KR20160133050A - 큐티나제를 이용한 왁스 에스테르의 제조방법 - Google Patents

큐티나제를 이용한 왁스 에스테르의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 큐티나제를 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올과 혼합하는 단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

큐티나제를 이용한 왁스 에스테르의 제조방법 {A method of preparing wax ester using cutinase}
본 발명은 큐티나제를 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올과 혼합하는 단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조 방법에 관한 것이다.
왁스(wax) 또는 왁스 에스테르(wax ester)는 탄소사슬이 긴 고급 지방산 및 지방 알코올의 에스테르 결합으로 구성되어 있다. 이는 보습 및 세안제에 사용되는 화장품 산업에 매우 중요한 천연 성분으로, 방향성 또는 기능성 성분을 용해하며 유화제로서 작용할 수 있다. 화장품 외에도 왁스 에스테르는 윤활제, 가소제 기능을 하는 성분으로서 각종 생활화학제품에서 널리 이용되고 있다. 또한, 최근 바이오디젤의 경제성이 문제되면서, 이를 극복하기 위한 방안으로 바이오디젤과 유사한 마이크로디젤로 왁스 에스테르가 제시되는 등 왁스 에스테르의 고부가 가치에 대한 관심이 증가하고 있다.
과거에는 왁스 에스테르를 고래를 포획하여 얻었지만 국제적으로 고래 포획이 금지됨에 따라, 식물로부터 왁스 에스테르를 공급받고 있다. 그러나 식물체에서 추출되는 양은 제한적이고 가격이 비싸다는 문제가 있다. 따라서 이를 극복하기 위해 화학적 또는 생물공학적 방법이 개발되고 있다. Duan 외(PLoS One. 2011;6(5))는 대장균에서 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) 유래 에탄올 생산 유전자와 아시네토박터 바일리(Acinetobacter baylyi) 유래 디아실글리세롤 아실트렌스퍼라제(diacylglycerol acyltransferase)를 함께 발현시켜 왁스 에스테르의 일종인 FAEE를 생산한바 있다. 그러나 여전히 왁스 에스테르 원료의 충분한 공급이 요구되고 있다.
큐티나제(cutinase)는 큐틴 기질을 가수분해할 수 있는 지질 분해 효소이다. 한국공개특허 10-2008-0028010는 큐티나제의 용도로서 세척제의 원료, 낙농업 분야에서의 유지방 분해, 청정 효소로서의 고분자 플라스틱의 생분해를 기재하고 있다. 그러나 큐티나제와 왁스 에스테르와의 관계에 대해서는 전혀 보고된바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 왁스 에스테르를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 큐티나제가 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올로부터 왁스 에스테르를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 큐티나제를 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올과 혼합하는 단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 큐티나제를 포함하는, 왁스 에스테르 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 담체를 수산화나트륨 용액에서 교반한 후, 완충 용액에서 교반하여 평형화하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 반응 생성물과 효소를 교반하는 제2단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조를 위한, 담체 고정화 큐티나제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 큐티나제를 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올과 혼합하는 단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조 방법을 제공한다.
종래 큐티나제는 지질 분해 효소로 알려져 있었으나, 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올로부터 왁스 에스테르를 제조하는 왁스 에스테르 합성효소의 역할을 할 수 있다는 것은 본 발명자들에 이르러 최초로 밝혀진 것이다.
왁스 에스테르 합성효소(wax ester synthase)는 탄소사슬이 긴 고급 지방산과 지방 알코올의 에스터교환반응을 촉매하는 효소이다. 본 명세서에서 왁스 에스테르 합성효소는 아실 코엔자임 A:디아실글리세롤 아실트렌스퍼레이즈(Acyl Coenzyme A:Diacylglycerol Acyltransferase) 또는 에틸트랜스퍼레이즈(ethyltransferase)와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 지방산(fatty acid)은 일 예로 탄소수가 11 이상의 고급 지방산인 것일 수 있으나, 지방 알코올과 반응하여 큐티나제가 왁스 에스테르를 제조할 수 있는 한, 당업계에 알려진 지방산을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 지방산은 올레인산(Oleic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 또는 그의 혼합물인 것일 수 있다.
