KR20170001703A - 키토산을 포함하는, 헬리코박터 파이로리 광역동 치료효과 증진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 키토산을 포함하는 광감각제(photosensitizer)와 병용되는 광역동 치료(photodynamic theraphy) 효과 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 키토산을 이용하여, 증진된 Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균 효과를 확인하였는바, Helicobacter pylori 광역동 치료에 있어서, 보다 효과적으로 접근하여 타겟치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

키토산을 포함하는, 헬리코박터 파이로리 광역동 치료효과 증진용 조성물{A composition comprising chitosan for ehancing the the photodynamic therapy against Helicobacter pylori}
본 발명은 광역동 치료효과 증진용 조성물로서, 보다 구체적으로는 Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균 효과를 증진시키고, 병용되는 광감각제의 투여용량을 감소시킬 수 있는, 키토산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균은 1982년 호주의 Marshall과 Warren에 의하여 인체의 위점막에서 처음 분리된 이래, 만성위염 및 소화성 궤양의 주요 원인균임이 밝혀졌으며, 1994년에는 세계보건기구 산하 국제 암연구기관에서 발암인자의 하나로 규명되었다. 이 균은 몇 개의 편모를 가진 그람음성 간균으로 위 점막층의 표층이나 점액내에 증식하며 가장 특징적인 미생물학적 성상으로서 강력한 운동성과 유레아제(urease)효소 활성을 가지고 있다. 보다 구체적으로, 강력한 운동성은 위의 점액내에서도 자유롭게 이동하면서 살아가기 위한 것으로 편모가 주된 역할을 한다. 또한, 유레아제 활성은 위 점막 내에 낮은 농도로 존재하는 요소를 효과적으로 분해할 수 있으며, 이에 따라 생산되는 암모니아가 세균의 주위환경을 중화시킴으로써 위산에 의한 공격에 대처하기 위한 것으로 추측되고 있다. 이러한 특징을 가진 헬리코박터 파이로리균은 만성위염과 위궤양과 관련이 있으며, 특히 위궤양의 70%, 위염의 90%, 십이지궤양의 90%가 직접적인 발병 원인이며, 위선종(gastric adenoma) 및 위점막 연관 림파종(gastric mucosa associated lymphoma)과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀져 항헬리코박터 파이로리균에 대한 관심이 꾸준히 대두되고 있다.
현재, 항헬리코박터 파이로리균에 대한 요법으로 일반적으로 항생제가 사용되고 있다. 가장 널리 사용하고 있는 제균법은 신 3제요법 (new triple therapy)으로서, proton pump inhibitor (PPI) 중 한가지 (omeprazole, lansoprazole, pantoprazole 또는 rabeprazole)와 clarithromycin, amoxicillin과 metronidazole (또는 trinidazole) 중 2가지를 7-14일간 병용하는 치료법이 널리 알려져 있으며, 이 뿐만 아니라, bismuth 와 PPI를 포함한 4제요법 등이 유용한 치료법으로 이용되고 있다. 그러나 상기와 같은 치료에 실패한 경우, 기존에 노출된 항생제에 대한 내성균이 발달하게 되는바, 후속 치료에 있어서 어려움을 겪고 있다. 또한, 항생제 치료시에 약 20%정도의 치료 실패율을 보이는데, 이는 항생제 내성의 증가로 인한 것이며, 이에 항생제를 대체할 수 있는 새로운 제균법의 필요한 실정이다. 또한, 현재의 헬리코박터 파이로리 제균법은 환자의 순응도에 따라 전체 환자의 약 25%는 1-2주 동안의 치료를 끝내지 못하는 경우도 있어서 항생제를 복용하지 않는 다른 제균법에 대한 요구가 증가하고 있는 추세이다.
