KR20170024940A

KR20170024940A - 신경세포로의 분화 촉진을 위한 중간엽 줄기세포의 전처리 배지 및 상기 전처리 배지를 이용한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진 방법

Info

Publication number: KR20170024940A
Application number: KR1020150120568A
Authority: KR
Inventors: 조광원; 조이슬
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2017-03-08

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포의 전처리 배지 및 상기 전처리 배지를 이용한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 줄기세포 배양 배지에 롤리프람을 유효성분으로 포함시킴으로써, 신경세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 전처리 배지 및 상기 전처리 배지를 이용한 신경세포 분화 촉진방법에 관한 것이다.

Description

신경세포로의 분화 촉진을 위한 중간엽 줄기세포의 전처리 배지 및 상기 전처리 배지를 이용한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진 방법{Pretreatment culture medium for promoting the differentiation of mesenchymal stem cells into neurons, Method of promoting the differentiation of mesenchymal stem cells into neurons using the same}

줄기세포(stem cell)는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로서, 끊임없이 스스로 증식하는 자가재생능력(Self Renewal)과 신체 내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 능력(Differentiation to specific tissue)을 가진 세포이다.

이와 같은, 줄기세포는 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로도 나눌 수 있다. 즉, 출생 후부터 우리 몸에 있는 여러 종류의 조직에 존재하는 성체줄기세포(Adult Stem Cell)와 인간 생명의 시초가 되는 수정란에서 유래하는 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell)의 두 종류로 구분될 수 있다.

이 중, 성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다.

특히, 골수세포는 쉽게 접근할 수 있고 2종류의 줄기세포를 갖고 있기 때문에 줄기세포의 이상적인 공급처로 여겨지고 있다.

또한, 골수에 존재하는 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시킬 경우, 세포 공급 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 자가 골수를 이용하므로 면역 거부 반응을 포함한 치료상의 문제점도 해결할 수 있는 이점을 갖는다.

한편, 이와 같은 이점을 지니는 중간엽 줄기세포를 활용하여, 세포 치료제로서의 유용성을 높이기 위해서는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 보다 효과적으로 촉진 또는 증진시킬 수 있는 조성물 및 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법에 대한 기술개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허, 제10-1542847호, 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 신경세포로 분화시키는 방법. 한국등록특허, 제10-1541974호, miR29b를 포함하는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 및 방법.

본 발명은 이러한 필요성에 의해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 줄기세포 배양 배지에 롤리프람을 유효성분으로 포함시킴으로써, 신경전구체의 발현을 증진시켜, 신경세포의 분화를 촉진 또는 증진시킬 수 있는 전처리 배지 및 상기 전처리 배지를 이용한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 중간엽 줄기세포 증식 배지; 및 롤리프람(Rolipram);을 포함하는 중간엽 줄기세포의 전처리 배지를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 롤리프람은 상기 증식 배지를 기준으로 0.5μM 내지 25μM이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 증식 배지는 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 증식 배지에서 배양하는 단계; 배양된 중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 증식 배지와 롤리프람(Rolipram)을 포함하는 전처리 배지에서 배양하는 전처리단계; 전처리된 중간엽 줄기세포를 전-유도 배지에서 배양하여 전-유도(pre-induction)하는 단계; 및 전-유도 처리된 중간엽 줄기세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화유도(induction)하는 단계;를 포함하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 전처리 단계는 6시간 내지 24시간 배양한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 전-유도 배지는 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor) 및 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 신경유도 배지는 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 및 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분화 촉진방법으로 분화된 신경세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 신경세포를 포함하는 신경퇴행성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.

본 발명의 전처리 배지 및 상기 전처리 배지를 이용한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진 방법에 의하면, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 유도 전에, 롤리프람을 유효성분으로 포함하는 전처리 배지에 중간엽 줄기세포를 전처리함으로써, 신경전구체의 발현을 증진시켜, 신경세포의 분화를 촉진 또는 증진시킬 수 있다.

