회분속의 칼슘무게를 비율로 계산한 결과에서도 유사하게 나타나, 본 발명에서 사용한 시료 2가지가 대퇴골 무게와 칼슘 증가에 유효함을 입증하였다. The calcium content in the femoral ash was also similar in the OVX group, compared with 141.8 mg in the normal group Sham group and 144.2 mg and 46.3 mg in the 2 experimental group, respectively. This was similarly observed in the ratio of calcium weight in the ash to the dry weight of the femur as a ratio, and it was proved that the two samples used in the present invention are effective for femur weight and calcium increase.

다음에 본 발명에 따른 멸치 칼슘제에 의한 골격대사능 관련 지표의 생화학적 분석을 실행하였다. Next, a biochemical analysis of skeletal metaplasia-related indicators by anchovy calcium according to the present invention was carried out .

오스테오칼신(Osteocalcin)은 골아세포와 상아아세포에서만 생산되는 골격의 산성단백질로, 혈청 내의 오스테오칼신 농도는 골아세포의 활성을 반영하는 것으로 알려져있다(Jayachandran and Miller, 2002). 오스테오칼신은 뼈의 구조에서 칼슘과 단단하게 결합되어 있는데, 새로운 뼈를 형성할 경우에 뼈의 모세포의 활성을 간접적으로 반영하는 뼈의 형성지표로서의 역할 또한 한다. 난소적출을 실시하면 혈청 중의 함량이 다소 감소한다고 보고되고 있다(Duda et. al., 1998).Osteocalcin is an acidic protein in the skeleton that is produced only in osteoblasts and ovarian cells. Osteocalcin concentration in serum is known to reflect the activity of osteoblasts (Jayachandran and Miller, 2002). Osteocalcin is tightly bound to calcium in the bone structure, which, when forming new bone, also serves as an indicator of bone formation that indirectly reflects the activity of the bone cell. It has been reported that ovariectomy results in a somewhat reduced serum content (Duda et al., 1998).

본 발명에서 SD-rat의 혈청 중의 오스테오칼신 함량은 The Rat Gla-Osteocalcin High Sensitive EIA Kit (Cat #MK126, Clontech Laboratories, Inc., CA, USA) 와 96-well plate, 그리고 자동생화학 분석기(BS-390 Automatic biochemistry analyzer, Medista, Korea)를 사용하여 면역혈청학적 방법에 의하여 측정하였다.In the present invention, the osteocalcin content in the serum of SD-rats was measured using a 96-well plate and an automatic biochemical analyzer (BS-390, USA) with the Rat Gla-Osteocalcin High Sensitive EIA Kit (Cat # MK126, Clontech Laboratories, And were measured by immunoassay using automated biochemistry analyzer, Medista, Korea).

실험결과, OVX 군에서 1.23 ng/mL로 가장 낮았으며, Sham군은 1.57 ng/mL로 OVX군에 비하여 유의하게 높은 수치를 나타내었다. 시료를 투여한 실험군 OVX-AnCa과 OVX-AnCa-OM은 OVX에 비해서는 증가된 수치를 보였으나 Sham보다는 낮게 측정되었다. 이 결과는 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여가 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명에 따른 시료 투여가 표 11 및 도 6에 도시된 바와 같이, 난소절제로 인해 유발된 골다공증의 뼈에서 모세포를 활성화시키고 뼈의 파괴세포의 활성도는 감소시켰을 것으로 추정된다. 도 6은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여에 따른 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 나타내는 그래프이다.In the OVX group, the lowest level was 1.23 ng / mL, and the Sham group was 1.57 ng / mL, which was significantly higher than the OVX group. The experimental groups OVX-AnCa and OVX-AnCa-OM were increased compared to OVX but lower than Sham. These results indicate that administration of anchovy powder and administration of the herbal medicine extract may increase the concentration of osteocalcin in the serum. As shown in Table 11 and FIG. 6, it is presumed that the sample administration according to the present invention activates the osteoblasts in osteoporosis caused by ovariectomy and decreases the activity of bone destruction cells. 6 is a graph showing the concentration of osteocalcin in serum according to administration of anchovy powder and combination herbal medicine extract in Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group.

