KR20170012800A - 반탄화 처리된 목재 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

반탄화 처리된 목재 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 반탄화 처리된 목재 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 참나무를 반탄화 처리하고, 상기 반탄화된 참나무를 에탄올 추출하여 얻어진 천연 추출물로서, 페놀성 화합물을 함유하며, 특히 인삼잿빛곰팡이 및 인삼점무늬병에 대하여 우수한 활성을 갖는 반탄화재 추출방법과 이를 이용한 인삼병해곰팡이에 항균활성을 가지는 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 반탄화된 참나무로부터 추출한 에탄올 추출물은 인삼병해곰팡이에 항균활성을 나타내므로, 인삼재배에서 발병하는 잿빛곰팡이 및 점무늬병의 생육을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

반탄화 처리된 목재 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법{Antifungal composition comprising torrefied wood extract and manufacturing method thereof}
본 발명은 반탄화 처리된 목재 추출물, 특히 반탄화 처리된 참나무 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 소비자들의 인식변화에 따라 친환경 농산물에 대한 수요가 증가하면서 화학비료, 유기합성농약 등 일체의 합성 화학물질을 사용하지 않고, 유기물과 자연광물, 미생물 등을 활용하여 제조된 자재만을 사용한 친환경농업에 대한 요구가 커지고 있다.
인삼(Panax ginseng) 재배의 경우, 동일한 경작지에서 최소 4년 이상 차광조건하에서 재배되는 특성상 잿빛곰팡이병, 점무늬병, 탄저병, 모잘록병 등의 병해가 농가에 큰 피해를 주고 있다. 특히, 잿빛곰팡이는 출아기, 6-7월 및 월동기간, 그리고 점무늬병은 4-5월에 피해가 심각하게 나타나며, 잿빛곰팡이와 점무늬병 방제를 위하여 여러 방제법이 이용되어 왔지만 매년마다 발생정도가 다르고 발생기간이 길기 때문에 대부분 메타락실 수화제, 보스칼리드 입상 수화제, 만코제브 수화제 등과 같은 화학농약에 의존하고 있다. 이러한 화학농약의 남용으로 인해 환경 오염 및 안정성에 대한 문제점이 발생함에 따라 화학 농약을 대체할 천연물에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 그 수가 미미한 실정이다.
반탄화 공정(torrefaction)은 바이오매스를 200 - 300 ℃의 고온에서 열화학적 처리를 가하는 열분해 공정의 하나로, 열분해 과정 중 발생하는 응축 휘발성 유기 화합물에는 다량의 페놀성 화합물, 테르펜 등을 함유하고 있으며, 특히 페놀성 화합물은 항진균, 항균, 살균 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재까지 반탄화 공정으로 열분해된 바이로매스로부터 항균물질의 추출방법 및 항균효과에 관한 보고는 알려진 바가 없다.
한국공개특허 10-2013-0025451(2013.03.12 공개)
본 발명의 목적은 반탄화 처리된 목재 추출물, 특히 반탄화 처리된 참나무 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 반탄화 처리된 참나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 참나무를 절단하여 음건시키는 단계; 상기 음건시킨 참나무를 반탄화 처리하는 단계; 및 상기 반탄화 처리된 참나무를 용매로 추출하는 단계를 포함하는 항균 활성을 갖는 반탄화 처리된 참나무 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명은 반탄화 처리된 목재 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 참나무를 반탄화 처리하고, 상기 반탄화된 참나무를 에탄올 추출하여 얻어진 천연 추출물로서, 페놀성 화합물을 함유하며, 특히 인삼잿빛곰팡이 및 인삼점무늬병에 대하여 우수한 활성을 갖는 반탄화재 추출방법과 이를 이용한 인삼병해곰팡이에 항균활성을 가지는 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 반탄화된 참나무로부터 추출한 에탄올 추출물은 인삼병해곰팡이에 항균활성을 나타내므로, 인삼재배에서 발병하는 잿빛곰팡이 및 점무늬병의 생육을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 참나무와 severity factor (log Ro) 조건에 따라 반탄화된 참나무의 추출 용매에 따른 추출 수율을 나타냈다.
도 2는 참나무와 severity factor (log Ro) 조건에 따라 반탄화된 참나무로부터 추출된 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 페놀성 화합물 함량을 나타냈다.
