KR20170010302A

KR20170010302A - Shp-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20170010302A
Application number: KR1020160089886A
Authority: KR
Inventors: 최유리; 박상면
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2017-01-26
Also published as: KR101838802B1

Abstract

본 발명은 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 투여하여 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법, 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물, 상기 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트 및 상기 진단용 조성물 또는 상기 키트를 이용한 퇴행성 뇌질환 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 α-시누클레인이 인접한 세포로 전이하여 야기하는 신호전달을 억제할 수 있으므로, 인접한 세포에 대한 α-시누클레인의 세포독성영향을 감소시킴으로써 퇴행성 뇌질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 퇴행성 뇌질환의 병인 기전을 밝혀낼 수 있는 중요한 단서가 될 수 있으므로, 원인을 해결하는 근본적 치료를 통해 퇴행성 뇌질환을 극복하는데 활용될 수 있을 것이다.

Description

SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising inhibitor for expressing or activating of SHP-1/-2}

본 발명은 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 투여하여 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법, 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물, 상기 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트 및 상기 진단용 조성물 또는 상기 키트를 이용한 퇴행성 뇌질환 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

파킨슨병의 정확한 발병원인은 아직 밝혀지지 않은 상태이지만, 그 중 유전성 파킨슨병은 알파-시누클레인(α-synuclein), parkin, PINK1, DJ-1, LRRK2 등의 여러 가지의 유전자 변이가 원인이 된다고 알려져 있다. 또한, 지금까지 알려진 바로는 산화스트레스, 미토콘드리아의 이상, 및 세포 내 단백질 제거 기능의 문제가 원인이 될 것으로 추측되고 있으며(Lees, A. J., et al., 2009, Lancet, 373, 2055-66.), 유전적인 원인과 더불어 환경적인 영향에 의해 발병되는 질환으로 추정하고 있다. 이러한 파킨슨병의 발병 여부는 임상적인 증상을 토대로 진단되고 있으며, 치료 또한 원인을 해결하기보다는 증상을 완화하는 보존적 치료에 그치고 있다. 따라서, 병인을 정확히 파악하여 그에 상응하는 적합한 치료방법을 찾는 것이 시급하다.

알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)은 파킨슨병 환자에게서 발견되는 세포질 내 루이소체(Lewy body)의 주요 단백질로서, 신경세포의 전시냅스(presynapse) 말단에 주로 분포하며, 뇌조직 전반에서 많은 양이 발현된다고 알려져 있다. 알파-시누클레인은 파킨슨병뿐만 아니라, 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies), 다계통위측증(Multiple system atrophy) 등의 다른 퇴행성 질환의 병인으로 알려져 있다. 알파-시누클레인의 비정상적인 침착과 관련된 상기 질환들은 모두 시누클리노패시(synucleinopathy)로 통칭하며, 상기 질환들의 공통된 치료 표적으로서의 알파-시누클레인에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

또한, 알파-시누클레인은 응집체를 형성할 수 있는데, 단량체 알파-시누클레인이 응집체가 되는 변성과정이 파킨슨병의 주원인이 될 수 있을 것이라는 가능성이 대두되었다(Eschbach, J., Danzer, K. M., 2013. Neurodegener Dis., 14, 1-17). 그 후, 알파-시누클레인 유전자의 이중중복(duplication) 및 삼중중복(triplication)이 가족성 파킨슨병에서 발견됨으로써 알파-시누클레인의 기능을 찾고자 하는 노력이 더욱 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 응집된 알파-시누클레인을 타겟으로한 약학 조성물로서, 알파-시누클레인의 응집에 의한 신경 독성으로부터 도파민 신경세포를 유의하게 보호할 수 있는, 용안욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물이 개발되었다(한국등록특허 제1189191호). 그러나, 알파-시누클레인이 작용하는 구체적인 수용체와 그에 관한 메커니즘에 대하여는 아직도 규명되지 않았다.

한편, 단백질의 단량체가 응집체로 변성되는 과정은 파킨슨병의 알파-시누클레인뿐만 아니라, 알츠하이머병의 아밀로이드 베타(Amyloid beta; Aβ), 타우(tau), 헌팅턴병의 변이된 헌팅틴(mutated huntingtin), 프라이온병의 프라이온(prion) 등에서도 일어나는 현상이다. 이러한 변성과정은 많은 퇴행성뇌질환의 공통적인 원인으로 여겨지고 있으며, 이를 억제하여 퇴행성 뇌질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이후로, 알파-시누클레인의 세포내 전달 가능성에 대해 관심이 급격히 높아졌다. 프라이온병에서 프라이온이 정상신경세포에 발현된 정상적인 프라이온과 결합하여 응집체를 형성하는 것처럼, 응집된 알파-시누클레인도 인접세포로 들어가 인접세포의 루이소체 생성 및 세포사멸에 관여할 수 있다는 가능성이 보고되었다(Costanzo, M., Zurzolo, C., 2013. Biochem J. 452, 1-17.; Goedert, M., et al., 2010. Trends Neurosci. 33, 317-25.; Lee, S. J., et al., 2010. Nat Rev Neurol. 6, 702-6.). 이러한 내용을 통해 세포 밖에 위치한 알파-시누클레인에 의한 파킨슨병 관련 병인기전을 유추해 보면, 세포에서 분비된 다양한 형태의 알파-시누클레인이, 인접해 있는 신경교세포에 작용하여 이를 활성화시킴으로써 신경세포 독성이 나타나고, 나아가 알파-시누클레인은 인접 신경세포로의 전이를 통해 직접적인 독성을 나타내거나 루이소체의 발생을 유도하여 일련의 세포독성을 보인다고 추측된다.

따라서, 세포 밖에 위치하는 알파-시누클레인에 의해 세포 내 신호전달과정에 관여하게 되는 수용체 혹은 구조물들은, 많은 종류의 퇴행성뇌질환의 병인기전을 밝혀낼 수 있는 중요한 단서가 될 수 있다. 더불어, 지금까지와는 다른 새로운 치료전략을 세울 수 있다는 점에서 매우 큰 관심을 가질만한 일이지만, 그에 관련한 연구는 많이 수행되지 않은 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 알파-시누클레인이 인접 세포로 전이되는 작용기전을 규명하고자 예의 연구노력한 결과, SHP-1/-2의 활성화가 알파-시누클레인의 전이에 관여한다는 것을 확인하였고, SHP-1/-2의 활성화는 알파-시누클레인의 수용체인 FcγRⅡB에 의하여 매개된다는 것을 확인하였으므로, 상기 SHP-1/-2 또는 FcγRⅡB의 발현 또는 활성을 억제할 경우, 알파-시누클레인에 의해 유발되는 다양한 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 SHP-1/-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1/-2)의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학 조성물을 투여하여 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 퇴행성 뇌질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 퇴행성 뇌질환의 병인기전을 밝힘으로써 보다 효과적인 새로운 치료전략을 세우기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)에 주목하게 되었다. 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인이 인접해 있는 신경교세포들에 작용하여 상기 세포를 활성화시킴으로써 신경세포의 손상에 관여한다는 가능성을 바탕으로, 세포 밖의 응집된 알파-시누클레인이 인접한 세포 내로 들어가는데 매개하는 수용체와 상기 수용체에 의해 활성화되는 단백질을 밝혀내었다.

본 발명자들은 응집된 α-syn이 미세아교세포의 식균작용 활성을 억제함을 확인하여, 면역 복합체(Immune Complexes; ICs)-유도 식균작용을 이용함으로써, 응집된 α-syn의 작용 메커니즘을 조사하였다. 또한, 상기 면역 복합체가 관여하는 ICs-FcγRs 신호전달경로는 SHP-1 및 SHP-2(이하, SHP-1/-2) 같은 여러 포스파타아제(phosphatase)의 소집(recruitment)에 의해 억제됨을 확인하고, 이에 따라, 응집된 α-syn이 SHP-1/-2의 활성화에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 응집된 α-syn은 활성화된 SHP-1을 원형질막으로 이동시킴으로써, 식균작용의 신호전달경로인 ICs-FcγRs의 초기 단계를 억제한다는 것을 확인하였고, 응집된 α-syn에 의한 SHP-1/-2의 활성화는 미세아교세포에 존재하는 FcγRⅡB 수용체가 매개함을 확인하였다.

나아가, SHP-1/-2의 발현이 억제된 미세아교세포 및 SHP-1/-2의 저해제인 NSC87877을 처리한 정상 도파민성 신경세포주 SH-SY5Y에서는 α-syn의 전이가 감소됨을 확인하였고, FcγRⅡB를 포함한 수용체 단백질을 과발현시킨 인간 신장세포주에서는 SHP-2의 인산화가 증가함을 확인하였다. 이를 통해, 인산화를 통한 SHP-1/-2의 활성화가 응집된 α-syn의 전이에 중요한 요소이며, 상기 응집된 α-syn은 신경세포에서 발현되는 FcγRIIb 수용체를 통해 세포 내로 신호를 전달함을 알 수 있었다. 또한, FcγRIIb 발현억제 도파민성 신경세포주 SH-SY5Y에서 α-syn의 이동이 감소함을 확인함으로써 다른 세포로부터 분비된 α-syn이 인접 세포로 이동하는데 FcγRIIb가 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

이처럼 다양한 퇴행성 뇌질환의 발병원인을 밝혀낼 수 있는 중요한 단서인 응집된 α-syn의 인접세포로의 전이 메커니즘은 종래에 전혀 공지되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 SHP-1/-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1/-2)의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 파킨슨병(Parkinson’s disease), 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies) 및 다계통위측증(Multiple system atrophy)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SHP-1/-2"이란, Src 상동성영역 2 도메인-포함 포스파타아제-1/-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1/-2)로서, PTPN6 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6)으로도 알려져 있으며, 일종의 단백질 티로신(tyrosine) 포스파타아제를 의미한다. 상기 SHP-1/-2는 N-말단(N-terminal)에 단백질 인산화-티로신 결합 도메인으로서 작용하는 Src 상동(Src homolog; SH2) 도메인을 포함하며, 세포 성장, 분화 및 유사분열 주기 등의 다양한 세포 내 과정을 조절하는 신호전달분자로 알려져 있다. 본 발명의 목적상, SHP-1/-2는 응집된 α-syn에 의해 활성화되는 단백질일 수 있다. 상기 SHP-1/-2 단백질의 유전자서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession AAC36009.1, AAC36008.1 등으로 표시되는 유전자일 수 있다.

