KR20160118593A - 열 감응성 분자 주사기 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)이 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집된 자가결집체이며, 온도상승에 따라 플루로닉 사슬이 소수화되어 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동과 소수성 상호작용을 함에 따라 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동에 포접된 약물이 방출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 자가결집체는 열적 소수화된 플루로닉 사슬이 피스톤 역할을 하고 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동(cavity)이 실린더 역할을 하여 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe) 기능을 한다.

Description

열 감응성 분자 주사기 및 그 제조방법{Temperature-responsive molecular syringe and the preparation of the same}
본 발명은 열 감응성 분자 주사기 및 그 제조방법에 관한 것으로, 온도 변화에 반응하여 약물이 방출되는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe) 기능을 수행하는 자가결집체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
신남산(cinnamic acid)은 대표적인 방향족 불포화 카복실산의 하나로, 페닐기와 카복시기가 이중결합에 대하여 반대쪽에 있는 트랜스형과 같은 쪽에 있는 시스형의 이성질체가 있다. 신남산은 천연에서 얻을 수 있는 물질로 카복실기와 이중결합을 포함하고 있어 UV 조사 시, 이중결합의 첨가 환화(cycloaddition)에 의해 광 반응성을 관찰 할 수 있으며 카복실기에 의해 pH 반응성 또한 나타낼 수 있다(7. A. Rosso, S. Ferrarotti, M. V. Miranda, N. Krymkiewichz, B. C. Nudel, and O. Cascone, Biotechnol. Lett., 27, 1171 (2005).). 하지만 페닐기의 소수성에 의해 낮은 용해도를 나타내기 때문에 신남산 자체의 수용액상에서의 이용은 제한적인 실정이다.
베타 사이클로덱스트린(beta-cyclodextrin, β-CD) 중합체는 글루코스 분자가 연결된 환형 올리고당으로 그 외부 표면은 친수성이고 내부는 소수성인 공동이 원통형 구조를 가지고 있어 난용성 약물의 용해성 개선 및 흡수성의 개선 등 약물의 물리화학적인 성질을 개선시키는 것으로 알려져 있다(E. Efmorfopoulou and P. Rodis, Chem. Nat. Compd., 40, 362 (2004)).
온도 감응성 고분자인 플루로닉(Pluronic)은 polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) 의 삼원블록공중합체이다. 플루로닉(Pluronic)은 16% 이상의 수용액 농도일 때 온도 의존적(Temperature-dependent) 졸-젤 전이(sol-gel transition) 현상을 나타낸다(MR Kim, TG Park, Temperature-responsive and degradable Hyaluronic acid/Pluronic composite hydrgels for controlled release of human growth hormone, J Control Rel, 80, 69 (2002); T lnoue, G Chen, K Nakamae, et al., Temperature sensitivity of a hydrogel network containing different LSCT oligomers grafted to the hydrogel backbone, Polymer Gels Network, 5, 561 (1997)). 플루로닉(Pluronic)은 생체 내 주입 시 체액에 의해 희석되어 빠른 속도로 졸 상태로 바뀌어 수상에서는 쉽게 불안정하기 때문에 젤의 안정성이 문제시 되고 있다.
약물전달시스템(Drug Delivery System)은 약물의 방출, 흡수를 제어하거나, 체내의 특정부위에 약물을 표적화하여 전달하기 위한 것으로, 약물의 부작용을 줄이면서 효능을 극대화시켜 필요한 양의 약물을 표적부위에 일정시간 동안 효과적으로 머무를 수 있도록 조절하기 위한 것이다. 이를 위하여 나노기술을 이용한 약물전달 시스템의 새로운 소재개발에 많은 연구가 집중되고 있는데, 최근의 연구들은 화학적 고분자중합체를 이용한 약물전달시스템과 공학적 재료의 접목을 이용한 약물전달기구개발 등으로 크게 나누어 볼 수 있다. 약물이 체내에 과량 존재하면 독성을 나타내게 되고 반대로 너무 적은 양이 전달되는 경우에는 치료 효과가 나타나지 않기 때문에, 약물이 체내에서 일정한 시간 동안 치료효과가 나타나는 범위 내에 유지되어야 한다. 이를 위하여 장기간 약효를 지속할 수 있도록 약물의 방출속도를 느리게 만들거나, 온도, pH 등에 반응하여 약물의 방출속도를 제어할 수 있는 고분자중합체의 개발이 이루어지고 있다.