한편, 광역동 치료(Photodynamic therapy (PDT))는 광감각제(photosensitizer)를 가시광선을 포함한 여러 영역의 특정 파장의 빛을 조사하여 활성화시킨 후, 활성화된 광감제의 작용으로 각종 국소적 질병을 치료하는 방법이다. 광감각제는 광원으로부터 빛을 흡수하고, 그 결과 분자상의 산소에 에너지를 전달하여 활성화된 single oxygen을 만들어 이 활성산소가 세포내 거대분자 물질들과 반응하여 세포 손상을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 치료법은 종래 항생제 내성 등과 같은 문제를 야기하지 않는바, 이를 이용한 치료법이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어 지고 있으나 (한국 특허공개번호 10-2011-0133032), 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 키토산 처리에 의해 증진된 Helicobacter pylori 광역동 살균 효과을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 광감각제(photosensitizer)와 병용되는 광역동 치료(photodynamic theraphy) 효과 증진용 조성물로서, 상기 조성물은 키토산(Chitosan)을 포함하고, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 광감각제 및 키토산을 유효성분으로 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 a) Helicobacter pylori에 광감각제 및 키토산을 처리하는 단계; 및 b) 상기 광감각제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 살균방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광감각제(photosensitizer)와 병용되는 광역동 치료(photodynamic theraphy) 효과 증진용 조성물로서, 상기 조성물은 키토산(Chitosan)을 포함하고, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 병용되는 광감각제의 투여용량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 상기 광감각제와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 광감각제는 Methylene blue, toludine blue, 및 protoporphyrin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 광감각제 및 키토산을 유효성분으로 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) Helicobacter pylori에 광감각제 및 키토산을 처리하는 단계; 및 b) 상기 광감각제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 살균방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 a) 단계의 광감각제는 Methylene blue, toluidine blue, 및 protoporphyrin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 Helicobacter pylori 감염증의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 키토산(Chitosan)을 포함하는 조성물의 Helicobacter pylori 감염증의 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 키토산을 유효성분으로 포함하며, 광역동 치료 (Photodynamic therapy, PDT)에서, 상기 키토산 처리에 의한 Helicobacter pylori 살균 효과의 증진 및 광역동 치료 기전인 DNA 산화적 손상의 증가를 확인하였는바, 상기 조성물은 Helicobacter pylori 광역동 치료효과를 증진시키기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 투여되는 광감각제의 농도와 양을 감소시켜 광감각제로 인한 인체에 대한 독성을 감소시킬 수 있다.
도 1은 다양한 농도의 키토산(0.2%~0.01%)이 함유된 배지에서 30분간 배양시킨 후, Helicobacter pylori의 집락 수를 비교한 결과이다.
도 2는 광역동 치료 전 키토산 처리를 한 경우, 시간의 경과에 따른 Helicobacter pylori의 집락 수를 비교한 결과이다.
도 3은 광역동 치료 전 또는 후에 키토산 처리를 한 경우, 시간의 경과에 따른 Helicobacter pylori의 집락 수를 비교한 결과이다.
도 4는 광역동 치료 및 키토산 처리에 의한 Helicobacter pylori DNA의 산화적 손상정도를 전기영동을 통하여 확인한 결과이다 (M: Size marker, a: 미호기성 조건에서 아무런 처리를 하지 않은 군, b: 실온에서 아무런 처리를 하지 않은 군, c: 실온에서 15분간 키토산을 처리한 군, d: MB와 함께 5분간 광선을 조사한 군, e: MB와 함께 10분간 광선을 조사한 군, f: MB와 함께 15 분간 광선을 조사한 군, g: MB, 키토산과 함께 5분간 광선을 조사한 군, h: MB, 키토산과 함께 10분간 광선을 조사한 군, i: MB, 키토산과 함께 15분간 광선을 조사한 군).