도 1a는 0μM 내지 25μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리된 중간엽 줄기세포의 신경전구체 표지분자들의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 1b는 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 시간에 따른 중간엽 줄기세포의 신경전구체 표지분자들의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 1c는 0μM 내지 25μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리된 중간엽 줄기세포의 세포독성(cytotoxicity)을 확인한 그래프이다.
도 1d는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포와 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포에 대하여, 신경 전구체 표시분자들의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 1e는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포와 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포에 대하여, 신경 전구체 표시분자들의 단백질 발현량을 면역블랏 분석한 결과이다.
도 2a는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 또는 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 이들 세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들의 형태적인 변화를 이미지화한 사진이다.
도 2b는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 또는 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 이들 세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들의 신경 분화율을 계산하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2c는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 또는 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 이들 세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들의 신경돌기의 길이를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2d는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 또는 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 이들 세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들의 신경돌기 수를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 중간엽 줄기세포, 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 이후, 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포, 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들에 대하여, 다양한 신경 전구체 표시분자들의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 3b는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 중간엽 줄기세포, 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 이후, 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포, 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들에 대하여, 다양한 신경 전구체 표시분자들의 단백질 발현 수준을 면역세포화학적 염색을 통해 관찰한 이미지이다.
도 3c는 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 중간엽 줄기세포, 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리 이후, 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포, 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리 이후, 신경유도 배지에서 배양하여 분화된 줄기세포들에 대하여, 다양한 신경 전구체 표시분자들의 단백질 발현 수준을 면역블랏 분석한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면에 도시된 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중간엽 줄기세포의 전처리 배지는 신경세포의 분화를 촉진 또는 증진시키기 위한 전처리 조성물로서, 중간엽 줄기세포 증식 배지 및 롤리프람(Rolipram)을 유효성분으로 포함한다.

상기 증식 배지는 통상적으로 줄기세포를 배양을 위해 사용되는 배지이면 제한되는 바가 아니나, 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신을 유효성분으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 증식 배지는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배지일 수 있다.

상기 롤리프람(Rolipram)은 PDE4(phosphodiesterase-4) 효소의 억제제로서, 세포내의 cAMP를 증가하도록 조절하는 화합물로 알려져 있다.

하지만, 본 발명에서는 상기 롤리프람을 이용하여, 배양된 중간엽 줄기세포를 전처리함으로써, 신경세포의 분화를 촉진 또는 증진시키는데 기술적 특징이 있다.

여기서, 상기 롤리프람의 적정 농도는 상기 배지를 기준으로 0.5 μM 내지 25 μM인 것이 바람직하다.

그 이유는 상기 롤리프람이 0.5 μM 미만일 경우에는 신경세포로의 분화 촉진효과가 미미하고, 25 μM를 초과할 경우에는 신경세포로의 분화 촉진효과가 일정수준 이상 증대되지 않기 때문이다.

또한, 하기의 실험예들로부터, 0.5 μM 내지 25 μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 중간엽 줄기세포를 전처리함으로써, 신경세포로의 분화가 촉진되는 것을 실험적으로 입증하였다.

또한, 본 발명은 본 발명의 전처리 배지를 이용한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법을 제공한다.

먼저, 중간엽 줄기세포를 증식 배지에서 배양한다.

여기서, 상기 증식 배지는 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다.

다음, 배양된 중간엽 줄기세포를 본 발명의 전처리 배지에서 배양하는 전처리 단계가 수행된다.

여기서, 상기 전처리 배지는 상기 증식 배지 및 롤리프람을 유효성분으로 포함한다.

또한, 상기 롤리프람는 전술한 바와 동일한 화합물이며, 동일한 농도로 이용되므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

한편, 상기 전처리 단계에서 배양시간은 6시간 내지 24시간 배양되는 것이 바람직하다.