하지만 아직까지 피스톤과 같은 운동으로 인하여 탑재되어 있는 약물이 방출될 수 있으며, 특히 온도변화에 반응하여 피스톤 운동이 이루어져 탑재되어 있던 약물이 방출될 수 있는 분자주사기(molecular syringe)에 대해서는 연구가 이루어지지 않고 있는 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0050579호 대한민국 공개특허 제10-2011-0085771호 대한민국 공개특허 특2003-0071117호
본 발명에서는 온도 변화(temperature change)에 응답하여 내용물을 방출하는 온도 감응성 분자주사기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)이 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집된 자가결집체이며, 베타 사이클로덱스트린 잔기에 포접된 약물의 방출이 온도 변화에 따라 제어되는 것을 특징으로 하는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)를 제공한다.
또한, 본 발명은 온도상승에 따라 플루로닉 사슬이 소수화되어 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동과 소수성 상호작용을 함에 따라, 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동에 포접된 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)을 제공한다.
또한, 본 발명은 염화신나모일과 베타 사이클로덱스트린 중합체를 축합반응시켜 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)를 제조하는 단계; 염화신나모일과 플루로닉 F127을 축합반응시켜 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 제조하는 단계; 및 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 수상에서 용해시켜 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 자가결집 후, 자가결집체에 자외선을 조사하여 신남산 잔기를 광이량화하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)에 관한 것으로, 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)이 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집됨에 따라 온도 감응성 분자주사기(molecular syringe) 기능을 가지는 자가결집체를 특징으로 한다.
본 발명의 자가결집체(self-asembly)는 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 수상에 함께 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 베타 사이클로덱스트린 중합체(polymeric β cyclodextrin, PβCD)와 플루로닉 F127(Pluronic F127)는 수용성 고분자이고, 신나모일기(Cinnamoyl group)는 소수성 페닐기(phenyl group)을 가지고 있기 때문에, 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)은 양친매성(amphiphilic)을 나타낸다. 따라서, 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)가 수상에 용해되면 신나모일기(Cinnamoyl group)의 소수성 상호작용으로 인하여 자가결집체를 형성할 수 있다. 이와 같이 형성된 본 발명의 자가결집체(self-asembly)는 투과전자현미경 사진에 의하면 둥근 모양을 가졌으며 직경은 대략 100 ~ 200 nm이다.
본 발명의 자가결집체는 베타 사이클로덱스트린 잔기에 포접된 약물의 방출이 온도 변화에 따라 제어되는 온도 감응성 분자주사기의 기능을 수행하다. 본 발명의 자가결집체 용액의 온도가 증가하게 되면 플루로닉 사슬은 소수화되고 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동과 소수성 상호작용을 하게 된다. 이에 열적 소수화된 플루로닉 사슬이 피스톤 역활을 하고, 베타사이클로덱스트린 잔기의 공동은 실린더 역활을 하게 되어, 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동에 탑재되어 있는 화합물(예: 나일레드, 소수성 형광물질, 항암제 등의 약물)은 피스톤과 같은 운동으로 인하여 베타사이클로덱스트린 잔기의 공동으로부터 방출되어 나온다(도 1 참조). 예를 들면, 본 발명의 실시예 5에 의하면 방출 미디움의 온도가 10 ℃와 20℃일 때 자가결집체로부터 나일레드(NR)의 방출은 미미하였으나, 온도가 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃일 때 5분 동안 방출 정도는 각각 17 %, 25 %, 32 %, 52% 였다. 이는 열적 소수화된 플루로닉 사슬(hydrophobicized Pluronic chain)과 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동(cavity)의 소수성 상호작용으로 인하여 나일레드(NR)가 베타 사이클로덱스트린 잔기의 소수성 공동으로부터 방출되기 때문이다.