본 발명자들은 Helicobacter pylori 광역동 치료에 있어서, 키토산 처리에 의한 살균효과 증진 및 DNA 산화적 손상의 증가를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 광감각제(photosensitizer)와 병용되는 광역동 치료(photodynamic theraphy) 효과 증진용 조성물로서, 상기 조성물은 키토산(Chitosan)을 포함하고, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "Helicobacter pylori"는 한쪽 끝에 몇개의 편모 (flagella) 를 갖는 나선형의 그람 음성 간균(bacillus)으로, 인간의 위 점막에 생식하는 균이다. 또한, 위염, 위궤양, 십이지장궤양의 원인균이며, 위암, 위 림프종 등의 질환과 관련된 유해한 세균 중 하나이다.
종래에는 Helicobacter pylori에 대한 치료를 위하여, 일반적인 항생제가 널리 사용되고 있었으나, 항생제 내성의 발생과 같은 부작용 등으로 인해 효과적인 치료에 어려움을 겪고 있으며, 이에, 새로운 치료법에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다.
이들 중 하나로서, 광감각제(Photosestizer) 및 광선을 이용하는 광역동 치료법(photodynamic theraphy)이 각광받고 있다. 다만, 상기 치료법 역시 광감각제에 의한 광감작 부작용, 즉 화상, 부종, 홍반, DNA 돌연변이 등과 같은 광과민성 반응을 유발할 수 있으므로, 광감각제의 투여용량을 감소시키는 기술에 대한 개발이 필요하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "광감각제"는 특정 파장의 빛에 조사되었을 때 여기(excitation)된 후, 형광 신호를 생성하거나, 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 반응성 산소종(reactive oxygen species)을 생성하는 물질로서, 바람직하게는 Methylene blue, toluidine blue, 및 protoporphyrin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 생성된 반응성 산소종은 주변 종양 세포를 자멸 또는 괴사시키는 효과를 가지고, 본 발명의 목적상 키토산 처리에 의하여, Helicobacter pylori 살균효과를 증진시키거나 광감각제의 투여용량을 감소시키는 것을 의미하며, 이에, 광감각제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 키토산 자체 항균활성의 영향을 배제시키기 위하여, 0.05%이하의 키토산을 사용하여야 함을 확인하였으며(실시예 1), 상기 키토산을 처리에 의하여, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균효과가 증진됨을 확인하였다(실시예 2). 또한, 광역동 치료 전에 키토산을 처리한 경우, 후-처리한 경우보다 살균효과가 우수하였으며(실시예 3), DNA 산화적 손상 정도의 증가를 전기영동 및 quantitative real time PCR을 통하여 확인하였는바, 키토산을 포함하는 조성물은 Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 4 및 5).
이에, 본 발명은 광감각제 및 키토산을 유효성분으로 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 광역동 살균용 조성물을 제공한다.
또한, a) Helicobacter pylori에 광감각제 및 키토산을 처리하는 단계; 및 b) 상기 광감각제를 활성화시키기 위한 광선을 조사하는 단계를 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 살균방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예는 하기와 같은 조건 및 방법으로 수행되었다
1. Bacterial strain
Korean Culture Type Collection (KCTC, Taejeon, Korea)에서 구입한 Helicobacter pylori 26695 표준균주를 사용하였다. 균주의 배양은 기본적으로 brain heart infusion agar (BHI)(Difco) 배지에 7% laked horse blood (Oxoid), 0.4% isovitalex (BBL), vancomycin (6mg/ml), amphothericn B (8mg/ml), trimethoprim (5mg/ml)을 첨가하여 사용하였다. 균주의 배양환경은 37℃ 배양기에 5% O2, 10% CO2, 및 85% N2가스를 공급하여 미호기성 상태를 유지하며 균주를 배양하였다.
2. Chemicals and Instrument
Agarose, chitosan(low molecular weight), methylene blue(MB), 및 ehidium bromide monoazide(EMA)는 Sigma (Sigma Chemicla Co, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, Endonuclease Ш는 New England Biolab (IPpswich,MA)에서 구입하여 사용하였다. 물을 이용하여 10mg/ml(1%) 농도의 MB 저장액(stock solution)을 제조하였으며, 사용 전에 암조건, 4℃에서 최대 2주동안 저장하였다. 1% acetic acid를 이용하여 chitosan(1% w/v) 저장액을 제조하였으며, 한달 이내에 사용하였다.
