KR20160139781A - 시토크롬 p450 이소효소 활성 동시 측정법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시토크롬 P450 이소효소에 특이적으로 반응하는 기질을 포함하는 가스크로마토그래피를 이용한 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소 활성 분석용 조성물을 제공함으로써, 가스크로마토그래피 질량분석을 통해 다양한 시토크롬 P450 이소효소들의 활성을 동시에 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 한약 탕재와 같은 다성분을 포함하는 복합물에서의 약물의 상호작용을 효율적으로 측정할 수 있는 시스템을 제공할 수 있다.
Description
본 명세서 기재된 내용은 시토크롬 P450 이소효소 중 약물의 일차대사기능을 하는 효소들의 활성을 가스크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 동시에 측정하고 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.
최근 신약 개발 과정에서 in vitro 시험법을 이용한 약물상호작용 평가를 권장하면서 약물상호작용에 영향을 미치는 대사 효소와 그 활성에 대한 다양한 비교 연구는 굉장히 중요시 되고 있다. 또한, 2005년 정부에서 발표한 약인성 간독성 사례 314 중 82례 (약26%)가 한약에 의한 것으로 보고 되었으나, 이에 따른 독성이나 부작용 등 여러가지 한약재를 조합하여 이루어진 한약 처방의 약물 상호작용에 대한 연구는 부족한 실정이다.
따라서, 약물 상호작용에 기인하며 간에서 약물의 생체전환 및 대사에 핵심적인 역할을 하는 시토크롬 P450 (CYP450)의 활성과 저해방법을 최적화하여 한약재 등과 같은 복합 다성분에 의한 현대 과학적 평가가 요구되고 있다.
In vitro 효소 유도 및 억제 연구에 대한 실험 프로토콜은 각 실험실마다 매우 다양하며, 2013년 2월 식품의약품안전처에서 약물대사 평가시험법 해설서를 편찬하여 구체적인 시험방법을 제시하고 있을 뿐, 정확하게 표준화된 기준은 존재하지 않는다.
현재 출판된 식품의약품안전처의 약물대사 평가시험법에 의하면, 약물 처리된 간세포로부터 생성된 시토크롬 P450 효소 특이적 기질의 대사물질의 양을 정량하는 방법은 크게 2가지로 나눌 수 있는데, 형광 탐침자를 이용하는 방법과 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법이다.
형광 탐침자는 in vtiro 상에서 실험이 불가능하고, 각 효소의 이소효소마다 특이적이지 않은 단점이 있다. 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 이용하는 방법이 보다 더 널리 사용되고 있는데, 이는 마이크로솜의 CYP 이소효소가 모두 포함되어 있기 때문에 한 번의 반응, 한 번의 주입으로 여러 이소효소의 생성물을 확인할 수 있는 고효율의 스크리닝이 가능하기 때문이며, HPLC 또는 HPLC-UV를 이용하여 많은 연구가 되어있다.
액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 효소 활성을 측정을 위해서 거치는 전처리 과정으로 효소의 반응 후 단백질을 제거하는 방법이 사용되며, 보통 메탄올이나 아세트나이트릴을 처리해 볼텍싱(vortexing) 후 원심분리를 하여 유기용매층을 기기에 주입한다. 이와 같은 제단백 전처리 방법은 단일의 약물이나 물질을 처리하였을 때에는 문제가 되지 않지만, 한약재와 같은 복합물을 효소에 처리하여 활성을 확인하기에는 제단백 전처리 방법만으로는 복합물로 인한 효소 생성물을 검출하는데 방해하는 물질들을 완벽하게 제거할 수 없어, 약물간 상호작용을 확인하기에는 한계가 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 포유동물의 약물대사 중 제1상 대사효소인 시토크롬 P450의 여러 가지 이소효소의 활성을 효과적으로 동시에 분석할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 상기 조성물을 이용한 시토크롬 P450 이소효소의 활성 분석 및 약물의 생체대사작용 평가방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소와 특이적으로 결합하는 기질을 포함하는, 가스크로마토그래피를 이용한 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소 활성 분석용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 관점은 상기 시토크롬 P450 이소효소가 시토크롬 P450 1A2, 시토크롬 P450 2A6, 시토크롬 P450 2C9, 시토크롬 P450 2C19, 시토크롬 P450 CYP2D6, 시토크롬 P450 CYP2E1 및 시토크롬 P450 3A4로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 기질은 페나세틴(Phenacetin), 쿠마린(Coumarin), 코티닌(Cotinine), 디클로페낙(Diclofenac), (S)-메페니토인((S)-Mephenytoin), 덱스트로메트로판(Dextromethorphan), 클로르족사존(Chlorzoxazone) 및 테스토스테론(Testosterone) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 가스크로마토그래피를 이용한 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 관점은 다른 일 실시예로서 상기 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물, 상기 시토크롬 P450 이소효소 및 조효소를 혼합하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응물로부터 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계; 및 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 가스크로마토그래피 질량분석기로 정량하여 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 확인하는 단계를 포함하는 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점은 상기 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물, 상기 시토크롬 P450 이소효소를 포함하는 분리된 생체시료, 조효소 및 약물을 혼합하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응물로부터 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계; 및 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 가스크로마토그래피 질량분석기로 정량하여 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계를 포함하는 약물의 생체대사작용 평가방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 시토크롬 P450 이소효소에 특이적으로 반응하는 기질을 포함함으로써, 상기 조성물을 가스크로마토그래피 질량분석하면 상기 조성물에 포함된 기질과 상기 효소의 효소반응 결과 생성된 생성물들의 질량분석을 통해 다양한 시토크롬 P450 이소효소들의 활성을 동시에 측정할 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 시토크롬 P450 이소효소들의 활성을 가스크로마토그래피 질량분석을 통해 분석하므로, 액체크로마토그래피 질량분석보다 감도가 우수하여 여러 종류의 시토크롬 P450 이소효소들이 포함된 복합물에서의 각 효소들의 활성을 정확하게 분석할 수 있다. ,
이로써 상기 본 발명에 따른 조성물에 약물와 같은 미지시료를 적용하면 여러 종류의 시토크롬 P450 이소효소들의 활성분석을 통해, 상기 미지시료의 인체내 대사작용을 예측할 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 분석방법에 의하면 미지의 약물시료의 농도에 따른 시토크롬 P450 효소 활성 또는 억제도 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 한약 탕재와 같은 다성분을 포함하는 복합물에서의 약물의 상호작용을 효율적으로 측정함으로써 약물 부작용의 발생을 미리 예측하고 방지할 수 있는 시스템을 제공할 수 있다.