상기 트리글리세라이드는 비제한적인 일 예로 팜유, 콩 오일, 카놀라유, 대두유, 홍화유, 아마인유, 옥수수유, 올리브유, 참기름, 면실유, 해바라기 오일, 겨자씨 오일, 포도씨 오일, 살구씨 오일, 쌀겨오일, 카멜리나 오일, 자트로파 오일, 땅콩 오일, 유채 오일, 중국 탤로 오일, 유동나무 오일, 피마자유, 어유, 조류유, 맥아 오일, 호호바 오일, 코코넛 오일, 아르간 오일, 마룰라 오일, 국화유, 로즈힙시드 오일, 및 대마유를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 일반적으로 당업계에 알려진 식물성 오일 등 트리글리세라이드라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다. 큐티나제는 지질 분해 효소이므로, 트리글리세라이드의 에스테르 결합을 분해하여 긴 사슬 지방산을 생성할 수 있다. 따라서 지방산 대신 트리글리세라이드를 알코올과 반응시켜 왁스 에스테르를 제조할 수 있다.
상기 지방 알코올(fatty alcohol)은 C1 내지 C22인 지방 알코올을 사용할 수 있다.일 예로 상기 지방 알코올은 탄소수가 6 이상의 고급 알코올인 것일 수 있으나, 지방산과 반응하여 왁스 에스테르를 합성할 수 있는 한, 당업계에 알려진 지방 알코올을 제한 없이 사용할 수 있다. 비제한적인 일 예로 상기 지방 알코올은 헥사놀, 옥타놀, 데카놀, 도데카놀, 테트라데카놀, 헥사데카놀, 옥타데카놀, 올레일알코올, 및 도코사놀로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 실시예에서는 지방산인 올레인산과, 지방알코올인 올레일알코올을 큐티나제와 반응시킨 결과, 왁스 에스테르인 올레일올레이트(oleyl oleate)을 생산함을 확인하였다(도 2, 도 5b). 또한 트리글리세라이드인 카놀라유, 해바라이유, 팜유, 대두유와, 지방알코올인 올레일알코올을 큐티나제와 반응시킨 결과, 각각 왁스 에스테르를 생산함을 확인하였다(도 3, 도4).
상기 왁스 에스테르는 바이오디젤인 지방산 에틸 에스테르 (FAEE, Fatty acid ethyl ester) 또는 지방산 메틸 에스테르 (FAME, Fatty acid methyl ester)인 것일 수 있다. 상기 지방산 에틸 에스테르는 에탄올과 지방산의 에스터교환반응(transesterification)을 통하여 제조되는 에스테르 화합물을 의미한다. 상기 지방산 메틸 에스테르는 메탄올과 지방산의 에스터교환반응(transesterification)을 통하여 제조되는 에스테르 화합물을 의미한다.
상기 큐티나제는 담체에 고정될 수 있다. 본 발명에 대한 일 실시예에 따르면 담체에 고정된 큐티나제는 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올로부터 왁스 에스테르를 합성하였으며(도 5b), 반응 기간 동안 효소의 안정성이 유지되는 것으로 나타났다(도 3 및 도 4). 또한 길이가 긴 탄소 사슬에 대한 결합 특이성이 높은 것으로 나타났다.
일 예로 상기 큐티나제는, 담체를 수산화나트륨 용액에서 교반한 후, 완충 용액에서 교반하여 평형화하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 반응 생성물과 효소를 교반하는 제2단계를 포함하는 방법에 의하여 담체에 고정화된 것일 수 있다.
상기 제1단계에서 상기 수산화나트륨 용액은 0.01 내지 0.5N 인 것일 수 있다. 또한 상기 완충 용액은 10mM 내지 30mM의 Tris-HCl 용액(pH 7.0 내지 9.0) 일 수 있다. 상기 제1단계의 반응 생성물은 완충용액이 제거된 것일 수 있다.
상기 담체에 고정된 큐티나제에서 담체와 큐티나제는 10:1 내지 5:5 중량비인 것일 수 있다.
상기 담체는 다공성 물질인 것일 수 있다. 일 예로 상기 담체는 아크릴계 또는 페놀계 다공성 유기 고분자인 것일 수 있다.