그 이유는 배양하는 시간인 6시간 미만일 경우에는 신경세포로의 분화 촉진효과가 미미하고, 24시간을 초과할 경우에는 신경세포로의 분화 촉진효과가 일정수준 이상 증대되지 않기 때문이다.

다음, 전처리된 중간엽 줄기세포를 전-유도 배지에서 배양하여 전-유도(pre-induction)하는 단계가 수행된다.

여기서, 상기 전-유도 배지는 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor) 및 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하는 것이 바람직하다.

다음, 전-유도 처리된 중간엽 줄기세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화유도(induction)하는 단계가 수행된다.

여기서, 상기 신경유도 배지는 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 및 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법으로 분화된 신경세포를 제공한다.

또한, 상기 신경세포는 롤리프롬으로 전처리되지 않은 줄기세포로부터 분화된 신경세포에 비해, 신경돌기의 길이가 길게 형성되므로, 줄기세포 치료제의 치료적 효능이 개선될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 신경세포를 포함하는 신경퇴행성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

<실시예 및 비교예>

중간엽 줄기세포를 증식배지에 배양하는 단계

본 발명에는 CEFO(Cell engineering for origin, korea)에서 구입한, 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다.

상기 중간엽 줄기세포를 공급자의 지시에 따라 T75 flasks(Becton Dickinson, USA)에서 배양하였다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 다른 자극 보조제 또는 비타민의 공급 없이 10% FBS, L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배양 배지(Gibco, USA)에서 배양하였다.

이때, 상기 중간엽 줄기세포는 37, 5% CO₂의 배양기에서 배양하면서, 7번 계대배양하여, 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

중간엽 줄기세포의 전처리

실시예 1(Roli-MSCs) 제조

준비된 중간엽 줄기세포를 배양 배지(Gibco, USA) 및 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에 배양하여, 전처리된 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

비교예 1(Ctrl-MSCs) 제조

비교예 1로서, 준비된 중간엽 줄기세포를 롤리프람을 포함하지 않는 배양 배지에 배양하여, 롤리프람 전처리되지 않은 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도

실시예 2(Roli-dMSCs) 제조

롤리프람 전처리된 중간엽 줄기세포(실시예 1, Roli-MSCs)를 10% FBS, 10 ng/ml bFGF 및 500μM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)를 함유하는 전-유도 배지에서 24시간 노출시킨 다음, 상기 배지를 100μM 농도의 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA) 및 2%(v/v) DMSO가 함유된 FBS-free media 유도 배지로 교체하여 6시간 동안 배양하여, 신경세포로 분화유도하였다.

비교예 2(dMSCs) 제조

실시예 2와 동일한 방법으로, 롤리프람 전처리되지 않은 중간엽 줄기세포(비교예 1, Ctrl-MSCs)를 신경세포로 분화유도하였다.

실시예 및 비교예 정리

실시예 1	Roli-MSCs	롤리프람 전처리 되지 않은 중간엽 줄기세포
비교예 1	Ctrl-MSCs	롤리프람 전처리된 중간엽 줄기세포
실시예 2	Roli-dMSCs	롤리프람 전처리 없이 신경 유도 배지에서 분화된 중간엽 줄기세포
비교예 2	dMSCs	롤리프람 전처리 후 신경 유도 배지에서 분화된 중간엽 줄기세포

실험예 1

본 실험에서는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도 전에, 배양된 중간엽 줄기세포를 상기 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에 전처리함으로써, 신경세포 분화에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 롤리프람의 농도별, 시간별에 따른 신경 전구체 유전자의 마커 발현량을 확인하고, 상기 롤리프람의 농도별로 처리된 중간엽 줄기세포의 활성도(cell viability)를 확인하였다.