도 1은 인간의 시토크롬 P450 이소효소 중 약물의 1차대사 기능을 하는 주요한 효소를 나타낸 도이다.
도 2는 가스크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 시토크롬 P450 이소효소들의 생성물을 확인한 크로마토그램이다.
도 3a 내지 도 3d는 시토크롬 P450 이소효소의 각 기질의 농도에 따른 생성물의 생성속도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 시토크롬 P450 이소효소의 효소반응결과 생성되는 생성물의 양을 반응시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 시토크롬 P450 이소효소의 억제제를 농도별로 처리하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 가스크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 시토크롬 P450 이소효소들의 생성물을 확인한 크로마토그램이다.
도 3a 내지 도 3d는 시토크롬 P450 이소효소의 각 기질의 농도에 따른 생성물의 생성속도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 시토크롬 P450 이소효소의 효소반응결과 생성되는 생성물의 양을 반응시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 시토크롬 P450 이소효소의 억제제를 농도별로 처리하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체예들을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소와 특이적으로 결합하는 기질을 포함하는, 가스크로마토그래피를 이용한 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소 활성 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 시토크롬 P450 (CYP, P450)은 헴(heme)을 보결기로 가지는 헴-단백질로서, 헴에 포함되어 있는 철 이온이 환원 상태에서 일산화탄소와 결합하면 450nm에서 최고 흡광도를 나타낸다. 이 효소는 대부분의 약물이나 환경물질과 같은 외인성 물질이나 스테로이드, 발암물질 등과 같은 내인성물질의 산화시키는 대표적인 촉매 효소이며, 생물체 안에서 약물과 호르몬 등의 1차 대사 과정에서 80%를 차지하여 중요한 산화반응을 수행하므로, 신약개발 과정에서 핵심적 요소로 작용한다. 상기 시토크롬 P450 효소가 소포체의 세포막에 위치하여 간세포에 포함되어 있는 마이크로조말 시토크롬 P450 시스템은 NADPH-시토크롬 P450 리덕테이즈(NPR)로부터 전자를 받아 산화반응을 수행한다. 그 결과 NADPH는 NADP+로 산화되고 NPR 자체는 환원되며, 환원된 P450 효소의 도움을 받아 외인성 물질을 산화시킴으로서 P450과 NPR은 하나의 전자 전달 체계를 가진다. 도 1은 인간의 시토크롬 P450 이소효소 중 약물의 1차대사 기능을 하는 주요한 효소를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 시토크롬 P450 이소효소는 시토크롬 P450 1A2(EC number 1.14.14.1), 시토크롬 P450 2A6(EC number 1.14.14.1), 시토크롬 P450 2C9(EC numbers 1.14.13.48, 1.14.13.49, 1.14.13.80), 시토크롬 P450 2C19(EC numbers 1.14.13.48, 1.14.13.49, 1.14.13.80), 시토크롬 P450 2D6(EC number 1.14.14.1), 시토크롬 P450 2E1(EC number 1.14.13.n7) 및 시토크롬 P450 3A4(EC numbers 1.14.13.157, 1.14.13.32, 1.14.13.67, 1.14.13.97)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 조성물은 상기 시토크롬 P450 이소효소들과 특이적으로 결합하는 기질로 페나세틴(Phenacetin), 쿠마린(Coumarin), 코티닌(Cotinine), 디클로페낙(Diclofenac), (S)-메페니토인((S)-Mephenytoin), 덱스트로메트로판(Dextromethorphan), 클로르족사존(Chlorzoxazone) 및 테스토스테론(Testosterone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 본 발명에 따른 조성물은 상기 기질을 디클로페낙, (S)-메페니토인 및 테스토스테론으로 이루어진 그룹, 페나세틴 및 쿠마린으로 이루어진 그룹, 코티닌, 덱스트로메트로판 및 클로르족사존으로 이루어진 그룹으로 나누어 상기 그룹 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 그룹은 각 시토크롬 P450 이소효소의 반응속도에 따른 반응시간과 기질에서 생성물이 생성되는 효율 (Kcat: turnover efficiency)을 고려하여 생성물을 효과적으로 생성할 수 있도록 조합한 것이다.
