KR20160138477A - 구리를 이용한 재조합 단백질의 발현 증가 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 단백질, 특히 재조합 Factor VIII, B 도메인이 결손된 재조합 Factor VIII, 재조합 Factor IX 및 rFVII 또는 rFVIIa와 같은 응고 단백질의 세포 발현을 개선하기 위한 구리 (제2 구리 이온)의 새로운 용도를 제공한다. 이러한 세포 배양 첨가물의 사용은 제조 공정의 생산성과 강건성(robustness)을 증가시킨다. 본 발명은 세포 발현과 생산 안정성을 향상시킨다.

Description

구리를 이용한 재조합 단백질의 발현 증가 방법 {ENHANCEMENT OF RECOMBINANT PROTEIN EXPRESSION WITH COPPER}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2014년 3월 23일자 미국 특허 출원 61/969,215을 기초로 하며, 이에 대해 우선권을 주장한다.

연방 지원에 의한 연구 또는 개발에 대한 진술: 해당되지 않음

재조합 단백질은 1980년대 이후로 배치 (batch) 방법 또는 관류에 기반한 세포 배양을 통해 제조되고 있다. 본 발명은 특히 포유류 세포에서 구리 첨가제의 사용에 의한 개선된 세포 발현을 제공한다. 본 발명은 CHO, BHK 및 인간 세포주, 특히 CHO와 같은 다수의 포유류 세포 배양물과, 재조합 Factor VIII (rFVHI), B 도메인이 결손된 rFVIII 및 재조합 Factor VII/Factor VIIa (rFVII/rFVIIa)와 같은 다수의 재조합 단백질을 발현시키는데 적용가능하다.

구리는 세포의 생장과 생존에 필수적이다. 구리의 기본적인 영양적 가치, 산화 스트레스의 촉매로서의 화학적 역할, 그리고 이의 석출 경향으로 인해, 특정 세포 배양 시스템 및 어플리케이션에 사용하기 위해서는, 이를 이해하고, 모니터링하고, 제형화하는 것이 중요하다.

구리는 전이 금속으로서, 시험관내에서 환원된 (제1 구리 (cuprous)), Cu (I) 및 산화된 (제2 구리 (cupric)), Cu (II), 구리로서 평형 상태로 존재한다. 구리는, 유리형 및 몇가지 킬레이트 형태로, 레독스 사이클링에 적극적으로 참여할 수 있다. 구리는, 세포 배양 프로세스의 최적화를 위해, 시스테인 및 아스코르베이트와 같은 다수의 주요 배지 성분들을 산화시킨다.

시험관내에서, Cu (I)는 환원된 시스테인, 글루타티온 및 잠재적으로 유기 설프하이드릴과의 착물을 자발적으로 형성하게 될 것이다. 제1 구리-시스테인 착물이 형성되는 것 외에도, Cu (II)는 다른 아미노산과도 이의 알파-아미노 질소 및 카르복시-산소 기와의 배위 결합을 통해 착물을 형성하게 될 것이다. Cu (II)이 히스티딘에 결합하는 것은, Cu (II)가 알부민으로부터 세포로 수송되는데 관여하는 중간과정으로 보이기 때문에, 중요하다. 구리는 세포 막을 통과할 수 있으려면, Cu (I)으로 환원되어야 한다.

구리는 산화 및 석출을 통해 세포 배양 배지내 시스테인과 시스틴의 감소를 야기할 수 있다. 시험관내에서, 시스테인은 자유롭게 용해성이며, 거의 중성 아미노산으로만 존재한다. 시스테인은 2-분자 산소 (di-molecular oxygen)의 존재 시 불안정하며, 비-효소적 자동 산화를 거치게 된다. 제2 구리 (Cupric copper)는 시스테인의 시스틴으로의 자동 산화를 가속화한다. 제2 구리는 시스틴과 킬레이트를 형성하여 석출될 수 있다. 세포 배양물내 시스테인이 고갈되면, 단백질과 주요 환원제인 글루타티온의 합성이 중단될 것이다. 환원된 글루타티온은 Cu (I)과 착물을 형성하게 되어, 하이드록시-무 함유성 라디칼의 형성에는 참여하지 못하게 될 수 있다. 이들 상호작용에는 시스테인의 황 원자가 관여한다. 생체내에서, Cu (I):글루타티온 착물은, 아마도 구리 트랜스포터 1 포어를 통해, 세포질로 유입되는 Cu (I)을 메탈로티오네인과 같은 세포내 결합 단백질로 안전하게 이동시키는 프로세스를 매개한다. Cu (I):글루타티온 착물의 형성은 자발적이며, 비-효소 반응이다 [Dieriek, P.J. (1986), In vitro interaction of organic copper (Π) compounds with soluble glutathione S-transferases from rat liver. [Res. Commun. Chem Pathol. Pharmacol. 51, 285-288].