본 발명의 용어 "SHP-1/-2의 활성화"란, SHP-1/-2의 인산화를 의미하고, 본 발명의 목적상, 응집된 α-syn에 의해 달성되는 것일 수 있으며, 상기 SHP-1/-2의 활성화는 α-syn의 인접한 다른 세포로의 전이를 증가시키는 현상에 관여할 수 있다.

본 발명의 용어 "알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)"이란, 세포질 내 루이소체(Lewy body)의 주 구성성분으로 알려진 단백질을 의미하며, 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 목적상 퇴행성 뇌질환의 병인에 관여하는 단백질 분자일 수 있다. 상기 α-syn 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession NP_001035916.1 등으로 표시되는 유전자일 수 있다.

본 발명의 용어 "알파-시누클레인의 전이"란, 알파-시누클레인이 알파-시누클레인을 분비하는 세포로부터 인접한 곳에 위치한 다른 세포로 이동하는 현상을 의미한다. 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 목적상 인접한 세포에 직접적인 독성을 나타내거나, 인접한 세포 내로 세포독성을 나타내는 신호를 전달하는 현상일 수 있으며, 상기 알파-시누클레인의 전이에 의해 SHP-1/-2가 활성화될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 응집된 형태의 알파 시누클레인(α-syn)이 용량 의존적으로 미세아교세포의 식균작용 활성을 억제함을 확인하였다(도 1). 또한, 응집된 α-syn은 면역 복합체(Immune Complexes; ICs)와 동일한 곳에 위치하며, 상기 면역 복합체에 의하여 유도된 신호전달 경로의 초기 단계에 관여함으로써 미세아교세포의 식균작용 활성을 억제시킴을 확인하였다(도 2). 나아가, 응집된 α-syn은 신장 세포주 등 다른 종류의 세포와는 다르게, 미세아교세포나 신경세포의 세포막에만 결합한다는 것을 확인하였다(도 8).

본 발명의 용어 "FcγRIIB"(IgG Fc receptor Ⅱ-B; FcgammaRIIB)이란, 일종의 IgG Fc 수용체(IgG Fc receptor; FcγRs)를 의미하는데, 본 발명의 목적상, 응집된 알파-시누클레인에 의한 SHP-1/-2의 활성화에 관여할 것으로 생각되는 수용체 단백질일 수 있다. 상기 FcγRIIB 단백질의 유전자서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession AAA97464.1 등으로 표시되는 유전자일 수 있다.

본 발명의 용어 "FcγRs(IgG Fc receptor)"란, 세포 활성화 및 체액성 관용(humoral tolerance)의 조절자로서, 면역 반응의 구심성(afferent) 및 원심성(efferent) 단계의 조절에 관여하는 저해 수용체(inhibitory receptor)를 의미하며, 면역 복합체(immune complexes; ICs)에 대한 급성 염증반응의 중요한 반응기(effector)로서 작용한다.

본 발명의 용어 "SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제"란, SHP-1/-2을 코딩하는 유전자, mRNA 또는 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하여 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 SHP-1/-2의 저해제와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제함으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 약학 조성물의 유효성분인 것일 수 있는데, 상기 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, SHP-1/-2의 mRNA에 특이적인 miRNA, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리코뉴클레오티드, SHP-1/-2의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 안타고니스트 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "miRNA, siRNA 또는 shRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 목적상, SHP-1/-2의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 효과를 나타내며, 본 발명의 목적상, SHP-1/-2의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 항체는 퇴행성 뇌질환의 발병이 의심되는 개체의 활성화된 SHP-1/-2 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다. 구체적인 예로, SHP-1/-2에 특이적으로 결합될 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란. 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.

본 발명의 목적상 상기 앱타머는 활성화된 SHP-1/-2 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "안타고니스트(antagonist)"란, 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적상 상기 안타고니스트는 활성화된 SHP-1/-2 단백질의 활성을 억제하는 분자라면 제한 없이 포함하며, 구체적인 예로 상기 안타고니스트는 활성화된 SHP-1/-2에 결합하여 활성을 억제하는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 안타고니스트는 응집된 α-syn에 의해 활성화된 SHP-1/-2 단백질의 활성을 억제하므로, 알파-시누클레인과 관련된 모든 질환의 치료제로 사용될 수 있으며, 구체적인 예로 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "퇴행성 뇌질환"이란, 신경세포의 손상에 의해 야기되는 뇌질환을 의미하며, 노화, 유전적 변이, 스트레스, 세포 내 단백질 제거 기능의 문제 등이 발병 원인이 될 것으로 추측되고 있지만, 정확한 원인은 밝혀지지 않았다. 상기 퇴행성 뇌질환은 알파-시누클레인에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환에 속하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 파킨슨병(Parkinson’s disease), 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies), 다계통위측증(Multiple system atrophy) 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 퇴행성 뇌질환치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 구체적인 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당 되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 면역치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 구체적으로 약 1 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란 퇴행성 뇌질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 치료제의 후보물질이 처리된 신경조직 유래 세포에 알파-시누클레인(α-Synuclein)을 처리하고, SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

일 예로서, 상기 스크리닝 방법은 (a) 퇴행성 뇌질환 치료제의 후보물질이 처리된 신경조직 유래 세포에 알파-시누클레인(α-Synuclein)을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 투여된 신경조직 유래 세포에서 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 스크리닝 방법은 상기 (b)단계에서 측정한 SHP-1/-2의 활성화가 억제되는 경우, 상기 (a)단계에서 처리한 후보물질을 퇴행성 뇌질환 치료제로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (b)단계의 알파-시누클레인(α-Synuclein) 및 상기 후보물질이 투여된 신경조직 유래 세포에서 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계는 상기 기술한 바와 같이 당업계에서 이용되는 통상의 발현 수준 측정 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 구체적인 예로 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR, 전기영동, 조직 면역염색(immunostaining) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 등이 있다.

또한, 퇴행성 뇌질환 치료제의 후보물질이 처리되는 상기 신경조직 유래 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나 일 예로서, 신경세포 또는 신경교세포가 될 수 있고, 다른 예로서, 미세아교세포(microglia), 성상교세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte), 상의세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann cell), 위성세포(satellite cell) 등의 신경교세포가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "퇴행성 뇌질환 치료제의 후보물질"이란, 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로, 직접 또는 간접적으로 퇴행성 뇌질환을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 치료가능 예상물질을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질 투여 전후에 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 한편, 상기 SHP-1/-2의 활성화가 후보물질 투여 전에 비해 투여 후에 억제된 경우, 해당 후보물질을 퇴행성 뇌질환 치료제로서 결정할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정할 수 있는 제제"란, SHP-1/-2의 인산화 여부를 측정할 수 있는 제제를 의미하며, 본 발명의 목적상, 세포에 대한 응집된 α-syn의 영향을 평가하는데 이용될 수 있는 제제를 의미한다. 상기 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 활성화된 SHP-1/-2의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 항체는 퇴행성 뇌질환의 발병이 의심되는 개체의 응집된 α-syn에 의해 활성화된 SHP-1/-2 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성화 여부를 측정할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다. 구체적인 예로, SHP-1/-2에 특이적으로 결합될 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 앱타머는 SHP-1/-2 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성화 여부를 측정할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 퇴행성 뇌질환의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 퇴행성 뇌질환의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 경과를 판단하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 제한 없이 포함하며, 임의의 동물(예컨대, 인간)을 의미한다. 보다 넓게는 상기 동물의 세포주까지 제한 없이 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 퇴행성 뇌질환 진단용 키트는 퇴행성 뇌질환을 진단하는 표지자인 알파-시누클레인(α-Synuclein)의 인접세포로의 전이를 직접 측정하거나, 또는 알파-시누클레인에 의해 활성화된 SHP-1/-2의 활성을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 상기 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 더불어, 단백질 수준을 분석하기 위하여, 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(otA: badioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 등의 방법을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 퇴행성 뇌질환 진단을 위한 정보의 제공 방법은 퇴행성 뇌질환이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하여 수행될 수 있고, 구체적인 예로, 상기 SHP-1/-2가 활성화되었을 때 퇴행성 뇌질환으로 판단할 수 있다.