따라서, 본 발명의 분자주사기 기능을 하는 자가결집체는 온도변화에 응답하여 약물을 방출하는 약물전달체(drug carrier)로 사용될 수 있다.
본 발명의 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)의 제조방법을 각 단계별로 살펴보면 다음과 같다.
(A) 염화신나모일과 베타 사이클로덱스트린 중합체를 축합반응시켜 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)를 제조하는 단계
본 단계는 염화신나모일과 베타 사이클로덱스트린 중합체를 축합반응시켜 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)를 제조하는 단계이다.
우선, 베타 사이클로덱스트린 중합체(polymeric β cyclodextrin, PβCD)는 에피클로로하이드린(epichlorohydrin, EPI)를 이용하여 베타 사이클로덱스트린의 수산기를 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
다음으로, 염화신나모일(Cinnamoyl chloride)의 산염화물(acid chloride)과 베타 사이클로덱스트린 중합체(polymeric β cyclodextrin, PβCD)의 수산기 사이의 축합반응으로 염화신나모일을 베타 사이클로덱스트린 중합체에 공유결합시킨다. 예를 들면, 염화신나모일(Cinnamoyl chloride)과 베타 사이클로덱스트린 중합체(polymeric β cyclodextrin, PβCD)의 혼합용액을 약 0℃에서 24시간 동안 반응시켜 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)를 제조할 수 있다.
여기서, 베타 사이클로덱스트린 중합체(polymeric β cyclodextrin, PβCD)에 공유결합된 염화신나모일(Cinnamoyl chloride)는 광이량화할 수 있는 소수성화합물(photo-dimerizable hydrophobic compound)의 역할도 할 수 있다.
(B) 염화신나모일과 플루로닉 F127을 축합반응시켜 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 제조하는 단계
본 단계는 염화신나모일과 플루로닉 F127을 축합반응시켜 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 제조하는 단계이다.
상기 (A)단계에서와 동일한 축합반응을 이용하여 염화신나모일(Cinnamoyl chloride)을 플루로닉 F127(Pluronic F127)의 말단에 공유결합킬 수 있다.
(C) 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 수상에서 용해시켜 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집시키는 단계
본 단계는 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 수상에서 용해시켜 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집시키는 단계이다.
베타사이클로덱스트린 중합체와 플루로닉 F127는 수용성 고분자이고, 염화신나모일은 소수성 페닐기(phenyl group)를 가지기 때문에, 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)이 수상에 용해되면 염화신나모일(Cinnamoyl chloride) 잔기의 소수성 상호작용으로 인하여 자가결집체를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 이와 같이 형성된 자가결집체에 자외선을 조사하여 신남산 잔기를 광이량화함으로써, 자가결집체의 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)를 필요에 따라 화학적으로 결합시킬 수도 있다. 이와 같이 자외선을 조사하여 자가결집체의 신남산 잔기를 광이량화 하여도 자가결집체의 크기와 모양은 거의 변화되지 않는다.
이와 같이 제조된 본 발명의 자가결집체는 용액의 온도가 증가하면 플루로닉 사슬은 소수화되고 베타사이클로덱스트린 잔기의 소수성 공동과 소수성 상호작용을 하게 되어, 결과적으로 베타사이클로덱스트린 잔기의 공동에 탑재되어 있는 화합물(예, 나일레드(Nile Red, NR), 소수성형광물질, 항암제등의 약물)은 피스톤과 같은 운동으로 인하여 베타사이클로덱스트린 잔기의 공동으로부터 방출되어 나온다. 따라서, 본 발명의 자가결집체는 온도 감응성 분자주사기(molecular syringe) 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 자가결집체는 용액의 온도가 증가하면 플루로닉 사슬은 소수화되고 소수성 상호작용으로 베타사이클로덱스트린 잔기의 소수성 공동과 소수성 상호작용을 함에 따라, 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동에 탑재되어 있는 약물은 피스톤과 같은 운동으로 인하여 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동으로부터 방출되어 나올 수 있다. 따라서, 본 발명의 자가결집체는 온도 감응성 분자주사기 기능을 하며, 이에 따라 온도변화에 응답하여 약물을 방출하는 약물전달체(drug carrier)로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 자가결집체의 분자주사기 운동에 의한 약물의 온도 응답성 방출은 나타내는 모식도이다.
