KR20170015852A - Novel cell penetrating peptide - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a novel cell penetrating peptide derived from melittin and showing low cytotoxicity and high cytopermeability; a polynucleotide for coding the peptide; an expression vector including the polynucleotide; a transformant having the expression vector introduced thereto; and an intracellular drug delivery composition including the cell penetrating peptide and a targeted drug. Although being derived from melittin, the cell penetrating peptide of the present invention does not show cytotoxicity that melittin has at all. Also, although being not covalently bound with a targeted drug, the cell penetrating peptide of the present invention shows excellent cytopermeability capable of feeding a targeted drug into cells. Thus, the cell penetrating peptide of the present invention can be widely utilized in developing intracellular drug delivery formulations.

Description

신규한 세포투과성 펩타이드{Novel cell penetrating peptide}A novel cell permeable peptide {Novel cell penetrating peptide}

본 발명은 신규한 세포투과성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 멜리틴으로부터 유래되어, 낮은 세포독성과 높은 세포투과성을 나타내는 신규한 세포투과성 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 세포투과성 펩타이드와 목적하는 약물을 포함하는 세포내 약물전달용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a novel cell permeable peptide, and more particularly to a novel cell permeable peptide derived from melittin exhibiting low cytotoxicity and high cell permeability, a polynucleotide encoding said peptide, , A transformant into which the expression vector has been introduced, and a composition for delivering a drug to cells comprising the cell permeable peptide and a desired drug.

일반적으로, 세포막은 대부분의 외래물질이 세포내로 유입되는 것을 방지하는 장벽으로서의 기능을 나타낸다. 이러한 세포막의 기능은 세포를 보호하기 위한 필수적인 역할이지만, 약학적인 측면에서는 치료를 위한 약물의 전달을 저해하는 주된 요인이 되고 있다. 상기 약물을 세포내로 전달하기 위해 사용되는 방법으로는 세포막에 존재하는 ATP-결합 수송 분자를 통한 능동수송 시스템을 이용하는 방법과, 세포막을 강제적으로 투과하는 방법으로 구분되는데, 능동수송 시스템을 이용하는 방법을 사용할 수 있는 약물은 극히 제한되므로, 대부분 세포막을 강제적으로 투과하는 방법이 사용되고 있다. 상기 세포막을 강제적으로 투과하는 구체적인 방법으로는 양이온성 지질/리포좀, 세포투과성 펩타이드, 마이크로-주사, 바이러스 등을 이용하여 약물을 세포내로 전달하는 방법을 들 수 있는데, 약물에 따라 사용될 수 있는 방법이 제한되고 있어, 세포막을 강제적으로 투과하는 새로운 방법을 개발하기 위한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.In general, cell membranes function as barriers to prevent most extraneous substances from entering cells. Although the function of these cell membranes is essential for protecting cells, it is a major factor in inhibiting the delivery of drugs for treatment in terms of pharmacy. Methods used to deliver the drug into cells include an active transport system using an ATP-binding molecule present in the cell membrane, and a method of forcibly passing a cell membrane. A method using an active transport system Since the drugs that can be used are extremely limited, a method of forcibly permeating the cell membrane is mostly used. Specific methods for forcibly permeating the cell membrane include a method of delivering a drug into cells using a cationic lipid / liposome, a cell permeable peptide, a micro-injection, a virus and the like. And research is underway to develop new methods for forcibly permeating cell membranes.

상기 방법 중에서 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 이용하는 방법은 대체로 세포막 투과성을 나타내는 펩타이드인 CPP에 목적하는 약물을 결합시킨 결합체를 이용하여 목적하는 약물을 세포내로 전달하는 방법인데, 이러한 CPP로는 대표적으로 HIV-1 TAT 전좌 도메인(Green; M. and Loewenstein, P.M. (1988) Cell 55, 1179-1188), 안테나페디아(Antennapedia) 단백질의 호메오도메인(Joliot; A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868) 등을 들 수 있고, 이들 이외에도 다양한 종류가 알려져 있을 뿐만 아니라, 지속적인 연구를 통하여 개발되고 있다. 이들 CPP는 공통적으로 염기성 아미노산을 비교적 높은 함량으로 포함하고, 양친매성을 나타내며, 대체로 50개 이하의 아미노산 서열로 구성된다는 특징을 나타낼 뿐만 아니라, 세포막의 안정성을 저해하여 세포막을 손상시키거나 또는 파괴하여 세포독성을 나타낸다고 알려져 있다. Among the above methods, a method of using a cell penetrating peptide (CPP) is a method of delivering a desired drug into a cell by using a conjugate in which a desired drug is bound to CPP, which is a peptide showing cell membrane permeability, Representative examples include the HIV-1 TAT translocation domain (Green; M. and Loewenstein, PM (1988) Cell 55, 1179-1188), the homeodomain of Antennapedia protein (Joliot; A. et al. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868). In addition to these, various types are known and are being developed through continuous research. These CPPs commonly include a relatively high content of basic amino acids, exhibit amphipathic nature, and are generally composed of no more than 50 amino acid sequences. In addition, the CPPs inhibit cell membrane stability and damage or destroy cell membranes Is known to exhibit cytotoxicity.

이처럼 세포독성을 나타내는 CPP의 하나로서 멜리틴(melittin)을 들 수 있다. 봉독(bee venom, apitoxin)의 주성분으로 알려진 멜리틴은 26개의 아미노산으로 구성되고, 나노몰 단위로 사용될 경우에도 심각한 세포독성을 나타내며, 세포투과성을 나타내는 펩타이드로 알려져 있다. 상기 멜리틴은 다른 CPP와는 달리 목적하는 약물과 직접적으로 결합체를 형성할 경우는 물론, 직접적으로 결합체를 형성하지 않고, 목적하는 약물과 혼합하여 비공유결합적 복합체를 형성한 경우에도, 상기 목적하는 약물을 세포내로 전달할 수 있다는 특징을 나타낸다. 예를 들어, 미국공개특허 제2013-0281658호에는 아시알로당단백질 수용체(asialoglycoprotein receptor, ASGPr)에 멜리틴이 결합된 결합체를 이용하여 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드를 간세포 내로 전달하는 기술이 개시되어 있다. 이같은 멜리틴은 목적하는 약물과의 결합이 필요하지 않다는 점에서 종래의 CPP에 비하여 현저한 우수성을 나타내지만, 높은 세포독성으로 인하여, CPP로 사용되지 못하고 있는 실정이다.One such CPP that exhibits cytotoxicity is melittin. Melitin, known as the main component of bee venom (apitoxin), is composed of 26 amino acids, and when used as a nano-molar unit, it shows severe cytotoxicity and is known as a cell permeable peptide. Unlike other CPPs, melitin, in addition to forming a complex directly with a desired drug, or forming a non-covalent complex by mixing with a desired drug without directly forming a complex, Can be delivered into cells. For example, U.S. Published Patent Application No. 2013-0281658 discloses a technique for delivering RNA interference polynucleotides into hepatocytes using a binding agent to which melittin is bound to an asialoglycoprotein receptor (ASGPr). Such melitin exhibits remarkable superiority over conventional CPP in that it does not require binding with a desired drug, but has not been used as CPP due to its high cytotoxicity.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기 멜리틴을 효과적인 세포투과성 펩타이드로 사용할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 상기 멜리틴의 일부 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 우수한 세포투과성과 낮은 세포독성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the inventors of the present invention have made extensive efforts to develop a method of using the melitin as an effective cell permeable peptide, and as a result, the peptide including a partial amino acid sequence of the melittin exhibits excellent cell permeability and low cytotoxicity And completed the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 세포투과성 펩타이드를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel cell permeable peptide.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a polynucleotide encoding said peptide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a transformant into which the above expression vector has been introduced.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드와 목적하는 약물을 포함하는 세포내 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for delivering a drug in a cell comprising the peptide and a desired drug.

본 발명자들은 목적하는 약물과 혼합하여 비공유결합적 복합체를 형성하여도 상기 약물을 세포내로 전달할 수 있지만, 나노몰의 소량으로도 높은 세포독성을 나타내는 멜리틴을 효과적인 세포투과성 펩타이드(CPP)로서 사용할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 상기 멜리틴 중에서 세포투과성을 나타내는 도메인과 세포독성을 나타내는 도메인을 분리하여, 세포투과성을 나타내는 도메인을 추출하고자 하였다. 이에, 상기 멜리틴으로부터 유래된 다양한 펩타이드 단편을 대상으로 세포독성과 세포투과성을 연구한 결과, 멜리틴의 N-말단으로부터 8개 미만의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편은 세포투과성이 멜리틴에 비해 낮은 수준을 나타내고, 멜리틴의 N-말단으로부터 17개 초과의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편은 세포투과성이 멜리틴과 유사한 수준의 세포독성을 나타내었으므로, 멜리틴에 비해 우수한 세포투과성과 낮은 세포독성을 동시에 나타내는 멜리틴의 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편이 세포투과성 펩타이드로서 적절함을 확인하였다.The present inventors have been able to use the melitin, which exhibits high cytotoxicity even in a small amount of nano-moles, as an effective cell permeable peptide (CPP), although they can transfer the drug into cells even when they form a non-covalent complex by mixing with a desired drug The inventors of the present invention have attempted to extract a domain exhibiting cell permeability and a domain exhibiting cytotoxicity by separating the domain exhibiting cell permeability and the domain exhibiting cytotoxicity among the melittin. As a result of studying the cytotoxicity and cell permeability of various peptide fragments derived from melittin, peptide fragments composed of less than 8 consecutive amino acid sequences from the N-terminal of melittin showed that the cell permeability is due to melittin And a peptide fragment composed of more than 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminal of melitin showed cytotoxicity similar to that of melittin, It was confirmed that a peptide fragment composed of 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminal of melittin, which simultaneously exhibits low cytotoxicity, is suitable as a cell permeable peptide.