여러 기질을 동시에 반응시킬 경우 기질마다 반응속도와 반응성에 차이가 있어, 같은 감도로 생성물을 분석하기 위해서는 많은 양의 기질이 필요하다. 이에 본 발명은 일 실시예로서 상기와 같이 기질들을 세 그룹으로 나누어 반응시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 기질 그룹 중 디클로페낙, (S)-메페니토인 및 테스토스테론이 포함된 그룹(혼합물 A)은 GC-MS로 분석하기 전 추출효율이 좋아 기질-효소반응 후 적은 생성물이 생성되었더라도 이를 대부분 회수할 수 있는 기질들을 그룹화한 것이다. 코티닌, 덱스트로메트로판 및 클로르족사존이 포함된 그룹(혼합물 C)은 GC-MS로 분석하기 전 추출효율이 좋지 않아 기질-효소 반응 후 생성되는 생성물의 양이 최대한 많도록 많은 시료를 사용하여야 하는 기질들을 그룹화 한 것이다. 페나세틴 및 쿠마린이 포함된 그룹(혼합물 B)은 상기 혼합물 A 및 C의 중간에 해당하는 기질들로 그룹화한 것이다. 상기와 같이 기질들을 반응속도 및 반응성에 따라 그룹화 할 경우, 그룹에 따라 미지의 생체시료를 이용하여 약물시료의 생체대사작용을 분석시 반응시간 및 생체시료의 농도를 조절함으로써 효소-기질 특이성에 적합하도록 최적화할 수 있으며, 생성물의 직선성 유지 및 기질간의 잠재적인 상호작용 방지에 효과적이다.
보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 시토크롬 P450 이소효소는 포유동물 간 마이크로좀, 일차간세포, 세포주, 대장균 등에 포함된 것일 수 있다. 약물 등은 복용시 간에서 대사되므로, 보다 구체적인 실시예로서 상기 시토크롬 P450 이소효소는 인간의 간 마이크로좀에 포함된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 일 실시예들에 따른 상기 기질은 시토크롬 P450 이소효소와 효소반응하여 생성물을 생산할 수 있으며, 상기 생성물은 아세트아미노펜(Acetaminophen), 7-하이드록시쿠마린(7-Hydroxycoumarin), 3-하이드록시코티닌(3-Hydroxycotinine), 4-하이드록시디클로페낙(4-Hydroxydiclofenac), 4-하이드록시메페니토인(4-Hydroxymephenytoin), 덱스트로판(Dextrorphan), 6-하이드록시클로르족사존(6-Hydroxychlorzoxazone) 및 6β-하이드록시테스토스테론(6β-Hydroxytestosterone)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예로서 상기 생성물은 상기 기질과 시토크롬 P450 이소효소가 반응한 반응물을 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 추출물은 에틸아세테이트 및 디클로로메탄의 혼합물을 추출용매로 포함하여 추출한 것일 수 있다.
한약재와 같이 매트릭스가 복잡한 약물의 대사작용에 의한 많은 종류의 효소기질과 생성물의 분석시 기존의 액체크로마토그래피 질량분석기를 사용하면서 상기 효소반응액에서 생성물을 추출하지 않고 효소반응액을 직접 주입할 경우 분석 방해 피크(peak)가 생성되어 정확한 정량이 어렵다. 따라서, 분석방해물질을 제거하는 추출공정이 더 필요하다. 그러나, 본 발명은 일 실시예로서 상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성 분석에 가스크로마토그래피 질량분석을 이용함으로써, 액체크로마토그래피 질량분석과 달리 이동상의 제조나 컬럼 컨디쇼닝과 같은 분석시 필요한 여러 처리를 할 필요가 없고 분석의 분리능이 좋아 반복적으로 시료를 연속하여 분석하기가 용이하다. 본 발명은 일 실시예로서 상술된 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물을 가스크로마토그래피 질량분석함으로써 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 측정할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예는 상술된 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물, 상기 시토크롬 P450 이소효소 및 조효소를 혼합하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응물로부터 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계; 및 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 가스크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 정량하여 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계를 포함하는 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석방법을 제공할 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예는 상술된 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석 방법을 적용하여 약제와 같은 미지시료의 대사작용을 분석하고, 인체내 약물 상호작용을 확인할 수 있다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명은 상술된 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물, 상기 시토크롬 P450 이소효소를 포함하는 분리된 생체시료, 조효소 및 약물을 혼합하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응물로부터 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계; 및 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 가스크로마토그래피 질량분석기로 정량하여 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계를 포함하는 약물의 생체대사작용 평가방법을 제공할 수 있다.
일 실시예로서 상기 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계는 상기 효소반응물에 추출용매로 에틸아세테이트 및 디클로로메탄의 혼합물을 처리하여 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 것을 포함할 수 있다. 상기 혼합물을 사용하면 본 발명의 효소 활성 분석에 대한 방해물질을 효과적으로 제거할 수 있어, 추출효율을 향상시킬 수 있다. 일 실시예로서 상기 생성물은 상기 시토크롬 P450 이소효소와 기질의 반응을 염기성으로 처리한 효소반응물을 에틸아세테이트 및 디클로로메탄의 혼합물을 추출용매로 하여 추출한 추출물일 수 있다.
상기 혼합물은 에틸아세테이트를 혼합물 총 부피에 대하여 1 부피% 이상, 10부피% 이상, 20 부피% 이상, 30 부피% 이상, 40 부피% 이상, 50 부피% 이상, 60 부피% 이상, 70 부피% 이상, 80 부피% 이상 또는 90 부피% 이상으로 포함할 수 있으며, 99 부피% 이하, 90 부피% 이하, 80 부피% 이하, 70 부피% 이하, 60 부피% 이하, 50 부피% 이하, 40 부피% 이하, 30 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 10 부피% 이하로 포함할 수 있으나, 상기 반응물을 효과적으로 추출할 수 있다면 상기 범위에 제한되지 않는다. 상기 혼합물은 디클로로메탄을 혼합물 총 부피에 대하여 99 부피% 이하, 90 부피% 이하, 80 부피% 이하, 70 부피% 이하, 60 부피% 이하, 50 부피% 이하, 40 부피% 이하, 30 부피% 이하, 20 부피% 이하 또는 10 부피% 이하로 포함할 수 있으며, 1 부피% 이상, 10부피% 이상, 20 부피% 이상, 30 부피% 이상, 40 부피% 이상, 50 부피% 이상, 60 부피% 이상, 70 부피% 이상, 80 부피% 이상 또는 90 부피% 이상으로 포함할 수 있으나, 상기 반응물을 효과적으로 추출할 수 있다면 상기 범위에 제한되지 않는다. 보다 구체적인 구현에로서 상기 혼합물은 에틸아세테이트 및 디클로로메탄을 20-80:80-20, 30-70:70-30 또는 40-60:60-40의 부피로 혼합한 혼합물일 수 있다.