도 2는 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 베타 사이클로덱스트린 중합체(PβCD)와 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)의 FTIR 스펙트럼이다. 여기서, (A)는 PβCD, (B)는 CinPβCD이다.
도 4은 본 발명의 자가결집체(CinPβCD/CinPlu)의 UV 조사 전, 후의 TEM 사진이다. 여기서 (A)는 UV 조사 전, (B)는 UV 조사 후이다.
도 5는 나일레드가 탑재된 분자주사기 현탁액 용액(25℃)을 담고 있는 큐벳을 10℃, 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃로 맞춰진 큐벳 하우징에 넣었을 때 시간경과에 따른 온도변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 증류수에 현탁되어있는 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)로부터 나일레드(NR)의 온도의존성 방출 프로필이다.
도 7은 증류수에 현탁되어있는 본 발명의 자가결집체(CinPβCD/CinPlu)로부터 나일레드(NR)의 온도의존성 방출 프로필이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1 : 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체[Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin(CinPβCD)]의 합성 및 특성
베타 사이클로덱스트린 중합체(Polymeric β cyclodextrin, PβCD)는 "E. Renard, A. Dertani, G. Volet, B. Sebille, Eur. Polym. J., 33 (1997). pp. 49-57."에 개시된 방법대로 합성하였다.
0.5 g의 PβCD를 100ml의 둥근 플라스크에 담겨져 있는 30 mL의 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF)에 용해시켰다. 0.147g의 디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine, DMAP)과 0.7 mL의 트리에틸아민(triethylamine, TEA)를 PβCD 용액에 첨가하였다. 1.66 g의 염화신나모일(cinnamoyl chloride)를 10 ml의 DMF에 용해시키고 이를 PβCD/DMAP/TEA의 혼합용액에 적하시켰다. 반응혼합물을 약 0 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 생성물을 디에틸에스테르로 침전시키고 세정한 후 40℃로 설정된 오븐에서 건조시켰다.
중수(D2O)에 용해된 PβCD의 13C NMR 스펙트럼과 DMSO-d6에 용해된 CinPβCD의 1H NMR 스펙트럼을 분광기[a Bruker Avance 600 spectrometer (Karlsruhe, Germany, installed in the Central Labolatory Center of Kangwon National University)]를 이용하여 얻었다.
PβCD, 염화신나모일, CinPβCD를 KBr를 이용하여 펠렛한 후에 FT-IR 스펙트럼을 분광광도계[a Fourier transformed infrared spectrophotometer (FT-IR, FT-3000-Excalibur, Varian Inc., Cambridge, USA, installed in the Central Labolatory Center of Kangwon National University)]을 이용하여 얻었다.
PβCD에서 βCD 함량은 페놀프탈레인을 인티케이터로 사용하여 정량하였다.
CinPβCD에서 신남산 잔기의 함량은 UV spectrophotometer (6505 UV-vis. Spectrophotometer, Jenway, U.K.)를 이용하여 270nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
PβCD의 13C NMR 스펙트럼에서, 72.2 ppm과 53.1 ppm에서 관찰된 신호는 EPI잔기의 탄소 신호이고, 50.6 ppm에서 관찰된 신호는 βCD 잔기의 the primary surface에 있는 탄소신호이고, 72.6 ppm에서 관찰된 신호는 secondary surface에 있는 탄소신호이다. EPI잔기에 결합된 primary surface의 탄소는 70.8 ppm에서 관찰되었으나 EPI잔기에 결합된 secondary surface의 탄소 신호는 관찰되지 않았다. 따라서 primary surface의 수산기들만이 EPI와 반응하였다는 것을 알 수 있었다.