본 발명의 용어, "시료"는 퇴행성 뇌질환 진단의 지표인 SHP-1의 활성화 여부에 차이를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 신경조직 유래 세포, 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간질액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시료일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하기 위한 방법으로는 식균작용 어세이(phagocytosis assay), 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR, 전기영동, 조직 면역염색(immunostaining) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용한 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법은 (a) 상기 진단용 조성물 또는 진단용 키트를 이용하여 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하여 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환을 진단하는 단계; 및 (b) 상기 퇴행성 뇌질환으로 진단된 개체에 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 α-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)이 인접한 세포로 전이하여 야기하는 신호전달을 억제할 수 있으므로, 인접한 세포에 대한 α-시누클레인의 세포독성영향을 감소시킴으로써 퇴행성 뇌질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명의 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 퇴행성 뇌질환의 병인 기전을 밝혀낼 수 있는 중요한 단서가 될 수 있으므로, 원인을 해결하는 근본적 치료를 통해 퇴행성 뇌질환을 극복하는데 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 응집된 α-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)이 미세아교세포의 식균작용(microglial phagocytosis)을 억제한다는 것을 보여주는 이미지 및 그래프이다.
도 1의 A 및 B는 BV-2 세포, 및 도 1의 D는 래트(rat) 일차(primary) 미세아교세포에서 확인한 결과이고, 상기 세포들을 해당하는 농도의 응집된 α-syn 및 형광 마이크로스피어(microspheres)와 함께 12시간 동안 배양한 후, 하기 실시예 1에 기재한 내용과 같은 식균작용 어세이를 수행하였다. 도 1의 A에서, 파란색은 DAPI 염색을 나타내며, 스케일바(Scale Bar)는 100 ㎛를 나타낸다.
도 1의 C는 1 μM의 응집된 α-syn으로 12시간 동안 배양한 BV-2 세포를 이용하여 LDH-세포독성 어세이를 수행한 그래프이다.
도 1의 E 및 F는 2 ㎎/㎖의 단량체 α-syn을 37℃에서 250 rpm으로 교반하면서 2주 동안 배양하고, 각각 해당하는 시간에 적은 양의 분획을 수득하여 상기 수득한 분획으로 티오플라빈 T(Thioflavin T) 결합 어세이를 수행한 그래프이고(도 1의 E), 전자 현미경(electron microscopy)으로 관찰한 이미지이다(도 1의 F).
도 1의 G 및 H는 1 μM의 α-syn을 37℃에서 250 rpm으로 해당하는 시간동안 교반한 것을 BV2 세포에 형광 마이크로스피어와 함께 배양하며 식균작용을 수행한 그래프이다. 도 1의 G는 2시간 동안 배양한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1의 H는 12시간 동안 배양한 결과를 나타내는 그래프이다. * P < 0.05, ** P < 0.01은 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 응집된 α-syn이 면역 복합체(Immune Complexes; ICs)에 의해 유도된 식균작용을 억제한다는 것을 보여주는 그래프 및 이미지이다.
도 2의 A는 BV-2 세포, 및 도 2의 B는 래트 일차 미세아교세포에서 식균작용 활성을 확인한 그래프이다. 상기 세포들을 해당하는 농도의 응집된 α-syn 및 0.5 ㎎/㎖의 ICs와 함께 30분 동안 배양하고, 이어서 형광 마이크로스피어로 2시간 동안 배양한 후, 식균작용 활성을 조사하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01은 ICs가 존재하는 조건에서 응집된 α-syn을 처리하지 않은 비교군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 2의 C는 도 2의 D 및 E에 대한 실험의 개략도이다.
도 2의 D는 BV-2 세포에서, 도 2의 E는 래트 일차 미세아교세포에서 실험한 결과를 나타내는 그래프이고, 0.5 ㎎/㎖의 ICs 및 1 μM의 응집된 α-syn으로 각 세포를 해당하는 시간동안 배양한 후, 식균작용 활성을 조사하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 2의 F는 BV-2 세포의 면역염색 결과를 나타내는 이미지이다. BV-2 세포를 1 μM의 응집된 α-syn으로 30분 동안 미리 배양한 후, 0.5 ㎎/㎖의 ICs로 10분 동안 배양하고, 그 이후에 세포 염색을 수행하였다. 비-투과성 조건에서, 초록색은 항-마우스 IgG 항체를 통해 면역염색된 ICs를 나타내고, 빨간색은 항-α-syn 항체가 접합된 Alexa 568을 통해 면역염색된 α-syn을 나타낸다.
도 2의 G는 α-syn이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 배양한 BV-2 세포의 면역염색 결과를 나타내는 이미지이다. 초록색은 항-마우스 IgG 항체를 통해 면역염색된 ICs를 나타낸다. 면역염색이후, 상기 세포를 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 관찰하였고, 형광의 세기를 분석하였다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.
도 3은 응집된 α-syn가 SHP-1 인산화를 유도한다는 것을 보여주는 그래프 및 이미지이다.
도 3의 A 및 B는 BV-2 세포, 및 도 3의 C는 래트 일차 미세아교세포에서 실험한 결과를 나타내며, 상기 세포들을 1 μM의 응집된 α-syn으로 30분 동안 배양한 후, 0.5 ㎎/㎖의 ICs로 5분 동안 배양하였다.
도 3의 D는 1 μM의 단량체 α-syn으로, 도 3의 E는 1 μM의 응집된 α-syn을 이용하여 BV-2 세포를 30분 동안 배양한 후, 용해하여 웨스턴블롯을 수행한 결과를 나타내는 그래프 및 이미지이다. * P < 0.05, ** P < 0.01는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 3의 F는 BV-2 세포, 도 3의 G는 래트 일차 미세아교세포를 1 μM의 응집된 α-syn을 이용하여 5분 동안 배양한 후, 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다. 초록색은 항-SHP-1 항체를 통해 면역염색된 것을 나타내고, 빨간색은 항-α-syn 항체를 통해 면역염색된 α-syn을 나타낸다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.
도 3의 H는 야생형 WT(wild type) 마우스 및 A53T TG 마우스의 전체 뇌 용해물을 이용하여 웨스턴블롯을 수행한 이미지 및 그래프를 나타낸다. * P < 0.05는 대조군 WT 마우스와 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 SHP-1 발현억제 또는 NSC87877의 처리가 응집된 α-syn에 의한 미세아교세포 식균작용의 억제 영향으로부터 회복시킨다는 것을 보여주는 이미지 및 그래프이다.
도 4의 A는 정상 비교군(Non-targeting; NT) 및 SHP-1 발현억제(knock down; KD) BV-2 세포를 용해하고, SHP-1에 대한 웨스턴블롯을 수행한 이미지이다.
도 4의 B는 정상 비교군(NT) 및 SHP-1 발현억제(KD) BV-2 세포를 해당하는 농도의 응집된 α-syn 및 형광 마이크로스피어로 12시간 동안 배양한 이후의 식균작용 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4의 C는 정상 비교군(NT) 및 SHP-1 발현억제(KD) BV-2 세포를 0.5 ㎎/㎖의 ICs로 30분 동안 미리 배양한 후, 1 μM의 응집된 α-syn 및 형광 마이크로스피어를 이용하여 2시간 동안 배양한 이후의 식균작용 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4의 D 및 E는 BV-2 세포 및 래트 일차 미세아교세포를 SHP-1의 저해제인 20 μM의 NSC87877로 30분 동안 미리 배양한 후, 1 μM의 응집된 α-syn 및 형광 마이크로스피어를 이용하여 12시간 동안 배양한 이후의 식균작용 활성을 보여주는 그래프이다. ** P < 0.01은 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 응집된 α-syn과 특별히 상호작용하는 FcγRIIB를 나타내는 이미지이다.
도 5의 A는 COS-7 세포 내에서 FcγRIIB, FcγRI 및 SIRPα가 발현하는 위치를 나타내는 이미지이다. COS-7 세포를 myc으로 표지된 FcγRIIB, FcγRI 및 SIRPα로 형질주입한 후, 하루 동안 배양하였다. 이후, 1 μM의 응집된 α-syn과 함께 30분 동안 배양하였고, 항-myc 항체(초록색) 및 항-syn 항체(빨간색)로 면역염색하였다. 이후, 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 세포를 관찰하였다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.
도 5의 B는 응집된 α-syn 또는 단량체 α-syn가 어느 단백질과 상호작용하는지 확인하고자 수행한 공동-면역침전(Co-Immunoprecipitation) 어세이의 결과를 나타내는 이미지이다. COS-7 세포를 myc으로 표지된 FcγRIIB, FcγRI으로 형질주입한 후, 하루 동안 배양하였다. 이후, 1 μM의 및 응집된 α-syn 또는 단량체 α-syn로 30분 동안 배양하였고, 항-myc 항체 및 항-syn 항체를 이용하여 면역침전을 수행하였다. 별표(*)는 IgG(Immunoglobulin G)의 중쇄(heavy chain)를 가리킨다.
도 6은 FcγRIIB 발현 억제는 응집된 α-syn에 의한 미세아교세포의 식균작용 억제 영향으로부터 회복시킨다는 것을 보여주는 이미지 및 그래프이다.
도 6의 A는 대조군(con), 정상 비교군(non-targeting; NT), FcγRIIB 발현억제(Knock-down; KD) #1 및 #2의 BV-2 세포를 용해하여 FcγRIIB에 대해 웨스턴블롯을 수행한 이미지이다.
도 6의 B는 상기 세포를 1 μM의 응집된 α-syn 및 형광 마이크로스피어와 함께 12시간 동안 배양한 후, 식균작용 활성을 분석한 그래프이다.
도 6의 C는 상기 세포를 1 μM의 응집된 α-syn로 30분 동안 배양한 후, 고정하여 비-투과적 조건에서 항-α-syn 항체(빨간색)로 면역염색한 이미지이다. 세포를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.
도 6의 D는 상기 세포를 1 μM의 응집된 α-syn로 5분 동안 배양한 뒤, 용해하여 웨스턴블롯을 수행한 결과를 나타내는 이미지와 그래프이다. ** P < 0.01은 PBS와 응집된 α-syn와 비교한 결과를 나타낸다.
도 6의 E는 BV-2 세포를 1 μM의 응집된 α-syn로, 도 6의 F는 BV-2 세포를 1 μM의 단량체 α-syn로 6시간 동안 배양한 뒤, FcγRIIB 검출을 위하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6의 G는 BV-2 세포를 1 μM의 응집된 α-syn로 12시간 동안 배양한 후, 웨스턴블롯을 수행한 결과를 나타내는 이미지 및 그래프이다. * P < 0.05, ** P < 0.01는 PBS와 비교한 결과를 나타낸다.
도 6의 H는 야생형 WT 및 A53T TG 마우스의 전체 뇌 용해물을 이용하여 FcγRIIB 검출을 위한 웨스턴블롯을 수행한 결과를 나타내는 이미지 및 그래프이다. * P < 0.05는 야생형 WT과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 인산화를 통해 활성화된 SHP-1가 응집된 α-syn의 인접 세포로의 전이에 관여한다는 것을 보여주는 이미지이다. 스케일바는 20 ㎛를 나타내고, 빨간색은 전이된 α-syn, 파란색은 세포내 DNA를 나타낸다.
도 7의 A와 D는 SHP-1 발현이 억제된 BV2에서 α-syn의 전이가 감소되어있음을 확인한 이미지와 그래프이다. 스케일바는 20 ㎛를 나타내며, *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7의 B와 E는 SHP-1/2의 저해제 NSC87877을 처리한 결과 α-syn의 전이가 감소되어있음을 보여준 이미지와 그래프이다. *** P < 0.001는 PBS처리한 군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7의 C와 F는 래트 미세아교세포에서 SHP-1/2의 저해제 NSC87877을 처리한 결과 α-syn의 전이가 감소되어있음을 재확인한 이미지와 그래프이다. 스케일바는 20 ㎛를 나타내며, *** P < 0.001는 PBS을 처리한 군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7의 G는도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y에서, 응집된 α-syn에 의한 SHP-1에 대한 웨스턴블롯을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 7의 H와 J는 SHP-1을 발현억제시킨 2개의 SH-SY5Y 세포주(SHP-1 KD1, SHP-1 KD2)를 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y에 α-syn을 과발현시킨 것과 공동배양하였을 때, 상기 SHP-1 KD1, SHP-1 KD2 세포주에서 응집된 α-syn의 전이가 감소됨을 보여주는 이미지와 그래프이다. *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7의 I와 K는 SH-SY5Y 세포주에 SHP-1,2의 저해제인 NSC87877을 처리한 결과, SHP-1 발현억제 세포주에서와 유사하게 응집된 α-syn의 전이가 감소됨을 관찰한 이미지와 그래프이다. *** P < 0.001는 PBS처리한 군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7의 L은 SHP-1의 발현이 억제된 OLN 93 세포주를 SHP-1에 대한 웨스턴 블롯으로 확인한 이미지이다.
도 7의 M와 O는 SHP-1이 발현이 억제된 OLN 93세포주에서 α-syn의 전이가 감소되었다라는 것을 확인한 이미지와 그래프이다. 스케일바는 20 ㎛를 나타내며, *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 7의 N와 P는 OLN 93세포주에서 SHP-1/2의 저해제인 NSC87877을 처리한뒤에 α-syn의 전이가 감소됨을 보여주는 이미지와 그래프이다. *** P < 0.001는 PBS처리한 군과 비교한 결과를 나타낸다.
도 8은 신경세포의 세포막에 응집된 α-syn이 결합할 수 있는 수용체가 존재하며, 상기 수용체를 통해 신호가 전달됨을 예측할 수 있다는 것을 보여주는 이미지이다.
도 8의 A는 인간 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y와 인간 신장세포주인 HEK293 세포에 응집된 α-syn을 처리한 후, 면역염색을 수행함으로써 응집된 α-syn을 관찰한 이미지이다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다. 빨간색은 α-syn를 가리키며, 파란색은 DNA를 가리킨다.
도 8의 B는 인간 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y에서, 응집된 α-syn에 의한 SHP-1의 인산화 수준을 조사하기 위해 웨스턴블롯을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 8의 C는 래트 신경세포에서 응집된 α-syn에 의해 SHP-1과 SHP-2의 인산화가 증가됨을 확인한 이미지이다.
도 8의 D는 분화된 SHSY5Y와 미 분화된 SHSY5Y세포주에서 응집된 α-syn에 의해서 증가된 SHP-1/2의 인산화를 확인한 이미지이다.
도 8의 E와 F는 A53T α-syn TG마우스의 전체 뇌 용해물에서도 SHP-2의 인산화가 증가되어있는 것을 확인한 이미지와 그래프이다. *** P < 0.001는 야생형 WT 마우스와 비교한 결과를 나타낸다.
도 9는 α-syn에 의해 나타나는 신경세포독성에 대한 SHP-1의 영향을 보여주는 이미지 및 그래프이다.
도 9의 A는 대조군 미분화 SH-SY5Y 세포 및 레티노산(retinoic acid)으로 5일간 분화를 시킨 분화 SH-SY5Y 세포에 대한 응집된 α-syn의 세포독성을 보여주는 이미지 및 상기 세포독성을 수치화하여 보여주는 그래프이다.
도 9의 B는 미분화 SH-SY5Y 세포 및 분화 SH-SY5Y 세포에서, 응집된 α-syn의 세포독성에 대한 SHP-1/2의 저해제인 NSC87877의 영향을 보여주는 그래프이다.
도 9의 C와 D는 분화된 SHSY5Y세포에서 응집된 α-syn의 세포독성에 대한 SHP-1/2의 저해제인 NSC87877의 영향을 보여주는 사진과 그래프이다. ** P < 0.01는 PBS을 처리한 SHSY5Y과 비교한 결과를 나타낸다.
도 9의 E와 F는 SHP-1의 발현을 억제시킨 SHSY5Y세포주를 분화시킨 상황에서 응집된 α-syn의 세포독성에 대한 사진과 그래프이다. 스케일바는 100 ㎛를 나타내며, ** P < 0.01는 NT SHSY5Y과 비교한 결과를 나타낸다.
도 10은 α-syn의 전이과정에서 SHP-1의 활성화가 영향을 미치는지를 보여주는 면역염색 이미지와 그래프이다. α-syn을 과발현시킨 SH-SY5Y 세포와 eGFP을 표지한 SHP-1 및 SHP-2의 mutant form을 과발현시킨 SH-SY5Y 세포 또는 cos7 세포를 two chamber 시스템을 이용하여 12시간 동안 배양하였다. 이후, SH-SY5Y 세포에서 분비된 α-syn이 eGFP을 표지한 SHP-1그리고 SHP-2의 mutant form을 과발현시킨 세포 내로 이동함을 확인하기 위해 알파-시누클레인 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 빨간색은 전이된 α-syn를 가리키며, 파란색은 DNA를 녹색은 SHP-1/2의 mutant form이 과발현됨을 가리킨다. Con은 SHP-1/2의 mutant form이 과발현 되지 않은 대조군 SH-SY5Y 세포를 나타낸다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.
도 11은 단량체 α-syn이 응집체가 되는 변성과정에서 SHP-1/2의 저해제인 NSC87877이 억제의 효과를 보이는지를 확인한 이미지이다. eGPF로 표지한 A53T α-syn을 과발현 한 SHSY5Y를 나타내고 있다.
도 11의 A는 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y만 레티노산(retinoic acid)으로 5일간 분화를 시킨뒤 공초점 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 11의 B는 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y와 α-syn이 과발현된 SHSY5Y을 같이 coculture하는데, 레티노산(retinoic acid)으로 5일간 분화를 시킨뒤 공초점 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 11의 C는 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y와 α-syn이 과발현된 SHSY5Y을 SHP-1/2의 저해제인 NSC87877을 친 상황에서 같이 coculture하는데, 레티노산(retinoic acid)으로 5일간 분화를 시킨뒤 공초점 현미경으로 관찰한 이미지이다. 스케일바는 20 ㎛를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미세아교세포의 식균작용 활성을 용량-의존적인 방법으로 억제하는 응집된 α- syn