상기 큐티나제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 지질 분해 효소인 큐티나제의 활성을 가지는 단백질로 알려진 것이면 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 큐티나제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 높은 상동성, 예를 들면 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열로서, 실질적으로 왁스 에스테르 합성 활성을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 이러한 서열번호 1와 유사성을 갖는 서열로서 상기 큐티나제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한, 상기 변이체는 발현하고자 하는 숙주세포에 따라 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
상기 큐티나제는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 유전자에 의하여 코딩되는 단백질일 수 있다. 상기 유전자는 큐티나제를 코딩하는 한 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함할 수 있다. 상기 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다. 서열번호 2와 유사성을 갖는 서열로서 상기 큐티나제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열로 표시되는 유전자 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 큐티나제는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 재조합 벡터가 도입된 숙주세포에서 생산된 것일 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포에 도입 시 큐티나제를 미생물에서 효율적으로 발현시킬 수 있다. 상기 벡터의 제작 시에는 큐티나제를 코딩하는 유전자뿐만 아니라, 큐티나제를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 또는 인핸서(inhancer)를 포함하는 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열, 하나 이상의 선택성 마커 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 벡터를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 숙주세포는 효모일 수 있으나, 당업계에서 널리 사용하는 숙주세포, 또는 큐티나제를 합성하는 미생물이라면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 도입할 숙주세포에 코돈 최적화하여 도입할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 큐티나제를 포함하는, 왁스 에스테르 제조용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올을 추가로 포함할 수 있다. 상기 큐티나제, 지방산, 트리글리세라이드, 지방알코올, 왁스 에스테르는 상기한 것과 같다.
본 발명에 따른 일 실시예에서 지방산인 올레인산과, 지방알코올인 올레일알코올을 큐티나제와 반응시킨 결과, 왁스 에스테르인 올레일올레이트(oleyl oleate)을 생산함을 확인하였다(도 2, 도 5b). 또한 트리글리세라이드인 카놀라유, 해바라이유, 팜유, 대두유와, 지방알코올인 올레일알코올을 큐티나제와 반응시킨 결과, 각각 왁스 에스테르를 생산함을 확인하였다(도 3, 도4).
또 다른 양태로서, 본 발명은 담체를 수산화나트륨 용액에서 교반한 후, 완충 용액에서 교반하여 평형화하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 반응 생성물과 효소를 교반하는 제2단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조를 위한, 담체 고정화 큐티나제의 제조 방법을 제공한다.
상기 제1단계에서 상기 수산화나트륨 용액은 0.01 내지 0.5N 인 것일 수 있다. 또한 상기 완충 용액은 10mM 내지 30mM의 Tris-HCl 용액(pH 7.0 내지 9.0) 일 수 있다. 상기 제1단계의 반응 생성물은 완충용액이 제거된 것일 수 있다.
상기 담체에 고정된 큐티나제에서 담체와 큐티나제는 10:1 내지 5:5 중량비인 것일 수 있다.
상기 담체는 다공성 물질인 것일 수 있다. 일 예로 상기 담체는 아크릴계 또는 페놀계 다공성 유기 고분자인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 왁스 에스테르의 제조 방법은 큐티나제를 사용함으로써 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올로부터 왁스 에스테르를 용이하게 제조할 수 있으며, 반응 기간 동안 효소의 안정성을 유지하며 왁스 에스테르를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 발현벡터(pPICZαA/Cu)의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 의하여 지방산과 알코올로부터 제조된 왁스 에스테르의 박막크로마토그래피 전개도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 의하여 트리글리세라이드과 알코올로부터 제조된 왁스 에스테르의 박막크로마토그래피 전개도를 나타낸 것이다(반응시간: 2시간).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 의하여 트리글리세라이드과 알코올로부터 제조된 왁스 에스테르의 박막크로마토그래피 전개도를 나타낸 것이다(반응시간: 24시간). 도 3 및 4에 표시된 숫자는 다음과 같다: 1은 oleyl alcohol, 2는 oil, 3은 oil + oleyl alcohol, 4는 oleyi oleate, 5는 큐티나제/VP OC1600고정화 효소를 이용하여 반응한 합성물, 6은 큐티나제/Duolite A568고정화 효소를 이용하여 반응한 합성물, 7은 Novozyme 435를 이용하여 반응한 합성물, 8은 RMIM을 이용하여 반응한 합성물, 9는 RMIM을 이용하여 반응한 합성물. 도 3 및 4에 표시된 부호는 다음과 같다: (a)는 카놀라유, (b)는 해바라기유, (c)는 팜유, (d)는 대두유를 트리글리세라이드.