실험예 1-1, 롤리프람의 농도별 전처리에 따른 신경 전구체 유전자의 마커 발현량

먼저, 7번 계대배양한 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

이후, 배양 배지를 기준으로 각각 0μM, 0.5μM, 1μM, 5μM, 25μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지를 제조하였으며, 각각의 전처리 배지에 준비된 중간엽 줄기세포를 12시간 동안 배양한 후 수확하였다.

이후, 수확된 중간엽 줄기세포들의 신경 전구체 유전자(Nestin , CD133)의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하였으며, 그 결과를 도 1a에 도시하였다.

도 1a에 도시된 바와 같이, 10.5μM 내지 25μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 전처리된 중간엽 줄기세포는, 롤리프람을 포함하지 않은 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포와 비교하여, 신경 전구체 유전자(Nestin , CD133)의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1-2, 배양시간별, 롤리프람의 신경 전구체 유전자의 마커 발현량

먼저, 7번 계대배양한 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

이후, 상기 배양 배지를 기준으로 1μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지를 제조하였으며, 상기 전처리 배지에 준비된 중간엽 줄기세포를 0시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 동안 배양한 후 수확하였다.

이후, 수확된 중간엽 줄기세포들의 신경 전구체 유전자(Nestin , CD133)의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하였으며, 그 결과를 도 1b에 도시하였다.

도 1b에 도시된 바와 같이, 6시간 내지 24시간 동안, 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포는 신경 전구체 유전자(Nestin , CD133)의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1-3, 롤리프람의 농도별 전처리에 따른 중간엽 줄기세포의 활성도( cell Vialbility )

먼저, 7번 계대배양한 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

이후, 배양한 중간엽 줄기 세포에서 세포 활성도를 분석(MTT assay)하였으며, 그 결과를 도 1c에 도시하였다.

도 1c에 도시된 바와 같이, 0.5μM 내지 25μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포에서 세포독성(cytotoxicity)이 거의 발견되지 않는 것으로 조사되었다.

즉, 실험예 1-1 내지 1-3을 통하여, 상기 전처리 배지의 롤리프람 최적의 농도는 상기 배양 배지를 기준으로 0.5μM 내지 25μM이며, 전처리 배양시간은 6시간 내지 24시간인 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1-4, 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포와 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포에 대하여, 신경 전구체 표시분자들의 mRNA 발현량 비교

먼저, 7번 계대배양한 중간엽 줄기세포를 준비하였다.

이후, 상기 배양 배지를 기준으로 1μM의 롤리프람을 포함하는 전처리 배지와, 롤리프람을 포함하지 않는 전처리 배지를 각각 제조하였으며, 상기 전처리 배지들에 준비된 중간엽 줄기세포를 12시간 배양한 후 수확하였다.

이후, 수확한 중간엽 줄기 세포에서 신경 전구체 표지분자들(Nestin , Musashi, CD133 , GFAP) 및 다능성 마커 유전자(Nanog , Oct -4)의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하였으며, 그 결과를 도 1d에 도시하였다.

도 1d에 도시된 바와 같이, 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(실시예 1, Roli-MSCs)는, 롤리프람을 포함하지 않은 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(비교예 1, Ctrl-MSCs)와 비교하여, 신경 전구체 표지분자들(Nestin , Musashi, CD133 , GFAP)의 발현량은 증가하고, 다능성 마커 유전자(Nanog , Oct -4)의 발현량은 변화가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1-5, 롤리프람를 포함하지 않는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포와 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 처리된 줄기세포에 대하여, 신경 전구체 표시분자들의 단백질 발현량 비교

실험예 1-4와 동일한 방법으로, 중간엽 줄기세포를 전처리 배지에 배양한 후 수확하였다.

이후, 수확한 중간엽 줄기 세포에서 신경 전구체 표지분자들(Nestin, Musashi, GFAP, Sox-2)의 단백질 발현량을 면역블랏으로 분석하였으며, 그 결과를 도 1e에 도시하였다.