또한, 상기 멜리틴의 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편 중에서도, 멜리틴의 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편인 Mel(1-14)는 상대적으로 가장 우수한 세포투과성을 나타내었으므로, 이를 이용한 세포투과성을 다양한 형태로 분석하였다. 그 결과, 상기 Mel(1-14)는 전달하고자 하는 물질과 비공유적으로 결합하여, 상기 물질을 세포내로 전달할 수 있는데, 상기 전달하고자 하는 물질의 전하에 영향을 받지 않고, 유전자 전달시에는 현재 사용되는 리포펙타민에 상응하는 수준의 세포투과성을 나타냄을 확인하였다.Among the peptide fragments consisting of 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus of melittin, Mel (1-14), a peptide fragment consisting of 8 to 17 contiguous amino acid sequences from the N-terminus of melittin, Showed relatively superior cell permeability, and thus cell permeability was analyzed in various forms. As a result, the Mel (1-14) binds non-covalently to the substance to be transduced and can transfer the substance into the cell. It is not affected by the charge of the substance to be transduced, Lt; RTI ID = 0.0 > lipofectamine < / RTI >

따라서, 멜리틴 서열중에서, N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, 대체로 낮은 세포독성과 높은 세포투과성을 나타내는 멜리틴 유래 펩타이드 단편으로서 신규한 세포투과성 펩타이드임을 알 수 있고, 상기 멜리틴 유래 펩타이드 단편은 그의 C-말단에 다양한 아미노산을 부가하여 상기 세포투과성 펩타이드로서의 효과를 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이처럼, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드는 지금까지 전혀 알려져 있지 않으며, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.Thus, of the melittin sequences, peptides containing 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus are novel cell permeable peptides as melittin-derived peptide fragments that exhibit generally low cytotoxicity and high cell permeability , It was found that the melittin-derived peptide fragment can increase the effect as a cell permeable peptide by adding various amino acids to its C-terminal end. As described above, among the melittin sequences, the cell permeable peptide comprising 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus has not been known at all and has been developed for the first time by the present inventors.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 멜리틴 서열중에서, N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드를 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a cell permeable peptide comprising 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus of a melittin sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 .

본 발명의 용어 "멜리틴(melittin)"이란, N-말단의 소수성 영역과 C-말단의 친수성 영역을 포함하는 양친매성을 갖고, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 멜리틴은 주로 봉독의 주요성분으로 알려져 있는데, 응혈효과, 표면장력 감소효과를 나타낸다고 알려져 있다.The term " melittin " of the present invention means a polypeptide having an amphipathic nature including a hydrophobic region at the N-terminus and a hydrophilic region at the C-terminus, and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 below. The melittin is known as a main component of bee venom, and is known to exhibit a clotting effect and a surface tension reducing effect.

멜리틴: GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호 1)Melitin: GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 1)

본 발명의 용어, "세포투과성"이란, 펩타이드가 세포막을 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다.The term "cell permeability" of the present invention means the ability or property of the peptide to permeate through the cell membrane and penetrate into the cell.

본 발명에서 제공하는 세포투과성 펩타이드는 멜리틴으로부터 유래된 펩타이드로서 멜리틴의 단점인 세포독성을 나타내지 않으면서도, 우수한 세포투과성을 나타낼 수 있는 멜리틴의 단편 펩타이드가 될 수 있는데, 일 예로서, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 단편 펩타이드가 될 수 있고, 다른 예로서, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 11 내지 14개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 단편 펩타이드가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 14개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 단편 펩타이드가 될 수 있다. 예를 들어, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 14개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 Mel(1-14)(서열번호 21)는 세포독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 목적하는 약물과 공유적으로 결합되지 않아도, 목적하는 약물을 세포내로 유입시킬 수 있는 우수한 세포투과성을 나타낸다.The cell permeable peptide provided by the present invention may be a peptide derived from melittin and may be a melittin fragment peptide which does not exhibit cytotoxicity which is a disadvantage of melittin and can exhibit excellent cell permeability. A fragment peptide comprising 8 to 17 contiguous amino acid sequences from the N-terminus of the amino acid sequence, and as a further example, a fragment peptide comprising 11 to 14 contiguous amino acid sequences from the N-terminus of the melittin sequence And as another example, a fragment peptide comprising 14 consecutive amino acid sequences from the N-terminus in the melittin sequence. For example, among the melittin sequences, Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21), a peptide comprising 14 consecutive amino acid sequences from the N-terminus, does not exhibit cytotoxicity and is covalently associated with the desired drug Even if it is not bound, it exhibits excellent cell permeability capable of introducing a desired drug into cells.

아울러, 상기 멜리틴의 N-말단으로부터 8개 미만의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편은 세포투과성이 멜리틴에 비해 낮은 수준을 나타내고, 멜리틴의 N-말단으로부터 17개 초과의 연속되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 단편은 세포투과성이 멜리틴과 유사한 수준의 세포독성을 나타낸다는 단점이 있다.In addition, peptide fragments composed of less than 8 contiguous amino acid sequences from the N-terminus of the melittin exhibit a lower level of cellular permeability than melittin and more than 17 contiguous amino acid sequences from the N-terminus of melittin Has the disadvantage that it exhibits cytotoxicity similar to that of melittin in the cell permeability.

한편, 본 발명에서 제공하는 세포투과성 펩타이드는 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열의 C-말단에 다른 아미노산 서열을 추가하여 세포투과성 펩타이드를 구성할 수 있는데, 상기 다른 아미노산 서열은 세포독성을 나타내지 않으면서도, 우수한 세포투과성을 나타낼 수 있게하는 한 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서 멜리틴으로부터 유래된 펩타이드 단편이 나타내는 소수성과 함께 양친매성을 강화시켜서 세포투과성을 향상시킬 수 있는, 친수성을 나타내는 아미노산 서열, 세포투과성 펩타이가 세포막에 보다 효과적으로 투과될 수 있도록 상기 펩타이드의 구조변화를 유도하는 아미노산 서열, 세포투과성을 나타내어 본 발명에서 제공하는 세포투과성 펩타이드의 효율을 증가시킬 수 있는 펩타이드 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 강한 친수성을 나타내도록 8개의 아르기닌으로 구성된 아미노산 서열(서열번호 11); 세포투과성을 나타내는 TAT(서열번호 8), MAP(서열번호 9), SAP(서열번호 10), Hph-1(서열번호 12), crotamine(서열번호 13), Cylop-1(서열번호 14) 또는 SKE(서열번호 15); 상기 펩타이드 단편의 형태를 나선형 형태로 유도할 수 있는 WGIRR(서열번호 17) 등이 될 수 있다. Meanwhile, the cell permeable peptide provided in the present invention can constitute a cell permeable peptide by adding another amino acid sequence to the C-terminal of 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminal in the melittin sequence, Although the sequence is not particularly limited as long as it can exhibit excellent cell permeability without exhibiting cytotoxicity, it is preferable that the peptide fragment derived from melitin, for example, has hydrophobicity as well as amphipathicity can be enhanced to improve cell permeability , An amino acid sequence showing hydrophilicity, an amino acid sequence which induces a structural change of the peptide so that the cell permeable peptide can be more effectively transmitted to the cell membrane, and a cell permeability which can increase the efficiency of the cell permeable peptide provided by the present invention Peptide And, as another example, to indicate a strong hydrophilic amino acid sequence consisting of eight arginine (SEQ ID NO: 11); (SEQ ID NO: 8), MAP (SEQ ID NO: 9), SAP (SEQ ID NO: 10), Hph-1 (SEQ ID NO: 12), crotamine (SEQ ID NO: 13), Cylop-1 SKE (SEQ ID NO: 15); A WGIRR (SEQ ID NO: 17) capable of inducing the form of the peptide fragment into a spiral form, and the like.

예를 들어, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 8개의 연속되는 아미노산 서열인 Mel(1-8)(서열번호 19)의 C-말단에 WGIRR(서열번호 17)을 추가하여 구성된 A-4 펩타이드(서열번호 4)는, 목적하는 약물과 공유적으로 결합되어, 목적하는 약물을 세포내로 유입시킬 수 있는 세포투과성을 나타낼 수 있다.For example, the A-4 peptide (SEQ ID NO: 17) constructed by adding WGIRR (SEQ ID NO: 17) to the C-terminus of Mel (1-8) (SEQ ID NO: 19) which is eight consecutive amino acid sequences from the N terminus in the melittin sequence SEQ ID NO: 4) may be covalently associated with the desired drug, and may exhibit cellular permeability that allows the desired drug to enter the cell.

본 발명에서 제공하는 세포투과성 펩타이드는 이를 구성하는 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 펩타이드의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 세포투과성이 증가한 펩타이드를 포함할 수 있다.The cell permeable peptide provided by the present invention may include a polypeptide having a sequence that differs from the amino acid sequence constituting the cell permeable peptide by one or more amino acid residues. Amino acid exchange in proteins and polypeptides that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art. The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly. In addition, it may include a peptide having increased structural stability or increased cell permeability due to mutation or modification of amino acid sequence, heat, pH, etc. of the peptide.