광선을 조사하기 위한 내시경기기로 Olympus EVIS(Endoscopic video informaiton system) Lucera spectrum immaging system 및 gastroscope(Olympus Medical Systems Co., Toyko, Japan)이 이용되었다.
광선 조사는 암실에서 수행되었으며, Helicobacter pylori 배양 플레이트를 광선으로부터 10cm 지점에 위치시켰다. optical power meter system, PM 100 Analog Power Meter 및 PM 30-120 detector(Thorlabs Ins.,)로 측정된 내시경 광선 에너지량은 7.5mJ/cm2였다.
실시예 1. 키토산 단독의 항균활성 확인
Helicobacter pylori의 광역동 치료(photodynamic therapy)에서, 키토산 자체 항균활성의 영향을 배제시키기 위하여 본 실험이 수행되었다.
보다 구체적으로, 키토산 저장액(1% w/v)을 Phosphate-buffered saline(PBS)로 희석시켜, 다양한 농도의 키토산 (0.2%~0.01%)을 함유하는 배지를 준비하였다. 이 후, 상기 배지에 Helicobacter pylori를 30분 동안 배양하고, PBS로 세척 한 후, 다시 PBS로 10배 희석시켰다. 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 형성된 집락(colony)의 수를 측정하였다.
도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 0.2%, 0.1%, 0.075%의 키토산이 함유된 배지에서는 Helicobacter pylori 집락의 수가 감소된 반면, 0.05%, 0.02%, 0.01% 키토산이 함유된 배지에서는 집락수의 변화가 없음을 확인하였다. 상기 실험을 통하여 0.05% 이하의 키토산이 함유된 배지에서는 키토산 자체의 항균 활성이 없음을 확인하였으며, 이에, 이하의 실험에서 키토산 농도는 0.05%으로 실시하였다.
[표 1]
Figure pat00001
실시예 2. 키토산 전-처리에 의한 증진된 살균효과 확인
광감각제인 메틸렌 블루(Methylene blue, MB) 처리 및 광선 조사 전, 키토산 처리에 의한 Helicobacter pylori 살균효과를 확인하기 위하여, Tegos의 방법을 변형하여 본 실험이 수행되었다. 우선, 본 발명자들은 70℃에 보관중인 Helicobacter pylori를 BHI 배지에 접종하여 3일간 배양하고, 2일간 계대배양하였다. 상기 세균을 108cells/ml 농도의 PBS로 부유시켰으며, 부유된 세균은 0.02mg/ml 또는 0.04mg/ml의 MB, 0.05% chitosan이 함유된 0.02mg/ml 또는 0.04mg/ml의 MB로 30분 동안 처리하였다. 이 후, 각 샘플은 PBS로 2회 세척한 후, 1000μL 부피의 플레이트에 분산된 세균에 대하여 5, 10, 및 15분간 광선을 조사하였다. 광선 조사 후, 각 균액을 10배 계열 희석하였으며, 10 ml씩 BHI plate에 spotting하고 37℃ 미호기성 상태에서 3일간 배양하였다. 상기 조건하에서 생성된 집락의 수를 세어서 CFU(colony forming unit)를 결정하였으며, 메틸렌 블루, 및 키토산을 처리하지 않고 광선을 조사하지 않은 Helicobacter pylori 를 대조군으로 이용하였다.
도 2 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control)은 시간의 경과에도 불구하고 큰 차이가 없었으며, 광선만을 조사 군(Light only)의 경우에도 80%이상의 균주가 생존하였다.