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오스테오칼신은 골과 상아질에 특이적으로 존재하는 단백질로 조골세포의 활동을 나타내는데 가장 민감하다고 알려졌으며, 골아세포에서 생성되어 일부는 골 기질에 축척되고, 일부는 혈액 속으로 방출된다(Price et. al., 1980). 골 형성시에는 골아세포의 활성이 증가되어 혈청 내 오스테오칼신의 농도가 높아져 골 생성의 지표로 이용된다. 또한, 오스테오칼신의 농도는 폐경 후에 증가되며, 폐경 후에 나타나는 골소실율의 예측에 이용된다(육태한 등, 2006). 즉, 혈청 오스테오칼신 농도 증가는 젊은 연령층에서는 골 형성의 증가를 의미하는 긍정적인 면으로 해석되지만, 폐경 후에는 골밀도와 음의 상관관계를 갖는 것으로 보고되어 골 교체율의 증가를 의미한다. Osteocalcin is a protein that is specifically present in bone and dentin, and is known to be most sensitive to osteoblast activity. Osteocalcin is produced in osteoblasts, some of which are accumulated in bone matrix and some are released into the blood (Price et al , 1980). During osteogenesis, osteoblast activity is increased and serum osteocalcin concentration is used as an index of bone formation. In addition, the concentration of osteocalcin is increased after menopause and is used to predict the rate of bone loss after menopause (Ghattahan et al., 2006). In other words, the increase in serum osteocalcin concentration is interpreted as a positive aspect of increased bone formation in younger age group, but it is reported to have a negative correlation with bone mineral density after menopause, which means an increase in bone turnover rate.

본 발명에 따른 실험의 결과는 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여가 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 시료 투여가 난소절제로 인해 유발된 골다공증의 뼈에서 모세포를 활성화시키고 뼈의 파괴세포의 활성도는 감소시켰을 것으로 추정된다. 멸치 분말 투여군에서는 비록 정상군인 Sham군의 수준에는 미치지 않았으나 멸치 분말과 한약재추출물을 동시에 투여한 실험군에서는 정상수치와 유사하게 증가하였다. 이는 한약재추출물이 같이 투여되었을 때 시너지효과를 낼 수 있음을 나타낸다.The results of the experiment according to the present invention show that administration of anchovy powder and administration of the herbal medicine extract can increase the concentration of osteocalcin in the serum. It is presumed that the administration of the sample of the present invention activates the osteoblast in osteoporosis bone caused by ovariectomy and decreases the activity of bone destruction cell. In the anchovy powder administration group, it was similar to that of normal group Sham group but increased in the experimental group treated with anchovy powder and herbal medicine extract similar to the normal value. This indicates that synergistic effects can be obtained when the herb extract is administered together.

다음에 본 발명에 따른 한방추출물과 멸치 분말 혼합물의 생리활성을 평가하였다.Next, the physiological activity of the herbal extract and anchovy powder mixture according to the present invention was evaluated.

(1) 혈액 중 생체기능 지표의 분석(1) Analysis of biological function index in blood

실험동물 혈액 중의 ALP(Alkaline phosphatase), calcium, GOT, GPT등의 지표를 분석하였다. Alkaline phosphatase (ALP), calcium, GOT, and GPT in the blood of experimental animals were analyzed.

실험동물의 심장으로부터 채취한 혈액은 3,000 rpm, 4℃, 15분간 원심분리(Avanti centrifuge J-20XP, Beckman coulter, USA)하여 분리된 혈청을 -70℃에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.The blood collected from the heart of the experimental animals was centrifuged at 3,000 rpm at 4 ° C for 15 minutes (Avanti centrifuge J-20XP, Beckman coulter, USA).

혈액으로부터 분리한 혈청에서 염기성 인산분해효소 ALP분석 Kit (Asan Co. Ltd., Korea)를 사용하였으며, spectrophotometer를 이용하여 500nm에서 정량하였다. ALP assay kit (Asan Co. Ltd., Korea) was used for serum isolated from blood and quantified at 500nm using spectrophotometer.

HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride, GOT, GPT, Ca은 자동생화학 분석기(BS-390 Automatic biochemistry analyzer, Medista, Korea)를 사용하여 면역혈청학적 방법에 의하여 측정하고 분석하였다.HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride, GOT, GPT and Ca were measured and analyzed by immunoassay using an automatic biochemistry analyzer (Medista, Korea).