상기 펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 펩타이드를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.The peptide may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or may be prepared by amplifying the gene encoding the peptide by polymerase chain reaction (PCR) or synthesizing it by a known method and then cloning it into an expression vector for expression have.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 멜리틴의 아미노산 서열을 이용하여 Mel(1-5)(서열번호 18), Mel(1-8)(서열번호 19), Mel(1-11)(서열번호 20), Mel(1-14)(서열번호 21), Mel(1-17)(서열번호 22), Mel(1-20)(서열번호 23), Mel(1-23)(서열번호 24)을 합성하고, 이들의 세포독성과 세포투과성을 비교한 결과, Mel(1-11)(서열번호 20), Mel(1-14)(서열번호 21) 및 Mel(1-17)(서열번호 22)이 낮은 세포독성과 높은 세포투과성을 나타내었고(도 1b 및 5a), Mel(1-11)(서열번호 20), Mel(1-12)(서열번호 25), Mel(1-13)(서열번호 2), Mel(1-14)(서열번호 21), Mel(1-15)(서열번호 26), Mel(1-16)(서열번호 27) 및 Mel(1-17)(서열번호 22)을 대상으로 세포투과성을 비교한 결과, Mel(1-12)(서열번호 25) 및 Mel(1-14)(서열번호 21)가 높은 수준의 세포투과성을 나타내었으며, Mel(1-14)(서열번호 21)가 가장 높은 수준의 세포투과성을 나타냄을 알 수 있었다(도 5b).According to an embodiment of the present invention, Mel (1-5) (SEQ ID NO: 18), Mel (1-8) (SEQ ID NO: 19), Mel Mel (1-12), Mel (1-13) (SEQ ID NO: 21), Mel (1-17) (1-11) (SEQ ID NO: 20), Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21) and Mel (1-17) (SEQ ID NO: 22) ), Mel (1-11) (SEQ ID NO: 20), Mel (1-12) (SEQ ID NO: 25), Mel (1-13) Mel (1-15) (SEQ ID NO: 2), Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21), Mel 22) exhibited a high level of cell permeability, while Mel (1-12) (SEQ ID NO: 25) and Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21) ) (SEQ ID NO: 21) exhibits the highest level of cellular permeability The (Fig. 5b).

또한, 상기 Mel(1-14)(서열번호 21)의 세포투과성을 추가로 분석한 결과, 상기 Mel(1-14)가 전달하는 물질의 전하에 영향을 받지 않고(도 7a 및 7b), 유전자 전달시에는 현재 사용되는 리포펙타민에 상응하는 수준의 세포투과성을 나타냄을 확인하였다(도 8).Further, as a result of further analyzing the cell permeability of Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21), it was found that, without being affected by the charge of the substance transferred by Mel (1-14) It was confirmed that they exhibited cell permeability at a level corresponding to that of lipofectamine currently used (Fig. 8).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a polynucleotide encoding said peptide.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 이용하여 합성할 수 있다.The polynucleotide may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, of one or more bases. When the nucleotide sequence is prepared by chemically synthesizing, it is possible to use a method well known in the art, for example, a method described in Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37: 73-127, 1988 , Triesters, phosphites, phosphoramidites and H-phosphate methods, PCR and other auto primer methods, and oligonucleotide synthesis on solid supports.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 세포투과성 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing the cell permeable peptide using the expression vector comprising the polynucleotide, the transformant containing the expression vector, and the transformant.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.The term "expression vector" of the present invention means a recombinant vector capable of expressing a target peptide in a desired host cell, and a gene construct comprising an essential regulatory element operably linked to the expression of the gene insert. The expression vector includes expression control elements such as an initiation codon, a termination codon, a promoter, an operator, etc. The initiation codon and the termination codon are generally regarded as part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene product is administered, And must be in coding sequence and in frame. The promoter of the vector may be constitutive or inducible.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.The term "operably linked" of the present invention means a state in which a nucleic acid sequence encoding a desired protein or RNA is functionally linked to a nucleic acid expression control sequence so as to perform a general function . For example, a nucleic acid sequence encoding a promoter and a protein or RNA may be operably linked to affect the expression of the coding sequence. The operative linkage with an expression vector can be produced using gene recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be performed using enzymes generally known in the art.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널 및 개시코돈은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.In addition, the expression vector may comprise a signal sequence for the release of the polypeptide to facilitate the separation of the protein from the cell culture fluid. A specific initiation signal may also be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In some cases, an exogenous translational control signal, which may include the ATG start codon, should be provided. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by the introduction of suitable transcription or translation enhancers.

아울러, 상기 발현벡터는 세포투과성 펩타이드의 검출이 용이하도록 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the expression vector may further include a protein tag which can be optionally removed using endopeptidase, so as to facilitate detection of the cell permeable peptide.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.The term "tag " of the present invention means a molecule exhibiting quantifiable activity or property and includes a polypeptide fluorescent substance such as a fluorophore such as fluorescein, a fluorescent protein (GFP) Or may be a fluorescent molecule including; Myc tag, a Flag tag, a histidine tag, a Lucin tag, an IgG tag, or a strap tagidine tag. Particularly, in the case of using an epitope tag, a peptide tag composed of preferably 6 or more amino acid residues, more preferably 8 to 50 amino acid residues can be used.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명의 세포투과성 펩타이드을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 세포투과성 펩타이드을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)가 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.In the present invention, the expression vector may include a nucleotide sequence encoding the above-described cell-permeable peptide of the present invention. The vector used herein is not particularly limited as long as it can produce the cell-permeable peptide of the present invention, (PUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), plasmids derived from Escherichia coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 and the like), Bacillus subtilis Derived plasmids such as yeast-derived plasmids (pUB110 and pTP5), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, lambda gt10, lambda gt11 and lambda ZAP), animal virus vectors (retrovirus Adenoviruses, vaccinia viruses, etc.), insect virus vectors (such as baculovirus, etc.). Since the amount of expression of the protein and the expression of the expression vector are different depending on the host cell, it is preferable to select and use the host cell most suitable for the purpose.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작될 수 있고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 세포투과성 펩타이드을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 본 발명의 세포투과성 펩타이드을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 세포투과성 펩타이드을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.The transformant provided in the present invention can be produced by introducing the expression vector provided in the present invention into a host and transforming the polynucleotide contained in the expression vector to produce the cell permeable peptide of the present invention Can be used. The transformants may be performed by various methods, one can produce cell permeability of the present invention peptayideueul, it not particularly limited to, CaCl 2 Precipitation method, CaCl 2 The Hanahan method, the electroporation method, the calcium phosphate precipitation method, the protoplast fusion method, the agitation method using the silicon carbide fiber, and the Agrobacterium-mediated transformation method are used for the precipitation method by using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) A transformation method using PEG, dextran sulfate, lipofectamine, and a dry / suppression-mediated transformation method. The host used in the production of the transformant may also be a bacterial cell such as E. coli , Streptomyces or Salmonella typhimurium, as long as it can produce the cell permeable peptide of the present invention. Yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae, and ski-inspected caromyces pombe; Fungal cells such as Pichia pastoris; Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, Bowmanella cells; Or plant cells.

상기 형질전환체는 또한 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.The transformant may also be used in a method for producing the cell permeable peptide of the present invention. Specifically, the method for producing the cell permeable peptide of the present invention comprises the steps of: (a) culturing the transformant to obtain a culture; And (b) recovering the cell permeable peptide of the present invention from the culture.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.The term "cultivation" of the present invention means a method of growing the microorganism under an appropriately artificially controlled environmental condition. In the present invention, the method for culturing the transformant may be carried out by a method well known in the art. Specifically, the culturing can be carried out continuously in a batch process or an injection batch or a repeated fed batch process, as long as it can produce the cell permeable peptide of the present invention. have.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.The medium used for the culture should meet the requirements of the specific strain in a suitable manner while controlling the temperature, pH and the like under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, and the like. The carbon sources that can be used include glucose and xylose mixed sugar as main carbon sources, and sugar and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, Oils and fats such as oils and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture. Nitrogen sources that may be used include inorganic sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine and glutamine, and organic substances such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or their decomposition products, defatted soybean cake or decomposition products thereof . These nitrogen sources may be used alone or in combination. The medium may include potassium phosphate, potassium phosphate and the corresponding sodium-containing salts as a source. Potassium which may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts. As the inorganic compound, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate and calcium carbonate may be used. Finally, in addition to these materials, essential growth materials such as amino acids and vitamins can be used.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.In addition, suitable precursors may be used in the culture medium. The above-mentioned raw materials can be added to the culture in the culture process in a batch manner, in an oil-feeding manner or in a continuous manner by an appropriate method, but it is not particularly limited thereto. Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in a suitable manner to adjust the pH of the culture.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 본 발명의 세포투과성 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.In addition, bubble formation can be suppressed by using a defoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester. An oxygen or oxygen-containing gas (e.g., air) is injected into the culture to maintain aerobic conditions. The temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, preferably 30 ° C to 35 ° C. The culture continues until the amount of the cell permeable peptide of the present invention is maximally obtained. Usually for 10 to 100 hours for this purpose.

아울러, 배양물로부터 상기 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 세포투과성 펩타이드를 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.In addition, the step of recovering the cell permeable peptide of the present invention from the culture can be carried out by a method known in the art. Specifically, the recovering method is not particularly limited as long as it can be used for recovering the produced cell permeable peptide of the present invention, but it is preferably centrifuged, filtered, extracted, sprayed, dried, (Eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (for example, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion) can be used.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 펩타이드와 목적하는 약물을 포함하는 세포내 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.In another aspect, the present invention provides a composition for intracellular drug delivery comprising the peptide and a desired drug.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 멜리틴 서열중에서, N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드는 멜리틴으로부터 유래되었음에도 불구하고, 멜리틴이 나타내는 세포독성이 현저히 감소될 뿐만 아니라, 목적하는 약물을 세포내로 유입시킬 수 있는 우수한 세포투과성을 나타내므로, 멜리틴 서열중에서 N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드는 세포내 약물전달용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.As described above, among the melittin sequences provided by the present invention, the cytopathic peptide comprising 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus is derived from melittin, but the cytotoxicity exhibited by melittin is remarkable And the cell permeable peptide containing 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus in the melittin sequence can be used for intracellular drug delivery It can be used as an active ingredient of the composition.