실시예 1-1. 미세아교세포의 식균작용 활성에 대한 응집된 α - syn의 영향 분석

재조합 α-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn) 및 응집된 α-syn을 준비하였다. 재조합 α-Syn을 대장균주 BL21(DE3)에서 과발현시키고, 상기 재조합 단백질을 공지된 방법으로 정제하였다(Lee, S. B., et al., 2009. Biochem Biophys Res Commun. 381, 39-43.). 정제한 α-Syn 단백질을 단량체 α-Syn로서 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 2 ㎎/㎖의 단량체 α-syn을 37℃에서 250 rpm으로 연속적인 교반을 하면서 2주 동안 배양하였고, 간단하게 초음파 처리하여 분해한 후, 응집된 α-syn로서 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 본 발명의 모든 실시예에서 상기 제조한, 응집된 α-syn을 사용하였다.

또한, 마우스 미세아교세포주인 BV-2 세포를 5% FBS(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM(Dulbeco’s modified Eagle’s Medium)에 접종하고, 37℃의 5% CO₂의 가습 배양기에서 배양하였다. 래트(rat) 일차 미세아교세포(microglia)는 태어난 지 1일 된 Sprague-Dawley 래트의 대뇌겉질(cerebral cortices)에서 분리하여 기존 문헌(Kim, K. S., et al., 2012. J Biol Chem. 287, 24862-72.)에 기재된 바에 따라 배양하였다.

미세아교세포의 식균작용 활성에 대하여 응집된 α-syn의 영향을 조사하기 위해, 먼저, 마우스 미세아교 세포주인 BV-2 세포에 단계적 농도의 응집된 α-syn 및 형광 마이크로스피어(microsphere)를 12시간 동안 처리하였고, 하기의 실험 방법으로 식균작용의 활성을 공지된 방법으로 조사하였다(Park, J. Y., et al., 2008. Glia. 56, 1215-23.).

간단하게 서술하면, BV-2 세포(웰당 5 x 10⁴ 세포)를 12웰 플레이트에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 5% FBS가 포함된 새로운 DMEM으로 교체하였다. 세포당 100개의 초록색을 띠는 형광 마이크로스피어(microspheres) 및 단계적 농도의 응집된 α-syn을 세포에 첨가하였고, 2시간 또는 12시간 동안 배양하였다. 세포를 차가운 PBS(phosphate buffered saline)로 세 번 세척하여 형광 마이크로스피어 표면에 부착된 남아있는 세포를 제거하였다. 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하였고, DAPI 염색을 통해 DNA를 염색하였고, 염색된 DNA는 파란색을 나타낸다. 세포(>100 세포)에서 임의적인 다섯 부분을 공초점 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 수를 세었다. 식세포의 비율(percentage)을 공지된 방법으로 분석하였다(Park, J. Y., et al., 2008. Glia. 56, 1215-23.). 즉, 세포 생존능 어세이를 위해, BV-2 세포를 1 μM의 응집된 α-syn로 12시간 동안 처리하였고, LDH 방출을 LDH-세포독성 어세이 키트(Biovision, CA, USA)를 이용하여 제조자의 설명에 따라 측정하였다.

상기 식균작용 어세이를 통해, 도 1의 A 및 B에 도시한 바와 같이, 응집된 α-syn은 용량 의존적인 방법으로 BV-2 세포의 식균작용 활성을 억제하였고, 이 영향은 세포의 생존율을 감소시킴으로써 나타나는 것이 아님을 확인하였다(도 1의 C). 래트 일차 미세아교세포에서도 동일한 영향이 관찰됨을 확인하였고(도 1의 D), 상기 결과는 본 발명자들의 이전 연구(Park, J. Y., et al., 2008. Glia. 56, 1215-23.) 내용과 일치함을 확인하였다.

실시예 1-2. 미세아교세포의 식세포작용을 억제하는 α- syn의 형태 분석

α-syn의 어떠한 형태가 미세아교세포의 식세포작용 활성을 억제하는지 조사하고자, 본 발병자들은 배양의 서로 다른 시간 지점에서 α-syn을 획득하였고, α-syn의 응집 상태는 공지된 방법인 티오플라빈(thioflavin) T 결합 어세이(Park, J. Y., et al., 2008. Glia. 56, 1215-23.) 및 전자 현미경(electron microscopy)을 통해 관찰하여 확인하였다.

간단하게 서술하면, α-syn을 배양하는 동안 적은 양의 분획을 수득하였고, 5X 어세이 버퍼(250 mM 글리신, pH 8.5)안에 든 20 μM의 티오플라빈 T와 혼합하여 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 이후, 형광을 들뜬상태인 446 nm와 함께 482 nm에서 측정하였다(PerkinElmer Vitor3). 나아가, 응집된 α-syn의 20 ㎕ 분획물을 탄소가 코팅된 구리 그리드(grid)위에 흡수시켰고, 20분 동안 자연건조 하였다. 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 1분간 음성(negative) 염색한 후, 응집된 α-syn을 전자 현미경(EM902A, Zeiss, Germany)으로 관찰한 결과, 새로 제조된 단량체 및 응집된 α-syn은 -80℃에서 저장된 단량체 및 응집된 α-syn과 서로 다른 점이 없음을 확인하였다.