ALP는 임상에서 가장 흔히 이용되는 골형성 표지자이며, 골아세포가 골형성을 하는 동안 생성되어 그 중의 일부가 혈중에 분비되는 당단백질 효소이다. 난소를 절제한 후에는 ALP의 활동이 증가된다고 알려졌다(Morris, 1993). 혈청 중 ALP의 함량을 보면, 골다공증이 유발된 OVX군에서는 8주 처리 후에 Sham군에 비하여 증가하였다. 한편, 멸치 분말과 복합한약재추출물을 투여한 실험군에서는 표 12 및 도 7에 도시된 바와 같이, 각각 110.27 U/L과 108.81 U/L로 Sham군보다도 더 감소한 결과를 보였다. 도 7은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 APL 농도 상태를 나타내는 그래프이다. ALP is the most commonly used bone formation marker in clinical practice, and is a glycoprotein enzyme that is produced during osteoblast formation and some of which is secreted into the blood. After ovariectomy, the activity of ALP was reported to increase (Morris, 1993). Serum ALP levels were higher in the ovariectomized OVX group than in the Sham group after 8 weeks of treatment. Meanwhile, as shown in Table 12 and FIG. 7, in the experimental group in which the anchovy powder and the herbal medicine extract were administered, the values were 110.27 U / L and 108.81 U / L, respectively, which were lower than those of the Sham group. FIG. 7 is a graph showing APL concentration in serum of experimental mice of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group.

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혈청 중 칼슘 농도의 변화 또한 골흡수 지표 중의 하나이다. 뼈에 존재하는 칼슘은 혈청 중 칼슘 농도에 영향을 끼치게 되고, 혈청 중 칼슘농도의 변화는 골흡수율과 관련이 있다(James et. al., 1994). 혈청 중 칼슘 함량을 보면, OVX군에서는 Sham군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 시험물질 투여한 실험군에서는 OVX군과 Sham군에 비하여 그 값이 증가하였다. 이는 표 12 및 도 8에 도시된 바와 같이, 실험군에서 상대적으로 골재생 활동이 활발해지고 있다는 것을 의미한다. 도 8은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 칼슘 농도 상태를 나타내는 그래프이다.A change in serum calcium concentration is also one of the bone resorption indexes. Calcium in the bone affects calcium concentration in the serum, and changes in serum calcium concentration are related to bone resorption (James et al., 1994). Calcium content in serum was significantly decreased in OVX group compared to Sham group. In the experimental group administered with the test substance, the value increased compared to the OVX group and the Sham group. This means that, as shown in Table 12 and FIG. 8, the bone regeneration activity is relatively active in the experimental group. FIG. 8 is a graph showing the calcium concentration status in serum of experimental rats of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group.

GOT와 GPT는 간장이나 심장 등에 다량 존재하여 아미노산을 분해하는 효소로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 이 수치가 상승하게 되므로 간계질환의 지표가 된다(김한수 등, 2010). 본 발명의 실험에서는 실험시료인 복합한약재추출물을 장기간 섭취하였을 경우 나타날 수 있는 간장에 대한 영향을 알아보기 위해 혈청 중의 GOT와 GPT를 측정한 결과, 일반 대조군인 Sham군의 수치가 GOT는 120.61 U/L, GPT는 48.29 U/L로 분석되었으며, 난소적출로 골다공증이 유도된 OVX군의 수치는 각각 242.63 U/L과 59.63 U/L로 GOT는 2배가량, GPT 또한 20% 이상 증가하였음을 알 수 있다. 한편, 실험시료를 급여한 두 실험군인 OVX-AnCa와 OVX-AnCa-OM군은 GOT와 GPT의 수치가 모두 유의하게 감소하였다. 8주간의 투여로 정상군으로 볼 수 있는 Sham군의 수치까지 감소하지는 않았지만, 표 12 및 도 9에 도시된 바와 같이, OVX군에 비해 현저하게 저하된 수치를 볼 수 있었으며, 통계적으로도 유의하다고 분석되었다. 도 9는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 GOT와 GPT를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이러한 결과는 실험시료가 농도에 따라 간장에 대한 영향이 있을 수는 있지만, 골다공증이 있는 동물의 간지수를 낮추어 줄 수 있는 결과로 해석된다.GOT and GPT are abundant in the liver and heart, and are enzymes that degrade amino acids. When hepatocytes are damaged, they are released into the blood, and these levels are elevated, which is indicative of a hepatic disease (Kim, Hansoo, 2010). In the experiment of the present invention, GOT and GPT in the serum were measured to determine the effect of the herbal medicine extract on the long-term intake of the herbal extract. As a result, the value of GOT in the general control group was 120.61 U / L and GPT were 48.29 U / L, respectively. The OVX group in ovariectomized ovariectomized rats was 242.63 U / L and 59.63 U / L, respectively. The GOT was doubled and the GPT was increased by 20% . On the other hand, both GOT and GPT values in the OVX-AnCa and OVX-AnCa-OM groups were significantly decreased in the two experimental groups fed the experimental samples. Although the 8-week administration did not reduce the Sham group to that of the normal group, as shown in Table 12 and FIG. 9, the OVX group was significantly lower than the OVX group, and statistically significant Respectively. FIG. 9 is a graph showing the results of measurement of GOT and GPT in sera from experimental rats of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group. These results are interpreted as a result of lowering the number of livers of osteoporotic animals, although the experimental samples may have an effect on the liver depending on the concentration.