도 1e에 도시된 바와 같이, 실험예 1-4와 마찬가지로 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(실시예 1, Roli-MSCs)는, 롤리프람을 포함하지 않은 전처리 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포(비교예 1, Ctrl-MSCs)에 비해, 신경 전구체 표지분자(Nestin, Musashi, GFAP, Sox-2)의 발현량은 증가한 것을 확인할 수 있었다.

즉, 실험예 1-4 및 실험예 1-5를 통하여, 전처리 배지에 포함된 롤리프람은 다능성 마커 유전자들의 발현량에는 변화를 주지 않고, 신경 전구체 관련 유전자의 발현량은 증가시키므로, 롤리프람은 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시, 매우 효율적인 화합물임을 확인하였다.

실험예 2

본 실험에서는 상기 실험예 1을 통해, 배양된 중간엽 줄기세포를 상기 롤리프람을 포함하는 전처리 배지에 전처리함으로써, 신경 전구체 관련 유전자의 발현량이 두드러지게 증가하는 것을 확인하였는바, 이러한 결과를 통해 롤리프람이 신경 전구세포의 유전자들을 자극하여 신경 세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다고 판단(가정)하였다.

이에 본 실험에서는 실제로 롤르프람의 전처리가 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있는 지를 확인하였다.

실험예 2-1, 줄기세포들의 형태적인 변화 확인

준비된 비교예 1(Ctrl-MSCs), 비교예 2(dMSCs), 실시예 1(Roli-MSCs), 실시예 2(Roli-dMSCs)를 현미경(Eclipse TS100; Nikon, Tokyo, Japan) 및 디지털 카메라(i-solution IMTcam3; JENOPTIK, Jena, Germany)를 이용 이미지화하여 도 2a에 도시하였다.

도 2a에 도시된 바와 같이, 신경 유도 배지에서 신경 분화된 실험군(실시예 2, 비교예 2)에서는 뉴런의 형태가 존재하는 것을 확인할 수 있었으나, 실험군(실시예 1, 비교예 1)에서는 신경 분화가 유도되지 않아, 평평하고 방추 형태의 외관을 가진 줄기세포의 형태 그대로를 보여주었다.

실험예 2-2, 신경 분화율 비교

비교예 2(dMSCs)와 실시예 2(Roli-dMSCs)의 신경분화율 신경 분화율(differentiation rate)을 평가하였다.

그 결과, 도 2b에서 나타낸 바와 같이, 롤리프람으로 전처리시킨 후 신경 유도 배지에서 분화된 중간엽 줄기세포(실시예 2)의 경우, 전처리 없이 분화시킨 비교예 2와 비교하여 신경 세포의 분화가 두드러지게 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2-3, 신경 돌기 비교

비교예 2(dMSCs)와 실시예 2(Roli-dMSCs)의 평균 신경돌기의 길이 및 신경돌기의 수를 측정하였다.

그 결과, 도 2c에 도시된 바와 같이, 롤리프람으로 전처리시킨 후 신경 유도 배지에서 분화된 중간엽 줄기세포(실시예 2)의 경우, 전처리 없이 분화시킨 비교예 2와 비교하여, 평균 신경돌기의 길이가 두드러지게 신장되는 것으로 나타났다

또한, 도 2d에 도시된 바와 같이, 롤리프람으로 전처리시킨 후 신경 유도 배지에서 분화된 중간엽 줄기세포(실시예 2)의 경우, 전처리 없이 분화시킨 비교예 2와 비교하여 신경돌기의 수도 크게 증가한 것을 확인하였다.

실험예 3

본 실험에서는 실제로 다양한 뉴런 특이 마커들의 유전자 발현이 증대되었는지 여부를 확인하였다.