상기 조효소는 NADP+ 등을 예로 들 수 있으며, 상기 시토크롬 P450 이소효소와 기질의 반응을 돕는 것이라면 이에 한정되지 않는다. 또한, 일 실시예로서 보조인자로 MgCl2 등의 금속이온이나 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산(ethylenediamine-tetraacetic acid: EDTA)와 같은 킬레이트 이온 등을 더 첨가할 수 있으며, 상기 보조인자는 효소에 일시적으로 결합하여 산화 환원되면서 효소가 활성을 띠게 하는 역할한다. 상기 킬레이트 이온은 마이크로좀과 NADPH가 존재할 때 지질과산화(lipid peroxidation)를 도와줄 수 있다.
상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계는 일 실시예로서 가스크로마토그래피 질량분석 전에 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물에 MSTFA(N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide), NH4I 및 DTE(dithioerythritol)를 넣고 열처리하여, 시토크롬 P450 이소효소를 유도체화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 유도체화 단계는 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물에서 질소를 완전히 제거한 후 데시케이터 안에서 진공상태로 30분 이상 보관한 다음, MSTFA : NH4I : DTE (500:4:2=w:v:v)를 50 μL 넣고, 60 heat block에서 30분 동안 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기와 같이 효소를 유도체화하면 시토크롬 P450 이소효소들과 상기 기질들은 효소반응을 통하여 생성된 생성물의 회수율을 100% 가까이 높일 수 있어, 가스크로마토그래피 질량분석시 발생할 수 있는 생성물의 감도 저하의 문제를 해결할 높일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계는 가스크로마토그래피 질량분석 결과 시토크롬 P450 이소효소 생성물의 농도가 높으면 해당 시토크롬 P450 이소효소의 활성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적인 실시예로서, 상기 효소활성은 시토크롬 P450 이소효소에 특이적으로 결합하는 상기 기질의 농도에 대한 상기 생성물의 농도로 나타낼 수 있으며, 기질이 효소와 시토크롬 P450 이소효소와 반응하여 기질의 농도가 감소하거나 생성물의 농도가 증가할수록 효소활성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 상기 관점에서, 약물의 생체대사작용 평가방법의 일 실시예는 상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석한 결과, 활성이 높으면 약물의 생체대사작용이 높은 것으로 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 생체시료는 예를 들어 포유동물의 간 마이크로좀, 보다 구체적인 예로는 인간의 간 마이크로좀 일 수 있으나, 약물의 대사작용을 확인할 수 있는 것이라면 이제 한정되지 않는다. 상기 약물은 일 실시예로서, 1종 또는 2종 이상의 약물 혼합물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 복수개의 약물을 포함하는 한약재일 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 분석대상물질 표준용액 제조 및 가스크로마토그래피 분석법
1-1. 시토크롬 P450
이소효소
결정
본 발명에서는 시토크롬 P450의 활성을 알아보기 위해, 가스크로마토그래피 질량분석(GC-MS)으로 검출할 수 있는 7가지 이소효소의 기질과 생성물을 결정하였다.
| P450 이소효소 | 기질 | 생성물 |
| CYP1A2 | 페나세틴(Phenacetin) | 아세트아미노펜(Acetaminophen) |
| CYP2A6 | 쿠마린(Coumarin) | 7-하이드록시쿠마린(7-Hydroxycoumarin) |
| 코티닌(Cotinine) | 3-하이드록시코티닌(3-Hydroxycotinine) | |
| CYP2C9 | 디클로페낙(Diclofenac) | 4-하이드록시디클로페낙(4-Hydroxydiclofenac) |
| CYP2C19 | (S)-메페니토인((S)-Mephenytoin) | 4-하이드록시메페니토인(4-Hydroxymephenytoin) |
| CYP2D6 | 덱스트로메트로판(Dextromethorphan) | 덱스트로판(Dextrorphan) |
| CYP2E1 | 클로르족사존(Chlorzoxazone) | 6-하이드록시클로르족사존(6-Hydroxychlorzoxazone) |
| CYP3A4 | 테스토스테론(Testosterone) | 6β-하이드록시테스토스테론(6β-Hydroxytestosterone) |
시토크롬 P450 이소효소 중 CYP2A6은 기질로서 각각 쿠마린과 코티닌의 2가지를 사용하였다. 이는 쿠마린은 한약재의 성분으로 빈번히 검출되는 물질로서 한약 탕재를 분석할 경우 쿠마린만을 기질로서 이용한다면 한약 탕재 안에 이미 존재하고 있는 쿠마린으로 인해 정확한 시토크롬 P450 효소의 약물 상호작용을 알 수 없고, 한약 탕재에 의한 효소의 활성을 예측할 수 없기 때문이다.
상기 표 1에 기재된 각 시토크롬 P450 이소효소의 효소반응결과 생성되는 생성물은 가스크로마토그래피 조건을 잡기 위해 시그마 알드리치와 산타크루즈 테크놀로지 그리고 BD 사이언스에서 구매하였다. 이를 메탄올을 이용하여 1000 μg/mL로 stock solution을 만든 뒤 50 μg/mL로 희석하여 사용하였다. 내부표준물질로는 카바마제핀(carbamazepine)을 사용하였다.