다음에 실험동물 혈액 중의 지질성분 중에서 HDL-, LDL-cholesterol, triglyceride 등의 지표를 분석하였다. Next, the parameters of HDL-, LDL-cholesterol, and triglyceride among the lipid components in the blood of the experimental animals were analyzed.

멸치 분말과 복합한약재추출물을 급여한 골다공증 유발쥐의 혈액중의 지질성분의 특성을 표 13과 도 10에 나타내었다. 도 10은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈액에서 HDL(A), LDL(B) 및 트리글리 세라이드(C)를 나타내는 그래프이다.The characteristics of lipid components in blood of osteoporosis-induced rats fed with anchovy powder and herbal medicine extracts are shown in Table 13 and FIG. FIG. 10 is a graph showing HDL (A), LDL (B) and triglyceride (C) in the blood of experimental rats of Sham group, OVX group, OVX-AnCa group and OVX-AnCa-OM group.

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골다공증이 유발된 OVX군은 정상군인 Sham군에 비하여 HDL-cholesterol 농도가 유의하게 증가하였으며, 멸치 분말과 복합한약재추출물을 투여한 실험군에서도 유의하게 증가하였다. LDL-cholesterol 농도는 실험시료를 급여한 두가지 실험군에서 상대적으로 감소하는 효과가 있었다. 이는 난소 적출 흰쥐를 대상으로 돈피 젤라틴 효소분해물 급여에 의한 혈청 HDL-cholesterol 농도의 상승을 유도했었다(박정은 등, 2012)는 결과와 일치하였다. The ovariectomized OVX group showed a significant increase in HDL-cholesterol concentration compared with that of the normal group Sham, and was also significantly increased in the test group administered with anchovy powder and herbal medicine extract. LDL-cholesterol concentration was decreased in the two experimental groups. This resulted in elevation of serum HDL-cholesterol concentration in the ovariectomized rats by feeding the swine gelatinase hydrolyzate (Park, Jeong Eun et al., 2012).

트리글리 세라이드(Triglyceride)의 경우에 Sham군에 비해 OVX군에서 상당히 증가된 수치(92.24 mg/dL)를 보였다. 실험군에서는 정상군의 수치만큼 떨어지지는 않았지만 유의적으로 감소되는 현상이 관찰되었으며, 한약재추출물을 투여한 실험군에서 그 저하폭이 크게 나타났다. 이는 난소 적출 군은 일반 정상군에 비하여 감소된 TG 수치를 나타낸다는 타 보고(박정은 등, 2012; 박찬수 등, 2008)와는 반대의 경향을 나타내었으나, 시험물질의 투여로 어느 정도 감소되는 경향을 나타내었다. Triglyceride showed a significantly increased value (92.24 mg / dL) in the OVX group compared to the Sham group. In the experimental group, the decrease was not significant but the decrease was significant in the group treated with herbal medicine extracts. In contrast, the ovariectomized group showed a tendency to decrease compared with the normal group (Tang et al., 2008; Park, Chan-soo, 2008) .

다음에 In vitro assay를 통한 복합한약재추출물의 항산화능을 분석하였다.Next, the antioxidant activity of the herbal medicinal herb extracts was analyzed by in vitro assay.

1) DPPH radical scavenging 활성 측정1) DPPH radical scavenging activity measurement

DPPH는 화학적으로 안정성을 띠는 자유라디칼을 가지고 있다. 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내주면서 라디칼이 소멸되고 자주색에서 황색으로 색깔이 변한다. 복합한약제추출물 샘플의 항산화능을 DPPH 라디칼 소거능을 이용하여 측정하였다. DPPH has chemically stable free radicals. When it comes into contact with a substance with antioxidant activity, the radical is extinguished by giving electrons and the color changes from purple to yellow. The antioxidative capacity of the herbal extracts was measured using DPPH radical scavenging ability.