실험예 3-1, 신경 특이적 유전자들의 mRNA 발현량 비교

준비된 비교예 1(Ctrl-MSCs), 비교예 2(dMSCs) 및 실시예 2(Roli-dMSCs)에서

신경 전구체 유전자들과 신경 특이적 유전자들(Nestin , Musashi , CD133 , GFAP, NF -M, MAP -2, KCNH1 , KCNH5)의 mRNA 발현량을 qPCR(quantitaative PCR)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3a에 도시하였다.

도 3a에 도시된 바와 같이, 비교예 1(Ctrl-MSCs)과 비교하여, 신경 유도 배지를 통해 분화시킨 실험군(비교예2, 실시예2)에서 신경 특이적 유전자들의 발현이 증대되는 것을 확인할 수 있었다.

특히, 롤리프람을 전처리한 이후, 분화시킨 실시예 2(Roli-dMSCs)는 롤리프람 전처리 없이 분화시킨 비교예 2(dMSCs)에 비해 mRNA 발현량이 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3-2, 면역세포화학적 염색

준비된 비교예 1(Ctrl-MSCs), 비교예 2(dMSCs) 및 실시예 2(Roli-dMSCs)에서 신경 전구체 표시분자와 신경 특이적 표시분자들(Nestin, NF-M, TUJ-1)의 발현수준을 면역세포화학적 염색을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 3b에 도시하였다.

도 3b에 도시된 바와 같이, 비교예 1(Ctrl-MSCs)의 경우, 신경 전구체 표시분자와 신경 특이적 표시분자들(Nestin, NF-M, TUJ-1)의 항체에 약하게 염색되었으나, 신경 유도 배지를 통해 분화시킨 실험군(비교예2, 실시예2)은 신경 전구체 표시분자와 신경 특이적 표시분자들(Nestin, NF-M, TUJ-1)의 항체에 강하게 염색되었고, 형태적인 변화가 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3-3, 면역블랏 분석

준비된 비교예 1(Ctrl-MSCs), 비교예 2(dMSCs) 및 실시예 2(Roli-dMSCs)에서 신경 특이적 표시분자들(Nestin, MUsashi, Sox-2, NF-M, TUJ-1)의 발현수준을 면역블랏을 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 3c에 도시하였다.

도 3c에 도시된 바와 같이, 비교예 1(Ctrl-MSCs)과 비교하여 신경 유도 배지를 통해 분화를 유도한 실험군(비교예 2, 실시예 2)은 신경 전구체 표시분자와 신경 특이적 표시분자들(Nestin, MUsashi, Sox-2, NF-M, TUJ-1)의 발현레벨이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

중간엽 줄기세포 증식 배지; 및
롤리프람(Rolipram);을 포함하는 중간엽 줄기세포의 전처리 배지.
제 1항에 있어서,
상기 롤리프람은 상기 증식 배지를 기준으로 0.5μM 내지 25μM인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 전처리 배지.
제 1항에 있어서,
상기 증식 배지는
소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 전처리 배지.
중간엽 줄기세포를 증식 배지에서 배양하는 단계;
배양된 중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 증식 배지와 롤리프람(Rolipram)을 포함하는 전처리 배지에서 배양하는 전처리단계;
전처리된 중간엽 줄기세포를 전-유도 배지에서 배양하여 전-유도(pre-induction)하는 단계; 및
전-유도 처리된 중간엽 줄기세포를 신경유도 배지에서 배양하여 분화유도(induction)하는 단계;를 포함하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법.
제 4항에 있어서,
상기 롤리프람은 상기 증식 배지를 기준으로 0.5μM 내지 25μM인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법.
제 5항에 있어서,
상기 전처리 단계는
6시간 내지 24시간 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법.
제 4항에 있어서,
상기 전-유도 배지는
소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor) 및 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법.
제 4항에 있어서,
상기 신경유도 배지는 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 및 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법.
제 4항에 있어서,
상기 증식 배지는
소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진방법.
제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 분화 촉진방법으로 분화된 신경세포.
제 10항의 신경세포를 포함하는 신경퇴행성 질환 치료용 약학 조성물.