도 5a는 올레일 알코올 및 올레인산의 가스크로마토그래피 질량분석(GC-MS) 결과를 나타낸 것이다. 올레일 알코올은 22.5 min, 올레인산은 23.2 min 에서 검출되었다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 의하여 지방 알코올과 지방산을 큐티나제와 반응시킨 결과물을 가스크로마토그래피 질량분석(GC-MS) 하여 나타낸 것이다. 올레일 올레이트는 41 min 에서 검출되었다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 고정화된 큐티나제의 준비
1-1. 큐티나제 유전자의 수득
푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 큐티나제(서열번호 1)를 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 수득하였다. 이 때, PCR용 프라이머는 큐티나제의 N-말단 앞쪽으로 EcoR I이 위치하도록 설계된 정방향 프라이머와 큐티나제의 C-말단 뒤쪽으로 Xba I이 위치하도록 설계된 역방향 프라이머를 사용하였다.
정방향 프라이머
5'-GCGAATTCGCGCCTACTAGTAACCCTGCT-3' 서열번호 3
(GAATTC : restriction enzyme 1 EcoR I)
역방향 프라이머
5'-CATCTAGACATCAAGCAGAACCACGGACAGC-3' 서열번호 4
(TCTAGA : restriction enzyme 2 Xba I)
이 때, PCR 조건은 94℃ 5분, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 1분 30초) 및 68℃ 7분으로 설정하였다.
1-2. 재조합 발현벡터( pPICZ αA/ Cu ) 및 형질전환체의 제작
상기 실시예 1-1에서 수득한 큐티나제 유전자에 제한효소인 EcoR I/Xba I을 처리하여 DNA 단편을 수득하였다. 상기 수득한 DNA 단편을 벡터 pPICZaA의 다클론부위에 삽입하여 도 1과 같이 재조합 발현벡터(pPICZαA/Cu)를 제작하였다.
상기 제작된 재조합 발현벡터를 전기천공법(electroporation transformation)으로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris X-33) 균주에 도입하여 형질전환체를 제작하였다.
1-3. 큐티나제를 생산하는 최적의 형질전환체 스크리닝
발현 벡터가 독립적으로 존재하므로 각 세포가 도입된 유전자를 동일하게 발현시키는 박테리아와는 달리, 효모 균주인 피키아 파스토리스 균주는 동일한 발현벡터를 도입하더라도, 도입된 유전자의 발현수준이 형질전환체마다 상이하게 될 수 있다. 이에 따라, 상기 실시예 1-2에서 제작한 형질전환체 중에서 큐티나제를 가장 효율적으로 생산하는 형질전환체를 선발하기 위한 스크리닝을 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, BMMY 아가배지(1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate, 1.34% YNB, 4x 10^-5% biotin, 0.5% methanol, 2% agar, pH 6.0)에 0.8 %(v/v)가 되도록 트리부티린(tributyrin)을 가하고 초음파처리하여 불투명한 고체배지를 제작하였다. 상기 제작된 고체배지에 상기 실시예 1-2에서 제작한 형질전환체를 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
큐티나제의 발현에 따라 배지의 트리부티린이 분해되어 투명환이 형성되므로, 투명환의 면적 또는 반경을 기준으로 큐티나제 발현량 또는 활성이 높은 20개의 균주를 1차 스크리닝하였다.
상기 1차 스크리닝을 통해 선별된 20여개의 형질전환체를 1㎖ BMMY 액체배지(1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate, 1.34% YNB, 4x 10^-5% biotin, 0.5% methanol, pH 6.0)에 접종하였다. 그 후, 30℃ 및 200rpm 배양기에서 48시간 동안 배양하여 배양물을 수득하였다. 상기 수득한 배양물을 4000rpm으로 10분간 원심분리를 하여 배양 상등액을 수득하고, 상기 배양 상등액에 pNPB(para-nitrophenyl butyrate) 용액(100μM pNPB in 50 mM tris-HCl, pH 8.0)을 가하고, 10분간 반응시켰다.