상기 어세이 및 현미경으로 관찰한 결과에 의하면, 도 1의 E에서 보듯이, α-syn에 티오플라빈(thioflavin) T 결합은 배양 2일부터 급격히 증가하였고, 6일째에 어느 정도 안정기에 도달하였다(도 1의 E). 전자 현미경 분석을 통해, 2일 동안 배양한 α-syn은 올리고머 형태가 우세하다는 것을 확인하였고, 3일 동안 배양한 α-syn은 여전히 α-syn의 올리고머 형태가 관찰되기는 하였지만, 그래도 섬유 형태라는 것을 확인하였다. 그리고 14일 동안 배양한 α-syn에서는 섬유형태의 α-syn으로만 존재하는 것을 확인하였다(도 1의 F). 본 발명의 조건에서는, 응집된 α-syn은 α-syn의 섬유 형태의 α-syn이라는 것을 이 결과를 통해 알 수 있었다.

다음으로, 서로 다른 시간 지점에서 획득한 α-syn의 단량체 형태 또는 응집된 형태를 이용하여 식균작용 어세이를 수행하였다. 본 발명자들의 이전 연구에서, 2시간 동안 배양한 형광 마이크로스피어에서 수행한 식균작용 어세이 결과는 미세아교세포의 식균작용 활성에 대한 단량체 α-syn의 통계적으로 유의한 활성을 보여주었지만, 미세아교세포의 식균작용 활성에 대한 응집된 α-syn의 억제 영향을 보여주지는 않았다. 하지만, 본 발명에서는, 12시간 동안 배양한 형광 마이크로스피어에서 수행한 식균작용 어세이가 통계적으로 유의한 응집된 α-syn의 억제 영향을 보여주었으며, 상기 결과는 식균작용 어세이의 민감도 때문이라고 추측된다. 따라서, 본 발명자들은 2개의 서로 다른 시간 지점에서 식균작용 어세이를 수행하였다.

도 1의 G 및 H에서 볼 수 있듯이, 단량체 α-syn은 미세아교세포 식균작용 활성을 증가시켰다. 하지만, 응집된 α-syn을 준비하는 배양시간이 증가함에 따라, α-syn은 미세아교세포 식균작용 활성을 억제하였다. 상기 결과는 미세아교세포 식균작용 활성에 대한 응집된 α-syn의 억제 영향은 섬유 형태의 α-syn에 의해 주로 발휘된다는 것을 의미한다.

종합하면, 상기 실시예 1을 통해, 단량체 α-syn은 미세아교세포의 식균작용 활성을 증가시키지만, 섬유 형태의 응집된 α-syn은 용량 의존적인 방법으로 미세아교세포의 식균작용 활성을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 2. 응집된 α- syn에 의해 억제되는 면역 복합체(Immune Complexes; ICs)-유도 식균작용

실시예 2-1. 면역 복합체(Immune Complexes; ICs)-유도 식균작용에 대한 응집된 α - syn의 영향 분석

미세아교세포의 식균작용 활성을 억제하는 응집된 α-syn의 분자적 메커니즘을 조사하기 위해, 본 발명자들은 상대적으로 신호전달경로가 잘 연구되어 있는 면역 복합체(Immune Complexes; ICs)-유도 식균작용을 이용하였다.

ICs를 제작하기 위하여 일반 마우스 IgG(Abcam, ab37355) 및 친화성-정제 래트 항-마우스 IgG Ab(Sigma, M8642)를 1:100의 비율로 30분 동안 반응시켰다.

이후, 실시예 1에서 수행한 방법과 같은 식균작용 어세이를 BV-2 세포 및 래트 일차 미세아교세포에서 수행하였다.

도 2의 A에서 볼 수 있듯이, BV-2 세포에서 ICs는 식균작용을 유도하였고, 응집된 α-syn은 용량-의존적인 방법으로 ICs-유도 식균작용을 억제하였다. 비슷한 영향을 래트(rat) 일차 미세아교세포에서도 확인하였다(도 2의 B).

이후, 본 발명자들은 도 2의 C에 나타낸 바와 같이, 미세아교세포의 식균작용 활성에 대한 서로 다른 시간의 지점에서 응집된 α-syn의 영향을 조사하고자, 실시예 1에서 수행한 방법과 같은 식균작용 어세이를 수행하였다.

상기 어세이를 통해, BV-2 세포에서는 ICs 자극 전, 및 ICs 자극 30분 후에 응집된 α-syn을 처리하는 것은 ICs-유도 식균작용 활성을 억제하였지만, ICs 자극 1시간 후에 α-syn을 처리하는 것은 ICs-유도 식균작용 활성을 억제하지 않음을 확인하였다(도 2의 D). 비슷한 영향을 일차 미세아교세포에서도 확인하였다(도 2의 E). 상기 결과를 통해, ICs-유도 식균작용 활성에 대한 응집된 α-syn의 억제 영향은 ICs-유도 신호전달 경로의 초기 단계에 야기된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2-2. 면역 복합체(Immune Complexes; ICs) 및 α- syn의 미세아교세포 내의 위치 분석

다음으로, 본 발명자들은 응집된 α-syn 및 ICs의 BV-2 세포내에서의 위치를 확인하고자 항-마우스 IgG 항체(초록색)가 접합된 Alexa 568 및 항-α-syn 항체(빨간색)가 접합된 Alexa 488을 이용하여 면역염색하였고, 공초점 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 분석하였다.

공초점 현미경을 이용하여 분석하기 위해, 커버슬립 위에 배양하였던 BV-2 세포를 PBS를 이용하여 세 번 세척하고, 4% 포름알데히드로 고정하였다. 고정한 세포를 PBS를 이용하여 여러 번 세척하고, 투과 버퍼(PBS containing 0.1% Triton X-100)가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 1분 동안 실온으로 배양하였다. 이후, 4℃에서 밤새 마우스 IgG 항체 및 α-syn 항체로 배양하였다. 준비한 세포를 Alexa 488 또는 Alexa 568-접합된 이차 항체(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 이용하여 2시간 동안 염색한 후, DNA를 10분 동안의 DAPI 염색을 통해 파란색으로 염색하였다. 상기 세포를 마운트(mount)하고, 공초점 현미경으로 관찰하였다.

관찰한 결과로서, 무리를 이룬 형식으로 원형질막에 결합한 응집된 α-syn은 본 발명자들의 이전 연구 결과와 일치하였고, 상기 병합된 이미지를 통해 응집된 α-syn의 일부분이 ICs와 동일한 곳에 위치한다는 것을 확인하였다(도 2의 F).

실시예 2-3. 미세아교세포의 식균작용 수용체 및 α- syn와의 연관관계 분석

식균작용은 리간드 및 특정한 수용체(대식세포에서 발현되는 Fc 수용체 및 보체 수용체 등)와의 상호작용을 통해 촉발된다. 특히, FcγRs 수용체에 의해 유도되는 식균작용은 IgG-opsonized immune complexes(ICs)에 의한 상기 수용체의 군집형성에 의해 시작되며, 식균작용 활성을 향상시키기 위한 신호를 전달한다는 사실이 공지되어 있다(Cox and Greenberg, 2001; Garcia-Garcia and Rosales, 2002). 그러한 이유로 응집된 α-syn이 원형질막에서 FcγRs와 결합한 ICs을 방해하는지 확인하고자, 본 발명자들은 응집된 α-syn이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 ICs을 염색하였다.

도 2의 G에서 보듯이, 응집된 α-syn는 원형질막에 결합하는 ICs를 방해하지 않음을 확인하였고, 상기 결과는 미세아교세포의 식균작용 활성에 대한 응집된 α-syn의 억제 영향은 FcγRs에 대한 ICs의 결합을 방해하는 것 때문이 아니라는 것을 암시한다.

종합하면, 상기 실시예 2를 통해, 응집된 α-syn에 의한 식균작용의 활성 억제 효과는 ICs-유도 신호전달 경로의 초기 단계에서 결정되고, 원형질막에 결합한 응집된 α-syn은 ICs와 동일한 곳에 위치함에도 불구하고, ICs와 FcγRs 수용체의 결합을 방해하지 않았으므로, 미세아교세포의 식균작용 활성을 억제하는 응집된 α-syn의 작용은 FcγRs에 대한 ICs의 결합을 방해하는 것 때문이 아님을 알 수 있었다.

실시예 3. SHP -1 활성화에 의한 ICs-유도 신호전달 경로를 억제하는 응집된 α-syn

실시예 3-1. 식균작용 신호전달 하위경로의 단백질들의 활성에 대한 응집된 α -syn의 영향 분석

ICs는 원형질막에서 FcγRs의 상호결합을 통해 식균작용을 유도하고, Syk 및 추가의 PLC-γ의 활성화를 야기하며, 식균작용을 유도하기 위한 추가적인 하위 신호전달경로를 촉발한다는 연구 결과가 공지되었다(Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V., 2008. Nat Rev Immunol. 8, 34-47.). 따라서, ICs-FcγRs 수준에서의 응집된 α-syn에 의해 억제되는 신호전달경로를 조사하기 위해, 우선, 본 발명자들은 BV-2 세포 및 래트 일차 미세아교세포에서, 식균작용 신호전달 하위경로의 단백질들의 활성을 웨스턴블롯을 통해 평가하였다.

웨스턴블롯을 수행하기 위하여 각 세포를 단백질 억제제(2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 100 ㎍/ml leupeptin, 10 ㎍/ml pepstatin, 1 ㎍/ml aprotinin 및 2 mM EDTA) 및 포스파타아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, Baker, TX)이 포함된 차가운 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl)로 용해하였다. 초음파처리를 통해 세포를 용해한 후, 용해물을 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였고, 상층액을 수득하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트를 이용하여 측정하였다. 단백질들을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 전이시킨 후, pSyk, Syk pPLCγ, PLCγ, pSHP-1, SHP-1, pSHP-2, SHP-2, p-α-syn, α-syn 및 액틴에 대한 항체를 및 향상된 ECL(chemiluminescence) 시스템(Thermo, Waltham, MA)을 이용하여 상기 단백질을 가시화하였다.