MB(0.02mg/mL) 및 광선을 조사한 군에서는, 광선 조사 후 10분 내지 15분이 경과한 때, 균수가 10배 가량 감소한 반면, 키토산 전-처리한 후, MB(0.02mg/mL) 및 광선을 조사한 군에서는, 광선 조사 후 10분 내지 15분이 경과한 때, 균수가 100배가량 감소함을 확인하였다. 또한, MB (0.04mg/mL)만을 처리한 군에서는 균수가 10배가량 감소하였으며, MB(0.04mg/mL) 및 광선을 조사한 군에서는, 광선 조사후 5분, 10분, 15분이 경과할 때마다 각각 102배, 104배, 105배 감소한 반면, chitosan을 전-처리한 후, MB(0.4mg/mL) 및 광선을 조사한 군에서는, 광선 조사후 5분, 10분 15분이 경과할 때마다 각각 103배, 105배, 107배 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 광역동 치료 전 키토산 처리는 Helicobacter pylori 살균효과를 증진시키며, 이를 통해 광감각제인 메틸렌 블루의 투여량을 감소시킬 수 있음을 의미한다.
[표 2]
Figure pat00002
실시예 3. 키토산 처리 시기에 따른 살균효과의 비교
상기와 같은 방법으로, 본 발명자들은 광감각제인 메틸렌 블루(Methylene blue, MB) 처리 및 광선 조사 후, chitosan 처리에 의한 Helicobacter pylori 살균효과를 확인하였다. 0.04mg/ml의 MB에서 30분 동안 배양시킨 후, 15분동안 광역동 치료를 실시하였다. 이 후, Helicobacter pylori 균주를 30분 동안 0.05%의 chitosan 처리를 한 후, PBS로 세척하였으며, 생성된 집락의 수를 세어서 CFU (colony forming unit)를 결정하였다.
도 3및 표 3에 나타낸 바와 같이, MB(0.04mg/mL) 및 광선을 조사한 군에서는, 광선 조사후 5분, 10분, 15분이 경과할 때마다 각각 102배, 104배, 105배 감소함을 확인하였다.
키토산을 후-처리한 군에서는, 광선 조사후 5분, 10분, 15분이 경과할 때마다 102배, 104배, 106배 감소함을 확인한 반면, 키토산을 전-처리한 군에서는, 광선 조사후 5분, 10분, 15분이 경과할 때마다 103배, 105배, 107배 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 키토산을 전-처리하는 것이 후-처리한 경우보다 더욱 우수한 살균효과를 나타냄을 의미한다.
[표 3]
Figure pat00003
실시예 4. 광역동 치료에 의한 DNA 산화적 손상정도 확인
키토산을 전-처리한 경우, 광감각제인 메틸렌 블루에 의한 DNA의 산화적 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 본 실험이 수행되었다. 우선, S. Kozmin의 실험방법을 변형하여 광역동 치료에 의한 DNA의 손상을 유발하였다. 상기 방법에 의해 부유된 Helicobacter pylori를 PBS에 108cells/ml 농도로 현탁한 후, DNA 손상을 유발하기 위하여, 10 mg/ml MB를 이용하였으며, 10mg/ml MB 처리 및 광선을 조사한 군(5, 10, 15분) 또는 10mg/ml MB, 0.05% chitosan 처리 및 광선을 조사한 군(5, 10, 15분)으로부터 Genomic DNA를 수득하였다.