큐티나제의 발현에 따라 pNPB는 분해되어 노란색을 나타내는 pNP(para-nitrophenol)를 분해산물로 생성하므로, 반응산물의 흡광도를 405 nm에서 측정하여 가장 높은 흡광도를 나타내는 형질전환체를 2차 스크리닝하였다.
상기 2차 스크리닝을 통해 선별된 형질전환체를 실험실적 규모(2l 배양)로 배양하고, 상기 배양물에 포함된 큐티나제의 함량을 측정한 결과, 순도 90% 이상의 큐티나제가 배양액 1 L 당 2g 이상의 수율로 생산됨을 확인하였다.
1-4. 담체에 고정화된 큐티나제 제작
(1) 최종 효소액 획득
상기 실시예 1-3에서 획득한 균주를 100ml BMMY 액체배지(1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate, 1.34% YNB, 4x10-5% biotin, 0.5% methanol, pH 6.0)에 접종하였다. 그 후 30℃ 및 200rpm 배양기에서 7일 동안 매 24시간 마다 0.5% 메탄올을 첨가하면서 배양하여 배양물을 수득하였다. 수득한 배양물을 4000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 선택하여, 재조합 균주로부터 발현된 효소액을 획득하였다. 획득한 효소액을 Lab scale TFF system(tangental flow filtration system, Merck KGaA)을 이용하여 농축하고, 완충용액을 20mM Tri-HCl, pH 8.0 완충용액으로 교환하여, 큐티나제를 포함하는 최종 효소액을 획득하였다.
상기와 동일한 방법으로 칸디다 안타르크티카 유래 리파아제의 변이체인 33-GG를 생산하는 균주를 배양한 후 33-GG를 포함하는 최종 효소액을 획득하였다.
(2) 고정화 효소 제작
담체로는 아크릴계 유기 고분자인 Lewatit VP OC 1600(Lanxess) 제품, 페놀계 유기 고분자인 Duolite A568(Dow Chemical Company) 제품을 사용하였다.
상기 획득한 최종 효소액을 담체에 고정화 하기 위하여 먼저 담체 1g을 0.1N NaOH용액과 상온에서 100rpm으로 교반하여 30분간 반응한 후 10ml증류수로 두 차례 세척하였다. 세척이 끝난 담체에 20mM Tris-HCl, pH 8.0 완충용액 10ml을 넣고 상온에서 100rpm으로 30분간 교반하여 평형화(equilibration)가 일어나도록 하였다. 그 후 완충용액을 제거하였다. 평형화가 끝난 담체 1g에, 효소 100mg이 포함된 효소액 10ml을 넣고 상온에서 100rpm으로 2시간 동안 교반하여, 담체에 고정화된 효소를 제작하였다. 그 후 10ml 증류수로 세척한 후 30℃에서 24시간 동안 건조시켜 최종적으로 고정화 효소를 획득하였다.
비교예 1. 리파아제 및 고정화된 리파아제의 준비
칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 유래 리파아제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 유래 리파아제는 노보자임에서 구입하였다. 칸디다 안타르크티카 유래 리파아제의 변이체, 및 이를 생산하는 균주는 한국등록특허 10-1176802에 기재된 33-GG, 및 그의 생산 균주를 사용하였다.
또한 칸디다 안타르크티카 유래 리파아제가 담체에 고정된 고정화 효소는 노보자임(Novozymes)에서 Novozyme 435를, 리조무코르 미에헤이 유래 리파아제가 담체에 고정된 고정화 효소는 노보자임(Novozymes)에서 RMIM를 구입하여 사용하였다.
실험예 1. 지방산과 알코올을 이용한 왁스 에스테르 제조
유리 바이알에 상기 실시예 1-4에서 제조한 고정화 효소 0.3g 또는 1g, n-헥산(hexane) 2ml, 2mmol 올레인산(Oleic acid), 4mmol 올레일 알코올(oleyl alcohol)을 넣은 후 37℃ 진탕 배양기에서 200rpm으로 1시간 또는 16시간 반응시켰다. 그 후 1:1 비율의 에탄올과 아세톤을 각각 7ml 넣어 반응을 정지시키고, 반응 상등액을 0.2um 필터로 여과하였다.