페놀프탈레인을 지시약으로 사용하여 작성된 βCD의 표준곡선은 Y = - 0.405 X - 0.068 (R2 = 0.9744) 이었다. 여기서 X는 βCD 농도(mg/ml)의 로그 값이고 Y는 550nm에서 페놀프탈레인의 흡광도이다. 표준곡선의 식과 PβCD 용액에서 페놀프탈레인의 흡광도값을 이용하여 계산한 결과 PβCD에서 βCD 잔기는 약 46.7 % 이었다.
도 2는 CinPβCD의 1H NMR 스펙트럼을 보여준다. 글루코스잔기의 C2, C3, C4, C5의 프로톤 신호와 EPI의 -CH-의 신호는 3.5 ppm ~ 5.2 ppm범위에서 발견되었다. EPI 잔기의 oxy methylene (-CH2-O-)의 프로톤은 3.06 ppm에서 관찰되었고 EPI 잔기의 hydroxyl methylene (-CH(OH)-)의 프로톤 잔기는 1.2 ppm에서 관찰되었다, 신남산 잔기의 비닐 프로톤 신호는 6.9 ppm과 8.2 ppm 에서 관찰되었고 신남산 잔기의 아로마틱 프로톤 신호는 7.3 ppm과 7.6 ppm에서 관찰되었다. 따라서, 신남산 그룹이 PβCD에 성공적으로 공유결합되었음을 알 수 있었다. 염화신나모일의 산염화물(acid chloride)는 축합반응을 통해서 βCD잔기의 수산기 뿐만 아니라 EPI 잔기의 수산기와도 반응할 것이다. 따라서 신남산 잔기는 PβCD 잔기 뿐만 아니라 EPI잔기에도 결합되었을 것이다.
도 3은 PβCD와 CinPβCD의 FTIR 스펙트럼을 이다. PβCD의 스펙트럼에서, 수산기 신호는 3400 cm-1에서 넓고 강한 신호로 관찰되었다. 수산기 신호는 βCD 잔기와 EPI잔기의 수산기 신호이다. CinPβCD의 스펙트럼에서, 수산기 신호는 PβCD 의 스펙트럼에서 관찰된 수산기의 신호보다 더 약하게 관찰되었고 에스테르 결합이 1716 cm-1에서 관찰되었다. 이것은 신남산(cinnamoyl acid)의 산염화물(acid chloride)가 PβCD의 수산기와 반응하여 에스테르 결합을 형성하기 때문이다.
에탄올에 용해되어 있는 염화신나모일(cinnamoyl chloride)의 표준곡선은 Y = 16.7 X + 0.0087 (R2 = 0.9994) 이다. 여기서 X는 염화신나모일의 농도(mM)이고 Y는 270 nm에서의 흡광도이다. 표준곡선과 CinPβCD 용액의 270 nm에서의 흡광도를 이용하여 CinPβCD에서 신나모일기(cinnamoyl group)의 함량을 계산한 결과 6.7 % (w/w) 이었다. PβCD에서 βCD의 함량은 46.7 % (w/w)로 결정되었고, CinPβCD에서 βCD/EPI/신나모일기(cinnamoyl group)의 무게비는 1:1.14:0.15로 계산되었고 몰비는 1:14:1.18로 계산되었다.
실시예 2 : 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체/신나모일 플루로닉(CinPβCD/CinPlu) 자가 결집체의 제조
신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)는 "M.H. Wang, J.C. Kim. J. Dispersion Sci. Technol., 36 (2015), pp. 377-383."에 개시된 방법대로 합성하였고, Pluronic F127 사슬과 신나모일기의 몰비율은 1:1.1이었다.
CinPβCD/CinPlu 자가결집체(이른바 '분자 주사기')를 제조하기 위해서, 50mg의 CinPβCD와 동일한 양의 CinPlu를 20ml의 유리병에 담겨져 있는 10ml의 증류수에 용해시켰다. 혼합물 용액에 자외선(365nm, 400W)을 30분 동안 조사하여 CinPβCD의 신남산 잔기와 CinPlu의 신남산 잔기를 이량화시켰다. 자가결집체를 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid) 용액(pH6.8, 2% in distilled water)으로 음성염색법(negative staining)으로 염색한 후, 투과전자현미경[Transmission Electron Microscope (LEO 912AB OMEGA, Germany)]을 이용하여 자가결집체의 이미지를 얻었다.