1-2. 가스크로마토그래피-질량분석기(
GC
-MS) 분석법
각 시토크롬 P450 이소효소의 생성물은 가스크로마토그래피-질량분석기(Gas chromatography-Mass sapectrometry, GC-MS)를 사용하여 분석하였다. 가스크로마토그래피와 질량분석기는 Agilent Technologies 7890A GC system, 5975C VL MSD 모델을 사용하였으며, 컬럼은 DB-5MS(30m×0.25 mm, 0.25 μm)로 분석하였다. 오븐온도는 280에서 분취방식으로 샘플링하여 그 비율은 12대 1로 하였고, 샘플의 주입용량은 1μL, 유속은 1mL/min으로 분석하였다. 오븐은 초기온도를 100로 하여 20/min의 속도로 가온되도록 하였고, 190에서 10/min으로 300까지 되도록 하여 1분간 유지하도록 하는 것으로 온도 조절을 프로그래밍 하였다. 이동상으로는 헬륨가스를 사용하여 물리, 화학적으로 안정하도록 하였고, 선택적인 이온화 모니터닝 방법으로 분석하였다. 질량분석기의 소스 온도는 230, 이온화 전압은 70 eV, 용매 지연시간은 5분으로 하였다.
[실시예 2] 시토크롬 P450의 추출 방법 및 반응조건
2-1. 시토크롬 P450 효소의 반응조건
시토크롬 P450 효소의 반응에 필요한 사람 간 마이크로좀(human liver microsome)은 BD 사이언스(Q452117)에서 구입하였고 20 mg/mL 농도를 사용하였다. 또한 반응을 돕는 조효소로써 NADPH와 MgCl2는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 실험에 사용한 이소효소 기질과 사람-간 마이크로좀 농도는 Km값에 따라 달리하여 반응시켜 GC-MS 분석에 적합한 최적의 반응조건을 결정하였다. 또한 각 이소효소의 반응속도에 따라 반응시간을 달리 함으로써 각 조건에서 생성물을 최대로 생성할 수 있는 반응시간으로 최적화하였다. 이로써 기질 혼합물 A, B, C로 나누었는데, 혼합물 A는 디클로페낙, (S)-메페니토인 및 태스토스테론으로 정하였고, B는 페나세틴 및 쿠마린, C는 그 외의 기질로 코티닌, 덱스트로메트로판 및 클로르족사존을 포함하였다. 상기 기질 혼합물 A, B 및 C의 자세한 정보는 하기 표 2에 게시하였다.
| 분류 | 기질 | 기질 농도 (μM) | 마이크로좀 농도 (mg/mL) |
| 혼합물 A | 디클로페낙 | 20 | 0.25 |
| (S)-메페니토인 | 20 | ||
| 테스토스테론 | 150 | ||
| 혼합물 B | 페나세틴 | 150 | 0.5 |
| 쿠마린 | 5 | ||
| 혼합물 C |
코티닌 | 100 | 1 |
| 덱스트로메트로판 | 100 | ||
| 클로르족사존 | 100 |
혼합물 A는 사람 간 마이크로좀 (농도 20 mg/mL), 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(potassuim phasphate buffer)를 각각 1.25 μL, 8.75 μL 혼합하였고, 혼합물 B는 사람 간 마이크로좀 (농도 20 mg/mL), 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(potassuim phasphate buffer)를 각각 2.5 μL, 7.5 μL, 혼합물 C는 사람 간 마이크로좀 (농도 20 mg/mL), 0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼(potassuim phasphate buffer)를 각각 5 μL, 5 μL로 혼합하였다. 각 혼합물 A, B, C의 최종농도는 0.23 내지 0.28 mg/mL, 0.48 내지 0.52 mg/mL, 0.98 내지 1.02 mg/mL로 최적화 하였다. NADPH를 제외한 나머지 반응요소들을 혼합한 다음, 이를 37 shaking incubator에서 5분간 pre-incubation 진행 후, NADPH (농도 50 mM) 20 μL를 넣어줌으로써 반응을 시작하였다. 이를 15분 반응시킨 뒤, pH 9의 차가운 암모늄 바이카보네이트 (NH4HCO3)를 197 μL 처리하여 반응을 멈추었고, 바로 아이스에 보관하였다. 모든 반응은 3번 반복하였고, 반응의 자세한 용량은 하기 표 3에 게시하였다.
| 반응 조건 | 용량 | ||
| 혼합물 A | 혼합물 B | 혼합물 C | |
| 기질 (μL) | 1 | 1 | 1 |
| 사람-간마이크로좀 (μL, 20 mg/mL) |
1.25 | 2.5 | 5 |
| 0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼 용량 (μL) | 8.75 | 7.5 | 5 |
| NADPH (μL, 50 mM) | 20 | 20 | 20 |
| MgCl2 (μL, 100mM) | 5 | 5 | 5 |
| 3차 증류수 (μL) | 64 | 64 | 64 |
| 총 반응용량(μL) | 100 | 100 | 100 |
| 암모늄 바이카보네이트 버퍼 용량 (μL) |
197 | 197 | 197 |
| Pre-incubation 시간 (분) | 5 | 5 | 5 |
| 반응시간 (분) | 15 | 15 | 50 |
2-2.