이때, 사용되는 약물은 세포내로 전달되어 세포내 활성을 조절하는 약리학적 활성을 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 화합물, 단백질, 핵산 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 전하를 띤 고분자 화합물, 형광화합물 등의 화합물; 효소, 리간드, 항체 등의 단백질; siRNA, 플라스미드, 유전자 등의 핵산 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 상기 약물로서 형광화합물의 일종인 Quantum dot 및 단백질의 일종인 베타-갈락토시다제를 예시적으로 사용하였다.Here, the drug to be used may be a compound, a protein, a nucleic acid, or the like, as long as it is capable of exhibiting a pharmacological activity that is transferred into a cell and regulates intracellular activity. However, Compounds such as fluorescent compounds and the like; Proteins such as enzymes, ligands, and antibodies; siRNA, a plasmid, a nucleic acid such as a gene, and the like. For example, in the present invention, Quantum dot, which is a kind of fluorescent compound, and beta-galactosidase, which is a type of protein, are exemplarily used as the drug.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명에서 제공하는 세포내 약물전달용 조성물은 세포투과성 펩타이드와 목적하는 약물을 포함하는데, 상기 펩타이드와 약물은 상호 결합되지 않고, 서로 혼합하여 비공유적인 결합체를 형성하는 것만으로도, 상기 약물을 세포내로 전달할 수 있다. According to an aspect of the present invention, a composition for intracellular drug delivery provided in the present invention includes a cell permeable peptide and a desired drug, wherein the peptide and the drug are not mutually bound but mixed to form a non- , It is possible to deliver the drug into a cell.

본 발명의 일 실시예에 의하면, N-Mel(1-14)(서열번호 21)는 비공유적 결합에 의하여도 세포투과성을 나타내어 공유결합되지 않은 베타-갈락토시다제를 높은 수준으로 세포내로 전달하는 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5a, 5b 및 6).According to one embodiment of the present invention, N-Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21) exhibits cell permeability even by non-covalent binding to deliver covalently bound beta-galactosidase to cells at a high level (Figs. 5A, 5B and 6).

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명에서 제공하는 세포내 약물전달용 조성물은 세포투과성 펩타이드와 목적하는 약물을 포함하는데, 상기 펩타이드와 약물은 상호 결합하여 결합체를 형성함으로써, 상기 약물을 세포내로 전달할 수 있다.According to another aspect of the present invention, a composition for intracellular drug delivery provided in the present invention comprises a cell permeable peptide and a desired drug, wherein the peptide and the drug bind to each other to form a complex, .

이때, 상기 결합체는 상기 세포투과성 펩타이드에 목적하는 약물이 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 결합체의 활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 화합물을 약물로 사용할 경우, 상기 약물의 결합을 촉진할 수 있는 화합물; 또는 단백질 또는 핵산을 약물로 사용할 경우, 상기 약물의 결합을 촉진시킬 수 있는 펩타이드 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 A-4에 Quantum dot를 효과적으로 결합시키기 위하여 SPDP를 링커로서 사용하였다.At this time, the target substance may be directly connected to the cell permeable peptide or may be connected to the cell permeable peptide through a linker. The linker is not particularly limited as long as it exhibits an effect of improving the activity of the conjugate. For example, when the compound is used as a drug, the linker may promote the binding of the drug. Or a peptide capable of promoting the binding of the drug when the protein or nucleic acid is used as a drug. For example, in the present invention, SPDP was used as a linker to effectively bind a quantum dot to A-4.

본 발명의 일 실시예에 의하면, SPDP를 링커로서 사용하여 A-4(서열번호 4)에 605nm에서 주황색 형광을 나타내는 Amine Quantum dot(amine-QD)를 결합시켜서 QD-SPDP-CPP 형태의 결합체를 수득하였고, 상기 결합체는 공유결합된 Quantum dot을 높은 수준으로 세포내로 전달하는 효과를 나타냄을 확인하였다(도 2 내지 4).According to one embodiment of the present invention, binding of QD-SPDP-CPP type conjugate to Amine Quantum dot (amine-QD) showing orange fluorescence at A-4 (SEQ ID NO: 4) at 605 nm using SPDP as a linker , And that the conjugate had an effect of delivering a covalently bound Quantum dot to the cells at a high level (Figs. 2 to 4).

본 발명의 세포투과성 펩타이드는 멜리틴으로부터 유래되었음에도 불구하고, 멜리틴이 나타내는 세포독성을 전혀 나타내지 않을 뿐만 아니라, 목적하는 약물과 공유적으로 결합되지 않아도, 목적하는 약물을 세포내로 유입시킬 수 있는 우수한 세포투과성을 나타내므로, 세포내 약물전달용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.Although the cytopathic peptide of the present invention is derived from melittin, it does not show cytotoxicity exhibited by melitin at all, and it does not exhibit cytotoxicity exhibited by melitin at all, Cell permeability, it can be widely used for the development of drugs for cell drug delivery.

도 1a는 본 발명에서 제공하는 멜리틴 유래 세포투과성 펩타이드가 헬라 세포주에 대하여 나타내는 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명에서 제공하는 다양한 멜리틴 단편이 헬라 세포주에 대하여 나타내는 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 헬라 세포주에 대한 amine-QD가 결합된 다양한 결합체의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 줄기세포에 대한 amine-QD가 결합된 다양한 결합체의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 다양한 수준의 amine-QD 또는 A-4를 사용하여 제조된 결합체의 처리에 따른 QD의 세포투과성을 공초점 현미경으로 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5a는 다양한 CPP 후보물질에 의한 베타-갈락토시다제의 세포투과성을, 베타-갈락토시다제의 기질인 ONPG를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 5b는 Mel(1-11) 내지 Mel(1-17)의 멜리틴 단편에 의한 베타-갈락토시다제의 세포투과성을, 베타-갈락토시다제의 기질인 ONPG를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 6은 다양한 세포에서 Mel(1-14)에 의한 베타-갈락토시다제의 세포투과성을, 베타-갈락토시다제의 기질인 X-gal을 사용하여 분석한 결과를 촬영한 현미경 사진이다.
도 7a는 CPP의 종류에 따른 음전하를 띤 QD의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 CPP의 종류에 따른 양전하를 띤 QD의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 Mel(1-14)의 농도에 따른 gwiz 유전자의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.FIG. 1A is a graph showing the cytotoxicity of melittin-derived cell permeable peptides provided by the present invention compared with those of Hela cell lines. FIG.
FIG. 1B is a graph showing the results of comparing cytotoxicity of various melittin fragments provided by the present invention on Hela cell lines. FIG.
2 is a graph showing the results of comparing cell permeabilities of various conjugates to which amine-QD is conjugated to Hela cell line.
FIG. 3 is a graph showing the results of comparing cell permeabilities of various conjugates in which amine-QD is bound to stem cells.
FIG. 4 is a photograph showing the results of evaluating the cell permeability of QD according to a confocal microscope according to treatment of a conjugate prepared using various levels of amine-QD or A-4.
FIG. 5A is a graph and a graph showing the results of analysis of cell permeability of beta-galactosidase by various CPP candidate substances using ONPG, a substrate of beta-galactosidase. FIG.
FIG. 5B shows the results of analysis of cell permeability of beta-galactosidase by melittin fragments of Mel (1-11) to Mel (1-17) using ONPG, a substrate of beta-galactosidase ≪ / RTI >
FIG. 6 is a photomicrograph showing the cell permeability of beta-galactosidase by Mel (1-14) in various cells using X-gal as a substrate of beta-galactosidase.
7A is a graph showing a result of comparing cell permeability of negative charged QD according to the type of CPP.
FIG. 7B is a graph showing the results of comparing cell permeability of positively charged QDs according to the type of CPP. FIG.
FIG. 8 is a graph showing the cell permeability of gwiz gene according to the concentration of Mel (1-14).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 세포투과성  1: cell permeability 펩타이드Peptides (cell penetrating peptide, (cell penetrating peptide, CPPCPP )의 세포독성 평가) ≪ / RTI >

실시예Example 1-1: 세포투과성  1-1: cell permeability 펩타이드의Of peptide 수득 purchase

봉독(bee venom, apitoxin)의 주성분으로 알려진 멜리틴(melittin)의 아미노산 서열을 이용하여, N-말단으로부터 1 내지 13번의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 Mel(1-13)(서열번호 2); N-말단으로부터 1 내지 10번의 아미노산 서열을 갖고 그의 C-말단에 8개의 아르기닌이 부가된 펩타이드인 Mel10R8(서열번호 3); 및, N-말단으로부터 1 내지 8번의 아미노산 서열을 갖고 그의 C-말단에 5개의 아미노산 서열인 WGIRR가 부가된 펩타이드인 A-4(서열번호 4)를 각각 합성하여 수득하였다.Mel (1-13) (SEQ ID NO: 2), which is a peptide having amino acid sequence 1 to 13 from the N-terminus, using the amino acid sequence of melittin, which is known as the main component of bee venom (apitoxin); Mel10R8 (SEQ ID NO: 3), which is a peptide having 1 to 10 amino acid sequences from the N-terminus and 8 arginines added to its C-terminus; And A-4 (SEQ ID NO: 4), which is a peptide having an amino acid sequence of 1 to 8 from the N-terminus and WGIRR added thereto at its C-terminus, which is a five amino acid sequence.

