KR101602689B1

KR101602689B1 - Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with PDGFb

Info

Publication number: KR101602689B1
Application number: KR1020140020770A
Authority: KR
Inventors: 이설훈; 강내규; 이상화
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2016-03-11
Also published as: KR101602690B1; KR20150056021A; KR20150056023A; KR101608131B1; KR101609041B1; KR20150056024A; KR20150056022A

Abstract

본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 PDGFb가 결합된 융합단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 및 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 PDGFb에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 피부투과성과 피부잔류성이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부에서 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 합성 또한 증대시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a fusion protein in which PDGFb is bound to a skin permeation promoting peptide, a polynucleotide encoding the fusion protein, a cosmetic composition for skin improvement comprising the fusion protein, and a pharmaceutical composition for external application for skin comprising the fusion protein will be. The fusion protein of the present invention binds PDGFb to a peptide for promoting skin permeation and not only significantly improves skin permeability and skin retention, but also increases the synthesis of substances exhibiting useful effects such as improving wrinkles in skin such as collagen and elastin Therefore, it can be widely used as an active ingredient of a functional cosmetic composition and a pharmaceutical composition for external application for skin.

Description

[0001] The present invention relates to a cosmetic composition for skin care comprising a fusion protein of platelet-derived growth factor b subunit (PDGFb)

본 발명은 혈소판유래성장인자 ｂ서브유닛(PDGFb)의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드에 PDGFb가 결합된 융합단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 및 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a cosmetic composition for improving skin comprising a fusion protein of a platelet-derived growth factor b subunit (PDGFb), and more particularly, to a cosmetic composition for skin improvement comprising a fusion protein in which PDGFb is bound to a skin permeation- A cosmetic composition for skin improvement comprising the fusion protein, and a pharmaceutical composition for external application for skin comprising the fusion protein.

일반적으로, 피부의 주름은 근육운동에 의해 만성적인 변형을 받는 부위에 국소적으로 형성, 정착되는 피부의 형태, 구조변화라고 말할 수 있고, 이러한 생리 변화만이 아니라 보다 미세한 피부 내부 구조의 변화나 물성 변화와 함께 주름 형성메커니즘을 검토하는 것도 실제적인 주름형성기구의 이해를 위해서는 중요하다고 말할 수 있다. 이와 관련하여, 광노화에 따른 피부 내부 구조 변화로서는, 표피, 진피의 비후화나 비정상적인 탄력섬유증물질(elastotic material)의 축적, 또는 탄성섬유의 입체구조 변화 등이 보고되고 있다. 또한, 피부구조의 주요 구성 성분인 골격이라는 콜라겐에 대해서는 콜라겐 섬유의 미세섬유화, 섬유형태의 약화 등이 밝혀지고 있다.Generally, the wrinkles of the skin can be said to be a change in the shape and structure of the skin locally formed and fixed at a site which is subjected to chronic deformation by the muscle movement. In addition to this physiological change, Consideration of the mechanism of wrinkling along with changes in physical properties is also important for understanding the actual wrinkling mechanism. In this regard, changes in the internal structure of the skin due to photoaging have been reported, such as epidermal and dermal hyperplasia, abnormal accumulation of elastic fibrous materials, or changes in the stereostructure of elastic fibers. In addition, collagen called skeleton, which is a major constituent of the skin structure, has been found to be microfibrillated and weakened in fiber form.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포의 간질에 존재하고 생체 단백질 총 중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유 시)의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광 노화에 의해 감소하고, 일반적으로 노화가 진행됨에 따라 피부의 두께가 얇아지며 이러한 현상은 피부의 탄력저하 및 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.Collagen is a major substrate protein produced in the fibroblasts of the skin. It is present in the epilepsy of the cells and occupies 30% of the total weight of the bioprotein. It has a strong triple helix structure. Its main functions are mechanical durability of the skin, resistance of connective tissues and binding force of tissues, support of cell adhesion, induction of cell division and differentiation (when organism grows or heals the wound). Such collagen is reduced by aging and photoaging due to ultraviolet irradiation. In general, as the aging progresses, the thickness of the skin becomes thinner, and this phenomenon is known to be closely related to the reduction of the elasticity of the skin and the formation of wrinkles.

콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 다양한 유효성분, 예를 들어 레티노익산(retinoic acid), TGF(transforming growth factor), 동물태반 유래의 단백질(일본특허공개번호 제1996-231370호), 베튤린산(betulinic acid)(일본특허공개번호 제1996-208424호), 클로렐라 추출물(일본특허공개번호 제1994-040523, 일본특허공개번호 제1998-036283) 등이 알려져 있으나, 상기 유효성분들은 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 또는 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능을 개선하는 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다. Retinoic acid, transforming growth factor (TGF), proteins derived from animal placenta (Japanese Patent Laid-Open No. 1996-231370), betulinic acid (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1996-208424), chlorella extract (Japanese Patent Laid-open No. 1994-040523, Japanese Patent Laid-Open No. 1998-036283), etc. However, There is a problem that the use amount is limited due to the problem of safety such as redness, or there is a problem that the effect is insignificant and the effect of improving skin function by promoting collagen synthesis of skin substantially can not be expected.

이러한 문제점은 콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 다양한 유효성분이 정상적으로 피부를 통해 흡수되지 못하는 것이 주된 원인으로 알려져 있기 때문에, 상기 유효성분의 흡수를 촉진시키는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 매우 우수한 IL-10-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타낼 뿐, 다른 약물의 전달용 담체로서 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 이러한 단점은 피부투과성이 우수하는 특성만으로는 약물의 전달에 사용할 수 없다는 것을 암시하는 것으로 분석되었으므로, 콜라겐 합성을 촉진하기 위하여는 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질의 개발이 요구되었으나, 아직까지는 별다른 연구결과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
These problems are known to be mainly caused by the fact that various effective ingredients that promote collagen synthesis and promote wrinkle reduction are not normally absorbed through the skin. Therefore, researches have been actively conducted to develop a method for promoting absorption of the above-mentioned effective ingredients. For example, Korean Patent Registration No. 1054519 discloses a human growth hormone-derived peptide and a composition containing the human growth hormone-derived peptide, which are superior in stability and skin permeability to natural human growth hormone. In Korean Patent No. 1104223, 10-derived peptides having the same functions as those of natural IL-10 and having excellent stability and skin permeability as compared with natural IL-10, and compositions comprising the same. However, these peptides are merely functional, It can not be used as a delivery carrier for other drugs. These disadvantages are analyzed to suggest that the excellent permeability of the skin can not be used for the delivery of drugs. Therefore, in order to promote collagen synthesis, it has not only excellent skin permeability, but also has two characteristics that improve the synthesis of collagen in skin The development of new materials has been demanded, but so far no other research results have been reported yet.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도 피부에 오래 잔류할 수 있는 피부투과 촉진용 펩타이드를 개발하였으며, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드에 PDGFb를 융합시킨 융합단백질이 피부투과성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 특성을 모두 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the inventors of the present invention have made extensive efforts to develop a new material which has not only superior skin permeability but also improved the synthesis of collagen in the skin, and as a result, it has been found that it can be used as a carrier for transdermal delivery of drugs, The inventors of the present invention have developed a peptide for promoting skin permeation which can be remained and confirmed that the fusion protein obtained by fusing PDGFb to the skin permeation promoting peptide exhibits excellent skin permeability as well as improving the synthesis of collagen in skin, Thus completing the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 피부투과 촉진용 펩타이드에 혈소판유래성장인자 ｂ서브유닛(PDGFb)이 결합된 융합단백질을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a fusion protein in which a platelet-derived growth factor b subunit (PDGFb) is bound to a skin permeation enhancing peptide.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding said fusion protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a cosmetic composition for improving skin comprising the fusion protein as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for external application for skin comprising the fusion protein.

