KR20160121971A

KR20160121971A - 광학 현미경과 이온 전류 측정을 이용한 전기 천공 방법 및 전기 천공 장치

Info

Publication number: KR20160121971A
Application number: KR1020150051893A
Authority: KR
Inventors: 강치중; 이홍기; 이태성; 박미라
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2015-04-13
Publication date: 2016-10-21
Also published as: KR101672399B1

Abstract

본 발명은 광학 현미경과 이온 전류 측정을 이용한 전기 천공법 및 전기 천공 장치에 관한 것으로서, 시료 및 탐침의 위치를 확인하는 광학 현미경; 상기 시료에 전압을 인가하고 DNA를 주입하는 제1 탐침 및 제2 탐침; 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침을 각각 고정하는 제1 탐침 홀더 및 제2 탐침홀더; 및 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전류를 인가하는 전류 제어기를 포함하는 전기 천공 장치를 제공한다. 또한 전기 천공 장치에 의한 전기 천공 방법을 제공한다.

Description

광학 현미경과 이온 전류 측정을 이용한 전기 천공 방법 및 전기 천공 장치{METHOD FOR LOCALIZED ELECTROPORATION USING OPTICAL MICROSCOPE WITH ION CURRENT MEASUREMENT AND DEVICE FOR THE LOCALIZED ELECTROPORATION}

본 발명은 광학 현미경과 이온 전류 측정을 이용한 전기 천공 방법 및 전기 천공 장치에 관한 것으로서, 구체적으로는 광학 현미경을 이용하여 세포 위에 탐침 전극을 일정한 높이로 유지시키면서 탐침에 일정한 전류를 인가하여 특정 세포에 선택적 DNA 주입을 가능하게 하는 전기 천공 방법 및 전기 천공 장치에 관한 것이다.

최근 분자 생물학 분야에서는 DNA, RNA, 단백질 또는 유전자(gene)와 같은 외인성 분자를 세포 내로 주입하는 기술이 다양하게 사용되고 있다. 예컨대, 시스템 내 세포의 생물학적 또 는 화학적 경로는 단백질 또는 2차 메신저 물질의 삽입을 통해 연구되고 있으며, 줄기 세포 연구 시에도 특정 단백질의 주입에 의해 세포 분화를 개시된다.

이러한 기술 가운데 전기 천공법(electroporation)은 전기적인 충격을 이용하여 일시적으로 세포막에 구멍을 만들어 DNA나 단백질과 같은 유전 물질을 세포 내로 주입하는 기술이고, 보다 구체적으로는 세포막을 투과하지 못하는 유전자 조합, 단백질 등 상대적으로 큰 물질을 전기 펄스를 이용하여 세포막 천공을 통해 세포 내로 도입되게 하는 유전자 도입법이다. 이러한 전기 천공법은 유전자 기능 분석을 통한 세포 연구뿐만 아니라 신약 개발 공정에도 이용 가능하므로 향후 고부가 가치 창출을 위한 산업화 노력이 지속적으로 필요한 분야이다.

종래 기술인 평행판 전극을 사용한 기존 전기 천공법의 개요도를 도 1에 도시한다. 평행판 전극 사이에 세포를 위치시킨 후 고전압을 인가함으로써 전기 천공을 실시하는 기존의 큐벳 방법은 다른 유전자 도입법에 비해 효율이 높지만, 수 킬로볼트(kV) 펄스에 의해 전극 주변 세포가 손상되고, 불균일한 전기장으로 인하여 유전자 도입이 무작위로 이루어진다는 단점이 있다. 특히 세포가 액상 부유 상태로 작업이 이루어지므로 이후 배지에 옮겨 세포 배양을 해야 하는 단점이 있다. 또한 전극 크기 등의 특성상 개별 세포에 적용할 수 없었다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0135209호(공개일 2013년12월10일)

본 발명은 종래의 전기 천공법이 가지는 단점을 극복하기 위해 제안된 것으로서, 본 발명은 광학 현미경을 이용하여 세포 위에 탐침 전극을 일정한 높이로 유지시키면서 탐침에 일정한 전류를 인가하여 특정 세포에 선택적 DNA 주입을 가능하게 하는 전기 천공법 및 전기 천공 장치를 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제1 특징으로서, 시료 및 탐침의 위치를 확인하는 광학 현미경; 상기 시료에 전압을 인가하고 DNA를 주입하는 제1 탐침 및 제2 탐침; 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침을 각각 고정하는 제1 탐침 홀더 및 제2 탐침홀더; 및 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전류를 인가하는 전류 제어기를 포함하는 전기 천공장치를 제공한다.