도 3은 참나무와 severity factor (log Ro) 조건에 따라 반탄화된 참나무로부터 추출된 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 인삼잿빛곰팡이 및 인삼점무늬병에 대한 항균 활성을 나타냈다.
도 4는 에탄올 농도, 추출 온도, 추출 시간에 따른 반응모델의 3차원 반응표면그래프를 나타냈다. (A) 추출 온도 및 추출 시간의 영향, (B) 에탄올 농도 및 추출 시간의 영향 (C) 에탄올 농도 및 추출 온도의 영향.
도 5는 반탄화 처리된 참나무（severity factor (log Ro) 4.23) 에탄올 추출물의 가스크로마토그래피의 크로마토그램을 나타냈다.
본 발명은 반탄화 처리된 참나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 반탄화 처리는 200 내지 220℃에서 5 내지 10분 동안 열분해 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있고, 보다 바람직하게는, 열수 추출물 또는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물에는 5-메틸-2-푸란카르복스알데히드(5-methyl-2-furancarboxaldehyde), 2,5-푸란디카르복스알데히드(2,5-furandicarboxaldehyde), 4-에틸-1,3-벤젠디올(4-ethyl-1,3-benzenediol), 4-하이드록시-3-메톡시-벤즈알데히드(4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde) 또는 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 항균 조성물은 인삼잿빛곰팡이(Botrytis cinerea) 또는 인삼점무늬병균(Alternaria panax) 억제 활성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 항균 조성물이란 항균제, 항생제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 균주의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
또한, 본 발명의 항균 조성물은 상기 추출물 이외에 다른 항균제를 포함하거나 각종 담체를 포함할 수 있다. 사용할 수 있는 담체로는 클레이, 탈크, 규조토, 백토(terra alba), 탄산칼슘, 무수규산, 벤토나이트, 황산나트륨, 실리카 겔, 유기산 염류, 당류, 전분, 수지류, 합성 혹은 천연고분자 등의 고체 분말 또는 과립상 담체; 크실렌 등의 방향족 탄화수소류, 케로신(kerosene) 등의 지방족 탄화수소류, 메틸에틸케톤, 시클로헥사논, 이소포론 등의 케톤류, 락탐류, 아니솔 등의 에테르류, 에탄올, 프로판올, 에틸렌글리콜 등의 알콜류, 초산에틸, 초산부틸 등의 에스테르류, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 물 등의 액체 담체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항균 조성물은 작물 병해 방제용 제제로서 통상 적용되는 제제 형태, 예를 들면, 오일용액제(oil solution), 에멀션제(emulsion), 산포제(dusting powder), 용액제(solution), 수화제(wettable powder), 과립제(granule), 현탁제(suspension)등으로 조제할 수 있으며 사용 전에 적당하게 희석할 수도 있다.
또한, 제제의 효과를 확보하기 위해서 유화제, 분산제, 습윤제, 결합제, 호료(糊料), 윤활제 등의 보조제를 목적에 따라 적당하게 선택 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 비이온성 또는 이온성의 계면활성제, 카복시메틸셀룰로스, 폴리초산비닐, 고무류(gums), 스테아린산 칼슘, 왁스 등을 보조제로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항균 조성물은 단독으로 사용하거나 살균제, 살충제, 제초제, 식물성장 조절제 등의 농약, 비료 또는 토양 개량제 등과 병용하거나 혼합제의 형태로 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 참나무를 절단하여 음건시키는 단계; 상기 음건시킨 참나무를 반탄화 처리하는 단계; 및 상기 반탄화 처리된 참나무를 용매로 추출하는 단계를 포함하는 항균 활성을 갖는 반탄화 처리된 참나무 추출물 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 반탄화 처리는 200 내지 220℃에서 5 내지 10분 동안 열분해 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 용매로 추출하는 단계는 60 내지 80 중량% 에탄올로 60 내지 80℃에서, 60 내지 80분 동안 추출할 수 있고, 보다 바람직하게는 69.15 중량% 에탄올로 71.60℃에서, 70.15분 동안 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물에는 5-메틸-2-푸란카르복스알데히드(5-methyl-2-furancarboxaldehyde), 2,5-푸란디카르복스알데히드(2,5-furandicarboxaldehyde), 4-에틸-1,3-벤젠디올(4-ethyl-1,3-benzenediol), 4-하이드록시-3-메톡시-벤즈알데히드(4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde) 또는 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 항균 조성물은 인삼잿빛곰팡이(Botrytis cinerea) 또는 인삼점무늬병균(Alternaria panax) 억제 활성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 조건별로 반탄화 처리된 참나무의 추출물 제조
본 발명의 공시재료는 참나무를 2 cm × 3 cm 의 크기로 chipping 하여 7일 동안 실온에서 음건 시킨 후, 반탄화 처리를 위한 시료로 사용하였다. 반탄화 처리는 반응기의 가열 및 내부 시료를 순환시킬 수 있도록 제작된 반탄화 반응기에서 수행하였으며, 반탄화 처리조건은 시간과 온도의 영향을 통합하여 단일 변수로 나타낼 수 있는 severity factor (log Ro)를 이용(식 1)하여 3가지 조건으로 설정하여 수행하였다 (표 1).