본 발명자들은 피부투과성 및 피부잔류성이 우수할 뿐만 아니라 피부에서 콜라겐의 합성을 향상시키는 두가지 특성을 포함하는 새로운 물질을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 피부투과 촉진용 펩타이드를 발굴하였다. 또한, 상기 발굴된 피부투과 촉진용 펩타이드를 다양한 성장인자와 융합하여 피부투과성과 콜라겐 합성수준이 우수한 융합단백질을 스크리닝한 결과, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드에 성장인자의 일종인 PDGFb가 결합된 형태의 융합단백질이 콜라겐 뿐만 아니라 엘라스틴의 발현수준을 증대시킬 수 있으면서도 피부투과성 및 피부잔류성이 우수함을 확인하였다.The inventors of the present invention conducted a variety of studies to develop a novel substance that has both excellent skin permeability and skin retention as well as two properties that improve the synthesis of collagen in the skin, and combined the phage library and the dissolution test method of the transdermal preparation , And a phage display method was performed to discover a novel peptide for promoting skin permeation including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Further, as a result of screening fusion proteins having excellent skin permeability and collagen synthesis level by fusing the excised skin permeation-promoting peptide with various growth factors, it was found that PDGFb, which is a type of growth factor, is bound to the skin permeation- It was confirmed that the fusion protein can increase not only the collagen but also the elastin expression level, but also the skin permeability and skin durability.

따라서, 상기 융합단백질은 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
Thus, it was found that the fusion protein can be used as an active ingredient of a functional cosmetic composition and a pharmaceutical composition for external application for skin.

이에, 상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 피부투과 촉진용 펩타이드가 혈소판유래성장인자 ｂ서브유닛(PDGFb)에 결합된 융합단백질을 제공한다. 바람직하게, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과 촉진용 펩타이드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 PDGFb의 N-말단에 결합되어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
In order to achieve the above-mentioned object of the present invention, the present invention provides a fusion protein in which a skin permeation promoting peptide is bound to a platelet-derived growth factor b subunit (PDGFb). Preferably, the present invention relates to a skin permeation enhancing peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the peptide for promoting skin permeation is bound to the N-terminus of PDGFb comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, .

본 발명의 용어 "피부투과 촉진용 펩타이드"란, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있으며, 피부투과성과 피부잔류성이 우수한 펩타이드를 의미한다. The term "peptides for promoting skin permeation" of the present invention means peptides that can permeate through the skin regardless of the size or nature of the molecule, can evenly deliver to the entire skin, and have excellent skin permeability and skin retention.

본 발명의 용어 "피부투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부내부로 침투할 수 있는 능력을 의미한다.The term "skin permeability" of the present invention means the ability of the peptide to permeate through the skin and penetrate into the skin.

본 발명의 용어 "피부잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부내의 조직에 결합되어 피부내에 잔류하는 능력을 의미한다.The term "skin persistence" of the present invention means the ability of a peptide permeating through the skin to pass through the skin tissue and not be transferred to the circulatory system, but to bind to the tissue in the skin and remain in the skin.

본 발명에 있어서, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드는 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 발굴된, 피부투과성과 피부잔류성이 우수한 펩타이드가 될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있다.
In the present invention, the skin permeation-promoting peptide may be a peptide having excellent skin permeability and skin retention, which has been discovered by carrying out a phage display method, which is a combination of a phage library and a dissolution test method of a transdermal preparation, A peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 용어 "혈소판유래성장인자 ｂ서브유닛(platelet-derived growth factor subunit b, PDGFb)"이란, 혈소판유래성장인자(PDGF) 계열에 속하는 단백질 중의 하나로서, 혈액내 혈소판에 함유되어 있으며, 약 14kDa의 크기를 같는 단백질을 의미한다. 혈소판에 존재하는 PDGF는 약 18kDa의 크기를 갖는 A 서브유닛과 상기 B 서브유닛으로 구성되는데, 이들은 이황화결합을 통해 동형이합체인 PDGF-AA 또는 PDGF-BB를 형성하거나, 이형이합체인 PDGF-AB를 형성한다고 알려져 있다. The term " platelet-derived growth factor subunit b (PDGFb) "of the present invention is one of the proteins belonging to the platelet-derived growth factor (PDGF) family and is contained in platelets in the blood, Means a protein having a size of 14 kDa. PDGF present in platelets consists of A subunits with a size of about 18 kDa and the B subunits which form PDGF-AA or PDGF-BB, homodimers, through disulfide bonds, or PDGF-AB, a heterodimer, &Lt; / RTI >

본 발명에 있어서, 상기 PDGFb는 콜라겐 생성 또는 엘라스틴 생성을 증대시키는 효과를 나타내는 한, 그의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는데, 상기 PDGFb의 전체 아미노산 서열을 사용할 수도 있고, 이의 변이된 아미노산 서열을 사용할 수도 있으며, 이의 일부단편을 사용할 수도 있다. 상기 PDGFb의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스(GenBank Accession No. NP_002599, NP_035187 등)에서 얻을 수 있다. 예를 들어, PDGFb로서 사람 또는 마우스로부터 유래된 PDGFb를 사용할 수 있고, 본 발명에서는 PDGFb로서 사람으로부터 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 사용하였다. 따라서, 상기 PDGFb는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드가 될 수 있다.
In the present invention, the amino acid sequence of PDGFb is not particularly limited as long as it exhibits an effect of enhancing collagen production or elastin production. The entire amino acid sequence of PDGFb may be used, or a mutated amino acid sequence thereof may be used , Some fragments thereof may be used. The specific amino acid sequence of PDGFb or the nucleotide sequence information of the gene encoding the PDGFb can be obtained from known databases such as GenBank of NCBI (GenBank Accession No. NP_002599, NP_035187, etc.). For example, PDGFb derived from human or mouse can be used as PDGFb. In the present invention, a peptide represented by amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 derived from a human is used as PDGFb. Thus, the PDGFb may preferably be a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 용어 "융합단백질"이란, 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 상기 PDGFb에 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질을 의미한다.The term "fusion protein" of the present invention means a protein artificially synthesized so that the skin permeation enhancing peptide binds to PDGFb.