시료 0.2 mL에 에탄올에 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL을 첨가하여 vortex mixer로 5초간 진탕한 후, 암소에서 10분 동안 반응시켰다. 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료용액 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소의 백분율로 나타내었다.0.8 mL of 0.4 mM DPPH solution dissolved in ethanol was added to 0.2 mL of the sample, followed by shaking for 5 seconds with a vortex mixer, followed by 10 minutes of reaction in a dark place. Absorbance was measured at 517 nm using the following microplate reader. The DPPH radical scavenging activity was expressed as a percentage of the absorbance reduction of the sample solution added and the non-added sample.

비타민 C의 일종으로 항산화활성의 표준물질인 ascorbic acid와 비교하였을 때 본 발명에서 사용한 복합한약재추출물 시료는 약 46~54% 정도의 항산화활성을 나타내었으며 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 반면에 표 14에 나타낸 바와 같이, 멸치 분말은 약간의 활성을 나타내었다. Compared with ascorbic acid, a vitamin C antioxidant, the herb extracts of the present invention exhibited antioxidative activities of about 46 to 54% and showed a tendency to increase in a concentration-dependent manner. On the other hand, as shown in Table 14, the anchovy powder showed slight activity.

Figure pat00014
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복합한약재추출물은 또한 기존의 멸치 분말과 단독으로 비교하였을 경우에도 2 mg/mL의 경우에 40% 이상의 강한 항산화활성을 나타내었고, 그 증가경향은 농도 의존적이었다. Compared with the conventional anchovy powder alone, the extracts of the herbal medicine extracts showed a strong antioxidative activity of more than 40% at 2 mg / mL, and the increasing tendency was concentration - dependent.

본 연구에서 투여한 1:2의 비율로 항산화활성을 비교한 경우에도 멸치 분말 단독의 경우에 비교하여 약 30% 정도의 향상된 항산화활성을 나타내었다. 복합한방추출물 단독의 경우보다는 약 15% 정도 저하된 항산화활성을 나타내었지만 이는 1:2의 비율을 적용하기 위해 투여된 절대량이 적기 때문에 나타난 현상으로 분석되었다.  Compared with anchovy powder alone, the antioxidant activity was increased by about 30% when the antioxidant activity was compared with the ratio of 1: 2 administered in the present study. The antioxidant activity of the herbal extracts was lowered by about 15% than that of the herbal extracts alone, but it was analyzed to be due to the small absolute amount administered to the ratio of 1: 2.

2) SOD-like 활성 측정2) Measurement of SOD-like activity

활성산소를 제거시키는 효소(Superoxide Dismutase)의 약자로서 몸 안에 필요 이상의 활성산소가 생겼을 때 이것을 중화하는 작용을 하는 물질이 있는지를 알아보는 실험이다.It is an abbreviation of superoxide dismutase (enzyme) that removes active oxygen. It is an experiment to see if there is any substance that acts to neutralize this excess oxygen when it is necessary.

각 농도별 시료 0.2 mL에 Tris-HCl buffer(50 mM tris containing 10 mM EDTA, pH 8.5, 3 mL)와 7.2 mM pyrogallol(0.2 mL)을 가하고 25에서 10분간 방치하였으며 1 N HCl(1 mL)로 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하여 백분율로 나타내었다. Add 0.2 mL of Tris-HCl buffer (50 mM tris-containing 10 mM EDTA, pH 8.5, 3 mL) and 7.2 mM pyrogallol (0.2 mL) to each 0.2 mL of each concentration and incubate at 25 for 10 min. Add 1 N HCl After stopping the reaction, the absorbance at 420 nm was measured and expressed as a percentage.

DPPH radical scavenging에서와 마찬가지로 표 15에 나타낸 바와 같이, SOD 결과에서도 복합한약재 추출물 시료는 농도 의존적으로 항산화활성을 나타내었으며, ascorbic acid에 비교하여 약 5053% 정도의 상대활성을 나타내었다. As in the case of DPPH radical scavenging, as shown in Table 15, the SOD results showed that the herbal extract extract had a concentration-dependent antioxidative activity and about 5053% of the ascorbic acid activity.