열수 추출은 공시재료인 참나무(대조구)와 조건별로 반탄화 처리된 참나무를 각각 50 g에 증류수 1000 mL씩 첨가하여 autoclave에서 1시간 동안 반응시킨 후 여과하여 열수추출물을 획득하였으며, 에탄올 추출은 공시재료인 참나무(대조구)와 조건별로 반탄화 처리된 참나무를 각각 50 g에 80% 에탄올 1000 mL씩 첨가하여 속슬렛 추출기에서 1시간 동안 반응시킨 후 여과하여 추출물을 획득하였다.
추출 수율은 식 2에 의거하여 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
Ro = log{t·exp[Tr - Tb/14.75]} ……………………………… 식 1
R0 = 반응 좌표 (Reaction ordinate)
t = 반응시간 (Retention time)
Tr = 반응 온도 (℃) (Retention temperature)
Tb = 기준 온도 100℃ (Base temperature)
(14.75 is the conventional energy of activation assuming that the overall process is hydrolytic and the overall conversion is first order) (활성화에너지)
반탄화 처리 조건
온도 (℃) 시간 (분) Severity factor (log Ro)
200 5 3.64
200 7.5 3.82
220 5 4.23
추출 수율(%)= (추출물의 전건중량/추출 전 시료의 전건중량)×100 … 식 2
도 1에 나타낸 바와 같이, 참나무의 열수 추출수율은 8.1%를 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무의 열수 추출수율은 각각 9.5%, 9.4%, 9.2%로 참나무의 열수 추출수율보다 반탄화 처리된 참나무의 열수 추출수율이 높게 나타났으나, severity factor (log Ro) 조건에 따른 영향은 나타나지 않았다. 또한, 참나무의 에탄올 추출수율은 10.0%를 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무의 에탄올 추출수율은 각각 10.7%, 10.2%, 10.6%로 반탄화 처리에 따른 영향은 나타나지 않았다.
< 실시예 2> 반탄화처리 조건별 추출물의 페놀성 화합물 함량 측정
페놀성 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 법에 의거하여 실시하였다. 추출물 30 uL에 증류수 3 mL, Folin－Ciocalteu's phenol reagent 0.1 mL를 가하여 혼합하고, 5분간 정치한 다음, 20% Na2CO3 0.3 mL 가하여 혼합하고 실온에서 30분간 방치한 후, UV-spectrophotometer (U-3000®, Hitachi, Japan)를 사용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 검량선은 gallic acid 사용하여 작성하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 참나무로부터 추출된 열수 추출물의 페놀성 화합물 함량은 13.2 mg/g을 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무로부터 추출된 열수 추출물의 페놀성 화합물 함량은 각각 30.4 mg/g, 28.4 mg/g, 25.3 mg/g으로, 반탄화되지 않은 참나무 열수 추출물보다 반탄화 처리된 참나무 열수 추출물에서 높은 페놀성 함량을 나타냈으나, 반탄화 처리 조건에 따른 영향은 나타나지 않았다. 또한, 참나무로부터 추출된 에탄올 추출물의 페놀성 화합물 함량은 11.8 mg/g을 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무로부터 추출된 에탄올 추출물의 페놀성 화합물 함량은 각각 21.1 mg/g, 32.8 mg/g, 42.8 mg/g으로, 반탄화되지 않은 참나무 에탄올 추출물보다 반탄화 처리된 참나무 에탄올 추출물에서 높은 페놀성 함량을 나타냈으며, severity factor (log Ro) 값이 커질수록 페놀성 화합물 함량이 증가하는 결과를 나타냈다. 따라서, 페놀성 화합물을 증대시킬 수 있는 반탄화 처리조건은 severity factor (log Ro) 4.23 조건이며, 반탄화처리된 참나무의 페놀성 화합물의 추출에는 에탄올 추출이 적합할 것으로 판단된다.