본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 피부투과 촉진용 펩타이드가 상기 PDGFb의 N-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 에스터가수분해효소 융합단백질의 효소활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 PDGFb의 N-말단을 2개의 펩타이드(GG)로 구성된 링커를 통해 연결시켜서 융합단백질을 제조하였다. 상기 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
In the present invention, the fusion protein may be directly linked to the N-terminal of the PDGFb or may be linked through a linker. The linker is not particularly limited as long as it exhibits an effect of improving the enzyme activity of the ester hydrolase fusion protein. Preferably, the linker is glycine, alanine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, asparagine, It is possible to use an amino acid such as acetic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, lysine or arginic acid, and more preferably to use a plurality of valine, leucine, aspartic acid, glycine, alanine, proline, Most preferably, one to five amino acids such as glycine, valine, leucine and aspartic acid may be used in connection with ease of gene manipulation. For example, in the present invention, a fusion protein was prepared by linking the C-terminus of the skin permeation enhancing peptide and the N-terminus of PDGFb through a linker composed of two peptides (GG). The fusion protein may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.The fusion protein may include a polypeptide having a sequence that differs from a wild-type amino acid sequence of each domain included therein by one or more amino acid residues. Amino acid exchange in proteins and polypeptides that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art. The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly. In addition, it may include a protein having increased structural stability or increased protein activity due to mutation or modification of the amino acid sequence, for example, heat, pH, etc. of the protein.

끝으로, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
Finally, the fusion protein or the polypeptide constituting the fusion protein may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or a gene encoding the fusion protein may be amplified by PCR (polymerase chain reaction) Followed by expression and cloning into an expression vector.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 피부투과 촉진용 펩타이드를 발굴하고, 상기 발굴된 피부투과 촉진용 펩타이드에 성장인자의 일종인 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 PDGFb가 결합되어, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질(T-PDGFb)을 생산하였다. 이어, 상기 생산된 융합단백질(T-PDGFb)의 효과를 PDGFb의 효과와 비교한 결과, PDGFb 보다도 콜라겐 발현수준을 증가시킬 수 있고(표 1), 엘라스틴의 발현수준을 증가시킬 수 있으며(표 2), 피부투과성을 증가시킬 수 있고(표 3) 및 피부잔류성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(표 4).According to one embodiment of the present invention, a novel phage display facilitating peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is discovered by performing a phage display method combining a phage library and a dissolution experiment method of a percutaneous preparation, PDGFb containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which is one type of growth factor, was ligated to the peptide for promoting skin permeation to produce a fusion protein (T-PDGFb) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. As a result of comparing the effect of the produced fusion protein (T-PDGFb) with the effect of PDGFb, it is possible to increase collagen expression level (PDGFb) (Table 1) and increase the level of elastin expression ), Increased skin permeability (Table 3), and increased skin retention (Table 4).

따라서, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 PDGFb에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 피부투과성과 피부잔류성이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부에서 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 합성 또한 증대시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, the fusion protein provided by the present invention is a fusion protein that binds PDGFb to a peptide for promoting skin permeation, which not only remarkably improves skin permeability and skin retention, but also exhibits useful effects such as improving wrinkles in skin such as collagen and elastin It can be used effectively as an active ingredient of a functional cosmetic composition and a pharmaceutical composition for external application for skin.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합단백질 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
In another aspect of the present invention for achieving the object of the present invention, the present invention provides a polynucleotide encoding a fusion protein, a fusion protein expression vector comprising the polynucleotide, a transformant into which the expression vector is introduced, And a method for producing the fusion protein using a transformant.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
The polynucleotide may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, of one or more bases. When the nucleotide sequence is prepared by chemically synthesizing, it is possible to use a method well known in the art, for example, a method described in Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37: 73-127, 1988 , Triesters, phosphites, phosphoramidites and H-phosphate methods, PCR and other auto primer methods, and oligonucleotide synthesis on solid supports.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. The term "expression vector" of the present invention refers to a recombinant vector capable of expressing a target peptide in a desired host cell, and a gene product containing an essential regulatory element operatively linked to the expression of the gene insert. The expression vector includes expression control elements such as an initiation codon, a termination codon, a promoter, an operator, etc. The initiation codon and termination codon are generally regarded as part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene product is administered, And must be in coding sequence and in frame. The promoter of the vector may be constitutive or inducible.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.The term "operably linked" of the present invention means a state in which a nucleic acid sequence encoding a desired protein or RNA is functionally linked to a nucleic acid expression control sequence so as to perform a general function . For example, a nucleic acid sequence encoding a promoter and a protein or RNA may be operably linked to affect the expression of the coding sequence. The operative linkage with an expression vector can be produced using gene recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be performed using enzymes generally known in the art.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.In addition, the expression vector may include a signal sequence for the release of the fusion polypeptide to facilitate the separation of the protein from the cell culture medium. A specific initiation signal may also be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In some cases, an exogenous translational control signal, which may include the ATG start codon, should be provided. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by the introduction of suitable transcription or translation enhancers.