실험예 2. 트리글리세라이드와 알코올을 이용한 왁스 에스테르 제조
올레인산이 풍부한 식물성 오일인 카놀라유, 해바라이유, 팜유, 대두유(soybean oil)을 트리글리세라이드로 사용하였다.
유리 바이알에 상기 실시예 1-4에서 제조한 고정화 효소 0.3g, n-헥산 1ml, 1mmol 대두유, 3mmol 올레일알코올을 넣은 후 40℃ 진탕 배양기에서 2000rpm으로 2시간 또는 24시간 반응시켰다. 그 후 1:1 비율의 에탄올과 아세톤을 각각 7ml 넣어 반응을 정지시키고, 반응 상등액을 0.2um 필터로 여과하였다.
실험예 3. 왁스 에스테르 제조 확인
3-1. 박막크로마토그래피 ( TLC ) 전개를 통한 왁스 에스테르 제조 확인
상기 실험예 1, 2에서 얻은 샘플에서 왁스 에스테르를 분석하기 위하여 TLC 분석을 진행하였다.
TLC 플레이트는 TLC 실리카겔 60 F254 플래이트 (Merck)를 사용하였다. 실리카겔 플레이트를 크기에 맞게 자르고 100℃ 오븐에 30분 이상 놓아두었다. 상기 샘플을 실리카겔 플레이트에 5~10 ul씩 점으로 찍었다. 양성 대조군으로 왁스 에스테르 표준물질인 올레일올레이트(oleyl oleate; C36의 왁스 에스테르)을 사용하였다. 용매로는 헥산:디에틸에스테르:아세트산(hexane:Diethyl ether:acetic acid, 90 : 7.5 : 1 v/v)을 사용하였다. 용매를 유리판 안쪽에 넣고 실리카겔 플래이트를 양쪽에 담가 용매로 전개하였다. 전개된 플래이트를 100℃ 오븐에 넣어 30분 동안 말렸다. 그 후, 플래이트를 100℃ 오븐에 넣고 20분 동안 요오드 (99.8%) 증기로 왁스 에스테르를 감지하였다.
도 2는 실험예 1에 따라 지방산과 알코올을 이용하여 제조된 왁스 에스테르를 TLC 전개하여 나타낸 것이다. 표시된 숫자는 다음과 같다.
1: oleic acid + oleyl alcohol
2: oleic acid
3: oleyl alcohol
4: oleyl oleate (양성 대조군, 왁스 에스테르 표준물질))
5: 33-GG/VP OC1600 고정화 효소 0.3g을 이용하여 16시간 반응한 합성물
6: 33-GG/VP OC1600 고정화 효소 1g을 이용하여 16시간 반응한 합성물
7: VP OC 1600 1g을 16시간 반응한 합성물 (음성 대조군)
8: VP OC 1600 0.3g을 16시간 반응한 합성물 (음성 대조군)
9: 큐티나제/VP OC1600 고정화 효소 0.3g을 이용하여 1시간 반응한 합성물
10: 큐티나제/Duolite A568 고정화 효소 0.3g을 이용하여 1시간 반응한 합성물
11: 고정화 효소인 Novozyme 435 0.3g을 이용하여 1시간 반응한 합성물
12: 고정화 효소인 RMIM 0.3g을 이용하여 1시간 반응한 합성물
13: 33-GG/VP OC1600 고정화 효소 0.3g을 이용하여 1시간 반응한 합성물
상기 도 2에 도시된 것과 같이 담체에 고정된 큐티나제(9, 10)는, 칸디다 안타르크티카 유래 리파아제, 리조무코르 미에헤이 유래 리파아제와 같이 긴 사슬 지방산과 긴 사슬 알코올로부터 왁스 에스테르를 제조하는 것으로 나타났다. 음성 대조군인 담체(7, 8)에서는 올레인산과 올레일알코올 외에 반응 생성물이 나타나지 않았다.
도 3 및 도 4는 실험예 2에 따라 트리글리세라이드와 알코올을 각각 2시간(도 3), 또는 24시간(도 4) 반응시켜 제조한 왁스 에스테르를 TLC 전개하여 나타낸 것이다. 표시된 숫자는 다음과 같다.