본 발명은 세포 배양 배지에 구리 첨가제를 사용하는 단계를 포함하는 포유류 세포의 세포 발현을 높이는 방법을 제공한다. 구리 약 0.5 마이크로몰 내지 약 10.0 마이크로몰을 세포 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 구리 0.5 마이크로몰 내지 약 10.0 마이크로몰을 유사하게 첨가하면, 세포 비생산성이 증가된다. 제2 구리 이온이 구리 첨가제로서 특히 바람직하다. 제조 시스템은 보강된 세포 배양 배지 (augmented cell culture medium)와 포유류 세포로 구성된다. 세포 배양 배지에 사용하기 바람직한 포유류 세포는 CHO, BHK 또는 인간 포유류 세포이다. 불안정한 재조합 단백질이, 구리 첨가제를 이용하여 막-기반의 세포 체류 시스템으로 발현시키기 특히 적합한 후보 물질이다. 본 시스템은, 재조합 Factor VIII, B 도메인 제거된 재조합 Facter VIII, 재조합 Factor IX 및 rFVII 또는 rFVIIa로 이루어진 군으로부터 선택되는 응고 단백질을 생산하기 위해 관류 세포 배양법과 함께 이용가능하다.

배지의 삼투압농도 (osmolality)를 높이는 나트륨 및 칼륨과 같은 다른 벌크 이온의 첨가 역시 단백질 발현을 증가시킨다.

본 방법은 바람직하게는 막-기반의 세포 체류 시스템 및 관류 세포 배양과 조합하여 사용된다.

가장 바람직하게는, 세포 배양 배지에 제2 구리 이온을 약 0.5 내지 약 10.0 마이크로몰 첨가하는 것을 포함하고, 외부 막-기반의 세포 체류 시스템과 함께 사용되는 관류 세포 배양으로 구성된 제조 시스템을 이용하는 이러한 개선된 재조합 단백질 발현 방법은, 포유류 세포에서 B 도메인이 결손된 재조합 FVIII의 발현을 증가시키는데 사용된다.

도 1A와 2A는 배양물내 고 수준의 구리가 재조합 단백질 발현에 대한 미치는 영향을 나타낸 것이다. 2개의 도면에서, Y 축은 수득한 재조합 단백질 역가에 대한 정규화된 데이타이다. 점선은 구리를 추가적으로 첨가하지 않은 배지를 이용하여 수득된 데이타이며, 즉 배지에 천연적으로 존재하는 구리의 기저 농도는 0.087 마이크로몰에 불과하다. X 축은 생물반응기에서의 경과 일 수를 나타낸다. 실선은 구리를 추가로 첨가하였을 때 수득된 단백질 역가를 나타낸다.
도 1B와 2B는 고 수준의 구리가 재조합 단백질 비생산성 (specific productivity)에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 2개의 도면에서, Y 축은 X 축의 생물반응기에서의 경과 일 수 대비 재조합 단백질 비생산성에 대한 정규화된 데이타를 나타낸다. 점선은 구리를 추가적으로 첨가하지 않은 배지를 이용하여 수득된 데이타이며, 즉 배지에 천연적으로 존재하는 구리의 기저 농도는 0.087 마이크로몰에 불과하다. 실선은 구리를 추가로 첨가하였을 때 수득된 단백질 비생산성을 나타낸다.
도 3A와 3B는 배지에서 검출되는 기저 수준의 구리와 다양한 농도로 첨가된 구리 (0.315, 0.629 및 1.259 마이크로몰) 조건 하에서, 생물반응기에서의 경과 일수에 따른 재조합 단백질 역가와 재조합 단백질 비생산성을 각각 나타낸 것이다.
도 4는 정규화된 비생산성 (qp) 대 삼투압농도 및 구리 농도를 도시한 표면도 (surface plot)이다.