도 4는 자외선을 조사하기 전·후 CinPβCD/CinPlu 자가 결집체(분자 주사기)의 TEM사진이다(A: UV 조사 전, B: UV 조사 후). 자가결집체는 하얀색의 둥근 입자로 관찰되었고 직경은 100 ~ 200 nm이었다. 신남산 잔기는 페닐그룹을 가지고 있어 소수성을 나타낸다. 따라서 신남산 잔기를 지니고 있는 CinPβCD와 CinPlu는 분자간 소수성 상호작용을 할 수 있고 수상에서 자가결집하여 입자를 형성할 수 있다. 자외선을 조사하여 자가결집체의 신남산 잔기를 이량화 하여도 자가결집체의 크기와 모양은 거의 변화하지 않음을 확인할 수 있었다. 자외선을 조사하면 신남산 잔기들 사이에서 사이크로 부탄 다리(cyclobutane bridge)가 형성되기 때문에 신남산 잔기는 광이량화(photo-dimerization)된다. 광이량화를 위한 필요조건은 신남산 잔기가 또 다른 잔기와 충돌(collision)하는 것이다. 신남산 잔기가 고분자에 결합되어 있기 때문에 용액에서 자유도는 제한될 것이다. 이와 같은 상황에서, 광 이량화는 서로 근접해 있는 신남산 잔기들 사이에서 발생할 것이다. 이와 같이 짧은 범위에 걸쳐서 광 이량화가 발생하기 때문에 자가결집체의 모양과 크기에 영향을 거의 미치지 못할 것으로 판단되었다.
실시예 3 : 베타사이클로덱스트린(βCD) 용액에서 나일레드(Nile Red, NR) 가용화
βCD를 증류수에 용해시켜서 그 농도가 0 mM에서 4 mM이 되게 하였다. 과량의 나일레드(NR, 5 mg)을 10ml의 유리병에 담겨져 있는 5 ml의 βCD용액에 첨가한 후에 롤러믹서(roller mixer, Hwashin 205rm,Korean)를 이용하여 25 ℃에서 24시간 동안 교반하였다. 주사기 필터(기공크기 400 nm, Whatman No. 541)를 이용하여 여과한 후에, 형광분광광도계(fluorescence spectrophotometer, Hitachi F2500, Japan)를 이용하여 590 nm에서 여과액을 여기시켜 642 nm에서 여과액의 형광세기를 측정하였다.
βCD 용액에서 NR의 형광성 세기는 Y =15.7X + 8.86 (R2 = 0.9949)으로 표현될 수 있는데, 여기서 Y는 NR의 형광성 세기이고 X는 βCD의 농도(mM)이다. 상기 방정식에서 알 수 있듯이 NR의 형광성 세기는 βCD농도에 비례하는데, 이것은 NR의 용해도가 βCD농도가 증가할수록 증가한다는 것을 의미한다. NR은 비극성이고 분자량은 비교적 낮기 때문에(분자량 318.4), βCD의 소수성 공동으로 포접될 것이다. βCD는 NR과 1:1 몰비로 포접복합체(inclusion complex)가 형성된다고 보고되었다("P. Hazra, D. Chakrabarty, A. Chakraborty, N. Sarkar, Chem. Phys. Lett., 388 (2004), pp. 150 ~ 157.").