1: oleyl alcohol
2: oil
3: oil + oleyl alcohol
4: oleyi oleate (양성 대조군, 왁스 에스테르 표준물질)
5: 큐티나제/VP OC1600고정화 효소를 이용하여 반응한 합성물
6: 큐티나제/Duolite A568고정화 효소를 이용하여 반응한 합성물
7: Novozyme 435를 이용하여 반응한 합성물
8: RMIM을 이용하여 반응한 합성물
9: RMIM을 이용하여 반응한 합성물
도 3 및 도 4에서 (a)는 카놀라유, (b)는 해바라기유, (c)는 팜유, (d)는 대두유를 트리글리세라이드로 한 경우를 의미한다.
도 3에 도시된 것과 같이, 담체에 고정된 큐티나제(5, 6)는, 칸디다 안타르크티카 유래 리파아제, 리조무코르 미에헤이 유래 리파아제와 같이 트리글리세라이드와 긴 사슬 알코올로부터 왁스 에스테르를 제조하는 것으로 나타났다. 또한 반응 시간이 증가됨에 따라 합성된 왁스 에스테르의 양이 증가하며, 효소의 안정성 또한 유지되는 것으로 나타났다(도 4).
3-2. 가스크로마토그래피 질량분석기( GC - MS )를 통한 왁스 에스테르 제조 확인
가스크로마토그래피 질량분석기 (Gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)를 이용한 왁스 에스테르 분석을 위해 박막크로마토그래피에서 분리된 왁스에스테르의 정제를 진행하였다.
실험예 3-1의 박막크로마토그래피에서의 왁스 에스테르 부분의 실리카겔을 긁어 클로로포름 1ml에 녹인 후 필터 정제를 통해 실리카겔을 제거하였다. 그 후 65℃ 오븐에서 클로로포름을 모두 증발시킨 후, 헥산 1ml에 녹여 가스크로마토그래프 질량분석기로 왁스 에스테르를 정성, 정량 분석하였다. 컬럼은 HP-5Ms UI (30m X 0.25mm X 0.25 um, Aglient)를 이용하였다. 운반가스로는 헬륨가스 (1.0 ml/min)을 사용하였고, 주입구온도（Injector temperature)는 250℃, 검출기온도 (Detector temperature)는 280℃로 맞춰주었다. 온도조건은 60℃에서 5분, 1분당 10℃씩 증가하여 300℃까지 증가시키고, 300℃에서 15분간 유지시켰다.
도 5a에 나타난 것과 같이 올레일 알코올은 22.5 min, 올레인산은 23.2 min 에서 검출된다. 반응 후 예상되는 생성물이자 양성 대조군인 올레일 올레이트는 41 min 에서 검출된다.
상기 실험에서 가스크로마토그래프 질량분석기로 분석한 결과, 도 5b에 도시된 것과 같이, 담체에 고정된 큐티나제를 올레일 알코올, 올레인산과 반응시킬 경우 생성물이 41 min 대에서 검출되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 큐티나제가 올레일 알코올, 올레인산으로부터 왁스 에스테르인 올레일 올레이트를 제조할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> A method of preparing wax ester using cutinase <130> KPA141329-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Fusarium solani <400> 1 Ala Pro Thr Ser Asn Pro Ala Gln Glu Leu Glu Ala Arg Gln Leu Gly 1 5 10 15 Arg Thr Thr Arg Asp Asp Leu Ile Asn Gly Asn Ser Ala Ser Cys Ala 20 25 30 Asp Val Ile Phe Ile Tyr Ala Arg Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Leu 35 40 45 Gly Thr Leu Gly Pro Ser Ile Ala Ser Asn Leu Glu Ser Ala Phe Gly 50 55 60 Glu Asp Gly Val Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Ala Tyr Arg Ala Thr 65 70 75 80 Leu Gly Asp Asn Ala Leu Pro Arg Gly Thr Ser Ser Ala Ala Ile Arg 85 90 95 Glu Met Leu Gly Leu Phe Gln Gln Ala Asn Thr Lys Cys Pro Asp Ala 100 105 110 Thr Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ala Ala Ala 115 120 125 Ser Ile Glu Asp Leu Asp Ser Ala Ile Arg Asp Lys Ile Ala Gly Thr 130 135 140 Val Leu Phe Gly Tyr Thr Lys Asn Leu Gln Asn Arg Gly Arg Ile Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Pro Ala Asp Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Thr Gly Asp Leu 165 170 175 Val Cys Thr Gly Ser Leu Ile Val Ala Ala Pro His Leu Ala Tyr Gly 180 185 190 Pro Asp Ala Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Leu Ile Glu Lys Val Arg 195 200 205 Ala Val Arg Gly Ser Ala 210 <210> 2 <211> 645 <212> DNA <213> Fusarium