< 실시예 3> 반탄화 처리 조건별 추출물의 항균 활성 측정
상기의 반탄화 처리 조건별 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 항균효과는 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
항균활성을 측정하기 위해 사용된 균류는 인삼잿빛곰팡이 균주(Botrytis cinerea KACC 43531) 및 인삼점무늬병 균주(Alternaria panax KACC 44351)를 사용하였으며, 인삼잿빛곰팡이 균주는 PDA (potato dextrose agar; potato dextrose broth 24 g, agar 15 g, distilled water 1L) 배지에 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 배양, 인삼점무늬병 균주는 V8 juice agar (V8(vegetable juice, cambell soup company 0020-011-8K) 163 mL, CaCO3 4 g, agar 20 g, distilled water + V8 815 mL) 배지에 접종하여 25℃ 배양기에서 14일간 배양하여, 지속적인 계대배양으로 균주를 확보하였다.
항균활성 측정은 추출물이 각각 1000 ppm 농도로 첨가된 PDA 및 V8 juice agar 배지에 계대 배양된 인삼잿빛곰팡이 균주 및 인삼점무늬병 균주를 각각 접종하여, 25℃의 growth chamber에서 인삼잿빛곰팡이 균주는 7일, 인삼점무늬병 균주는 14일간 배양시켰다. 균총의 평균 직경을 측정하여 항균활성을 식 3에 의하여 계산하였으며, 대조구는 추출물이 첨가되지 않은 PDA 배지 및 V8 juice agar 배지를 사용하였다.
항균 활성(%) = [1-(처리구의 균총 직경(mm)/대조구의 균총 직경(mm))] × 100 ………………………………………………… 식 3
그 결과 표 2 및 도 3과 같이, 인삼잿빛곰팡이 균주에 대한 항균활성에 있어서, 참나무로부터 추출된 열수 추출물의 항균활성은 7.3%를 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무로부터 추출된 열수 추출물의 항균활성은 각각 40.7%, 26.0%, 31.4%로, 반탄화되지 않은 참나무 열수 추출물보다 반탄화 처리된 참나무 열수 추출물에서 높은 항균활성을 나타냈다. 또한, 참나무로부터 추출된 에탄올 추출물의 항균활성은 9.8%를 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무로부터 추출된 에탄올 추출물의 항균활성은 각각 35.5%, 49.5%, 68.3%로, 반탄화되지 않은 참나무 에탄올 추출물보다 반탄화 처리된 참나무 에탄올 추출물에서 높은 페놀성 함량을 나타냈으며, severity factor (log Ro) 값이 커질수록 항균활성이 증가하는 결과를 나타냈다.
인삼점무늬병 균주에 대한 항균활성에 있어서, 참나무로부터 추출된 열수 추출물의 항균활성은 2.3%를 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무로부터 추출된 열수 추출물의 항균활성은 각각 20.7%, 13.3%, 11.0%로, 반탄화되지 않은 참나무 열수 추출물보다 반탄화 처리된 참나무 열수 추출물에서 높은 항균활성을 나타냈다. 또한, 참나무로부터 추출된 에탄올 추출물의 항균활성은 3.9%를 나타냈고, severity factor (log Ro) 3.64, severity factor (log Ro) 3.82, severity factor (log Ro) 4.23 조건으로 처리된 반탄화 참나무로부터 추출된 에탄올 추출물의 항균활성은 각각 12.4%, 19.8%, 23.7%로, 반탄화되지 않은 참나무 에탄올 추출물보다 반탄화 처리된 참나무 에탄올 추출물에서 높은 페놀성 함량을 나타냈으며, severity factor (log Ro) 값이 커질수록 항균활성이 증가하는 결과를 나타냈다.
반탄화재 추출물은 인삼점무늬병 균주보다 인삼잿빛곰팡이병 균주에 우수한 항균활성을 나타냈으며, severity log (Ro) 4.23 조건으로 반탄화 처리된 참나무의 에탄올 추출물에서 가장 높은 항균 활성을 나타냈다.