이때, 상기 제2 탐침은 전극이 코팅된 유리 피펫 탐침일 수 있다.

이때, 상기 제2 탐침 홀더는 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 인가되는 전류에 따라 상기 시료와 상기 제2 탐침 사이의 거리를 일정하게 유지할 수 있다.

이때, 상기 전류 제어기는 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 5 볼트(V) 이하의 저전압 펄스를 인가하는 것이 바람직하다.

한편, 상기 제1 탐침은 주사 탐침 현미경(SPM)의 주사 탐침으로 구성될 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제2 특징으로서, 시료 및 탐침의 위치를 확인하는 광학 현미경, 상기 시료에 전압을 인가하고 DNA를 주입하는 제1 탐침 및 제2 탐침; 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침을 각각 고정하는 제1 탐침 홀더 및 제2 탐침홀더; 및 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전류를 인가하는 전류 제어기를 포함하는 전기 천공장치를 이용한 전기 천공 방법에 있어서, (a) 광학 현미경으로 시료 및 탐침의 위치를 확인하는 단계; (b) 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전압을 인가하는 단계; (c) 상기 제2 탐침 홀더를 조절하여 시료와 상기 제2 탐침 사이의 거리를 일정하게 유지하는 단계; 및 (d) 시료 표면에 생성된 천공에 DNA를 주입하는 단계를 포함하는 전기 천공 방법을 제공한다.

이때, 상기 전류 제어기는 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 5 볼트(V) 이하의 저전압 펄스를 인가할 수 있다.

이때, 상기 제2 탐침은 전극이 코팅된 유리 피펫 탐침으로 이루어질 수 있다.

한편, 상기 제1 탐침은 주사 탐침 현미경(SPM)의 주사 탐침으로 이루어질 수 있다.

본 발명은 광학 현미경을 통해 전기 천공시 탐침과 세포간의 거리를 확인하여 탐침의 위치를 일정하게 유지시키므로 전기 천공의 효율과 신뢰성을 높을 수 있다.

또한, 탐침과 세포간의 거리 변화에 따른 이온 전류를 모니터링하고 제어하여 세포 손상을 미연에 방지 가능하다.

또한, 본 발명은 배양 세포에 직접 적용할 수 있기 때문에 효율과 세포의 생존율을 동시에 높일 수 있다. 뿐만 아니라, 종래 기술은 그 적용 범위가 제한적이었던 것에 비해 본 발명은 어떤 유형의 세포에도 적용될 수 있어 응용의 폭이 넓다는 장점이 있다.

도 1은 종래 방식인 큐벳 방법에 의한 전기 천공 방법을 설명하는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기 천공 장치의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 전기 천공 장치를 이용하여 DNA가 세포에 주입되는 예를 보여준다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명한다. 본 발명의 실시형태는 여러 가지의 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로만 한정되는 것은 아니다. 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다.

그리고 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 또는 "구비"한다고 할 때, 이는 반대 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함하거나 구비할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 전기 천공 장치의 모식도이다.

도 3은 본 발명의 전기 천공 장치를 이용하여 DNA가 세포에 주입되는 예를 보여준다.

도시된 바를 참조하면 본 발명에 따른 전기 천공 장치(1000)는 제1 탐침(120a), 제2 탐침(120b), 제1 탐침 홀더(110a), 제2 탐침 홀더(110b), 전류 제어기(200) 및 광학 현미경(500)을 포함한다.