시토크롬
P450
효소 생성물의 추출
상기 시토크롬 P450 이소효소와 기질의 각 효소반응을 종료한 후, 내부표준물질인 카바마제핀을 3 μL (1000 μg/mL) 넣었다. 1차 추출을 위해 에틸아세테이트 1 mL을 넣고, 1분간 볼텍싱(vortexing)한 후 2분간 3500 rpm, 4로 원심분리를 하였다. 분리된 층에서 상층액을 새로운 테스트 튜브에 옮긴 후, 2차 추출로 디클로로메탄 1 mL을 넣어 다시 볼텍싱과 원심분리를 하였다. 유기용매 층을 1차 추출의 상층액과 함께 질소로 완벽하게 날렸다. 이를 유도체하기 전까지 데시케이터 안에 보관하였다. 최종 에틸아세테이트와 디클로로메탄의 비율은 1:1 (v:v)로 추출하였다.
2-3. 추출 용매에 따른 시토크롬 P450
이소효소
생성물의 추출효율 확인
상기 2.2와 같은 추출방법에 있어서, 여러 가지 용매에 따른 시토크롬 P450 이소효소의 추출효율을 확인하기 위해 첫 번째로 stop 용매의 pH를 3과 9로 처리한 에틸아세테이트와 디클로로메탄과 두 번째로 이 두 용매를 각각 처리한 것, 마지막으로 아세트나이트릴로 제단백 처리한 방법을 진행하고 그 추출효율을 확인하였다. 모든 실험은 3번 반복하였고, 그 결과는 표 4에 게시하였다.
| 생성물 | 염기성 stop- 에틸아세테이트-디클로로메탄 | 산성 stop- 에틸아세테이트-디클로로메탄 |
에틸아세테이트 | 디클로로메탄 | 아세토나이트릴 |
| 아세트아미노펜(Acetaminophen) | 89.1 | 32.6 | 70.5 | 23.7 | 65.4 |
| 7-하이드록시쿠마린(7-Hydroxycoumarin) | 97.5 | 74.9 | 82.1 | 108.1 | 65.8 |
| 3-하이드록시코티닌(3-Hydroxycotinine) | 101.4 | 8.0 | 14.6 | 63.0 | 60.6 |
| 4-하이드록시디클로페낙(4-Hydroxydiclofenac) | 88.5 | 74.8 | 80.5 | 24.7 | 68.2 |
| 4-하이드록시메페니토인(4-Hydroxymephenytoin) | 95.7 | 71.0 | 70.1 | 83.7 | 72.6 |
| 덱스트로판(Dextrorphan) | 84.8 | 42.0 | 26.1 | 65.9 | 85.0 |
| 6-하이드록시클로르족사존(6-Hydroxychlorzoxazone) | 115.8 | 67.1 | 82.1 | 98.1 | 124.3 |
| 6β-하이드록시테스토스테론(6β-Hydroxytestosterone) | 121.4 | 68.6 | 94.1 | 100.4 | 57.0 |
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 효소반응물을 염기성으로 반응을 종료하여 에틸아세테이트와 디클로로메탄의 혼합물로 추출한 경우 상기 8종의 모든 시토크롬 P450 이소효소들의 생성물이 100%에 가까운 추출효율을 보였다. 따라서 후술되는 실험에서는 상기 염기성 stop- 에틸아세테이트-디클로로메탄를 추출용매로 하여 추출한 생성물을 사용하였다.
2-4. 시토크롬 P450 효소의
유도체화
상기 추출된 8종의 각 생성물들을 데시케이터 안에서 진공상태로 30분 이상 보관한 후, MSTFA(N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) : NH4I : DTE(dithioerythritol)(500:4:2=w:v:v)를 50 μL 넣고, 60 heat block에서 30분 동안 처리하였다. 이를 식힌 후, 전용 바이알에 옮긴 후, 가스크로마토그래피에 1 μL 씩 주입하였다.
[실시예 3] 시토크롬 P450 이소효소의 활성 확인
상기 1-2. 가스크로마토그래피-질량분석기(GC-MS) 분석법에 기재된 바와 같이 각 시토크롬 P450 이소효소의 생성물의 가스크로마토그램 조건을 잡은 후, 이를 in vitro에서 효소 반응을 진행하여 가스크로마토그래피-질량분석기를 이용하여 효소의 활성을 확인하였다.
3-1. 시토크롬 P450
이소효소
생성물의 크로마토그램 확인
각 시토크롬 P450 이소효소 생성물의 크로마토그램 결과를 도 2에 나타내었다. 확인된 크로마토그램의 정보는 표 5에 나타내었다.
| P450 이소효소 | 생성물 | 확인된m /z | 첨가물(Adduct) | 머무름시간(분) |
| CYP1A2 | 아세트아미노펜(Acetaminophen) | 181 | [M-C3H6OSi+TMS+H]+ | 7.96 |
| CYP2A6 | 7-하이드록시쿠마린(7-Hydroxycoumarin) | 219 | [M+TMS-H]+ | 8.74 |
| 3-하이드록시코티닌(3-Hydroxycotinine) | 249 | [M+TMS-CH3]+ | 9.22 | |
| CYP2C9 | 4-하이드록시디클로페낙(4-Hydroxydiclofenac) | 302 | [M+TMS-CO2-HCl]+ | 14.85 |
| CYP2C19 | 4-하이드록시메페니토인(4-Hydroxymephenytoin) | 349 | [M+2TMS-2CH3]+ | 11.85 |
| CYP2D6 | 덱스트로판(Dextrorphan) | 329 | [M+TMS-H]+ | 12.10 |
| CYP2E1 | 6-하이드록시클로르족사존(6-Hydroxychlorzoxazone) | 286 | [M+2TMS-3CH3+3H]+ | 10.07 |
| CYP3A4 | 6β-하이드록시테스토스테론(6β-Hydroxytestosterone) | 520 | [M+2TMS-2H]+ | 16.70 |
| IS | 카르바마제핀(Carbamazepine) | 193 | [M+H]+ | 13.01 |
상기 표 5의 상기 카바마제핀은 내부표준물질(Internal standard)로서, 분석시 추출의 오류를 보정하기 위한 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법 결과 스토크롬 P450 이소효소 생성물 8종의 농도가 동시에 측정되었으며, 이를 통해 여러종류의 스토크롬 P450 이소효소 활성을 동시 분석할 수 있음을 확인할 수 있다.