본 데이타는, 구리 무-첨가 배지를 이용하여 외막-기반의 세포 체류 디바이스에서 실험한 2013년에 생성되었다. (-) 구리로 표시되는 베이스라인 배양은 정상 배지에서 검출되는 구리 농도 16 - 160 나노몰 범위에서 수행되었다. 구리 첨가 효과에 대한 1차 실험 증거는, 구리가 첨가된 배지가 든 두 (2)개의 생물반응기에서 수득되었다. 열흘째 (10)에 구리를 첨가하였으며, 단백질 발현의 급격한 증가를 도시한 그래프에서 입증되는 바와 같이, 재조합 단백질의 발현에 즉각적인 효과가 나타났다. 황산구리(II) 또는 염화 구리(II) 또는 비슷한 특성을 가진 기타 제2 구리 염과 같은 제2 구리 이온 소스도, 세포 첨가 전에 배지에 첨가할 수 있으며, 유사한 결과를 달성할 수 있다. 도 1은 배양 배지에 구리를 40.9 마이크로몰 첨가한 효과를 나타낸다. 단백질 발현의 네배 (4) 내지 다섯배 (5) 증가가, 베이스라인 실험과 동일한 조건에서 작동시킨 동일한 2개의 생물반응기에서 입증되었다. 제2 구리 이온 형태로 구리를 약 40 마이크로몰 첨가하는 경우에 최적의 결과가 달성되는 것으로 보이며, 0.5 마이크로몰 내지 약 10.0 마이크로몰 범위의 그외 농도들 역시 유사한 결과를 달성하는 것으로 보인다.

초기 실험에서 확인된 고 농도의 구리가 미치는 효과를 더 잘 이해하기 위해, 구리 양을 줄여 추가적인 실험을 수행하였다. 도 2는 구리를 7.87 마이크로몰로 첨가하여 수득한 데이타를 나타낸다. 이 데이타는, 다른 모든 조건들은 베이스라인 생물반응기와 동일하게 하였는데, 구리를 7.87 마이크로몰 첨가하면, 단백질 발현이 세배 (3) 내지 네배 (4) 증가함을 보여준다.

단백질 발현에 대한 보다 합리적인 농도의 구리가 미치는 영향을 확인하기 위해 또 다른 생물반응기 실험을 수행하였다. 도 3은 생물반응기 운행 코스 동안 구리 농도를 변경하면서 운영된 동일한 2개의 생물반응기로부터 생성된 데이타를 나타낸다. 다른 파라미터들은 모두 베이스라인 실험과 동일하게 유지하였다. 이 데이타는, 도 2에 자세히 언급된 구리 첨가 농도 7.87 마이크로몰과 비교하였을 때, 구리는 0.315, 0.63 및 1.26 마이크로몰 농도에서 7.87 마이크로몰과 비슷하게 세배(3) 내지 네배(4)로 발현을 증가시킴을 입증해준다.

도 4는 각각 구리 농도 및 삼투압농도인 X 축과 Y 축에 대비 Z 축 (수직) 비생산성을 도시한 것이다. 이 데이타는, 첨가된 구리의 효과를 측정/입증하기 위해, 6일간, 250 mL 교반 플라스크, 배치 세포 배양 모델을 이용해, 수득되었다. 또한, 비생산성은 배지의 삼투압농도 증가에 따라 증가될 수 있지만, 최대 효과는 구리 이온 첨가시 관찰되었다. 실험의 반응 표면 설계는, 구리 농도와 삼투압농도를 각각 0.087 - 3.78 마이크로몰 및 270 - 380 mOsmo로 조정하기 위해, 염화구리(II) 및/또는 선택적으로 염화나트륨이 첨가된 기본 배지에, 배양물을 0.5e6 세포/mL로 접종하여, 수행하였다. 각각의 인자는 5가지 수준으로 선택하였다 (구리 농도: 0.087, 0.787, 1.495, 2.927 및 3.78 마이크로몰; 삼투압농도: 270, 310, 350, 360, 380 mOsmo). 그런 후, 6일간 살아있는 세포의 농도를 측정하기 위해 배양물에서 매일 샘플을 취하였다. 생성물의 농도 평가는 4-6일에 수행하였다. 비생산성은, 실험의 중간값 (310 mOsmo, 1,49 마이크로몰 Cu) 조건에서의 평균 비생산성에 대해 정규화한, 배치 배양 4일 - 6일의 평균 비생산성이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 삼투압농도 증가 및 구리 농도 증가에 따라 비생산성이 명확하게 증가하였다. 반응 표면 설계 실험에서 수득된 데이타를 통계학적으로 분석한 바, Cu와 삼투압농도 모두 비생산성에 대한 유의성이 매우 높았으며, P = 0.000 (임의의 P<0.05는 유의한 것으로 간주됨), 둘 간에 통계적으로 유의한 상호작용이 존재하였으며, P = 0.003, 표 1을 참조한다.