제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)은 각각 제1 탐침 홀더(110a) 및 제2 탐침 홀더(110b)에 의해 고정되며, 전류 제어기(200)는 제1 탐침 홀더(110a) 및 제2 탐침 홀더(110b)를 통해 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)에 전압을 인가한다.

광학 현미경(500)은 시료와 탐침의 위치를 확인하는데 사용된다. 본 발명은 세포 천공을 형성하여 내부에 DNA를 주입하는 발명이므로 시료는 세포(300)를 의미한다.

제1 탐침(120a)은 주사 탐침 현미경(scanning probe microscope: SPM)에서 사용하는 탐침이며, 제2 탐침은 SPM 탐침의 프로브 부분이 전극이 코팅된 유리 피펫으로 이루어진다.

전류 제어기(200)는 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)에 전압을 인가하고, 양 전극 사이의 이온 전류를 모니터링 한다.

제1 탐침 홀더(110a) 및 제2 탐침 홀더(110b)는 모티터링 되는 전류에 따라 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)과 세포(300) 간의 거리를 일정하게 유지한다.

본 발명에 의한 전기 천공 방법은 광학 현미경으로 세포(300) 및 탐침(120a, 120b)의 위치를 확인하는 단계, 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)에 전압을 인가하는 단계, 제2 탐침 홀더(110b)를 조절하여 세포(300)와 제2 탐침(120b) 사이의 거리를 일정하게 유지하는 단계 및 세포(300) 표면에 생성된 천공(310)에 DNA를 주입하는 단계를 포함한다.

본 발명에 의한 전기 천공법에 따르면, 배양된 전기 천공 대상 세포(300)를 배지에 놓고 도입하고자 하는 물질을 함유하는 버퍼액으로 주변을 채운 시료를 제조한다. 이러한 시료를 주사 탐침 현미경의 스캐너 위에 올려놓고, 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)을 전기 천공 대상 세포(300) 위에 위치시킨다.

이때, 세포(300) 내에 도입하고자 하는 물질은 생체 분자 또는 약물일 수 있다. 생체 분자의 예로서, DNA, RNA, 단백질 또는 유전자 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 세포는 어떠한 종류의 세포를 사용하여도 상관이 없다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 사용 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

이때, 제2 탐침(120b)은 내부에 전극이 삽입된 유리 피펫 탐침을 사용할 수도 있다. 유리 피펫 탐침은 유리 피펫 탐침의 외벽에 금속이 더 코팅되어 있는 것이 바람직하다. 코팅되는 금속으로서, 금, 은, 알루미늄, 구리 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

제2 탐침(120b)은 탐침의 편평한 끝 부분을 제외하고 절연층이 코팅되어 있는 금속 코팅된 탐침일 수 있다. 이러한 탐침은 백금 등의 금속이 코팅되어 있는 일자형 탐침에 산화막, 질화막 등의 절연층을 코팅하고, 집속 이온빔(focused ion beam, FIB)을 이용하여 탐침의 끝 부분을 깎아내는 방식으로 제조할 수 있다. 금속 및 절연층은 예시된 것뿐만 아니라 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지된 것으로부터 적절하게 선택할 수 있다.

제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)은 나노 규모이다. 바람직하게는, 끝 부분 곡률반경이 10 nm ∼ 100 nm이다. 주사 탐침이 나노 규모이기 때문에, 전기 천공을 위한 전기장이 개별 세포에 대해 국소적으로 인가될 수 있고, 보다 정확하게 전기 천공할 수 있다.

전류 제어기(200)는 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)에 전압을 인가하고, 양 전극 사이의 이온 전류를 모니터링 한하고, 제1 탐침 홀더(110a) 및 제2 탐침 홀더(110b)는 모티터링 되는 전류에 기초하여 따라 제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)과 세포(300) 간의 거리를 일정하게 유지한다.

이온 전류를 측정하는 구체적인 방법은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으므로, 자세한 논의는 생략한다.