아울러, 상기 발현벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the expression vector may further comprise a protein tag that can be removed using an endopeptidase, optionally in order to facilitate detection of the fusion protein.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.The term "tag " of the present invention means a molecule exhibiting quantifiable activity or property and includes a polypeptide fluorescent substance such as a fluorophore such as fluorescein, a fluorescent protein (GFP) Or may be a fluorescent molecule including; Myc tag, a Flag tag, a histidine tag, a Lucin tag, an IgG tag, or a strap tagidine tag. Particularly, in the case of using an epitope tag, a peptide tag composed of preferably 6 or more amino acid residues, more preferably 8 to 50 amino acid residues can be used.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
In the present invention, the expression vector may include a nucleotide sequence encoding the fusion protein provided by the present invention. The vector used herein is not particularly limited as long as it can produce the fusion protein of the present invention (PUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), plasmids derived from Escherichia coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), Bacillus subtilis plasmids Derived plasmids (e.g., pUB110 and pTP5), yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, lambda gt10, lambda gt11 and lambda ZAP) (eg, retrovirus, adenovirus, vaccinia virus, etc.), insect virus vectors (baculovirus, etc.). Since the amount of expression of the protein and the expression of the expression vector are different depending on the host cell, it is preferable to select and use the host cell most suitable for the purpose.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 융합단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
The transformant provided in the present invention can be used to produce the fusion protein of the present invention by introducing the expression vector provided in the present invention into a host and transforming the same and expressing the polynucleotide contained in the expression vector have. The transformation can be carried out by various methods and is not particularly limited as long as it is capable of producing the fusion protein of the present invention showing an effect of improving various cell activities to a high level. However, CaCl ₂ precipitation method, CaCl ₂ ₂ precipitation method using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide), an electroporation method, an electroporation method, a calcium phosphate precipitation method, a protoplast fusion method, an agitation method using silicon carbide fiber, an agrobacterium-mediated trait A transformation method using PEG, a dextran sulfate, a lipofectamine, and a dry / suppression-mediated transformation method. The host used in the production of the transformant may also be a bacterial cell such as E. coli, Streptomyces or Salmonella typhimurium, as long as it can produce the fusion protein of the present invention. Yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae, and ski-inspected caromyces pombe; Fungal cells such as Pichia pastoris; Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, Bowmanella cells; Or plant cells.

상기 형질전환체는 또한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
The transformant may also be used in a method for producing the fusion protein provided by the present invention. Specifically, the method for producing a fusion protein provided by the present invention comprises the steps of: (a) culturing the transformant to obtain a culture; And (b) recovering the fusion protein of the present invention from the culture.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.The term "cultivation" of the present invention means a method of growing the microorganism under an appropriately artificially controlled environmental condition. In the present invention, the method for culturing the transformant may be carried out by a method well known in the art. Specifically, the culture can be continuously cultured in a batch process or an injection batch or a repeated fed batch process, as long as it can produce the fusion protein of the present invention. .

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. The medium used for the culture should meet the requirements of the specific strain in a suitable manner while controlling the temperature, pH and the like under aerobic conditions in a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, and the like. The carbon sources that can be used include glucose and xylose mixed sugar as main carbon sources, and sugar and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, Oils and fats such as oils and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture. Nitrogen sources that may be used include inorganic sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine and glutamine and organic substances such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or their decomposition products, defatted soybean cake or decomposition products thereof . These nitrogen sources may be used alone or in combination. The medium may include potassium phosphate, potassium phosphate and the corresponding sodium-containing salts as a source. Potassium which may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts. As the inorganic compound, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate and calcium carbonate may be used. Finally, in addition to these materials, essential growth materials such as amino acids and vitamins can be used.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.In addition, suitable precursors may be used in the culture medium. The above-mentioned raw materials can be added to the culture in the culture process in a batch manner, in an oil-feeding manner or in a continuous manner by an appropriate method, but it is not particularly limited thereto. Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in a suitable manner to adjust the pH of the culture.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 융합단백질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.In addition, bubble formation can be suppressed by using a defoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester. An oxygen or oxygen-containing gas (e.g., air) is injected into the culture to maintain aerobic conditions. The temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, preferably 30 ° C to 35 ° C. The culture is continued until the amount of the fusion protein is maximally obtained. Usually for 10 to 100 hours for this purpose.

아울러, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
In addition, the step of recovering the fusion protein from the culture can be carried out by a method known in the art. Specifically, the recovering method is not particularly limited as long as the recovered fusion protein of the present invention can be recovered. Preferably, the recovering method includes centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, Methods such as fractional dissolution (for example, ammonium sulfate precipitation), chromatography (for example, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion) can be used.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.
In another aspect of the present invention, the present invention provides a cosmetic composition for improving skin comprising the fusion protein as an active ingredient.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 콜라겐 및 엘라스틴의 생산량을 증대시킬 수 있으므로, 상기 융합단백질은 증대된 콜라겐 및 엘라스틴으로 인하여 피부를 개선시킬 수 있는 화장료 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
As described above, since the fusion protein provided by the present invention can increase the production amount of collagen and elastin, the fusion protein can be used as an effective ingredient of a cosmetic composition that can improve skin due to increased collagen and elastin .

본 발명의 용어 "피부개선"이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 피부개선이란, 본 발명의 융합단백질을 피부에 도포함으로써 유도될 수 있는, 피부세포에서 콜라겐 및 엘라스틴 합성의 촉진, 이로 인한 주름개선 등의 효과를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
The term "skin improvement" of the present invention comprehensively refers to a process of treating, alleviating, or alleviating damage to the skin caused by intrinsic or extrinsic factors of the skin or its effect. In the present invention, the skin improvement can be interpreted to mean the effect of stimulating the synthesis of collagen and elastin in the skin cells, which can be induced by applying the fusion protein of the present invention to the skin, and thereby improving wrinkles .

상기 융합단백질은 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 융합단백질의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.It is preferable that the fusion protein is contained in an amount of 0.0001 to 50% by weight based on the weight of the entire cosmetic composition. When the content of the fusion protein is less than 0.0001% by weight of the total cosmetic composition, it is difficult to substantially improve the skin. If the content of the fusion protein is more than 50% by weight, the formulation may become unstable.

한편, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 살균제, 산화방지제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이러한 첨가제들은 필요에 따라 적절한 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.
Meanwhile, the cosmetic composition according to the present invention may further comprise an additive. The kind of the additive is not particularly limited, but may be at least one of, for example, oil, water, a surfactant, a moisturizer, a lower alcohol, a bactericide, an antioxidant, a thickener, a chelating agent, a pigment, a preservative and a perfume. These additives may be used in an appropriate amount as required.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 피부개선용 화장료 조성물을 포함하는 기능성 화장품을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a functional cosmetic composition containing the cosmetic composition for skin improvement.

본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.
The term "cosmedical, cosmeceutical" of the present invention refers to a product having a professional function that has a physiologically active effect and an effect emphasized, unlike general cosmetics, A product that helps, a product that helps to improve wrinkles, a product that helps protect skin from burns or UV rays.

본 발명의 상기 화장료 조성물에 일반 피부용 화장품의 제조시에 사용되는 적절한 담체를 가하여, 기능성 화장품을 제조할 수 있다. 이때, 사용되는 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다. Functional cosmetics can be prepared by adding an appropriate carrier to be used in the production of a cosmetic for general skin to the cosmetic composition of the present invention. At this time, the carrier to be used is not particularly limited, but preferably oil, water, a surfactant, a moisturizer, a lower alcohol, a thickener, a chelating agent, a coloring agent, an antiseptic and a flavoring may be used alone or in appropriate combination.