solani <400> 2 gcgcctacta gtaaccctgc tcaggagctt gaggcgcgcc agcttggtag aacaactcgc 60 gacgatctga tcaacggcaa tagcgcttcc tgcgccgatg tcatcttcat ttatgcccgg 120 ggttcaacag agacgggcaa cttgggaact ctcggtccta gcattgcctc caaccttgag 180 tccgccttcg gcgaggacgg tgtctggatt cagggcgttg gcggtgccta ccgagccact 240 cttggagaca atgctctccc tcgcggtacc tctagcgccg caatcaggga gatgcttggt 300 ctcttccagc aggccaacac caagtgccct gacgcgactt tgatcgccgg tggctacagc 360 cagggtgctg cacttgcggc cgcctccatc gaggacctcg actcggccat tcgtgacaag 420 atcgccggaa ctgttctgtt cggctacacc aagaacctac agaaccgtgg ccgaatcccc 480 aactaccctg ccgacaggac caaggtcttc tgcaatacag gagatctcgt ttgtactggt 540 agcttgatcg ttgctgcacc tcacttggct tatggtcctg atgctcgggg ccctgcccct 600 gagttcctca tcgagaaggt tcgggctgtc cgtggttctg cttga 645 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcgaattcgc gcctactagt aaccctgct 29 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 catctagaca tcaagcagaa ccacggacag c 31

Claims (15)

  1. 큐티나제를 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올과 혼합하는 단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방산은 탄소수가 11 이상의 고급 지방산인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 지방 알코올은 탄소수가 6 이상의 고급 알코올인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 트리글리세라이드는 팜유, 콩 오일, 카놀라유, 대두유, 홍화유, 아마인유, 옥수수유, 올리브유, 참기름, 면실유, 해바라기 오일, 겨자씨 오일, 포도씨 오일, 살구씨 오일, 쌀겨오일, 카멜리나 오일, 자트로파 오일, 땅콩 오일, 유채 오일, 중국 탤로 오일, 유동나무 오일, 피마자유, 어유, 조류유, 맥아 오일, 호호바 오일, 코코넛 오일, 아르간 오일, 마룰라 오일, 국화유, 로즈힙시드 오일, 및 대마유를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 큐티나제는 담체에 고정된 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 큐티나제는, 담체를 수산화나트륨 용액에서 교반한 후, 완충 용액에서 교반하여 평형화하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 반응 생성물과 효소를 교반하는 제2단계를 포함하는 방법에 의하여 담체에 고정된 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 담체는 다공성 물질인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 담체와 큐티나제는 10:1 내지 5:5 중량비인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 큐티나제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 포함하는 단백질인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 큐티나제는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 유전자에 의하여 코딩되는 단백질인 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 큐티나제는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 재조합 벡터가 도입된 숙주세포에서 생산된 것인, 왁스 에스테르의 제조 방법.
  12. 큐티나제를 포함하는, 왁스 에스테르 제조용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 조성물은 지방산 또는 트리글리세라이드, 및 지방알코올을 추가로 포함하는 것인, 왁스 에스테르 제조용 조성물.
  14. 담체를 수산화나트륨 용액에서 교반한 후, 완충 용액에서 교반하여 평형화하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 반응 생성물과 효소를 교반하는 제2단계를 포함하는, 왁스 에스테르의 제조를 위한, 담체 고정화된 큐티나제의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 담체와 큐티나제는 10:1 내지 5:5 중량비인 것인, 왁스 에스테르의 제조를 위한, 담체 고정화된 큐티나제의 제조 방법.
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