참나무 및 severity factor (log Ro) 조건에 따라 반탄화된 참나무로부터 추출된 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 인삼잿빛곰팡이 및 인삼점무늬병에 대한 항균 활성
severity factor
(log Ro)		 Antifungal activity (radial growth infibition), %
Botrytis cinerea KACC 43531 Alternaria panax KACC 44351
열수 추출물 에탄올 추출물 열수 추출물 에탄올 추출물
Raw material 7.3 9.8 2.3 3.9
3.64 40.7 35.5 20.7 12.4
3.82 26.0 49.5 13.3 19.8
4.23 31.4 68.3 11.0 23.7
< 실시예 4> 반탄화 처리된 참나무의 페놀성 화합물 추출 증대를 위한 최적 추출 조건 확립
반탄화 처리된 참나무（severity factor (log Ro) 4.23)에서 페놀성 화합물 추출의 최적 조건을 탐색하기 위해 반응표면분석을 실시하였다. Box-Behnken design에 따라 에탄올 농도(X1, 60-80%), 추출 온도(X2, 60-80℃), 추출 시간(X3, 60-80분) 세 가지 요인변수를 이용하여 -1, 0, 1의 단계로 부호화 하였다. 표 3에서와 같이 17개의 추출조건을 이용하여 무작위로 순서를 정하여 3회 반복 실험하였다. 이들 변수에 영향을 받는 종속변수로 페놀성 화합물 함량을 측정하였다. 모든 결과의 수치는 건조 중량을 기준으로 하였으며, 반응표면 분석에서 독립변수 X i 와 X j 에 대한 종속변수 Y(페놀성 화합물 함량)은 다음과 같은 2차회귀식으로 나타내었으며, β0 는 상수이고 β i , β ii , β ij 는 회귀계수이다.
Figure pat00001
모든 반응 변수는 다중회귀분석(multiple regression analysis)과 분산분석(ANOVA)을 통하여 회귀식을 통한 반응모델의 적합성을 검증하였으며, 통계 분석 및 반응모델의 3차원 반응표면그래프는 SAS (statistical analysis system, SAS institute U.S.A)를 이용하여 나타내었다. 회귀분석 결과, 최적점이 최대점 혹은 최소점이 아닌 안장점일 경우에는 능선분석을 통하여 최적점을 유도하였다.
표 3에 의하면, 최대 페놀성 화합물 함량은 5조건(에탄올 농도 70%, 추출 온도 70 ℃, 추출 시간 70분)에서 45.3 mg/g으로 가장 높게 나타났고, 최소 페놀성 화합물 함량은 10조건(에탄올 농도 70%, 추출 온도 60 ℃, 추출 시간 80분)과 15조건(에탄올 농도 60%, 추출 온도 60 ℃, 추출 시간 70분)으로 나타났다.
중심점(에탄올 농도 70%, 추출 온도 70 ℃, 추출 시간 70분)으로 추출된 2조건, 5조건, 13조건, 14조건, 17조건에서 페놀성 화합물 함량은 각각 45.2 mg/g, 45.3 mg/g, 45.0 mg/g, 45.1 mg/g, 45.2 mg/g으로 전반적으로 45 mg/g 이상의 높은 페놀성 화합물 함량을 나타냈으며, 높은 에탄올 농도(80 %)의 조건으로 추출된 1조건, 3조건, 8조건, 11조건에서 페놀성 화합물 함량은 각각 37.2 mg/g, 38.0 mg/g, 36.9 mg/g, 37.5 mg/g, 높은 추출 온도(80℃)의 조건으로 추출된 4조건, 11조건, 12조건, 16조건에서 페놀성 화합물 함량은 각각 40.2 mg/g, 37.5 mg/g, 40.6 mg/g, 39.0 mg/g, 높은 추출 시간(80분)의 조건으로 추출된 3조건, 9조건, 10조건, 12조건에서 페놀성 화합물 함량은 각각 38.0 mg/g, 38.3 mg/g, 36.8 mg/g, 40.6 mg/g으로 페놀성 화합물 추출에는 추출 온도 > 추출 시간 > 에탄올 농도 순으로 영향을 미친 것으로 예측되었다.