실시예Example 1-2: 세포투과성  1-2: cell permeability 펩타이드의Of peptide 세포독성 평가 Cytotoxicity Assessment

상기 실시예 1-1에서 수득한 각 세포투과성 펩타이드의 세포독성을 평가하기 위하여, 상기 수득한 각 세포투과성 펩타이드와 공지된 다수의 세포투과성 펩타이드를 다양한 농도(0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 0.8, 1, 2, 4, 5, 8 또는 10 μM)로 헬라 세포주에 가하고 배양한 다음, CCK-8 assay kit(Dojindo)를 이용하여 배양된 헬라 세포주의 세포생존율을 측정한 다음, 이를 비교하였다(도 1a). 이때, 공지된 세포투과성 펩타이드로는 멜리틴(Mel. 서열번호 1), TAT(서열번호 8), MAP(서열번호 9), SAP(서열번호 10), Mel(1-13)(서열번호 5), A-4(서열번호 4), MelR8(서열번호 3) 및 R8(서열번호 11)을 사용하였다.To evaluate the cytotoxicity of each of the cell permeable peptides obtained in Example 1-1, the obtained cell permeable peptides and a number of known cell permeable peptides were mixed at various concentrations (0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 0.8, 1, 2, 4, 5, 8, or 10 μM), and then cell viability of the cultured Hela cell line was measured using the CCK-8 assay kit (Dojindo) 1a). The known cell permeable peptides include melittin (Mel. SEQ ID NO: 1), TAT (SEQ ID NO: 8), MAP (SEQ ID NO: 9), SAP ), A-4 (SEQ ID NO: 4), MelR8 (SEQ ID NO: 3) and R8 (SEQ ID NO: 11)

도 1a는 본 발명에서 제공하는 멜리틴 유래 세포투과성 펩타이드가 헬라 세포주에 대하여 나타내는 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 멜리틴 유래 세포투과성 펩타이드 중에서 Mel(1-13)(서열번호 2) 및 A-4(서열번호 4)는 헬라 세포주에 대하여 전혀 세포독성을 나타내지 않았으나, MelR8(서열번호 3)은 헬라 세포주에 대하여 멜리틴과 유사한 수준의 세포독성을 나타냄을 확인하였다.FIG. 1A is a graph showing the cytotoxicity of melittin-derived cell permeable peptides provided by the present invention compared with those of Hela cell lines. FIG. As shown in FIG. 1A, Mel (1-13) (SEQ ID NO: 2) and A-4 (SEQ ID NO: 4) among the melittin-derived cell permeable peptides of the present invention did not show any cytotoxicity against Hela cell line, MelR8 (SEQ ID NO: 3) showed cytotoxicity similar to melitin in Hela cell lines.

실시예Example 1-3: 세포투과성  1-3: Cell permeability 펩타이드의Of peptide 세포독성 평가 Cytotoxicity Assessment

상기 실시예 1-2의 결과로부터, 멜리틴 유래 세포투과성 펩타이드 중에서 Mel(1-13)(서열번호 2) 및 A-4(서열번호 4)는 헬라 세포주에 대하여 전혀 세포독성을 나타내지 않았으므로, 다양한 형태의 멜리틴 단편을 합성하고, 상기 합성된 멜리틴 단편을 다양한 농도(0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 또는 50 μM)로 헬라 세포주에 가하고 배양한 다음, 이의 세포독성을 평가하였다(도 1b). 이때, 합성된 멜리틴 단편은 Mel(1-5)(서열번호 18), Mel(1-8)(서열번호 19), Mel(1-11)(서열번호 20), Mel(1-14)(서열번호 21), Mel(1-17)(서열번호 22), Mel(1-20)(서열번호 23) 및 Mel(1-23)(서열번호 24)이고, 비교군으로는 TAT(서열번호 8), MAP(서열번호 9) 및 멜리틴(Mel(1-26))(서열번호 1)을 사용하였다.From the results of Example 1-2, Mel (1-13) (SEQ ID NO: 2) and A-4 (SEQ ID NO: 4) among the melittin-derived cell permeable peptides did not show any cytotoxicity against Hela cell line, Various types of melittin fragments were synthesized and the synthesized melittin fragments were added to Hella cell lines at various concentrations (0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 or 50 μM) and cultured. (Fig. 1B). Mel (1-8) (SEQ ID NO: 19), Mel (1-11) (SEQ ID NO: 20), Mel (1-14) Mel (1-12), Mel (1-20) (SEQ ID NO: 23) and Mel (1-23) (SEQ ID NO: 24) No. 8), MAP (SEQ ID NO: 9) and melittin (Mel (1-26)) (SEQ ID NO: 1) were used.

도 1b는 본 발명에서 제공하는 다양한 멜리틴 단편이 헬라 세포주에 대하여 나타내는 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 멜리틴 단편의 길이가 감소될 수록 세포독성이 감소되는 경향을 나타냄을 확인하였다. 특히, Mel(1-17)은 50μM 이상으로 처리할 경우, 세포독성을 나타내었으나, Mel(1-20)은 5μM 이상으로 처리할 경우, 세포독성을 나타내었으므로, 세포독성과 관련하여서는 멜리틴의 N-말단으로부터 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 임계적인 의의가 있음을 알 수 있었다.FIG. 1B is a graph showing the results of comparing cytotoxicity of various melittin fragments provided by the present invention on Hela cell lines. FIG. As shown in FIG. 1B, it was confirmed that the cytotoxicity tends to decrease as the length of the melittin fragment decreases. In particular, Mel (1-17) exhibited cytotoxicity when treated with 50 μM or more, whereas Mel (1-20) showed cytotoxicity when treated with 5 μM or more. Therefore, melitin The peptide comprising 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus of the peptide was critical.

실시예Example 2:  2: CPP의Of CPP 공유적Shared 결합에 의한 세포투과성 분석 Analysis of cell permeability by binding

상기 실시예 1-1에서 수득한 CPP 중에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인된 Mel(1-13) 또는 A-4를 이용하고, 목적하는 약물로서 605nm에서 주황색 형광을 나타내는 Amine Quantum dot(amine-QD)를 이용하여, CPP와 약물이 공유적으로 결합된 결합체를 이용한 약물의 세포투과성을 분석하고자 하였다.Mel (1-13) or A-4, which was confirmed to have no cytotoxicity, was used as the CPP obtained in Example 1-1, and Amine Quantum dot (amine-QD ) Were used to analyze the cell permeability of drugs using covalently bonded conjugate of CPP and drug.

실시예Example 2-1:  2-1: CPP와CPP and 약물을 포함하는 결합체의 수득 Obtaining a drug-containing conjugate

상기 실시예 1-1에서 수득한 펩타이드인 Mel(1-13) 또는 A-4에 605nm에서 주황색 형광을 나타내는 Amine Quantum dot(amine-QD)를 결합시켜서 결합체를 수득하였다. 이때, 가교제로서 SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)를 사용함으로써, 최종적으로는 QD-SPDP-CPP 형태의 결합체를 수득하였다.A binding product was obtained by binding Amine Quantum dot (amine-QD) showing orange fluorescence at 605 nm to Mel (1-13) or A-4, which is the peptide obtained in Example 1-1. At this time, by using SPDP (succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate) as a crosslinking agent, finally, a conjugate in the form of QD-SPDP-CPP was obtained.

구체적으로, 2mg/400㎕ DMF를 포함하는 180㎕ PBS에 25μM의 amine-QD와 16mM SPDP를 가하고, 상온의 차광조건에서 3시간 동안 반응시켜서, 반응물을 수득하고, 이를 PBS에서 투석하여 QD-SPDP 복합체를 수득하였다. Specifically, 25 μM amine-QD and 16 mM SPDP were added to 180 μl of PBS containing 2 mg / 400 μl DMF and allowed to react for 3 hours at room temperature under light shielding conditions to obtain a reaction product, which was dialyzed against PBS to obtain QD-SPDP Complex.

80㎕ PBS에 상기 수득한 QD-SPDP 복합체 16㎕와 상기 수득한 5mg/㎖ Mel(1-13) 또는 A-4 2㎕를 가하고, 4℃의 차광조건에서 하룻밤동안 반응시켜서, 반응물을 수득하고, 이를 PBS에서 투석하여 QD-SPDP-Mel(1-13) 또는 QD-SPDP-A-4 형태의 결합체를 수득하였다.16 μl of the above-obtained QD-SPDP complex and 2 μl of the obtained 5 mg / ml Mel (1-13) or A-4 were added to 80 μl PBS and reacted at 4 ° C. overnight under light condition to obtain a reaction product , And this was dialyzed in PBS to obtain a conjugate in the form of QD-SPDP-Mel (1-13) or QD-SPDP-A-4.

실시예Example 2-2: 헬라 세포주를 이용한 결합체의 세포투과성 평가 2-2: Evaluation of cell permeability of conjugate using Hela cell line

상기 실시예 2-1에 개시된 결합체를 수득한 방법과 동일한 방법을 이용하여, 멜리틴(Mel(1-26), 서열번호 1), Mel(1-13)(서열번호 2), A-4(서열번호 4), TAT(서열번호 8), MAP(서열번호 9), SAP(서열번호 10), Hph-1(서열번호 12), crotamine(서열번호 13), Cylop-1(서열번호 14) 또는 SKE(서열번호 15)에 각각 amine-QD를 결합시켜서 각각의 결합체를 제조하였다. 이어 상기 제조된 각 결합체를 다양한 농도(1, 2 또는 4 nM)로 헬라 세포주에 가하고 배양한 다음, 형광측정기(Multireader)를 사용하여 배양된 각 헬라 세포주에서 QD로부터 유래된 형광값을 측정하고 비교하였다(도 2). 이때, 음성 대조군으로는 상기 결합체를 처리하지 않고 배양한 헬라 세포주를 사용하고, 양성 대조군으로는 결합체가 아닌 amine-QD를 처리하여 배양한 헬라 세포주를 사용하였다.(Mel (1-26), SEQ ID No. 1), Mel (1-13) (SEQ ID No. 2), A-4 (SEQ ID No. 2), and the like were prepared in the same manner as in the above- (SEQ ID No. 4), TAT (SEQ ID No. 8), MAP (SEQ ID No. 9), SAP (SEQ ID No. 10), Hph-1 (SEQ ID No. 12), crotamine (SEQ ID No. 13), Cylop- ) Or SKE (SEQ ID NO: 15) with amine-QD, respectively. Then, each of the prepared conjugates was added to Hella cell line at various concentrations (1, 2 or 4 nM) and cultured. Fluorescence values derived from QD were measured in each Hela cell line cultured using a fluorescence meter (Multireader) (Fig. 2). At this time, as a negative control group, a Hela cell line cultured without treatment of the conjugate was used, and as a positive control group, Hela cell line cultured by treatment with amine-QD, which was not a conjugate, was used.