3-2. 시토크롬 P450
이소효소
생성물의 생성속도 확인
각 시토크롬 P450 이소효소의 반응속도를 알아보기 위해 상기 8종의 기질을 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 mM의 농도별로 처리하였다 (최종 기질농도는 0, 10, 20, 50, 100, 200, 400 μM, 코티닌은 0, 20, 50, 100, 500 μM). 그 결과, 단위 시간당 기질에서 생성물로 옮기는 대사 회전수인 Kcat과 기질의 농도가 증가함에 따라 포화되는 속도의 1/2 대한 농도인 Km값 그리고 이 상수들을 나누어 효소 속도의 효율(Kcat/Km)을 도 3a 내지 도 3d와 표 6에 나타내었다.
| P450 이소효소 | 기질 | Kcat (분-1) | Km (μM) | Kcat/Km |
| M-1·분-1 | ||||
| CYP1A2 | 페나세틴(Phenacetin) | 1.19 | 156.6 | 0.007 |
| CYP2A6 | 쿠마린(Coumarin) | 2.23 | 7.19 | 0.310 |
| 코티닌(Cotinine) | 0.03 | 54.5 | 0.001 | |
| CYP2C9 | 디클로페낙(Diclofenac) | 9.60 | 2.09 | 0.442 |
| CYP2C19 | (S)-메페니토인((S)-Mephenytoin) | 0.10 | 31.6 | 0.003 |
| CYP2D6 | 덱스트로메트로판(Dextromethorphan) | 0.07 | 7.4 | 0.009 |
| CYP2E1 | 클로르족사존(Chlorzoxazone) | 0.02 | 296.4 | 0.001 |
| CYP3A4 | 테스토스테론(Testosterone) | 13.86 | 162.2 | 0.085 |
표 6과 같이 쿠마린, 디클로페낙 및 덱스트로메트로판은 다른 기질에 비해 Km값이 매우 낮게 나타났으며, 이는 효소에 의해 기질에서 생성물이 빠르게 전환됨을 의미한다. 즉, 효소의 기질에 대한 결합 친화도가 높음을 의미한다. 이 외의 기질들은 반대로 Km값이 높게 나타났으므로 효소의 기질에 대한 결합 친화도가 낮음을 알 수 있다.
3-3. 반응 시간에 따른 각 시토크롬 P450
이소효소
생성물 양
비교
상기 각 시토크롬 P450 이소효소의 생성물의 양을 반응시간에 따라 비교하였다. 반응은 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80분 동안 실시하였고, 80분 동안 반응시킨 생성물의 양을 100%로 정하여 각 시간대별로의 생성물을 비교하였다. 이는 각각 3번씩 실시하였고, 반응 결과는 도 4에 게시하였다.
도 4로부터 시간에 따른 생성물의 생성속도를 보면 7-하이드록시쿠마린, 4-하이드록시디클로페낙 및 덱스트로판은 반응시간이 늘어날수록 생성물의 속도가 100%에 가까워지며 점점 빨라졌음을 확인할 수 있다. 이는 기질에서 효소에 의해 생성물로 변화하는 것, 즉 기질-생성물 전환이 빠르다는 것을 의미한다.
[실시예 4] 시토크롬 P450 이소효소의 억제 확인
상기 시토크롬 P450 이소효소에 대하여 당업계에 알려져 있는 억제제를 농도별로 처리함으로써 상기 각 효소의 억제반응을 확인하였다 (최종 억제제 농도는 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 μM). 또한 이를 이용하여 효소의 50%의 억제시키는 억제제의 농도인 IC50값을 구하였다. 표 7에는 각 시토크롬 P450 이소효소의 억제제로 알려진 물질들과 그 물질의 농도에 따른 IC50값을 나타내었다. 도 5a 내지 도 5d에는 억제제를 농도별로 처리한 그래프를 게시하였다.