Run Independent variable Response variable
Ethanol concentration (X1,%) Temperature
(X2,℃)		 Time
(X3,min)		 Total phenolic compound
(mg/g)
1 1(80) 0(70) -1(60) 37.2
2 0(70) 0(70) 0(70) 45.2
3 1(80) 0(70) 1(80) 38.0
4 -1(60) 1(80) 0(70) 40.2
5 0(70) 0(70) 0(70) 45.3
6 0(70) -1(60) -1(60) 38.2
7 -1(60) 0(70) -1(60) 39.2
8 1(80) -1(60) 0(70) 36.9
9 -1(60) 0(70) 1(80) 38.3
10 0(70) -1(60) 1(80) 36.8
11 1(80) 1(80) 0(70) 37.5
12 0(70) 1(80) 1(80) 40.6
13 0(70) 0(70) 0(70) 45.0
14 0(70) 0(70) 0(70) 45.1
15 -1(60) -1(60) 0(70) 36.8
16 0(70) 1(80) -1(60) 39.0
17 0(70) 0(70) 0(70) 45.2
반응표면 분석한 결과 17개의 실험결과를 통해 다음과 반응표면모델식을 얻었다.
Y 1 = -452.412500 + 5.618750X1 + 4.875000X2 + 3.676250X3 - 0.038125X1 2 -0.009000X1X2 -0.033375X2 2 + 0.004250TimeX1X3 + 0.007500X2X3 - 0.032125X3 2
표 4는 예측된 2차 반응표면모델의 회귀변수의 분산(ANOVA) 분석을 나타낸 결과로, 종속변수에 영향을 미치는 1차항인 에탄올 농도(X1), 추출 온도(X2), 추출 시간(X3)의 P-value는 0.0001로 매우 유의적인 수준을 나타내어 페놀성 화합물 추출에 세 인자 모두 영향을 크게 미치는 것으로 나타났다.
반응모델의 적합도를 나타내는 R2(결정계수)는 0.9984로 이는 유도된 2차 다항방정식이 실험된 조건 안에서의 반응을 99.84% 설명할 수 있다는 의미이며, 2차 다항방정식은 p<0.0001에서 유의하였다. 따라서 유도된 2차 다항방정식은 최적 페놀성 화합물 추출조건의 반응값 예측에 적합하다고 판단된다.
Term Sum of squares Degrees of freedom Mean square P-value
X1 67.264408 4 16.816102 <0.0001
X2 59.995657 4 14.998914 <0.0001
X3 46.427039 4 11.606760 <0.0001
Linear 3 <0.0001
Quadratic 3 <0.0001
Lack of fit 0.287500 3 0.095833 <0.0001
Pure error - 4
R2 0.9984
Morphology Maximum point
또한 도 4에 의하면, 에탄올 농도 및 추출 시간의 영향을 나타낸 그래프 (B)와 에탄올 농도 및 추출 온도의 영향을 나타낸 그래프 (C)에서 완만한 능선을 나타내어, 추출 온도 및 추출 시간이 페놀성 화합물 추출에 가장 영향을 적게 미친 것을 알 수 있으며, 예측된 정상점은 최대점(maximum point)으로, 이때의 추출 조건은 에탄올 농도 69.15%, 추출 온도 71.60 ℃, 추출 시간 70.15 분으로 예측되었으며, 예측된 페놀성 화합물 함량은 45.3 mg/g으로 나타났다.
이상 종합하면, 본 발명에서는 반탄화 처리된 참나무（severity factor (log Ro) 4.23)의 에탄올 추출물의 페놀성 화합물의 추출 조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였는데, Box-Behnken design에 따라 추출 조건인 독립변수(에탄올 농도, 추출 온도, 추출 시간)와 이에 영향을 받는 종속변수(페놀성 화합물 함량)로 설정하여 실험하였다. 앞서 설명한 바와 같이, 에탄올 추출물의 페놀성 화합물 함량은 에탄올 농도, 추출 온도, 추출 시간의 영향을 받는 것을 알 수 있으며, 에탄올 추출물의 최적 추출조건은 에탄올 농도 69.15%, 추출 온도 71.60 ℃, 추출 시간 70.15 분으로 예측되며, 도출된 회귀식은 신뢰(R2 = 0.9984) 할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 5> 반탄화 처리된 참나무 에탄올 추출물의 성분 분석
반탄화 처리된 참나무（severity factor (log Ro) 4.23)의 에탄올 추출물은 Agilent 6890 gas chromatograph / 5973 mass selective detector(Palo Alto, Calif.)를 이용하여 측정하였고, VF-5MS column을 사용하여 분리하였다. 캐리어가스(carrier gas)로서 헬륨을 1 mL/min의 일정한 속도로 흐르도록 하여 사용하였고, 오븐의 온도는 45 ℃에서 1분 세팅한 후, 45℃-100 ℃ 에서는 분당 10 ℃ 씩 상승, 100-250 ℃ 에서는 분당 7.5 ℃, 250-300 ℃에서는 분당 10 ℃씩 상승시킨 후, 300 ℃에서 6분간 유지시켰다. 디텍터(detector)와 인젝터(injector)의 온도는 260 ℃로 유지하였다. 대부분의 피크는 컴퓨터 라이브러리(Wiley 275L program) 프로그램을 이용하였다.