도 3의 A에서 볼 수 있듯이, ICs는 BV-2 세포에서 Syk 및 PLCγ의 인산화를 유도하였다. 하지만, 응집된 α-syn은 Syk 및 PLCγ의 ICs-유도 인산화를 억제하였고, 상기 결과는 Syk 활성화의 ICs-유도 상위 신호전달경로를 억제한다는 것을 암시한다. 한편, ICs-FcγRs 신호전달경로는 SHP-1 및 SHP-2 같은 여러 포스파타아제(phosphatase)의 소집(recruitment)에 의해 억제된다는 연구 결과가 공지되어 있다(Scharenberg, A. M., Kinet, J. P., 1996. Cell. 87, 961-4.). 상기 연구 결과와 일치하게, 본 발명의 응집된 α-syn은 ICs-자극 및 휴지(resting) 조건 모두에서 SHP-1의 인산화를 유도하였다(도 3의 B). BV-2 세포에서 확인한 비슷한 영향을 일차 미세아교세포에서도 확인하였다(도 3의 C). 반면에, 단량체 α-syn는 SHP-1의 인산화를 유도하지 않았고(도 3의 D), BV-2 세포에서 응집된 α-syn에 의한 SHP-2의 인산화도 거의 유도되지 않았다(도 3의 E).

실시예 3-2. 식균작용 신호전달 하위경로의 단백질들 및 응집된 α- syn의 미세아교세포 내의 위치 분석

식균작용의 신호전달 경로와 관련 있는 상기 단백질들이 미세아교세포 내에서 위치하는 곳을 조사하기 위하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 초록색의 항-SHP-1 항체 및 빨간색의 항-α-syn 항체를 이용하여 면역염색을 수행한 후, 공초점 현미경을 통해 관찰하였다.

공초점 현미경을 통한 분석은 BV-2 세포에서 응집된 α-syn이 SHP-1의 원형질막으로의 위치이동을 유도하고, 원형질막으로 이동한 SHP-1는 응집된 α-syn와 동일한 곳에 위치한다는 것을 암시하며(도 3의 F), 상기 영향은 일차 미세아교세포에서도 동일함을 확인하였다(도 3의 G).

실시예 3-3. 뇌 전체 수준에서의 SHP -1의 인산화 상태에 대한 α- syn의 영향 분석

나아가, 세포 수준이 아닌, 9개월령의 A53T 이형접합 형질전환 마우스의 전체 뇌 용해물에서, SHP-1의 인산화 상태를 조사하였다. 뇌 용해물은 하기와 같은 방법으로 수득하였다.

9개월령 된 C57BL6 A53T α-syn 이형 형질전환 마우스 및 대조군 C57BL6 마우스로부터 기존 문헌(Lee, H. J., et al., 2011. Exp Neurobiol. 20, 181-8.)에 기재된 바에 따라 뇌를 획득하였다. 두뇌 반구를 단백질 억제제 및 포스파타아제 억제제 칵테일이 포함된 600 ㎕의 차가운 RIPA 버퍼 안에 넣고 균질화하였다. 용해물을 4℃에서 30분 동안 배양하였고, 상기 용해물을 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 획득하여 웨스턴블롯을 수행하였다.

그 결과, SHP-1의 인산화 상태인 pSHP-1의 수준은 야생형 WT(wild type) 마우스의 전체 뇌 용해물의 pSHP-1의 수준에 비해 9개월령의 A53T 이형접합 형질전환 마우스의 전체 뇌 용해물에서 증가함을 확인하였다(도 3의 H). 상기 결과를 통해 응집된 α-syn이 SHP-1을 활성화하고, 활성화된 SHP-1을 원형질막으로 위치를 이동(recruitment)시킴으로써 ICs-FcγRs 신호전달 경로를 억제함을 알 수 있었다.

종합하면, 상기 실시예 3을 통해, 응집된 α-syn은 Syk 활성화의 ICs-유도 상위 신호전달경로를 억제하고, 응집된 α-syn이 SHP-1을 활성화시키며, 활성화된 SHP-1을 원형질막으로 이동시킴으로써 ICs-FcγRs 신호전달 경로를 억제함을 알 수 있었다.

실시예 4. 응집된 α- syn에 의한 미세아교세포 식균작용 활성을 억제하는데 필수적인 SHP -1

실시예 4-1. SHP -1 발현억제(knockdown; KD) 미세아교세포주의 식균작용 활성에 대한 응집된 α -syn의 영향 분석

응집된 α-syn에 의한 미세아교세포 식균작용 활성을 억제하는데 SHP-1의 역할을 확인하기 위해, SHP-1 발현억제(knockdown; KD) BV-2 세포주를 하기와 같은 방법으로 제작하여 식균작용 어세이에 이용하였다.

형질주입을 위한 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하였으며, SHP-1 발현억제(knockdown; KD) BV-2 세포주를 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 구성체(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 공지된 방법으로 제조하였다. FcγRⅡB발현억제(knockdown; KD) BV-2 세포주 역시 ShRNA을 발현하는 렌티바이러스 구성체를 이용하여 FcγRⅡB 발현억제 BV-2 제조하였고(Yoon, S., et al., 2014. Cell Death Dis. 5, e1494.), 퓨로마이신(puromycin)을 이용하여 선발하였다.

또한, 상기 제조한 SHP-1 발현억제 BV-2 세포주에서 SHP-1의 발현양을 SHP-1 항체를 이용하여 상기 실시예 3에서 수행한 방법과 같은 웨스턴블롯을 통해 조사하였고, 그 결과, 제조한 SHP-1 발현억제 BV-2 세포주에서 SHP-1의 발현이 효율적으로 감소함을 확인하였다(도 4의 A). 도 4의 B에서 볼 수 있듯이, 응집된 α-syn은 정상 비교군으로서 사용한 타겟하지 않은(non-targeting; NT) shRNA으로 제조된 BV-2 세포주에서 식균작용 활성을 효율적으로 억제하였지만, SHP-1 KD BV-2 세포의 식세포작용을 억제하지는 않았고, 응집된 α-syn에 의해 억제되었던 ICs-유도 식균작용 활성 또한 SHP-1 KD BV-2 세포에서 회복됨을 확인하였다(도 4의 C).

실시예 4-2. 응집된 α- syn에 의해 억제된 미세아교세포주의 식균작용 활성에 대한 SHP-1의 저해제의 영향 분석

나아가, 본 발명자들은 BV-2 세포 및 일차 미세아교세포에 SHP-1의 발현을 억제하는 저해제인 NSC87877을 처리하였고, 실시예 1에서 수행한 방법과 같은 식균작용 어세이를 수행하였다.

도 4의 D 및 E에서 볼 수 있듯이, NSC87877에 의한 SHP-1의 억제는 미세아교세포 식균작용 활성에 대한 응집된 α-syn의 억제 영향에서 효율적으로 회복되었고, 상기 결과는 응집된 α-syn에 의한 SHP-1 활성화가 응집된 α-syn에 의한 미세아교세포 식균작용 활성의 억제에 필수적이라는 것을 암시한다.

종합하면, 상기 실시예 4를 통해, SHP-1의 발현이 억제된 미세아교세포에서는 응집된 α-syn을 처리하여도, 상기 세포의 식세포작용 활성을 억제하지 않았고, SHP-1의 저해제인 NSC87877은 응집된 α-syn에 의해 감소한 미세아교세포의 식균작용 활성을 효율적으로 회복시킨다는 것을 확인하였다. 이를 통해, 응집된 α-syn에 의한 미세아교세포의 식균작용 활성의 억제에는 응집된 α-syn에 의해 활성화된 SHP-1이 필수적임을 알 수 있었다.

실시예 5. FcγRⅡB와 상호작용함으로써 SHP -1을 활성화시키는 응집된 α-syn

실시예 5-1. 섬유세포주 COS- 7세포에서의 FcγR ⅡB 및 응집된 α- syn과의 연관관계 분석

다음으로, FcγRⅡB가 ICs-FcγRs 신호전달경로를 억제하는 저해 수용체라는 것이 공지되어 있었기 때문에(Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V., 2006. Immunity. 24, 19-28.), 본 발명자들은 FcγRⅡB에 주목하였다. BV-2 세포로부터 획득한 cDNA를 이용하여 PCR을 통해 pCDNA3.1(-) myc.His murine FcγRⅡB, FcγRI, 및 SIRPα의 유전자 벡터를 제조하였고, COS-7 세포에 형질주입하였다. 상시 실시예에서 확인한 바에 따르면, 외인성으로 첨가된 응집된 α-syn은 대부분 미세아교세포의 원형질막에 위치하였다(도 2의 G). 따라서, 응집된 α-syn에 의한 세포 내의 SHP-1 활성은 원형질막의 특정 요소에 의해 매개될 것이라고 가정하였다. 미세아교세포의 원형질막에 존재하는 매개자를 확인하기 위해, 본 발명자들은 우선 원숭이 신장(kidney) 조직에서 유래한 섬유세포주인 COS-7 세포, 즉 미세아교세포가 아닌 세포에 응집된 α-syn을 처리하고, 원형질 막에 결합하는지를 확인하고 더 나아가 세포 내에서 FcγRⅡB, FcγRI, 및 SIRPα가 발현하는 상황에서 응집된 α-syn이 원형질막에 결합하는지를 조사하고자 실시예 3과 동일한 면역염색을 수행하였다. COS-7 세포를 myc으로 표지된 FcγRIIB, FcγRI 및 SIRPα로 형질주입한 후, 하루 동안 배양하였다. 이후, 1 μM의 응집된 α-syn과 함께 30분 배양하였고, 고정하여 항-myc 항체(초록색) 및 항-syn 항체(빨간색)으로 면역염색하였다. 이후, 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 세포를 관찰하였다.

그 결과, 응집된 α-syn은 COS-7 세포의 원형질막에 결합하지 않았고, FcγRIIB가 발현하는 COS-7 세포에서만 응집된 α-syn이 원형질막에 결합하였고, 나머지 FcγRI 및 SIRPα이 발현하는 COS-7세포의 원형질막에는 결합하지 않았다(도 5의 A).

상기 결과를 통해 응집된 α-syn은 COS-7 세포가 아닌, 미세아교세포의 원형질막의 특정 요소에 결합한다는 것을 알 수 있었다.