분리 동정된 Genomic DNA는 -20℃에 보관되었으며, 이 후, 200ng genomic DNA를 10×buffer(2μL), 아세틸화된 BSA(2μL)와 endonuclease Ш(1μL)로 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양시킨 후, DNA 손상의 정도를 확인하기 위하여, Sambrook et al(sambrook J, Russell WD. Molecular cloning. 3rd ed. Cold spring Harbor)에 게재된 방법에 따라 Alkaline gel electrophorsis 후, DNA 분해 정도를 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 DNA smearing이 관찰되지 않은 반면, MB (10mg/mL) 및 광선을 조사한 군(5분, 10분, 15분), chitosan(0.05%), MB (10mg/mL) 및 광선을 조사한 군(5분, 10분, 15분)에서는 smearing 된 DNA band가 관찰되었다. 특히, 키토산을 추가적으로 처리한 군에서 DNA smearing이 가장 심한 것을 확인하였다. 상기 결과는 키토산을 추가적으로 처리하는 경우, 더욱 심각한 DNA의 산화적 손상을 유발시킴으로써, 광역동 치료효과가 증진됨을 의미한다.
실시예 5. 광역동 치료에 의한 세포벽 등의 손상 확인
키토산을 전-처리한 경우, Helicobacter pylori 의 세포벽 및 세포막의 손상에 미치는 영향을 정량적으로 평가하기 위하여, Ethidium bromide monoazide(EMA) 처리 후, quantitative real time PCR을 실시하였다. 보다 구체적으로, MB(0.04mg/mL)만을 단독 처리한 군, 또는 키토산만을 단독 처리한 군, 및 MB 및 키토산을 처리한 군에 각각 15분간 광선을 조사한 후, 각 세포 부유액을 EMA(100μg)로 처리하였다. 각 샘플은 암실에서 5분 동안 배양시켰으며, DNA는 GeneAll Cell SV system(GeneAll, Seoul, Korea)을 통하여 추출하였다. 손상의 정도를 확인하기 위한 Target 유전자로는 Helicobacter pylori의 항존 유전자(House keeping gene)인 cycS를 이용하였으며, 증폭을 위하여 cysS Forward (GTGCATAATAGCAGCATTGAA(서열번호 1)), cysS Reverse(CTGCATGGATATCAATTTGAT(서열번호 2))를 프라이머를 사용하였다.
2μL의 DNA, 10μL의 Power SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies PTy Ltd, NY,USA), 및 10 pmole의 각 프라이머를 혼합하여 총 20μL의 반응 혼합물을 제조한 후, Step-One Plus Real Time PCR system(Life Technolohies Pty Ltd, NY, USA)에 따라 10분간 95℃ 처리 한 후, 15초간 95℃로 40사이클 실시하였으며, 다시 60분간 60℃ 처리하였다. 융해 분석을 위하여, 95℃에서 15초간, 60℃에서 60초간, 95℃까지 상승시켰으며, 온도변화율(Ramp rate)는 0.3℃/s였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, EMA-PCR의 Ct value는 키토산만을 처리한 경우 12.419±0.089, MB만을 처리한 경우 17.261±0.26인 반면, 키토산 및 MB를 처리한 군은 26.799±0.215로서, 유의적인 증가를 확인하였다. 상기 결과는 키토산 처리을 추가적으로 처리하는 경우, 세포벽과 세포막을 더욱 심각하게 손상시킴으로써, 광역동 치료효과가 증진됨을 의미한다.
[표 4]
Figure pat00004
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (4)

  1. 광감각제(photosensitizer)와 병용되는 Helicobacter pylori에 대한 광역동 치료(photodynamic theraphy) 효과 증진용 조성물로서,
    상기 광감각제는 Methylene blue, toluidine blue, 및 protoporphyrin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
    상기 조성물은 키토산(Chitosan)을 포함하고, Helicobacter pylori의 DNA 산화적 손상 및 세포벽 손상을 증진시켜 광역동 살균 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 병용되는 광감각제의 투여용량을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 광감각제와 동시에(simultaneous), 별도(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 하기의 단계를 포함하는, Helicobacter pylori에 대한 살균방법:
    a) Helicobacter pylori에 Methylene blue, toluidine blue, 및 protoporphyrin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 광감각제 및 키토산을 20 내지 30분 동안 처리하는 단계;
    b) 상기 처리한 Helicobacter pylori에 5 내지 15분 동안 광선을 조사하는 단계.
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