본 발명의 기능성 화장품은 콜라겐합성 촉진효과, 엘라스틴합성 촉진효과 등의 피부개선 효과를 나타내고, 그의 제형은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림, 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있고, 바람직하게는 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼 또는 오일젤의 제형으로 제조될 수 있는데, 이때, 사용되는 담체는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용될 수 있다.
The functional cosmetic composition of the present invention exhibits skin improving effects such as collagen synthesis promoting effect and elastin synthesis promoting effect. The formulation thereof is not particularly limited, but examples thereof include solutions, emulsions, suspensions, pastes, creams, lotions, gels , Powders, sprays, surfactant-containing cleansing, oils, soaps, liquid cleansing agents, bath salts, foundations, makeup bases, essences, lotions, foam, packs, , A cream, a cream, an essence, a pack, an emulsion or an oil gel. The carrier to be used may be selected according to the formulation of the cosmetic product. .

예를 들어, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 파우더 또는 스프레이 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더, 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 용액 또는 유탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 현탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 화장비누 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
For example, when an ointment, a paste, a cream or a gel is prepared, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, Can be used alone or in combination; In the case of producing powder or spray-type cosmetics, it is preferable to use, as a carrier component, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, chlorofluorohydrocarbons, propane / butane, Or in combination; When preparing cosmetics in the form of solutions or emulsions, it is preferable to use water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, Oil, corn oil, olive oil, castor oil, sesame oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan can be used alone or in combination; In the case of preparing a suspension-type cosmetic, it is preferable to use water, ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide , Bentonite, agar, trachant and the like can be used alone or in combination; When cosmetic products in the form of cosmetic soap are prepared, it is preferable to use, as a carrier component, an alkali metal salt of a fatty acid, a fatty acid hemiester salt, a fatty acid protein hydrolizate, isethionate, a lanolin derivative, an aliphatic alcohol, a vegetable oil, glycerol, May be used alone or in combination.

구체적인 일례로서, 피부외용연고는 본 발명의 융합단백질 이외에 바셀린 50 내지 97중량% 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1 내지 5중량%를 함유하도록 제조될 수 있고; 유연화장수는 본 발명의 융합단백질 이외에 프로필렌글리콜 또는 글리세린과 같은 다가알콜류 1 내지 10중량% 및 폴리에틸렌올레일에테르 또는 폴리옥시에틸렌 경화피마자유와 같은 계면활성제 0.05 내지 2중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 융합단백질 이외에 스쿠알란, 바셀린 또는 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5 내지 20중량% 및 세탄올, 스테아릴알콜 또는 밀납과 같은 왁스성분 3 내지 15중량%을 함유하도록 제조될 수 있고; 에센스는 본 발명의 융합단백질 이외에 글리세린 또는 프로필렌글리콜과 같은 다가알콜류 5 내지 30중량%를 함유하도록 제조될 수 있으며; 마사지크림은 본 발명의 융합펩타이드 이외에 유동파라핀, 바셀린 또는 이소노닐이소노나노에이트와 같은 오일류를 30 내지 70중량% 함유하도록 제조될 수 있고; 팩은 본 발명의 융합단백질 이외에 폴리비닐알콜을 5 내지 20중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩으로 제조되거나 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연 또는 이산화티탄과 같은 안료가 5 내지 30중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조될 수 있다.
As a specific example, the ointment for external use may be prepared to contain 50 to 97% by weight of petrolatum and 0.1 to 5% by weight of polyoxyethylene oleyl-ether phosphate in addition to the fusion protein of the present invention; In addition to the fusion protein of the present invention, the softening longevity may be prepared to contain from 1 to 10% by weight of polyhydric alcohols such as propylene glycol or glycerin and from 0.05 to 2% by weight of a surfactant such as polyethylene oleyl ether or polyoxyethylene hardened castor oil ; The nutritional lotion and nutritional cream may contain, in addition to the fusion protein of the present invention, 5 to 20% by weight of an oil such as squalane, vaseline or octyldodecanol and 3 to 15% by weight of a wax component such as cetanol, stearyl alcohol or beeswax &Lt; / RTI > The essence may be prepared to contain 5 to 30% by weight of polyhydric alcohols such as glycerin or propylene glycol in addition to the fusion protein of the present invention; In addition to the fusion peptide of the present invention, the massage cream may be prepared to contain 30 to 70% by weight of oils such as liquid paraffin, petrolatum or isononylisononanoate; The pack may be made of a peel off pack containing 5 to 20% by weight of polyvinyl alcohol in addition to the fusion protein of the present invention, or may be made of a pigment such as kaolin, talc, zinc oxide or titanium dioxide, And may be prepared in a wash off pack containing 30% by weight.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 피부외용제용 약학 조성물을 제공한다.
In another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for external application for skin comprising the fusion protein.

PDGFb는 세포의 증식촉진, 상처치료, 퇴행성 신경질환 치료, 허혈성 신경질환 치료, 신경손상 질환 치료, 관절염 치료 등의 효과를 나타낸다고 알려져 있는데, 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 상기 PDGFb의 효과를 향상시킬 수 있음을 확인하였으므로, 상기 융합단백질은 종래의 PDGFb에 의해 야기되는 세포의 증식촉진, 상처치료, 퇴행성 신경질환 치료, 허혈성 신경질환 치료, 신경손상 질환 치료, 관절염 치료 등의 효과를 향상시켜서, 상기 증상의 치료 또는 개선효과를 나타내는 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
PDGFb is known to exhibit effects such as promotion of cell proliferation, wound healing, treatment of degenerative nerve disease, treatment of ischemic neuropathy, treatment of nerve damage disease, arthritis treatment, etc. The fusion protein provided by the present invention enhances the effect of PDGFb The fusion protein improves the effects of promoting cell proliferation, wound healing, degenerative nerve disease treatment, ischemic neuropathy treatment, nerve damage disease treatment and arthritis treatment caused by conventional PDGFb, It can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for external application for skin showing the treatment or improvement of symptoms.

본 발명의 용어 "피부외용제"란, 유지류, 바셀린, 라놀린, 글리세롤 등의 다양한 기제에 약품을 혼합하여 쉽게 피부에 바를 수 있도록 한 고형, 반고형 또는 액상의 외용약을 의미한다. 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.The term "external preparation for skin " of the present invention means a solid, semi-solid or liquid external preparation which can be easily applied to skin by mixing drugs with various bases such as oils, petrolatum, lanolin and glycerol. Formulations for external use are not particularly limited, but powders, gels, ointments, creams, liquids or aerosol formulations are preferred.

본 발명의 목적상 상기 피부외용제는 본 발명의 융합단백질을 포함하고, 적절한 피부외용제용 담체인 기제를 포함하는 제제로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
For the purpose of the present invention, the external preparation for skin may be interpreted as a preparation containing a fusion protein of the present invention and a carrier which is a carrier for a suitable external preparation for skin, but is not particularly limited thereto.