도 2는 헬라 세포주에 대한 amine-QD가 결합된 다양한 결합체의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, A-4를 사용하여 제조된 결합체를 처리한 경우에만, 헬라 세포주에서 형광값이 높은 수준으로 검출되었고, 상기 검출된 형광값은 결합체의 처리농도에 비례하여 증가됨을 확인하였다.2 is a graph showing the results of comparing cell permeabilities of various conjugates to which amine-QD is conjugated to Hela cell line. As shown in FIG. 2, fluorescence values were detected at a high level in the Greek cell line only when the conjugate prepared using A-4 was treated, and it was confirmed that the detected fluorescence value was increased in proportion to the concentration of the conjugate .

실시예Example 2-3: 줄기세포를 이용한 결합체의 세포투과성 평가 2-3: Evaluation of cell permeability of conjugate using stem cells

상기 실시예 2-2에서 확인된 A-4 펩타이드를 포함하는 결합체의 세포투과성이 헬라 세포주가 아닌 다른 세포에서도 동일하게 적용되는지를 입증하기 위하여, A-4(서열번호 4), TAT(서열번호 8) 또는 SKE(서열번호 15)를 사용하여 실시예 2-2에 개시된 결합체와 동일한 형태의 결합체를 제조하고, 이들 제조된 결합체를 다양한 농도(1, 2 또는 4 nM)로 줄기세포(rat Cardiac stem cell)에 처리하여 배양한 다음, 유세포분석을 통해, 줄기세포내로 도입된 QD의 수준을 정량분석하고 이를 비교하였다(도 3). 이때, 음성 대조군으로는 상기 결합체를 처리하지 않고 배양한 줄기세포를 사용하고, 양성 대조군으로는 결합체가 아닌 amine-QD를 처리하여 배양한 줄기세포를 사용하였다.4 (SEQ ID NO: 4), TAT (SEQ ID NO: 4), and TAT (SEQ ID NO: 4) to confirm that the cell permeability of the conjugate containing the A-4 peptide identified in Example 2-2 was also applied to cells other than Hela cell line 8) or SKE (SEQ ID NO: 15) were used to prepare conjugates of the same type as the conjugates described in Example 2-2, and the prepared conjugates were mixed with various concentrations (1, 2 or 4 nM) stem cells), followed by flow cytometry to quantitatively analyze the level of QD introduced into stem cells and compare them (FIG. 3). At this time, as a negative control, stem cells cultured without treatment of the conjugate were used, and stem cells cultured by treatment with amine-QD, which is not a conjugate, were used as a positive control.

도 3은 줄기세포에 대한 amine-QD가 결합된 다양한 결합체의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 줄기세포를 사용한 경우에도, A-4를 사용하여 제조된 결합체를 처리한 경우에만 형광값이 높은 수준으로 검출되었고, 상기 검출된 형광값은 결합체의 처리농도에 비례하여 증가됨을 확인하였다.FIG. 3 is a graph showing the results of comparing cell permeabilities of various conjugates in which amine-QD is bound to stem cells. As shown in FIG. 3, even when stem cells were used, the fluorescence value was detected at a high level only when the conjugate prepared using A-4 was treated, and the fluorescence value detected was increased in proportion to the concentration of the conjugate Respectively.

실시예Example 2-4:  2-4: 공초점Confocal 현미경을 이용한 결합체의 세포투과성 평가 Evaluation of cell permeability of a conjugate using a microscope

상기 결합체의 세포투과성을 확인하기 위하여, 헬라 세포주에 A-4를 사용하여 제조된 결합체, 상기 결합체에 포함된 것과 동일한 양의 amine-QD 또는 상기 결합체에 포함된 것의 4배 양의 amine-QD를 가하여 배양한 후, 공초점 현미경으로 세포내 형광의 수준을 촬영하였다(도 4).In order to confirm the cell permeability of the conjugate, the conjugate prepared using A-4 in Hela cell line, amine-QD in the same amount as that contained in the conjugate, or amine-QD in quadruplicate amount contained in the conjugate After culturing, the level of intracellular fluorescence was photographed with a confocal microscope (Fig. 4).

도 4는 다양한 수준의 amine-QD 또는 A-4를 사용하여 제조된 결합체의 처리에 따른 QD의 세포투과성을 공초점 현미경으로 평가한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 보듯이, amine-QD를 단독으로 처리하면 아무리 많은 양을 처리하여도 세포내로 유입되지 않았으나, amine-QD가 A-4와 결합된 결합체를 처리하면 용이하게 세포내로 QD가 유입됨을 확인하였다.FIG. 4 is a photograph showing the results of evaluating the cell permeability of QD according to a confocal microscope according to treatment of a conjugate prepared using various levels of amine-QD or A-4. As shown in FIG. 4, when the amine-QD alone was treated, the QD was easily introduced into the cell when the conjugate in which amine-QD was conjugated with A-4 was not introduced into the cells even when treated with as much amount as possible Respectively.

실시예Example 3:  3: CPP의Of CPP 비공유적Unofficial 결합에 의한 세포투과성 분석 Analysis of cell permeability by binding

상기 실시예 1-2에서 수득한 7종의 멜리틴 단편유래 CPP를 이용하고, 목적하는 약물로서 베타-갈락토시다제(β-galactosidase, β-gal)를 이용하여, CPP와 약물의 비공유적인 결합에 의한 약물의 세포투과성을 분석하고자 하였다.Using 7 kinds of melittin fragment-derived CPPs obtained in the above Example 1-2 and using β-galactosidase (β-gal) as a target drug, the CPP and the non- And to analyze the cell permeability of the drug by binding.

실시예Example 3-1: 베타- 3-1: Beta- 갈락토시다제와Galactosidase and ONPG를ONPG 사용한  Used CPP의Of CPP 세포투과성 분석 Cell permeability analysis

0.1μM 베타-갈락토시다제와 다양한 농도(0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 4, 5 또는 10μM)의 다양한 CPP 후보물질을 혼합하고, 상온에서 30분 동안 반응시켜서 반응물을 수득한 다음, 상기 반응물을 헬라 세포주에 가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 회수하고, 이를 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득한 다음, 상기 세포파쇄물에 베타-갈락토시다제의 기질인 ONPG(Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside)를 가하여 반응시켰으며, 반응이 종료된 후, 반응물을 대상으로 OD420에서 흡광도를 측정하여, 반응산물인 ONP(Ortho-Nitrophenyl)를 정량분석하였다(도 5a). 이때, 음성대조군으로는 아무것도 처리하지 않고 배양된 세포를 사용하고, 양성대조군으로는 베타-갈락토시다제 만을 처리하여 배양된 세포를 사용하였다. 또한, 사용된 CPP로는 Mel(1-5)(서열번호 18), Mel(1-8)(서열번호 19), Mel(1-11)(서열번호 20), Mel(1-14)(서열번호 21), Mel(1-17)(서열번호 22), Mel(1-20)(서열번호 23), Mel(1-23)(서열번호 24), Mel(1-26)(서열번호 1), TAT(서열번호 8) 및 MAP(서열번호 9)를 사용하였다.Various CPP candidate substances of various concentrations (0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 4, 5 or 10 μM) with 0.1 μM beta-galactosidase were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes to obtain a reaction product, The reaction product was added to a Greek cell line and incubated at 37 DEG C for 1 hour and 30 minutes. The cultured cells were recovered and disrupted to obtain a cell lysate. Then, ONPG (Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside), which is a substrate of β-galactosidase, was added to the cell lysate, After that, the absorbance of the reaction product was measured at OD420 to quantitatively analyze the reaction product, ONP (Ortho-Nitrophenyl) (FIG. 5A). At this time, cultured cells were used as a negative control group, and cultured cells were treated with only beta-galactosidase as a positive control group. The CPPs used were Mel (1-5) (SEQ ID NO: 18), Mel (1-8) (SEQ ID NO: 19), Mel (1-11) Mel (1-22) (SEQ ID NO: 21), Mel (1-17) (SEQ ID NO: 22) ), TAT (SEQ ID NO: 8) and MAP (SEQ ID NO: 9) were used.

도 5a는 다양한 CPP 후보물질에 의한 베타-갈락토시다제의 세포투과성을, 베타-갈락토시다제의 기질인 ONPG를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다. 도 5a에서 보듯이, 멜리틴의 세포투과성을 기준으로 볼 때, Mel(1-11) 내지 Mel(1-20)의 단편이 상대적으로 높은 수준의 세포투과성을 나타내었고, 그 중에서도 Mel(1-14)가 가장 우수한 수준으로 비공유적 결합에 의하여 베타-갈락토시다제를 세포내로 전달하는 효과를 나타냄을 확인하였다.FIG. 5A is a graph and a graph showing the results of analysis of cell permeability of beta-galactosidase by various CPP candidate substances using ONPG, a substrate of beta-galactosidase. FIG. As shown in FIG. 5A, on the basis of the cell permeability of melitin, the fragments of Mel (1-11) to Mel (1-20) showed a relatively high level of cell permeability, 14) was the most excellent level and it was confirmed that beta - galactosidase was transferred into cells by non - covalent binding.