실시예 4 : CinPβCD/CinPlu 자가 결집체에 NR 탑재
과량의 나일레드(NR, 10 mg)을 20ml의 유리병에 담겨져 있는 10 ml의 CinPβCD/CinPlu 자가결집체(분자주사기) 용액(1%, w/w)과 10 ml의 CinPβCD 용액(1 %, w/w)에 첨가하였다. 그리고 유리병을 상온에서 24시간 동안 롤러 믹서(roller mixer)에서 롤링함으로써 혼합물을 혼합하였다. 용해되지 않은 NR은 주사기 필터를 통하여 혼합물을 여과함으로써 제거하였다. 여과액(NR이 탑재된 CinPβCD/CinPlu 자가결집체를 함유한 여과액 또는 NR이 탑재된 CinPβCD을 함유한 여과액)의 형광세기를 570nm에서 여기하여 615nm에서 측정하였다. 여과액의 형광세기를 이용하여, 분자주사기에 탑재된 NR의 양과 CinPβCD에 탑재된 NR의 양을 "βCD 용액 농도에 대한 NR형광성의 표준 곡선"(βCD 용액에서 NR 가용화에서 얻어진 표준곡선)을 이용하여 결정하였다. 그 다음, NR의 비 탑재량(specific loading)은 탑재된 NR 질량을 고분자의 질량으로 나누어 줌으로써 계산되었다.
분자주사기에 NR의 비탑재량(specific loading)은 5.5%(wt NR/wt polymer)로 계산되었고, CinPβCD에 NR의 비탑재량은 11.8%(wt NR/wt polymer)로 계산되었다. 분자 주사기는 CinPβCD와 CinPlu로 구성(1:1 무게비)구성되어 있고 CinPβCD에서 βCD의 함량은 43.6 %(wt/wt)이었기 때문에, βCD 잔기 양에 기초한 NR의 비 탑재량은 약 25.1 % (wt NR/wt βCD residue)로 계산되었다. 그리고 분자주사기에서 βCD 잔기에 대한 NR의 몰비는 0.89:1로 계산되었다. 동일한 방법으로, CinPβCD에서 NR:βCD 잔기의 몰비는 0.97:1로 계산되었다. 이와 같은 결과들은 βCD가 1:1 몰비로 NR과 포접 복합체(inclusion complex)를 형성한다는 문헌의 보고와 일치한다. CinPβCD의 βCD잔기가 거의 1:1 몰비로 NR과 포접 복합체(inclusion complex)를 형성한다는 것은 βCD 공동(cavity)이 고분자 중합반응 후에도 변성되지 않고 온전하다는 것을 의미하고, 또한 상온에서 CinPlu와 EPI 세그먼트(segment)가 βCD 잔기와 NR 사이의 포접복합체 형성을 방해하지 않았다는 것을 의미한다.
실시예 5 : CinPβCD/CinPlu 자가 결집체로부터 NR의 온도의존성 방출
NR이 탑재된 CinPβCD/CinPlu 자가결집체 (분자주사기) 용액 0.5 ml을 0.5 ml 큐벳에 넣었다. 그 다음 큐벳을 형광분광계의 하우징에 넣고 큐벳하우징을 둘러싸고 있는 워터제킷을 통해서 특정온도의 물을 순환시킴으로써 큐벳 하우징의 온도를 10 ℃, 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃로 맞추었다. 분자주사기 용액의 형광세기를 13분 동안 시간 경과에 따라서 측정하였다. 분자주사기 용액의 온도는 서모커플(thermocouple)을 이용하여 측정하였다. 대조군(control)으로 CinPβCD-CA으로부터 온도변화에 따라서 방출되는 NR의 양을 동일한 조건에서 관찰하였다. 방출 정도는 다음과 같은 방정식을 이용하여 결정하였다.
방출정도(Release, %) = (1 - F/Fi) x 100
여기서 Fi는 초기 형광성 세기이고(NR이 탑재된 고분자 용액의 25℃에서의 형광성 세기), F는 큐벳을 특정 온도로 맞춰져 있는 하우징에 넣은 후 특정한 시간에서 측정한 형광성세기이다. 형광세기는 형광분광을 이용하여 570m에서 여기시키고 615 nm에서 형광세기를 측정하였다. NR은 비극성 환경에서 형광성을 나타내지만 극성환경에서는 형광성을 나타내지 않는다. 따라서, NR은 비극성인 βCD 공동(cavity)에 포접될 경우에 형광성을 나타낼 것인고 극성인 물에 있을 경우에는 형광성을 나타내지 않을 것이다. 사실상, 형광세기는 βCD에 포접된 NR양에 비례한다("βCD 용액에서 NR 가용화" 참조). 이것은 NR 방출정도가 NR이 탑재된 CinPβCD/CinPlu 자가결집체 고분자 용액의 형광세기를 결정함으로써 결정될 수 있는 이론적 근거를 제시한다.