| P450 이소효소 | 기질 | 억제제 | IC50 (μM) |
| CYP1A2 | 페나세틴(Phenacetin) | α-나프토플라본(α-Naphthoflavone) | 0.032 |
| CYP2A6 | 쿠마린(Coumarin) | 8-메톡시프소랄렌(8-Methoxypsoralen) | 0.488 |
| 코티닌(Cotinine) | 0.409 | ||
| CYP2C9 | 디클로페낙(Diclofenac) | 설파페나졸(Sulfaphenazole) | 1.943 |
| CYP2C19 | (S)-메페니토인((S)-Mephenytoin) | S-벤질니르바놀(S-Benzylnirvanol) | 0.127 |
| CYP2D6 | 덱스트로메트로판(Dextromethorphan) | 퀴니딘(Qunidine) | 0.124 |
| CYP2E1 | 클로르족사존(Chlorzoxazone) | 디에틸디티오카르바메이트(Diethyldithiocarbamate) | 3.306 |
| CYP3A4 | 테스토스테론(Testosterone) | 케토코나졸(Ketoconazole) | 0.160 |
이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따르면 시토크롬 P450 이소효소를 반응시켜 가스크로마토그래피로 그 활성을 측정하고 이미 널리 알려진 각 시토크롬 P450 이소효소의 억제제를 농도별로 처리함으로써 최종적으로 50%억제되었을 농도를 확인할 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 본 발명에 따른 상기 기질과 미지시료 등을 시토크롬 P450 이소효소가 포함된 마이크로좀에 처리하여, 농도에 따른 미지시료의 시토크롬 P450 효소를 활성 또는 억제시킬 수 있음을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (14)
- 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소와 특이적으로 결합하는 기질을 포함하는,
가스크로마토그래피를 이용한 시토크롬 P450(Cytochrome P450) 이소효소 활성 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 시토크롬 P450 이소효소는 시토크롬 P450 1A2, 시토크롬 P450 2A6, 시토크롬 P450 2C9, 시토크롬 P450 2C19, 시토크롬 P450 CYP2D6, 시토크롬 P450 CYP2E1 및 시토크롬 P450 3A4로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
상기 기질은 페나세틴(Phenacetin), 쿠마린(Coumarin), 코티닌(Cotinine), 디클로페낙(Diclofenac), (S)-메페니토인((S)-Mephenytoin), 덱스트로메트로판(Dextromethorphan), 클로르족사존(Chlorzoxazone) 및 테스토스테론(Testosterone) 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,
가스크로마토그래피를 이용한 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물. - 제2항에 있어서, 상기 기질은
디클로페낙, (S)-메페니토인 및 테스토스테론으로 이루어진 그룹;
페나세틴 및 쿠마린으로 이루어진 그룹; 및
코티닌, 덱스트로메트로판 및 클로르족사존으로 이루어진 그룹;
중 하나 이상의 그룹을 포함하는, 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 시토크롬 P450 이소효소와 반응하여 생성물을 생산하는 것이고,
상기 생성물은 아세트아미노펜(Acetaminophen), 7-하이드록시쿠마린(7-Hydroxycoumarin), 3-하이드록시코티닌(3-Hydroxycotinine), 4-하이드록시디클로페낙(4-Hydroxydiclofenac), 4-하이드록시메페니토인(4-Hydroxymephenytoin), 덱스트로판(Dextrorphan), 6-하이드록시클로르족사존(6-Hydroxychlorzoxazone) 및 6β-하이드록시테스토스테론(6β-Hydroxytestosterone)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,
시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물. - 제4항에 있어서, 상기 생성물은 상기 기질과 시토크롬 P450 이소효소가 반응한 반응물을 추출한 추출물이고,
상기 추출의 추출용매는 에틸아세테이트 및 디클로로메탄의 혼합물인, 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 포유동물의 간 마이크로좀에 포함된 시토크롬 P450 이소효소와 특이적으로 반응하는 것인, 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물, 상기 시토크롬 P450 이소효소 및 조효소를 혼합하여 효소반응시키는 단계;
상기 효소반응물로부터 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계; 및
상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 가스크로마토그래피 질량분석기로 정량하여 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 확인하는 단계;
를 포함하는 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석방법. - 제7항에 있어서, 상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계는 가스크로마토그래피 질량분석 결과 시토크롬 P450 이소효소 생성물의 농도가 높으면 해당 시토크롬 P450 이소효소의 활성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석방법.
- 제7항에 있어서, 상기 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계는 상기 효소반응물에 추출용매로 에틸아세테이트 및 디클로로메탄의 혼합물을 처리하여 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 것을 포함하는, 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석방법.
- 제7항에 있어서, 상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계는 가스크로마토그래피 질량분석기의 이용 전에 상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물에 MSTFA(N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide), NH4I 및 DTE(dithioerythritol)를 넣고 열처리하여, 시토크롬 P450 이소효소를 유도체화하는 단계를 더 포함하는, 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 시토크롬 P450 이소효소 활성 분석용 조성물, 상기 시토크롬 P450 이소효소를 포함하는 분리된 생체시료, 조효소 및 약물을 혼합하여 효소반응시키는 단계;
상기 효소반응물로부터 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 추출하는 단계; 및
상기 추출된 시토크롬 P450 이소효소 생성물을 가스크로마토그래피 질량분석기로 정량하여 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석하는 단계;
를 포함하는 약물의 생체대사작용 평가방법. - 제11항에 있어서, 상기 시토크롬 P450 이소효소의 활성을 분석한 결과, 활성이 높으면 약물의 생체대사작용이 높은 것으로 평가하는 단계를 더 포함하는 약물의 생체대사작용 평가방법.
- 제11항에 있어서, 상기 생체시료는 포유동물의 간 마이크로좀인, 약물의 생체대사작용 평가방법.
- 제11항에 있어서, 상기 약물은 2종 이상의 약물 혼합물인, 약물의 생체대사작용 평가방법.
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| KR1020150075295A KR101824530B1 (ko) | 2015-05-28 | 2015-05-28 | 시토크롬 p450 이소효소 활성 동시 측정법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106841451A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-06-13 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法 |
| WO2018216909A1 (ko) * | 2017-05-23 | 2018-11-29 | 경북대학교 산학협력단 | 신약 후보물질의 약물 대사 효소 활성 평가용 조성물 및 이를 이용한 약물 대사 효소 활성 평가 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030097059A (ko) | 2002-06-19 | 2003-12-31 | 윤철호 | 구리 2가 이온을 유효성분으로 포함하는 시토크롬 p450 효소 및 nadph-시토크롬 p450 환원효소의 활성 저해제 |
-
2015
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20030097059A (ko) | 2002-06-19 | 2003-12-31 | 윤철호 | 구리 2가 이온을 유효성분으로 포함하는 시토크롬 p450 효소 및 nadph-시토크롬 p450 환원효소의 활성 저해제 |
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| KR20180128314A (ko) * | 2017-05-23 | 2018-12-03 | 경북대학교 산학협력단 | 신약 후보물질의 약물 대사 효소 활성 평가용 조성물 및 이를 이용한 약물 대사 효소 활성 평가 방법 |
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