상기 도 5a의 결과로부터, 멜리틴의 세포투과성을 기준으로 볼 때, Mel(1-11) 내지 Mel(1-20)의 단편이 상대적으로 높은 수준의 세포투과성을 나타냄을 확인하였으나, Mel(1-20)의 경우에도 상대적으로 높은 세포독성을 나타내었기 때문에, Mel(1-11) 내지 Mel(1-17)의 단편을 대상으로, 베타-갈락토시다제의 세포투과성을 평가하였다(도 5b). 이때, 사용된 단편은 Mel(1-11)(서열번호 20), Mel(1-12)(서열번호 25), Mel(1-13)(서열번호 2), Mel(1-14)(서열번호 21), Mel(1-15)(서열번호 26), Mel(1-16)(서열번호 27) 및 Mel(1-17)(서열번호 22)을 사용하였다.From the results of FIG. 5A, it was confirmed that the fragments of Mel (1-11) to Mel (1-20) exhibited a relatively high level of cell permeability based on the cell permeability of melittin, -20), the cell permeability of the beta-galactosidase was evaluated on the fragments of Mel (1-11) to Mel (1-17), as shown in FIG. 5B ). Mel (1-12), Mel (1-13) (SEQ ID NO: 2), Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21), Mel (1-15) (SEQ ID NO: 26), Mel (1-16) (SEQ ID NO: 27) and Mel (1-17) (SEQ ID NO: 22)

도 5b는 Mel(1-11) 내지 Mel(1-17)의 멜리틴 단편에 의한 베타-갈락토시다제의 세포투과성을, 베타-갈락토시다제의 기질인 ONPG를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다. 도 5b에서 보듯이, 베타-갈락토시다제를 단독으로 ㅅ사용한 경우보다는 Mel(1-11) 내지 Mel(1-17)의 멜리틴 단편을 사용할 경우, 세포투과성이 증가됨을 확인하였고, 특히, Mel(1-12)(서열번호 25) 및 Mel(1-14)(서열번호 21)가 높은 수준의 세포투과성을 나타내었으며, Mel(1-14)(서열번호 21)가 가장 높은 수준의 세포투과성을 나타냄을 알 수 있었다.FIG. 5B shows the results of analysis of cell permeability of beta-galactosidase by melittin fragments of Mel (1-11) to Mel (1-17) using ONPG, a substrate of beta-galactosidase ≪ / RTI > As shown in FIG. 5B, it was confirmed that when melitin fragments of Mel (1-11) to Mel (1-17) were used, cell permeability was increased rather than using beta-galactosidase alone, Mel (1-12) (SEQ ID NO: 25) and Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21) showed high levels of cell permeability and Mel (1-14) Permeability.

실시예Example 3-2: 다양한 세포에서 베타- 3-2: Beta- 갈락토시다제와Galactosidase and X-gal을 사용한  Using X-gal CPP의Of CPP 세포투과성 분석 Cell permeability analysis

상기 실시예 3-2의 결과에서 보듯이, Mel(1-14)(서열번호 21)가 가장 높은 수준의 세포투과성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 펩타이드가 다른 세포에서도 동일한 효과를 나타내는지를 확인하고자 하였다.As shown in the results of Example 3-2, it was confirmed that Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21) exhibited the highest level of cell permeability, so that it was confirmed whether the peptide exhibited the same effect in other cells .

구체적으로, 0.1μM 베타-갈락토시다제와 5μM의 CPP 후보물질(TAT, MAP 또는 Mel(1-14))을 혼합하고, 상온에서 30분 동안 반응시켜서 반응물을 수득한 다음, 상기 반응물을 다양한 세포(A549 세포, H1299 세포, 헬라세포 또는 MCF-7 세포)에 가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 세척한 다음, 포름알데이드를 가하여 상온에서 10분동안 고정시키고, X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)을 처리하고 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, X-gal의 분해에 의하여 발색되는 청색의 수준을 측정하여, 베타-갈락토시다제의 세포투과성을 분석하였다(도 6).이때, 음성대조군으로는 아무것도 처리하지 않고 배양된 세포를 사용하고, 양성대조군으로는 베타-갈락토시다제 만을 처리하여 배양된 세포를 사용하였다.Specifically, 0.1 μM beta-galactosidase and 5 μM CPP candidate material (TAT, MAP or Mel (1-14)) were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes to obtain a reaction product, Cells (A549 cells, H1299 cells, HeLa cells or MCF-7 cells) and cultured at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. The cultured cells were washed, fixed with formaldehyde at room temperature for 10 minutes, treated with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside And the cell permeability of beta-galactosidase was assayed by measuring the level of blue color developed by the decomposition of X-gal (Fig. 6). At this time, the negative control group was cultured without any treatment Cells were used, and as a positive control group, cultured cells were treated with only beta-galactosidase.

도 6은 다양한 세포에서 Mel(1-14)에 의한 베타-갈락토시다제의 세포투과성을, 베타-갈락토시다제의 기질인 X-gal을 사용하여 분석한 결과를 촬영한 현미경 사진이다. 도 6에서 보듯이, TAT 및 MAP는 세포의 종류에 따라 세포투과성에 차이를 나타냄에 반하여, Mel(1-14) 모든 세포에서 동등한 수준의 세포투과성을 나타냄을 확인하였다.FIG. 6 is a photomicrograph showing the cell permeability of beta-galactosidase by Mel (1-14) in various cells using X-gal as a substrate of beta-galactosidase. As shown in FIG. 6, it was confirmed that TAT and MAP showed the same level of cell permeability in all cells of Mel (1-14), while they showed different cell permeability according to the type of cell.

실시예Example 4: 전하에 따른 세포투과성 분석 4: Analysis of cell permeability by charge

음전하 또는 양전하를 띤 QD(Quantum dot)의 세포투과성에 미치는 Mel(1-14)의 효과를 분석하였다.The effect of Mel (1-14) on the cell permeability of negatively charged or positively charged QD (Quantum dot) was analyzed.

실시예Example 4-1: 음전하를 띤  4-1: Negatively charged QD의QD's 세포투과성 분석 Cell permeability analysis

먼저, 카르복시화된 QD(녹색) 80 nM과 다양한 종류의 CPP 20 μM을 혼합하고, 100 ㎕의 혼합물을 수득하였으며, 이를 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다음, 상기 혼합물에 900 ㎕의 RPMI 배지를 첨가하여, 1 ㎖의 시료를 수득하였다.First, 80 nM of car- boxylated QD (green) and 20 uM of various kinds of CPP were mixed and 100 μl of a mixture was obtained, which was reacted at room temperature for 30 minutes. Then, 900 占 퐇 of RPMI medium was added to the mixture to obtain 1 ml of a sample.

한편, 2×105 세포수/㎖의 헬라세포를 12웰 플레이트에 웰당 1㎖씩 분주하고, 37℃에서 하루동안 배양하였다. 이어, 상기 배양된 헬라세포에 상기 수득한 시료 1 ㎖을 각각 가하고, 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이때, CPP의 최종농도는 2 μM이고, QD의 최종농도는 8 nM이 되게 하였으며, CPP는 TAT(서열번호 8), MAP(서열번호 9) 및 Mel(1-14)(서열번호 21)를 사용하였다.On the other hand, Hela cells at 2 × 10 5 cells / ml were dispensed in a 12-well plate in an amount of 1 ml per well, and cultured at 37 ° C. for one day. Then, 1 ml of the obtained sample was added to the cultured HeLa cells, and the cells were reacted at 37 ° C for 6 hours. The final concentration of CPP was 2 μM, the final concentration of QD was 8 nM, and the CPP was TAT (SEQ ID NO: 8), MAP (SEQ ID NO: 9) and Mel (1-14) Respectively.

반응이 종료된 후, 반응물을 유세포분석기(FACS calibur)에 적용하여 음전하를 띤 QD(CQD)를 단독으로 사용한 실험군(CQD); FL-1 filter 형광을 나타내는 세포의 히스토그램을 분석하여, CPP에 의한 음전하를 띤 QD의 세포투과성을 산출하고 CPP 별로 비교하였다(도 7a).After completion of the reaction, the experimental group (CQD) using the negatively charged QD (CQD) alone by applying the reactant to a flow cytometer (FACS calibur); Histograms of cells showing FL-1 filter fluorescence were analyzed to calculate the cell permeability of negative-charged QD by CPP and compared by CPP (FIG. 7A).

도 7a는 CPP의 종류에 따른 음전하를 띤 QD의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7a에서 보듯이, 음전하를 띤 QD의 세포투과성은 CPP에 따라 서로 상이하며, 본 발명에서 제공하는 Mel(1-14)는 음전하를 띤 QD를 상대적으로 가장 높은 효율로 세포에 전달함을 알 수 있었다.7A is a graph showing a result of comparing cell permeability of negative charged QD according to the type of CPP. As shown in FIG. 7A, the cell permeability of the negatively charged QDs differs according to the CPP, and Mel (1-14) provided by the present invention transmits the negatively charged QD to the cells with the highest efficiency. I could.