Figure pat00015
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또한, 기존의 멸치 분말과 단독으로 비교하였을 경우에도 2 mg/mL의 경우에 30% 이상의 강한 항산화활성을 나타내었고, 그 증가경향은 농도의존적이었다. 멸치 분말 단독으로는 미미한 SOD 유사활성을 나타내었다. Also, when compared with the conventional anchovy powder alone, the antioxidant activity was more than 30% at 2 mg / mL, and the increasing tendency was concentration dependent. Anchovy powder alone showed a slight SOD - like activity.

본 발명에서 투여한 1:2의 비율로 항산화활성을 비교한 경우에도 멸치 분말 단독의 경우에 비교하여 약 20% 이상의 향상된 항산화활성을 나타내었다. 복합한방추출물 단독의 경우보다는 약 10% 정도 저하된 항산화활성을 나타내었지만 이는 1:2의 비율을 적용하기 위해 투여된 절대량이 적기 때문에 나타난 현상으로 분석되었다. When the antioxidant activity was compared at the ratio of 1: 2 administered in the present invention, the antioxidant activity was improved by about 20% or more as compared with the case of anchovy powder alone. The antioxidant activity of the herbal extracts was lowered by about 10% than that of the herbal extracts alone.

최근 의학계 보고와 한방여성과학에서는 골다공증은 노화현상과 함께 오는 질환이라는 관점으로 파악하고 있는 점을 고려할 때 항산화활성을 가지는 복합한약재추출물은 그 자체의 골다공증 극복 활성과 더불어 항노화 활성도 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 흡수율이 높은 멸치 분말과 복합처방 될 경우에 골다공증 예방과 개선에 시너지 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다. In view of the fact that osteoporosis is a disease that comes with aging phenomenon in recent medical reports and oriental women's science, it is anticipated that the herbal medicine extract having antioxidant activity will have anti-aging activity in addition to its own activity to overcome osteoporosis. do. In addition, synergistic effects on the prevention and improvement of osteoporosis can be expected in combination with anchovy powder having high absorption rate.

다음에 본 발명에 따른 한방추출물과 멸치 분말 혼합물의 시제품 제작 및 품질 검사를 시행하였다.Next, prototype preparation and quality inspection of the herbal extract and anchovy powder mixture according to the present invention were carried out.

(1) 시제품 제작 및 관능검사(1) Prototype production and sensory evaluation

상술한 결과를 토대로 하여 시제품을 제작하여 관능검사를 시행하였다. 기존의 멸치 칼슘제를 대조군으로 하여 한방소재를 첨가한 칼슘제로 나누어 관능성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 동의대학교 재학생, 절골마을 주민, 주변의 지인 등을 선정하여 실시하였다. 이들에게 관능평가 실험의 목적과 상세 정보를 숙지토록 하고, 조직감(texture), 풍미(flavor), 색(color), 맛(taste), 이물감(feeling of irritation), 전체적 기호도(overall acceptance)를 평가하도록 하였다. 시식은 한 개의 시료를 검사한 후에는 물로 입안을 헹군 후 다른 시료를 시식하고 평가하도록 하였다. 검사 방법은 "매우 좋음(5점), 좋음(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)으로 구분 채점하여 관능검사를 실시하여 가장 기호도가 높은 최적의 조건을 찾았다.Based on the above results, prototypes were prepared and sensory tests were conducted. In order to evaluate the effect of the anchovy calcium supplementation on the sensory evaluation, the subjects were selected from the students of Dong - They should be familiar with the purpose and detail information of the sensory evaluation experiment and evaluate the texture, flavor, color, taste, feeling of irritation, and overall acceptance Respectively. After sampling one sample, the sample was rinsed with water and then another sample was sampled and evaluated. The test method is classified into "very good (5 points), good (4 points), normal (3 points), poor (2 points) and very poor (1 point) I found the condition.

표 16에서와 같이 전 연령층에서 골고루 기존 칼슘제보다는 본 발명에 따른 한방추출물이 배합된 칼슘제에서 높은 평가를 받았다. 특히 고령 연령층으로 갈수록 높은 평가를 받았는데, 한방소재에 대한 편안한 인식과 친숙함의 결과로 판단되며, 웰빙의 이미지가 강한 것으로 나타났다.As shown in Table 16, the herbal extracts of the present invention were highly evaluated in the calcium preparations which were mixed with the calcium compounds rather than the conventional calcium compounds in all ages. Especially, it was highly evaluated by the elderly age group, and it was judged as a result of comfortable recognition and familiarity with oriental herbal materials.