본 발명의 융합단백질은 PDGFb에 피부투과 촉진용 펩타이드가 결합되어, 피부투과성과 피부잔류성이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부에서 주름개선 등의 유용한 효과를 나타내는 물질의 합성 또한 증대시킬 수 있으므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.
The fusion protein of the present invention binds PDGFb to a peptide for promoting skin permeation and not only significantly improves skin permeability and skin retention, but also increases the synthesis of substances exhibiting useful effects such as improving wrinkles in skin such as collagen and elastin Therefore, it can be widely used as an active ingredient of a functional cosmetic composition and a pharmaceutical composition for external application for skin.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 피부투과 촉진 1: Promotes skin permeation 펩타이드의Of peptide 선발 Selection

피부투과 촉진 펩타이드를 선별하기 위해서 파지라이브러리와 경피제제의 용출 실험 방법을 조합한, 파지 디스플레이 방법을 수행하였다. In order to select the skin permeation promoting peptide, a phage display method was performed in which a phage library and a dissolution test method of a transdermal preparation were combined.

먼저, 1% BSA를 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) 용액 500㎕에, Ph.D-12 phage library kit(New England Biolab)로부터 유래된 10⁹개의 파지를 가하여 파지용액을 수득하였다.First, 10 ⁹ phages derived from a Ph.D-12 phage library kit (New England Biolab) were added to 500 μl of TBS (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) solution containing 1% BSA to obtain a phage solution .

다음으로, Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5㎖, Permgear)의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고 상단에 상기 파지용액을 가하고, 16시간 동안 반응시킨 다음, 상기 돼지 피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 도달된 파지를 수득하고, 이를 증폭시켰다. Next, pig skin (0.7 mm in thickness, Medikinetics) was placed between the upper and lower ends of a Franz glass cell (standard diameter 9 mm, Receiver 5 ml, Permgear), the above phage solution was added to the upper part, A phage permeating the pig skin and reaching the lower receiver was obtained and amplified.

상기 증폭은 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)를 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 25㎖의 LB배지에 진탕 배양된 대장균 ER2738 균주에 상기 파지용액 5㎖를 가하고 4시간동안 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 8,000G로 원심 분리하여 파지분획이 포함된 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 6㎖의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 반응시켜서 파지를 침전시키고, 상기 반응액을 8,000G로 원심분리하여 파지를 침전시켰으며, 상기 침전물을 TBS용액에 현탁시켜서, 증폭된 파지용액을 수득하였다. The amplification was performed using E. coli ER2738 (New England Biolab) as the host cell. Specifically, 5 ml of the phage solution was added to Escherichia coli ER2738 strain shake cultured in 25 ml of LB medium and cultured for 4 hours. Then, the culture was centrifuged at 8,000 G to obtain a supernatant containing the phage fraction. The supernatant was treated with 6 ml of sediment (20% PEG6000, 2.5M NaCl) and allowed to react to precipitate the phage. The reaction solution was centrifuged at 8,000 G to precipitate the phage. The precipitate was dissolved in TBS solution And suspended to obtain an amplified phage solution.

이처럼, 돼지 피부에 파지를 가하여 피부를 투과시킨 파지를 수득하고, 이를 증폭시키는 과정을 1회 진행하는 것을 1round라고 정의하였으며, 1Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2Round를 진행하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 경쟁하는 방식으로 선별하였고 총 3 Round를 수행하였다. As described above, it is defined as 1round that the process of amplifying the phage obtained by transferring the phage to the skin of the pig by applying a phage to the skin of the pig is carried out once, and 2 rounds are progressed with the phage amplified in 1 round. The phage were selected in a competitive manner and a total of 3 rounds were performed.

상기 3 Round를 수행하여 최종적으로 얻어진 파지에 포함된 펩타이드의 서열을 확인하기 위하여, 상기 파지를 포함하는 TBS용액을 대장균 ER2738 균주에 가하여 현탁시키고, 상기 현탁액에 TOP agar를 가하여 혼합한 다음, 상기 혼합물을 LB/X-gal/IPTG 평판배지의 상단에 가하여 고형화시켰다. 그런 다음, 고형화된 배지를 16시간 동안 배양한 후, 청색의 콜로니를 선별하였다. 상기 선별된 콜로니로부터 유래된 균주를 6시간 동안 배양하고, 이로부터 DNA를 수득한 다음, 파지로부터 유래된 염기서열을 분석함으로써, 돼지 피부를 투과하는 특성을 나타내는 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 1)을 결정하였다.
In order to confirm the sequence of the peptide contained in the phage finally obtained by carrying out the 3 rounds, a TBS solution containing the phage was added to Escherichia coli strain ER2738 to suspend, TOP agar was added to the suspension, Was applied to the top of LB / X-gal / IPTG plate media to solidify. Then, the solidified medium was cultured for 16 hours, and blue colonies were selected. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the peptide showing the property of penetrating the pig skin was determined by culturing the strain derived from the selected colony for 6 hours, obtaining DNA therefrom, and analyzing the base sequence derived from the phage. .

실시예Example 2: 피부투과 촉진 2: Promoting skin permeation 펩타이드가The peptide 섬유모세포성장인자에Fibroblast growth factor 결합된Combined 융합단백질의Of the fusion protein 제조 Produce

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 피부투과 촉진용 펩타이드의 C-말단과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 혈소판유래성장인자 ｂ서브유닛(PDGFb)의 N-말단이 두개의 아미노산(GG)으로 구성된 링커를 매개로 연결된 형태의 융합단백질인 T-PDGFb(서열번호 3)를 생산하였다.
The N-terminal of the platelet-derived growth factor b subunit (PDGFb) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the C-terminal of the peptide for promoting skin permeation having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 PDGFb (SEQ ID NO: 3), which is a fusion protein in the form of a linker composed of amino acid (GG).

구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 합성하고, 두개의 아미노산(GG)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 중심으로 연결시켜서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제작하였다. 한편, 엔테로키나제(Enterokinase)에 의해 절단될 수 있는 절단부위인 DDDDK(서열번호 4)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 이를 상기 제작된 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 연결하여, 엔테로키나제 절단부위-피부투과 촉진용 펩타이드-PDGFb로 구성된 융합단백질을 코딩하는 최종 폴리뉴클레오티드를 수득하였으며, 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 GST 발현 벡터에 도입하여 발현벡터를 제작하였다. Specifically, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are synthesized, and a nucleotide sequence encoding two amino acids (GG) is linked at the center A polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was prepared. On the other hand, a polynucleotide encoding DDDDK (SEQ ID NO: 4), which is a cleavage site that can be cleaved by enterokinase, was synthesized and ligated to the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: Terminal to obtain a final polynucleotide encoding a fusion protein composed of an enterokinase cleavage site-skin permeation promoting peptide-PDGFb, and the obtained polynucleotide was introduced into a GST expression vector to prepare an expression vector.