실시예Example 4-2: 양전하를 띤  4-2: positively charged QD의QD's 세포투과성 분석 Cell permeability analysis

카르복시화된 QD(녹색) 대신에 아민화된 QD(오렌지색)를 사용하고, 유세포분석기를 이용하여 음전하를 띤 QD(AQD)를 단독으로 사용한 실험군(AQD); FL-2 filter 형광을 나타내는 세포의 히스토그램을 분석하는 것을 제외하고는, 실시예 4-1과 동일한 방법을 수행하여, CPP에 의한 음전하를 띤 QD의 세포투과성을 산출하고 CPP 별로 비교하였다(도 7b).(AQD) using negative QD (AQD) alone, using aminated QD (orange) instead of car- boxylated QD (green) and using flow cytometry; Cell permeability of negatively charged QD by CPP was calculated and compared per CPP by performing the same method as in Example 4-1 except that the histogram of cells showing FL-2 filter fluorescence was analyzed (Fig. 7B ).

도 7b는 CPP의 종류에 따른 양전하를 띤 QD의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7b에서 보듯이, 음전하를 띤 QD의 세포투과성은 CPP에 따라 서로 상이하며, 본 발명에서 제공하는 Mel(1-14)는 양전하를 띤 QD를 다른 CPP에 비하여 현저하게 높은 효율로 세포에 전달함을 알 수 있었다.FIG. 7B is a graph showing the results of comparing cell permeability of positively charged QDs according to the type of CPP. FIG. As shown in FIG. 7B, the cell permeability of the negatively charged QDs differs according to the CPP, and Mel (1-14) provided by the present invention is capable of delivering positively charged QD to the cells at a significantly higher efficiency than other CPPs .

상기 실시예 4-1 및 4-2의 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 Mel(1-14)는 전하에 상관없이 높은 효율로 세포투과성을 나타내는 펩타이드임을 알 수 있었다.From the results of Examples 4-1 and 4-2, it can be seen that Mel (1-14) provided by the present invention is a peptide showing cell permeability with high efficiency regardless of charge.

실시예Example 5: 유전자 전달효율 분석 5: Analysis of gene transfer efficiency

먼저, gwiz 유전자 1 ㎍과 다양한 농도(1, 2, 5 또는 10 μM)의 Mel(1-14)(서열번호 21)를 혼합하고, 100 ㎕의 혼합물을 수득하였으며, 이를 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다음, 상기 혼합물에 900 ㎕의 RPMI 배지를 첨가하여, 1 ㎖의 시료를 수득하였다. First, 1 μg of the gwiz gene and Mel (1-14) (SEQ ID NO: 21) of various concentrations (1, 2, 5 or 10 μM) were mixed to obtain 100 μl of a mixture, which was reacted for 30 minutes at room temperature . Then, 900 占 퐇 of RPMI medium was added to the mixture to obtain 1 ml of a sample.

또한, 비교군으로서 gwiz 유전자 1 ㎍과 3 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine)을 혼합하고, 100 ㎕의 혼합물을 수득하였으며, 이를 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다음, 상기 혼합물에 900 ㎕의 RPMI 배지를 첨가하여, 1 ㎖의 시료를 수득하였다. As a comparative group, 1 占 퐂 of gwiz gene and 3 占 퐇 of Lipofectamine were mixed and 100 占 퐇 of a mixture was obtained, which was reacted at room temperature for 30 minutes. Then, 900 占 퐇 of RPMI medium was added to the mixture to obtain 1 ml of a sample.

한편, 2×105 세포수/㎖의 헬라세포를 12웰 플레이트에 웰당 1㎖씩 분주하고, 37℃에서 하루동안 배양하였다. 이어, 상기 배양된 헬라세포에 상기 수득한 각각의 시료 1 ㎖을 각각 가하고, 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. On the other hand, Hela cells at 2 × 10 5 cells / ml were dispensed in a 12-well plate in an amount of 1 ml per well, and cultured at 37 ° C. for one day. Then, 1 ml of each of the samples obtained above was added to the cultured HeLa cells, and they were reacted at 37 ° C for 6 hours.

반응이 종료된 후, 반응물을 유세포분석기(FACS calibur)에 적용하여 gwiz 유전자로부터 발현된 녹색형광단백질의 형광(Green; FL-1 filter)을 나타내는 세포의 히스토그램을 분석하여, Mel(1-14)의 농도에 따른 gwiz 유전자의 세포투과성을 산출하고, 이를 비교군인 리포펙타민의 세포투과성과 비교하였다(도 8).After the reaction was completed, the reaction was applied to a FACS calibur to analyze the histogram of cells showing green fluorescence (FL-1 filter) expressed from the gwiz gene, and Mel (1-14) The cell permeability of the gwiz gene was calculated according to the concentration of the lipopolysaccharide and compared with the cell permeability of the comparative group of lipofectamine (FIG. 8).

도 8은 Mel(1-14)의 농도에 따른 gwiz 유전자의 세포투과성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, gwiz 유전자의 세포투과성은 Mel(1-14)의 농도에 비례하여 증가하며, 비교군으로 사용된 리포펙타민에 상응하는 수준임을 알 수 있었다.FIG. 8 is a graph showing the cell permeability of gwiz gene according to the concentration of Mel (1-14). As shown in FIG. 8, the cell permeability of the gwiz gene increased in proportion to the concentration of Mel (1-14) and was found to be a level corresponding to the lipofectamine used as the comparative group.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Novel cell penetrating peptide <130> KPA150825-KR-P1 <150> KR 10-2015-0109148 <151> 2015-07-31 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> melittin <400> 1 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-Mel(1-13) <400> 2 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel10R8 <400> 3 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-4 <400> 4 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Trp Gly Ile Arg Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-Mel(1-13) <400> 5 ggaattggag cagttctgaa ggtattaacc acaggattg 39 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel10R8 <400> 6 ggaattggag cagttctgaa ggtattaacc cgtaggcgta ggcgtaggcg tagg 54 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-4 <400> 7 ggaattggag cagttctgaa ggtatgggga attcgtagg 39 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 8 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP <400> 9 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SAP <400> 10 Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro 1 5 10 15 Pro Pro <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R8 <400> 11 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hph-1 <400> 12 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> crotamine <400> 13 Tyr Lys Gln Cys His Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cylop-1 <400> 14 Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKE <400> 15 Ser Lys Glu Trp Gln Pro Ala Gln Val Ile Leu Leu Cys 1 5 10 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-8 <400> 16 Gly Leu Gly Gly Val Arg Leu Pro Phe Tyr Ile Leu Gly Cys 1 5 10 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 17 Trp Gly Ile Arg Arg 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-5) <400> 18 Gly Ile Gly Ala Val 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-8) <400> 19 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-11) <400> 20 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-14) <400> 21 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-17) <400> 22 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-20) <400> 23 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-23) <400> 24 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys 20 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-12) <400> 25 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-15) <400> 26 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel(1-16) <400> 27 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 <110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Novel cell penetrating peptide <130> KPA150825-KR-P1 <150> KR 10-2015-0109148 <151> 2015-07-31 <160> 27 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> melittin <400> 1 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu   1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln              20 25 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-Mel (1-13) <400> 2 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu   1 5 10 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel10R8 <400> 3 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg   1 5 10 15 Arg Arg         <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-4 <400> 4 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Trp Gly Ile Arg Arg   1 5 10 <210> 5 <211> 39 <212> 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10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel (1-15) <400> 26 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala   1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mel (1-16) <400> 27 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu   1 5 10 15

Claims (15)

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 멜리틴 서열중에서, N-말단으로부터 8 내지 17개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드.
A cell permeable peptide comprising 8 to 17 consecutive amino acid sequences from the N-terminus, among melittin sequences consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서,
상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 멜리틴 서열중에서, N-말단으로부터 12 내지 14개의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩타이드.
The method according to claim 1,
Wherein said cell permeable peptide comprises 12 to 14 consecutive amino acid sequences from the N-terminus of a melittin sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서,
상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 2, 21 또는 25의 아미노산 서열로 구성되는 것인 펩타이드.
The method according to claim 1,
Wherein said cell permeable peptide is comprised of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 21 or 25.
제1항에 있어서,
상기 세포투과성 펩타이드는 상기 아미노산 서열의 C-말단에 다른 아미노산 서열이 추가된 형태인 것인 펩타이드.
The method according to claim 1,
Wherein the cell permeable peptide is a form in which another amino acid sequence is added to the C-terminus of the amino acid sequence.
제4항에 있어서,
상기 다른 아미노산 서열은 서열번호 8 내지 15 및 17의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열인 것인 펩타이드.
5. The method of claim 4,
Wherein the other amino acid sequence is at least one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 8 to 15 and 17.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
6. A polynucleotide encoding the cell permeable peptide of any one of claims 1 to 5.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
An expression vector comprising the polynucleotide of claim 6.
제7항의 발현벡터가 도입된 형질전환체.
A transformant into which the expression vector of claim 7 has been introduced.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포투과성 펩타이드와 목적하는 약물을 포함하는 세포내 약물전달용 조성물.
6. A composition for intracellular drug delivery comprising the cell permeable peptide of any one of claims 1 to 5 and a desired drug.
제9항에 있어서,
상기 약물은 화합물, 단백질 또는 핵산인 것인 조성물.
10. The method of claim 9,
Wherein the drug is a compound, protein or nucleic acid.
제9항에 있어서,
상기 펩타이드와 약물은 비공유적인 결합체를 형성하는 것인 조성물.
10. The method of claim 9,
Wherein the peptide and the drug form a noncovalent association.
제11항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
12. The method of claim 11,
Wherein the peptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
제9항에 있어서,
상기 펩타이드와 약물은 상호 결합되어 결합체를 형성하는 것인 조성물.
10. The method of claim 9,
Wherein the peptide and the drug are mutually linked to form a conjugate.
제13항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
14. The method of claim 13,
Wherein said peptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
제13항에 있어서,
상기 결합체는 상기 펩타이드와 약물이 링커를 통해 결합된 형태인 것인 조성물.14. The method of claim 13,
Wherein the conjugate is in a form in which the peptide and the drug are bound through a linker.
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