가스크로마토그래피 분석결과, 반탄화 처리된 참나무（severity factor (log Ro) 4.23) 에탄올 추출물의 주된 성분은 5-메틸-2-푸란카르복스알데히드(5-methyl-2-furancarboxaldehyde), 2,5-푸란디카르복스알데히드(2,5-furandicarboxaldehyde), 4-에틸-1,3-벤젠디올(4-ethyl-1,3-benzenediol), 4-하이드록시-3-메톡시-벤즈알데히드(4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde), 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)으로 나타났으며, 이들 중 4-에틸-1,3-벤젠디올(4-ethyl-1,3-benzenediol), 4-하이드록시-3-메톡시-벤즈알데히드(4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde), 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)이 페놀계 화합물인 것으로 나타났다(표 5). 따라서, 반탄화 처리된 참나무（severity factor (log Ro) 4.23)의 에탄올 추출물에는 페놀성 화합물 함량이 다량 존재하였으며, 이들 화합물이 항균활성과 연계되어 있는 것으로 추정된다.
Peak
no.		 Retention
time		 Compounds Synonym Structural
formula		 Class
1 5.91 5-메틸-2-푸란카르복스알데히드
(5-methyl-2-furancarboxaldehyde)		 5-메틸-푸르푸랄
(5-methyl-furfural);
2-포밀-5-메틸푸란
(2-formyl-5-methylfuran);
2-메틸-5-포밀푸란
(2-methyl-5-formylfuran);
5-메틸-2-푸르알데히드
(5-methyl-2-furaldehyde)
Figure pat00002

C6H6O2 		퓨란
유도체
2 7.92 2,5-푸란디카르복스알데히드
(2,5-furandicarboxaldehyde)		 2,5-푸란디카르브알데히드
(2,5-furandicarbaldehyde);
2,5-디포밀푸란
(2,5-diformylfuran);
5-포밀푸르푸랄
(5-formylfurfural)
Figure pat00003

C6H4O3 		퓨란
유도체
3 9.82 4-에틸-1,3-벤젠디올
(4-ethyl-1,3-benzenediol)		 4-에틸레소르시놀
(4-ethylresorcinol)
Figure pat00004

C8H10O2 		페놀
유도체
4 11.40 4-하이드록시-3-메톡시-벤즈알데히드
(4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde)		 바닐린(vanillin)
Figure pat00005

C8H8O3 		페놀
유도체
5 13.37 2,6-디메톡시페놀
(2,6-dimethoxyphenol)		 4-하이드록시베라트롤
(4-hydroxyveratrole);
3,4-비스(메틸옥시)페놀
3,4-bis(methyloxy)phenol;
시린졸(syringol);
1,3-디메톡시-2-하이드록시벤젠
(1,3-dimethoxy-2-hydroxybenzene);
3,4-디메톡시-페놀
(3,4-dimethoxy-phenol)
Figure pat00006

C8H10O3 		페놀
유도체

Claims (7)

  1. 반탄화 처리된 참나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 반탄화 처리는 200 내지 220℃에서 5 내지 10분 동안 열분해 처리하는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물은 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 반탄화 처리된 참나무 추출물에는 5-메틸-2-푸란카르복스알데히드(5-methyl-2-furancarboxaldehyde), 2,5-푸란디카르복스알데히드(2,5-furandicarboxaldehyde), 4-에틸-1,3-벤젠디올(4-ethyl-1,3-benzenediol), 4-하이드록시-3-메톡시-벤즈알데히드(4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde) 및 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물이 포함된 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항균 조성물은 인삼잿빛곰팡이(Botrytis cinerea) 또는 인삼점무늬병균(Alternaria panax) 억제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  7. 참나무를 절단하여 음건시키는 단계;
    상기 음건시킨 참나무를 반탄화 처리하는 단계; 및
    상기 반탄화 처리된 참나무를 용매로 추출하는 단계를 포함하는 항균 활성을
    갖는 반탄화 처리된 참나무 추출물 제조방법.
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