제1 탐침(120a) 및 제2 탐침(120b)이 세포(300)에 접근시키면서 이온 전류의 변화를 측정한다. 전류가 급격하게 변하는 순간을 기준 높이로 하고, 기준 높이에서 전기 천공을 수행한다. 이러한 방법은 세포(300) 표면으로부터 탐침(120b)의 위치가 일정 거리를 유지하도록 조절할 수 있기 때문에 거리 조절이 정확하다.

본 발명에 따른 전기 천공법에 따르면, 양 전극(120a, 120b) 사이에 저전압 펄스를 인가하여 전기 천공을 수행할 수 있다. 인가되는 저전압 펄스는 단지 수 볼트(V)의 전압에 불과하며, 바람직하게는 5 V 이하, 더욱 바람직하게는 2 V ∼ 5 V의 전압을 인가할 수 있다.

전기 천공 대상 세포(300)에 저전압 펄스를 인가하여 전기 천공을 수행하면, 세포 주변에 존재하는 물질이 천공(310)으로 주입된다. 이때, 제2 탐침(120b) 내부에 수용된 물질(DNA)도 천공(310)에 주입된다.

상기와 같이 본 발명은 광학 현미경(500)으로 전기 천공을 확인하므로, 전기 천공을 수행하는 일련의 과정을 관찰할 수 있으며, 전기 천공 이후의 세포를 관찰하는 것 또한 용이하다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이므로, 본 발명이 상기 실시예에만 국한되는 것으로 이해돼서는 안 되며, 본 발명의 권리범위는 후술하는 청구범위 및 그 등가개념으로 이해되어야 할 것이다.

110a, 110b : 탐침 홀더
120a, 120b : 탐침
200 : 전류 제어기
300 : 세포
310 : 천공
400 : 배지
500 : 광학 현미경

Claims

시료 및 탐침의 위치를 확인하는 광학 현미경;
상기 시료에 전압을 인가하고 DNA를 주입하는 제1 탐침 및 제2 탐침;
상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침을 각각 고정하는 제1 탐침 홀더 및 제2 탐침홀더; 및
상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전류를 인가하는 전류 제어기를 포함하는 전기 천공장치.
청구항 1에 있어서,
상기 제2 탐침은 전극이 코팅된 유리 피펫 탐침인 것을 특징으로 하는 전기 천공장치.
청구항 1에 있어서,
상기 제2 탐침 홀더는 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 인가되는 전류에 따라 상기 시료와 상기 제2 탐침 사이의 거리를 일정하게 유지하는 것을 특징으로 하는 전기 천공장치.
청구항 1에 있어서,
상기 전류 제어기는 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 5 볼트(V) 이하의 저전압 펄스를 인가하는 것을 특징으로 하는 전기 천공장치.
청구항 1에 있어서,
상기 제1 탐침은 주사 탐침 현미경(SPM)의 주사 탐침인 것을 특징으로 하는 전기 천공장치.
시료 및 탐침의 위치를 확인하는 광학 현미경, 상기 시료에 전압을 인가하고 DNA를 주입하는 제1 탐침 및 제2 탐침; 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침을 각각 고정하는 제1 탐침 홀더 및 제2 탐침홀더; 및 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전류를 인가하는 전류 제어기를 포함하는 전기 천공장치를 이용한 전기 천공 방법에 있어서,
(a) 광학 현미경으로 시료 및 탐침의 위치를 확인하는 단계;
(b) 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 전압을 인가하는 단계;
(c) 상기 제2 탐침 홀더를 조절하여 시료와 상기 제2 탐침 사이의 거리를 일정하게 유지하는 단계; 및
(d) 시료 표면에 생성된 천공에 DNA를 주입하는 단계를 포함하는 전기 천공 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 전류 제어기는 상기 제1 탐침 및 상기 제2 탐침에 5 볼트(V) 이하의 저전압 펄스를 인가하는 것을 특징으로 하는 전기 천공 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 제2 탐침은 전극이 코팅된 유리 피펫 탐침인 것을 특징으로 하는 전기 천공 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 제1 탐침은 주사 탐침 현미경(SPM)의 주사 탐침인 것을 특징으로 하는 전기 천공 방법.