상기 제작된 발현벡터를 대장균에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 수득한 형질전환체를 배양한 다음, 배양물을 파쇄하여 세포 파쇄물을 수득하였으며, 상기 수득한 세포 파쇄물을 GST 친화성 컬럼에 적용하여, GST-엔테로키나제 절단부위-피부투과 촉진용 펩타이드-PDGFb로 구성된 융합단백질을 회수하였다. 상기 회수된 융합단백질에 엔테로키나제를 처리하여 GST 부분을 제거한 다음, 상기 반응물을 GPC 컬럼 크로마토그래피에 적용함으로써, 최종적으로 피부투과 촉진용 펩타이드-PDGFb로 구성된 융합단백질인 T-PDGFb(서열번호 3)를 생산하였다.
The resulting expression vector was introduced into Escherichia coli to obtain a transformant. The obtained transformant was cultured, and then the culture was disrupted to obtain a cell lysate. The obtained cell lysate was subjected to GST affinity column To obtain a fusion protein composed of GST-enterokinase cleavage site-skin permeation enhancing peptide-PDGFb. PDGFb (SEQ ID NO: 3), which is a fusion protein composed of peptide-PDGFb for skin permeation promotion, is finally obtained by treating the recovered fusion protein with an enterokinase to remove the GST moiety and then applying the reaction product to GPC column chromatography. .

실시예Example 3: 3: 융합단백질의Of the fusion protein 효과검증 Verification of effect

실시예Example 3-1: 콜라겐 발현에 미치는 효과검증 3-1: Validation of effect on collagen expression

상기 실시예 2에서 합성된 T-PDGFb과 PDGFb를 대상으로 하여, 콜라겐 및 엘라스틴 생성에 미치는 효과를 검증하고자 하였다.To examine the effect of T-PDGFb and PDGFb synthesized in Example 2 on collagen and elastin production.

구체적으로, 섬유모세포를 DMEM 배지가 담겨진 6웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양하여, 70 내지 80%의 포화도를 나타내는 배양물을 수득하였다. 상기 배양물에 다양한 농도(1, 10 또는 100ng/ml)의 T-PDGFb 또는 PDGFb를 가하고, 16시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, PBS로 배양된 세포를 세척하고, RNAeasy kit을 이용하여 각 세포로부터 총 RNA를 수득하였다. 상기 수득한 총 RNA를 이용하여 역전사 PCR 반응을 수행하여 cDNA를 수득하고, 상기 수득한 cDNA를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행함으로써, 콜라겐의 발현량을 정량분석하였다. 이때, 대조군으로는 T-PDGFb 또는 PDGFb를 전혀 처리하지 않고 배양한 섬유모세포를 사용하고, 내부대조군으로는 GAPDH의 mRNA를 사용하였다(표 1).
Specifically, the fibroblasts were inoculated in a 6-well plate containing DMEM medium and cultured for 24 hours to obtain a culture showing a degree of saturation of 70 to 80%. T-PDGFb or PDGFb at various concentrations (1, 10 or 100 ng / ml) was added to the culture and further cultured for 16 hours. After incubation, the cells incubated with PBS were washed and total RNA was obtained from each cell using an RNAeasy kit. The obtained total RNA was subjected to reverse transcription PCR to obtain cDNA, and real-time PCR was performed using the obtained cDNA to quantitatively analyze the expression amount of collagen. At this time, fibroblasts cultured without any treatment of T-PDGFb or PDGFb were used as a control group, and GAPDH mRNA was used as an internal control (Table 1).

콜라겐 발현에 미치는 융합단백질의 효과 Effect of Fusion Proteins on Collagen Expression 처리단백질Treated protein 처리양Treatment amount 발현수준(%)Expression level (%) 대조군Control group -- 100±11100 ± 11 PDGFbPDGFb 1ng/ml
10ng/ml
100ng/ml1 ng / ml
10 ng / ml
100 ng / ml 190±13
324±35
630±35190 ± 13
324 ± 35
630 ± 35 T-PDGFbT-PDGFb 1ng/ml
10ng/ml
100ng/ml1 ng / ml
10 ng / ml
100 ng / ml 212±31
360±26
670±36212 ± 31
360 ± 26
670 ± 36

상기 표 1에서 보듯이, PDGFb와 T-PDGFb를 처리할 경우, 대조군보다는 콜라겐의 발현수준이 증가하였고, PDGFb 보다는 T-PDGFb를 처리할 경우 콜라겐의 발현수준이 상대적으로 더욱 증가함을 확인하였다.
As shown in Table 1, when PDGFb and T-PDGFb were treated, the level of collagen expression was higher than that of the control, and the level of collagen expression was further increased by treatment with T-PDGFb rather than PDGFb.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, PDGFb를 단독으로 사용할 경우에 비하여 콜라겐의 발현량을 더욱 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the use of the fusion protein of the present invention can further increase the amount of collagen expression compared with the case of using PDGFb alone.

실시예Example 3-2: 엘라스틴 발현에 미치는 효과검증 3-2: Validation of effect on elastin expression

콜라겐 대신에 엘라스틴의 발현량을 정량분석하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1의 방법을 사용하여, T-PDGFb 또는 PDGFb이 엘라스틴 발현에 미치는 영향을 검증하였다(표 2).
Using the method of Example 3-1, the effect of T-PDGFb or PDGFb on elastin expression was verified (Table 2), except that the expression level of elastin was quantitatively analyzed instead of collagen.

엘라스틴 발현에 미치는 융합단백질의 효과 Effects of Fusion Proteins on Elastin Expression 처리단백질Treated protein 처리양Treatment amount 발현수준(%)Expression level (%) 대조군Control group -- 100±12100 ± 12 PDGFbPDGFb 1ng/ml
10ng/ml1 ng / ml
10 ng / ml 180±11
322±19180 ± 11
322 ± 19 T-PDGFbT-PDGFb 1ng/ml
10ng/ml1 ng / ml
10 ng / ml 192±26
370±34192 ± 26
370 ± 34

상기 표 2에서 보듯이, PDGFb 또는 T-PDGFb를 처리할 경우, 대조군보다는 대체로 엘라스틴의 발현수준이 증가하였고, PDGFb 보다는 T-PDGFb를 처리할 경우 엘라스틴의 발현수준이 상대적으로 더욱 증가함을 확인하였다.
As shown in Table 2, when PDGFb or T-PDGFb was treated, elastin expression level was generally higher than that of the control group, and when T-PDGFb was treated with PDGFb rather than PDGFb, the level of elastin expression was relatively increased .