응집된 α-syn이 어느 단백질과 상호작용하는지 조사하고자, 공동-면역침전(Co-Immunoprecipitation) 어세이를 수행하였다. COS-7 세포를 myc으로 표지된 FcγRIIB, FcγRI으로 형질주입하고, 하루 동안 배양한 이후, 1 μM의 및 응집된 α-syn 또는 단량체 α-syn로 30분 동안 배양하였다. 각 세포의 상층액 500㎍을 4℃에서 밤새 1 ㎍의 myc 항체 및 α-syn 항체와 배양하였다. 이후, 단백질 G-Agarose(Millipore, Temecula, CA)에 흡수시켰다. 차가운 RIPA 버퍼로 광범위하게 세척한 후, 각 샘플들을 2x SDS-PAGE 샘플 퍼버에 두어 5분 동안 열을 가하고, SDS-PAGE 젤에서 젤 전기영동을 한 이후, 웨스턴블롯(Western blot)을 수행하였다.

상기 어세이 결과를 통해, 응집된 α-syn이 FcγRI가 아닌, FcγRⅡB와 상호작용한다는 것을 확인하였고, 단량체 α-syn은 FcγRⅡB와 상호작용하지 않는다는 것을 확인하였다(도 5의 B). 상기 결과는 FcγRⅡB는 미세아교세포 식균작용 활성을 억제하는 응집된 α-syn의 특정한 수용체라는 것을 암시한다.

실시예 5-2. 미세아교세포주에서의 FcγR ⅡB 및 응집된 α- syn과의 연관관계 분석

응집된 α-syn에 의한 미세아교세포 식균작용 활성의 조절과 FcγRⅡB의 상기 연관성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 FcγRⅡB의 발현이 감소된 2개의 다른 FcγRⅡB KD BV-2 세포주를 사용하여 FcγRⅡB의 발현양을 조사하였다.

실시예 3에서 수행한 동일한 방법의 웨스턴블롯으로 조사한 결과, FcγRⅡB 발현은 2개의 다른 FcγRⅡB KD BV-2 세포주에서 효율적으로 억제됨을 확인하였다(도 6의 A).

또한, 실시예 1에서 수행한 동일한 방법의 식균작용 어세이를 통해 조사한 결과, 도 6의 B에서 보듯이, 응집된 α-syn은 대조군(con) 및 정상 비교군(Non-targeting; NT) BV-2 세포주에서 미세아교세포 식균작용 활성을 효율적으로 억제하지만, 2개의 다른 FcγRⅡB KD BV-2 세포주에서는 식균작용 활성을 억제하지 않음을 확인하였다.

덧붙여, 실시예 2에서 수행한 동일한 방법의 면역염색을 통해 조사한 결과,응집된 α-syn은 대조군(con) 및 정상 비교군(NT) BV-2 세포주보다 FcγRⅡB KD BV-2 세포주의 원형질막에 덜 효율적으로 결합함을 확인하였다(도 6의 C). 상기 FcγRⅡB KD BV-2 세포주에서는 응집된 α-syn에 의해 유도되는 SHP-1의 인산화 또한 억제됨을 웨스턴블롯을 통해 확인하였다(도 6의 D). 상기 결과를 통해, 응집된 α-syn은 FcγRⅡB를 통한 SHP-1 활성화에 의해 미세아교세포 식균작용 활성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

본 발명자들은 1 μM의 응집된 α-syn 및 1 μM의 단량체 α-syn로 6시간 동안 배양한 BV-2세포에서, FcγRIIB의 발현양을 정량적 실시간 RT-PCR을 통해 조사하였다.

BV-2 세포(웰당 2 내지 3 x 10⁵세포)를 6웰 플레이트에 두고, 1μM α-syn을 처리하였다. 세포로부터 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 토탈(total) RNA를 추출하고, 조류 골수아세포 역전사효소(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 제조자의 설명에 따라 cDNA를 준비하였다. cDNA 샘플을 Rotor-Gene cyclers(Qiagen, Valencia, CA)에서 Rotor-Gene SYBR Green PCR Master mix 키트를 이용하여 분석하였으며, 마우스 FcγRⅡB를 위해 forward : 5’-CATGTTTGAGACCTTCAACA-3’(서열번호 1) 및 reverse : 5’-GCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3’(서열번호 2)의 프라이머를 사용하였고, 마우스 액틴(actin)을 위해 forward : 5’-GGTTCCAGCTCTCCCAGG-3’(서열번호 3) 및 reverse : 5’-TTCATCCAGGGCTTCGGG-3’(서열번호 4)의 프라이머를 사용하였다. 모든 값을 delta delta Ct 방법을 이용하여 계산하였고, 발현의 차이를 액틴 mRNA의 발현에 상대적으로 표현하였다.

응집된 α-syn은 FcγRⅡB 발현을 유도하였지만(도 6의 E), 단량체 α-syn은 유도하지 않았고(도 6의 F), 나아가, 응집된 α-syn은 FcγRⅡB 발현을 유도한다는 것을 웨스턴블롯을 통해 확인하였다(도 6의 G).

또한, 세포 수준이 아닌, 뇌 전체에서의 FcγRⅡB 발현을 웨스턴블롯을 통해 조사한 결과, 야생형 WT 마우스의 전체 뇌 용해물에서 발현되는 양보다 A53T TG 마우스의 전체 뇌 용해물에서 FcγRⅡB 발현양이 더 증가했음을 확인하였다(도 6의 H).

종합하면, 상기 실시예 5를 통해, FcγRⅡB는 응집된 α-syn에 대한 특이적인 수용체이고, 상기 응집된 α-syn은 FcγRⅡB와 결합된 후, SHP-1을 활성화시켜서 미세아교세포 식균작용 활성을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 6. α- syn 전이에 대한 SHP -1의 영향

실시예 6-1. SHP-1의 발현억제 세포주에서 확인한 α-syn 전이에 대한 SHP-1의 영향

응집된 α-syn에 의한 SHP-1의 활성화는 α-syn의 전이에 어떠한 영향을 주는지를 살펴보기 위해서 본 발명자들은 실시예 4에 따른 방법으로 SHP-1의 발현을 억제 시킨 2개의 SH-SY5Y 세포주(SHP-1 KD1, SHP-1 KD2)와 2개의 BV2세포주 1개의 OLN 93 세포주를 제작하였고, 이를 이용하여 α-syn의 전이를 분석하였다.

제작한 상기 SHP-1 발현억제 SH-SY5Y 도파민성 신경세포주(SHP-1 KD1, SHP-1 KD2)에 α-syn이 과발현된 SH-SY5Y 도파민성 신경세포주와 Two chamber를 이용하여 12시간 동안 공동배양(Co-culture)을 수행하였다. 상기 공동배양을 간략히 정리하면, SH-SY5Y 또는 BV2 또는 OLN93 세포를 12-웰 커버글라스(cover glass)위에 웰당 4 x 10⁴ 세포의 농도로 분주하였다. 그리고, α-syn이 과발현된 SH-SY5Y 세포는 12-웰 트렌스웰(transwell)에 웰당 4 x 10⁴ 세포의 농도로 분주하였다. 각각 하루 동안 배양한 이후, 트렌스웰(α-syn이 과발현된 SH-SY5Y 세포가 분주됨)을 12-웰 커버글라스(SH-SY5Y 세포가 분주됨)로 옮겨 12시간 동안 공동배양을 수행하였고, 그 이후, 면역염색을 수행하였다.

그 결과, 정상 비교군(NT) 세포주에서는 α-syn의 전이가 관찰되는 반면에, SHP-1 KD1 및 SHP-1 KD2 세포주에서는 α-syn의 전이가 감소됨을 확인하였다. (도 7의 A,H,M) 상기 결과를 한번 더 확인하기 위하여 SHP-1,2의 저해제인 NSC87877을 처리한 결과, SHP-1 발현억제 BV-2, SHSY5Y 그리고 OLN93 세포주에서 확인한 결과와 유사하게 α-syn의 전이가 감소됨을 확인하였다(도 7의B,I,N).또한 이는 primary microglia에서도 SHP-1.2의 저해제인 NSC87877을 처리한 결과 α-syn의 전이가 감소됨을 확인하였다. (도 7의 C)

실시예 6-2. 신경세포에서 확인한 응집된 α- syn에 대한 SHP -1의 활성화

응집된 α-syn이 신경세포에서 작용하는 기작을 확인하기 위하여, 인간 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y 및 인간 신장세포주인 HEK293에 응집된 α-syn을 처리하였다.

그 결과, 인간 도파민성 신경세포주인 SH-SY5Y 세포의 세포막에 α-syn이 붙는 것을 확인하였고(도 8의 A), SHP-1의 인산화 역시 증가함을 확인하였다(도 8 의 B). 이는 인간 신장세포주인 COS-7 또는 HEK293 세포와는 다른 현상이었고, 상기 결과를 통해 COS-7 세포나 HEK293 세포와는 다르게 미세아교세포나 신경세포에는 응집된 α-syn이 결합할 수 있는 수용체가 존재하며, 상기 수용체를 통해 신호가 전달됨을 예측할 수 있었다(도 8).또한 응집된 α-syn에 의해 증가된 SHP-1의 인산화 현상은 neuron(도 8의 C)에서도 확인하였고, 이는 분화된 SHSY5Y에서 미분화된 SHSY5Y보다 SHP-1의 인산화가 증가되어있는 것(도 8의 D)을 확인하였으며, 응집된 α-syn에 의해 SHP-1의 인산화가 미분화된 SHSY5Y보다 분화된 SHSY5Y에서 더욱 증가되는 것을 확인하였다. (도 8의 D). 또한 SHP-1과 상동성을 가지는 SHP-2의 인산화 역시 응집된 α-syn에 의해서 증가되는 것을 SHSY5Y(도 8의 B), primary neuron (도 8의 C) A53T Transgenic mice(도 8의 E,F)에서 확인하였다. 앞에서 확인한 래트 미세아교세포와 BV2에서는 응집된 α-syn에 의해 SHP-1의 활성화가 증가되고, SHP-2의 활성화는 증가되지 않았다. 하지만 SHSY5Y와 신경세포, 그리고 A53T 뇌 용해물에서는 SHP-1의 활성화와 SHP-2 활성화가 모두 증가되는 것을 알 수 있다. 이는 미세아교세포와 신경세포에서의 응집된 α-syn의 영행에 차이가 있다는 것을 확인할 수 있다.

종합하면, 상기 실시예 6을 통해, 인산화에 의한 SHP-1의 활성화가 응집된 α-syn에 의해 미세 아교세포 뿐만 아니라 신경세포에서도 인산화에 의한 SHP-1의 활성화와 인산화에 의한 SHP-2의 활성화가 일어난다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. α- syn에 의한 신경세포독성에 대한 SHP -1의 영향

응집된 α-syn에 의해서 신경세포독성이 보이는지를 확인하기 위해 레티노산(retinoic acid)을 이용하여 도파민성 신경세포로 분화된 SH-SY5Y 세포에 응집된 α-syn을 처리한 후, 세포독성을 측정하였다.