이 데이타를 모델링하기 위해 개발된 식에 따르면, 삼투압농도 270일 때 구리 농도를 0.087에서 3.78 마이크로몰 수준으로 증가시키면, 비생산성이 0.134에서 0.355로 증가하였으며, 삼투압농도 380일 때에는 1.2에서 2.15로 증가하였다. 마찬가지로, 구리 농도 0.087 마이크로몰일 때 삼투압농도를 270에서 380으로 증가시키면 비생산성이 0.143에서 1.22로, 구리 농도 3.78 마이크로몰 수준에서는 0.355에서 2.158로 명확하게 증가되었다.

항목	Coef SE	Coef	T	P
상수	1.28562	0.03053	42.107	0.000
Osmo	0.71634	0.03372	21.245	0.000
Cu ppb	0.28843	0.03492	8.260	0.000
Osmo*Osmo	0.10210	0.04882	2.091	0.063
Cu ppb*Cu ppb	-0.31375	0.05114	-6.135	0.0000
Osmo*Cu ppb	0.18223	0.04553	4.002	0.003

표 1은 삼투압농도 및 구리 농도에 따라 수집된 비생산성 데이타를 피팅시킨 회귀 모델 등식의 계수들을 나타낸 것이다. 등식은 표 1의 제1 열에 나타낸 바와 같이 상수 (constant), 2개의 선형 항목 (Osmo, Cu ppb) 및 3개의 비-선형 항목 (Osmo*Osmo, Cu ppb*Cu ppb, Osmo*Cu ppb)으로 구성된다. "Osmo"라는 항목은 배양물의 삼투압농도를 나타내는 것이고, "Cu ppb"라는 항목은 구리 농도를 나타내는 것이다. 각 항목에 대한 계수는 제2 열(Coef)에 열거하고, 이의 표준 편차는 제3 열 (SE Coef)에 열거한다. 제4 열은 계수의 T 통계로서, 계수를 계수의 표준 편차로 나눈 몫이다. T 값의 크기가 클수록, 계수의 유의성도 커진다. 제5 열은 각 항목의 p-값으로서, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 본다. 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, Osmo*Osmo 항목을 제외한 항목들 모두 p 값이 < 0.05이므로, 유의성이 있는 것으로 보인다. 최종 회귀 등식을 아래에 나타낸다.

Qp = 1.28562 + 0.71634*Osmo + 0.28843*Cu ppb + 0.10210*Osmo*Osmo - 3.1375*Cu ppb*Cu ppb + 0.18223*Osmo*Cu ppb

Claims (11)

1. 포유류 세포의 단백질 발현을 증가시키는 방법으로서,
   세포 배양 배지에 약 0.5 마이크로몰 내지 약 10.0 마이크로몰의 구리를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
2. 세포의 비생산성 (specific productivity)을 높이는 방법으로서,
   세포 배양 배지에 약 0.5 마이크로몰 내지 약 10.0 마이크로몰의 구리를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   보강된 세포 배양 배지 (augmented cell culture medium)와 포유류 세포를 포함하는 제조 시스템이 재조합 단백질의 제조에 사용되는, 방법.
4. 제2항에 있어서,
   보강된 세포 배양 배지 (augmented cell culture medium)와 포유류 세포를 포함하는 제조 시스템이 재조합 단백질의 제조에 사용되는, 방법.
5. 제3항에 있어서,
   상기 재조합 단백질이 응고 단백질 (coagulation protein)인, 방법.
6. 제3항에 있어서,
   상기 응고 단백질이 재조합 Factor VIII, B 도메인이 결손된 재조합 Factor VIII 및 재조합 Factor VII 또는 재조합 Factor VIIa로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 포유류 세포가 CHO, BHK 또는 인간 포유류 세포로부터 선택되는, 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 구리가, 단백질 발현에 대한 추가적인 강화제로서 배지의 삼투압농도를 높이는 나트륨 및 칼륨과 같은 다른 벌크 이온과 함께 첨가되는, 방법
9. 제1항에 있어서,
   막-기반의 세포 체류 시스템이 관류 세포 배양과 함께 사용되는, 방법.
10. 제1항에 있어서,
    첨가되는 상기 구리가 제2 구리 이온 (cupric ion) 형태인, 방법.
11. 포유류 세포에서 B 도메인이 결손된 재조합 Factor VIII의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    세포 배양 배지에 제2 구리 이온을 약 0.5 내지 약 10.0 마이크로몰 첨가하는 것을 포함하며, 외부 막-기반의 세포 체류 시스템 (external membrane based cell retention system)과 함께 관류 세포 배양 (perfusion cell culture)으로 구성된 제조 시스템이 사용되는, 방법.

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