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, PDGFb를 단독으로 사용할 경우에 비하여 엘라스틴의 발현량을 더욱 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the use of the fusion protein of the present invention can further increase the expression amount of elastin compared with the case of using PDGFb alone.

실시예Example 3-3: 피부투과성 검증 3-3: Verification of skin permeability

Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하여 융합단백질의 피부투과성을 검증하였다.The skin permeability of the fusion protein was verified using a Franz glass cell (Standard diameter 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear).

구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% Tween 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 상기 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 상기 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 PDGFb 또는 T-PDGFb를 상단에 가하고, 16시간 동안 반응시킨 후, 하단에 존재하는 PDGFb 또는 T-PDGFb의 농도를 정량분석하고, PDGFb의 함량에 대한 T-PDGFb의 양의 상대적인 함량을 투과량으로 산출하였다(표 3).
Specifically, TBS (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) containing 1% BSA and 0.01% Tween 20 was prepared by placing pig skin (0.7 mm in thickness, Medikinetics) between the upper and lower ends of the glass cell, 500 μl of the above TBS was added to the donor chamber of the glass cell and 5 ml of the TBS was added to the lower chamber of the glass cell. Then, 2 占 퐂 of PDGFb or T-PDGFb was added to the top and allowed to react for 16 hours. Then, the concentration of PDGFb or T-PDGFb present at the bottom was quantitatively analyzed and the relative amount of T-PDGFb relative to the content of PDGFb The content was calculated as the amount of permeation (Table 3).

융합단백질의 피부투과성Skin permeability of fusion protein 처리 단백질Treated protein 투과량(%)Permeability (%) PDGFb
T-PDGFbPDGFb
T-PDGFb 100±25
490±38100 ± 25
490 ± 38

상기 표 3에서 보듯이, PDGFb 보다는 T-PDGFb를 처리할 경우 피부투과성이 약 5배 증가함을 확인하였다.As shown in Table 3 above, it was confirmed that when T-PDGFb was treated with PDGFb rather than PDGFb, the skin permeability increased about 5 times.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, 피부투과성이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
Thus, using the fusion protein of the present invention, skin permeability was remarkably increased.

실시예Example 3-4: 피부잔류성 검증 3-4: Verification of skin persistence

Franz glass cell (Standard 직경 9mm, Receiver 5ml, Permegear)을 이용하여 융합단백질의 피부잔류성을 검증하였다.The skin persistence of the fusion protein was verified using a Franz glass cell (Standard diameter 9 mm, Receiver 5 ml, Permegear).

구체적으로, 상기 Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고, 1% BSA와 0.01% Tween 20을 포함하는 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)를 준비한 다음, 상기 Glass cell의 상단(Donor chamber)에는 상기 TBS를 500㎕ 가하고, 상기 Glass cell의 하단(Receiver chamber)에는 상기 TBS를 5㎖ 가하였다. 이어, 2㎍의 PDGFb 또는 T-PDGFb를 상단에 가하여 반응시키고, 상기 돼지 피부를 회수한 다음, 상기 돼지 피부를 분쇄하였으며, 이에 포함된 PDGFb 또는 T-PDGFb의 함량을 정량분석하였다. 그런 다음, PDGFb의 함량에 대한 T-PDGFb의 양의 상대적인 함량을 잔류량으로 산출하였다(표 4).
Specifically, TBS (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) containing 1% BSA and 0.01% Tween 20 was prepared by placing pig skin (0.7 mm in thickness, Medikinetics) between the upper and lower ends of the glass cell, 500 μl of the above TBS was added to the donor chamber of the glass cell and 5 ml of the TBS was added to the lower chamber of the glass cell. Then, 2 μg of PDGFb or T-PDGFb was added to the top of the reaction tube, and the pig skin was recovered. Then, the pig skin was pulverized, and the content of PDGFb or T-PDGFb contained therein was quantitatively analyzed. Then, the relative content of the amount of T-PDGFb relative to the content of PDGFb was calculated as residual (Table 4).

융합단백질의 피부잔류성Skin persistence of fusion protein 처리 단백질Treated protein 잔류량(%)Residual amount (%) PDGFb
T-PDGFbPDGFb
T-PDGFb 100±25
11,300±700100 ± 25
11,300 ± 700

상기 표 4에서 보듯이, PDGFb 보다는 T-PDGFb를 처리할 경우 피부투과성이 약 110배 증가함을 확인하였다.As shown in Table 4, it was confirmed that when T-PDGFb was treated with PDGFb rather than PDGFb, skin permeability increased about 110 times.

따라서, 본 발명의 융합단백질을 사용하면, 피부잔류성이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
Therefore, it was found that the use of the fusion protein of the present invention significantly increased skin retention.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Cosmetic composition for skin care comprising fusion protein with PDGFb <130> KPA140077-KR <150> KR 10-2013-0138657 <151> 2013-11-14 <150> KR 10-2013-0138658 <151> 2013-11-14 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transdermal peptide <400> 1 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFb fragment <400> 2 Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys 1 5 10 15 Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg 20 25 30 Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg 35 40 45 Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln 50 55 60 Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys 65 70 75 80 Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala 85 90 95 Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr 100 105 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 3 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr 20 25 30 Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn 35 40 45 Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg Cys Ser 50 55 60 Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln Val Gln 65 70 75 80 Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro 85 90 95 Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys 100 105 110 Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr 115 120 <110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Cosmetic composition for skin care containing fusion protein with PDGFb <130> KPA140077-KR <150> KR 10-2013-0138657 <151> 2013-11-14 <150> KR 10-2013-0138658 <151> 2013-11-14 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transdermal peptide <400> 1 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFb fragment <400> 2 Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys 1 5 10 15 Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg 20 25 30 Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg 35 40 45 Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln 50 55 60 Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys 65 70 75 80 Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala 85 90 95 Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr 100 105 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 3 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr 20 25 30 Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn 35 40 45 Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln Arg Cys Ser 50 55 60 Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln Val Gln 65 70 75 80 Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro 85 90 95 Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys 100 105 110 Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr 115 120

Claims

Wherein the peptide for promoting skin permeation, which is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is bound to a platelet-derived growth factor b subunit (PDGFb).

The method according to claim 1,
Wherein the peptide for promoting skin permeation is bound to the N-terminus of PDGFb.

The method according to claim 1,
Wherein the PDGFb is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

The method according to claim 1,
Wherein the fusion protein is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

5. A polynucleotide encoding a fusion protein of any one of claims 1 to 4.

A cosmetic composition comprising the fusion protein of claim 1 as an active ingredient.

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