SH-SY5Y 세포를 도파민성 신경세포로 분화시키기 위하여, 배양접시에 분주된 SH-SY5Y 세포를 50μM의 레티노산이 포함된 배양액으로 5일 동안 배양하였다. 이때, 배양을 시작한지 각각 3일, 4일, 5일째에 50μM의 레티노산이 포함된 새로운 배양액으로 교체하였다. 또한, 세포독성을 측정하기 위하여, 분화된 SH-SY5Y 도파민성 신경세포와 미분화된 SH-SY5Y 도파민성 신경세포 각각을 12-웰에 분주하여 하루 동안 배양하였다. 이후, 1μM의 응집된 α-syn 및 SHP-1/-2의 저해제인 50μM의 NSC87877이 포함된 배양액으로 이틀 동안 배양한 후, 제조자의 설명에 따라, LDH(lactate dehydrogenase) release 어세이를 수행하였다.

그 결과, 도파민성 신경세포로 분화시킨 조건에서만 응집된 α-syn이 세포 독성을 보이는 것을 확인하였다(도 9의 A). 도파민성 신경세포의 사멸은 파킨슨 질병의 특징 중 하나인데, 상기 결과를 통해 응집된 α-syn이 파킨슨병의 원인이 될 수 있음을 알 수 있었다.

나아가, 분화된 신경세포에서 SHP-1의 활성화가 응집된 α-syn에 의한 신경세포독성에 관여하는지를 조사하기 위하여 SHP-1/2의 저해제인 NSC87877을 동시에 처리한 결과, 응집된 α-syn에 의한 신경세포 독성이 감소하는 것을 확인함으로써 응집된 α-syn에 의한 신경세포독성에 SHP-1의 활성화가 관여할 가능성이 있음을 확인하였다(도 9의 B). 또한 응집된 α-syn이 세포독성을 보이는 것이 SHP-1에 의해서 일어나는지를 확인하기 위해서 SHP-1의 발현이 억제된 2개의 SHSY5Y 세포주를 제작하였다. 레티노산(retinoic acid)을 이용하여 도파민성 신경세포로 분화된 SHP-1의 발현이 억제된 SH-SY5Y 세포에 응집된 α-syn을 처리한 후, 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 정상 비교군(NT) 세포주에서는 α-syn에 의해서 세포독성이 관찰되는 반면에, SHP-1 KD1 및 SHP-1 KD2 세포주에서는 세포 독성이 감소됨을 확인하였다(도 9의 C,D).

종합하면 상기 실시예 7을 통해서, 응집된 α-syn에 의해 분화된 SHSY5Y 세포가 죽고 또 미분화 SHSY5Y에서는 일어나지 않은 현상임을 확인할 수 있었다. 마지막으로 SHP-1에 의해서 응집된 α-syn의 세포 독성효과가 일어나는 현상임을 알 수 있었다.

실시예 8. α- syn의 세포내 이동에 대한 SHP -1, SHP -2의 영향

α-syn의 전이과정에서 SHP-1의 활성화가 영향을 미치는지를 확인하기 위해 eGPF로 표지한 SHP-1의 WT, eGPF로 표지한 SHP-1의 활성을 가지는 mutant form(SHP-1△N), eGPF로 표지한 SHP-1의 비 활성을 가지는 mutant form(SHP-1C453S)을 제작을 하여 SHSY5Y세포에 형질주입을 진행하였다. 그런 뒤 α-syn을 과발현시킨 SH-SY5Y 세포와 SHP-1 WT, SHP-1의 활성(SHP-1△N) 또는 비활성(SHP-1C453S)을 가지는 mutant form을 형질주입시킨 SH-SY5Y 세포를 two chamber 시스템을 이용하여 12시간 동안 배양하였다. 그 결과, SHP-1 의 활성을 가지는 mutant form(SHP-1△N)을 형질주입한 세포에서 α-syn의 전이가 증가되어있는 것을 확인하였고, 반대로 SHP-1의 불활성 mutant form (SHP-1 C453S)을 형질주입한 세포에서 α-syn의 전이가 감소됨을 확인하였다(도 10의 C,D). α-syn의 전이과정에서 SHP-2의 활성화가 영향을 미치는지를 확인하기 위해 eGPF로 표지한 SHP-2의 WT, eGPF로 표지한 SHP-2의 활성을 가지는 mutant form(SHP-2 D61A), eGPF로 표지한 SHP-2의 비 활성을 가지는 mutant form(SHP-2 C459S)을 제작을 하여 Cos7세포에 형질주입을 진행하였다. 그런 뒤 α-syn을 과발현시킨 SH-SY5Y 세포와 SHP-2의 활성과 비활성을 가지는 mutant form을 형질주입시킨 COS7 세포를 two chamber 시스템을 이용하여 12시간 동안 배양하였다. 그 결과, SHP-2 의 활성을 가지는 mutant form(SHP-2 D61A)을 형질주입한 세포에서 α-syn의 전이가 증가되어있는 것을 확인하였고, 반대로 SHP-1의 불활성 mutant form(SHP-1 C459S)을 형질주입한 세포에서 α-syn의 전이가 감소됨을 확인하였다(도 10의 A,B). SH-SY5Y 세포 또는 cos7세포 내로 이동한 α-syn을 확인하기 위해 알파-시누클레인 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 빨간색은 전이된 α-syn를 가리키며, 녹색은 eGFP을 가리키고 파란색은 DNA를 가리킨다.

종합하면, 상기 실시 예 8을 통하여, 활성을 가지는 SHP-1, SHP-2에 의해 α-syn의 전이가 일어나며, SHP-1, SHP-2가 불활성을 가졌을 때 α-syn의 전이가 일어나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 α-syn의 전이에 SHP-1과 SHP-2의 활성이 필수 요소임을 확인할 수 있다.

실시예 9. α- syn의 세포내 응집에 대한 SHP -1의 영향

단량체 α-syn이 응집체가 되는 변성과정이 파킨슨의 주된 원이 될수 있는 가능성이 대두되는 이 시점에서, SHSY5Y 세포주에서 단량체 A53Tα-syn을 과발현을 시킨 상황에서 이 과발현이 된 단량체 A53Tα-syn이 응집체로 변성되는 과정 영향을 주는지 확인하였다.

우선 eGPF로 표지된 A53Tα-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주를 lentivirus을 이용하여 제작하였고, 제작된 eGPP로 표지된 A53Tα-syn 과발현된 SHSY5Y 세포주와 α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주를 같이 섞어서 그리고 A53Tα-syn 과발현된 SHSY5Y 세포주와 α-syn이 과발현 된 SHSY5Y 세포주를 같이 섞어서 coculture을 진행하였다. Coculture을 진행한 5일째에 공초점 현미경을 이용해서 eGFP로 표지된 A53Tα-syn 의 세포안에서의 분포도를 확인였다. eGFP로 표지된 A53Tα-syn이 과발현된 세포에서의 eGFP의 분포도가 세포 안에서 응집이 되어있는 형태를 확인하였다(도 11의 B). 반면 eGFP로 표지된 A53Tα-syn이 과발현된 SHSY5Y만 키웠을때는 세포안에서의 eGFP의 분포도가 응집이 되는 현상은 coculture상황에 비해서 적게 나타나는 것을 확인하였다(도 11의 A). 이 상황에서 SHP-1/2 inhibitor인 NSC87877을 치고 A53Tα-syn 과발현된 SHSY5Y 세포주와 α-syn이 과발현 된 SHSY5Y 세포주를 같이 섞어서 coculture을 진행하였다. NSC 87877을 치고 Coculture을 진행한 5일째에 공초점 현미경을 이용해서 eGFP로 표지된 A53Tα-syn 의 세포안에서의 분포도를 확인하였더니 eGFP로 표지된 A53Tα-syn이 과발현된 세포에서의 eGFP의 분포도가 세포 안에서 응집이 되어있는 형태가 사라짐을 확인하였다(도 11 의 C)

종합하면, 상기 실시예 9를 통해, SHP-1의 활성화가 응집된 α-syn의 형성에 중요한 요소임을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising inhibitor for expressing or activating of SHP-1/-2 <130> KPA150590-KR-P1 <150> KR 10-2015-0100430 <151> 2015-07-15 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for FcgammaRIIB <400> 1 catgtttgag accttcaaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for FcgammaRIIB <400> 2 gccatctcct gctcgaagtc 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for actin <400> 3 ggttccagct ctcccagg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for actin <400> 4 ttcatccagg gcttcggg 18

Claims

SHP-1/-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1/-2)의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는, 파킨슨병(Parkinson’s disease), 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies) 및 다계통위측증(Multiple system atrophy)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SHP-1/-2의 발현을 억제할 수 있는 제제는 SHP-1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리코뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SHP-1/-2의 활성을 억제할 수 있는 제제는 SHP-1의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 안타고니스트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 퇴행성 뇌질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료하는 방법.
파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 치료제의 후보물질이 처리된 신경조직 유래 세포에 알파-시누클레인(α-Synuclein)을 처리하고, SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법.
제5항에 있어서,
상기 신경조직 유래 세포는 신경세포 또는 신경교세포인 것인 방법.
제6항에 있어서,
상기 신경교세포는 미세아교세포(microglia), 성상교세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte), 상의세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann cell), 위성세포(satellite cell) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 방법은 SHP-1/-2의 활성화를 억제하는 후보물질을 퇴행성 뇌질환 치료제로 선발하는 것인 방법.
SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 SHP-1/-2의 활성화는 알파-시누클레인(α-Synuclein)의 전이에 의하여 유발되는 것인, 진단용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정할 수 있는 제제는 활성화된 SHP-1/-2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머인 것인, 진단용 조성물.
제9항의 조성물을 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제12항의 키트를 이용하여 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.
제13항에 있어서,
상기 SHP-1/-2이 활성화되었을 때 퇴행성 뇌질환이 발병된 것으로 판단하는 것인 방법.
(a) 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제12항의 키트를 이용하여 SHP-1/-2의 활성화 여부를 측정하여 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통위측증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌질환을 진단하는 단계; 및
(b) 상기 퇴행성 뇌질환으로 진단된 개체에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법.