Figure pat00016
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이와 같이 전 연령층에 걸쳐 받은 평가를 토대로 연령층에 맞는 기능성 소재를 개발하고, 차별화된 제형, 차별화된 포장방법 및 디자인을 개발한다면 다양한 소비층으로부터 선택받을 수 있으리라 사료된다.Based on the evaluations received from all ages, it will be possible to develop functional materials suitable for the age group and develop differentiated formulations, differentiated packaging methods and designs.

본 발명에 따른 한방소재에 대한 긍정적 평가를 기반으로 한방소재에 대한 다양한 부가가치의 창출이 기대되며, 식품에 대한 긍정적 이미지의 부합으로 기능성 소재의 개발이 기대된다.Based on the positive evaluation of the herbal materials according to the present invention, it is expected to create various added value for the oriental herbal materials, and development of functional materials is expected with the positive image of food.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.Although the present invention has been described in detail with reference to the above embodiments, it is needless to say that the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications may be made without departing from the spirit of the present invention.

본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제를 사용하는 것에 의해 우수한 고기능성 칼슘제를 제공할 수 있다.By using the age-friendly high-quality anchovy calcium agent using the herbal material according to the present invention, an excellent high-function calcium agent can be provided.

Claims (3)

한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제로서,
숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척으로 이루어진 한약재 추출물과 멸치 분말을 포함하고,
상기 한약재 추출물은 전체 중량 100%에 대해 숙지황 10~20중량%, 당귀 10~20중량%, 골쇄보 10~15중량%, 구기자 10~20중량%, 두충 10~15중량%, 우슬 3~7중량%, 육계 3~7중량%, 속단 3~7중량%, 감초 3~7중량% 및 구척 3~7중량%로 이루어지고,
상기 멸치 분말은 멸치 잔사를 자숙, 수세 및 탈수공정을 거쳐 건조된 후, 500mesh로 분쇄된 것이고,
상기 멸치 분말은 수분 3.3중량%, 조단백질 26.6중량%, 조지방 1.6중량%, 조회분 66.0중량% 및 탄수화물 2.5중량%로 이루어지고, 상기 한약재 추출물은 수분 18.1중량%, 조단백질 7.5중량%, 조지방 0.9중량%, 조회분 5.5중량% 및 탄수화물 68.0중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 멸치 칼슘제.
As an aged-friendly, high-quality anchovy calcium agent using herbal ingredients,
Anchovy powder and an extract of medicinal herbs consisting of a medicinal herb, a medicinal herb, a medicinal herb,
The medicinal plant extract according to claim 1, wherein the medicinal herb extract comprises 10 to 20% by weight of Sulfuric Acid, 10 to 20% by weight of Angelica keiskei, 10 to 15% by weight of bone marrow, 10 to 20% by weight of Gugija, 10 to 15% 3 to 7% by weight, 3 to 7% by weight, 3 to 7% by weight licorice and 3 to 7% by weight,
The anchovy powder was obtained by drying the anchovy residue after lyophilization, washing, dehydration, and pulverization at 500 mesh,
The anchovy powder comprises 18.1% by weight of moisture, 7.5% by weight of crude protein and 0.9% by weight of crude fat. The anchovy powder contains 3.3% by weight of water, 26.6% by weight of crude protein, 1.6% by weight of crude fat, 66.0% by weight of query and 2.5% by weight of carbohydrate. By weight, 5.5% by weight of whey protein, and 68.0% by weight of carbohydrate.
제1항에서,
상기 한약재 추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기를 이용하여 상기 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척의 혼합물 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축한 것을 특징으로 하는 멸치 칼슘제.
The method of claim 1,
The herbal medicine extract was prepared by adding 1 kg of a mixture of Sukjunghwang, Angelica keiskei, Bombyx mori, Gugija, Jugwort, Wusu, broiler, herbaceous, licorice and cormorant and 4 L of water at a temperature of 105 ± 2 ° C for 7 hours using a water- Wherein the anchovy calcium concentrate is concentrated under reduced pressure in a post-rotary concentrator.
제2항에서,
상기 한약재 추출물과 멸치 분말은 중량비로서 1 : 1로 혼합된 것을 특징으로 하는 멸치 칼슘제.
3. The method of claim 2,
Wherein the herbal medicine extract and the anchovy powder are mixed at a weight ratio of 1: 1.
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