도 5는 NR이 탑재된 고분자 용액(분자주사기 현탁액)(25℃)을 함유한 큐벳을 특정온도에 맞추어진 큐벳 하우징에 넣은 후에 관찰한 온도 변화이다. 시간 0에서 온도는 25℃ 이었고, 처음 100초 동안 빠르게 변하였고 400 초 후에 지정온도(Set Temperature)에 도달하였다.
도 6은 증류수에서 CinPβCD로부터 NR의 방출 프로필을 10℃, 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 관찰한 결과이다. 데스트한 모든 온도에서 감지할 만한 방출은 관찰되지 않았다. βCD 잔기 공동의 소수성도 NR의 비극성도 온도의 영향을 거의 받지 않을 것이고 그리고 βCD 잔기 공동과 NR사이의 소수성 상화작용 역시 온도의 영향을 거의 받지 않을 것이다.
도 7은 10℃, 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 수상에서 CinPβCD/CinPlu 자가결집체(분자주사기)로부터의 NR방출 프로필이다. 온도가 10 ℃와 20℃ 일 때, 800초 동안 감지할 만한 방출은 보이지 않았다. 그러나, 30℃에서 감지할 만한 방출이 관찰되었고 방출정도는 방출 미디움의 온도에 비례하였다. 예를 들면, 온도가 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃ 일 때, 최대 방출 정도는 각각 17%, 25%, 32%, 52% 이었다. 방출정도는 포화적으로 증가하였고 방출 미디움 온도가 그랬듯이 방출 정도는 300초 후에 최대값에 도달하였다. 이것은 NR방출의 온도의존성이 높다는 것을 보여준다.
플루로닉(Pluronic) F127는 낮은 임계 용액 온도(lower critical solution temperature)를 보여주는 온도 감응성 고분자이다. 고분자 사슬은 낮은 온도에서 수화되고 친수성을 나타내고 온도가 상승하면 탈수화되고 소수화된다. 따라서, 낮은 온도(예 10 ℃ 그리고 20 ℃)에서 고분자 사슬들은 CinPβCD/CinPlu 자가 결집체에서 수화된 형태로 존재할 것이고 βCD 잔기의 소수성 공동과 상호작용이 어려울 것이다. 반면, 높은 온도에서는(예 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃), 고분자 사슬은 탈 수화된 상태로 존재할 것이고 βCD 잔기의 공동과 강하게 상호작용할 것이다. 결과적으로, 온도상승으로 인하여 소수화된 플루로닉(Pluronic) 사슬들은 NR과 함께 βCD 잔기 공동과의 소수성 상호작용에 대해서 상호 경쟁한다. 그리고 온도상승으로 인하여 소수화된 플루로닉(Pluronic) 사슬(분자 피스톤)과 βCD잔기의 공동(실린더)의 상호작용으로 NR이 βCD 잔기의 공동으로부터 밀려 나올 수 있다. 이러한 이유 때문에 NR이 높은 온도에서 방출되는 것이다.
이상 종합하면, 본 발명의 분자주사기 역할을 하는 자가 결집체는 온도변화에 따라서 약물을 제어 방출할 수 있는 약물 전달체로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (4)

  1. 신나모일 베타 사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)이 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집된 자가결집체이며,
    베타 사이클로덱스트린 잔기에 포접된 약물의 방출이 온도 변화에 따라 제어되는 것을 특징으로 하는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe).
  2. 제1항에 있어서,
    온도상승에 따라 플루로닉 사슬이 소수화되어 베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동과 소수성 상호작용을 함에 따라,
    베타 사이클로덱스트린 잔기의 공동에 포접된 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe).
  3. 염화신나모일과 베타 사이클로덱스트린 중합체를 축합반응시켜 신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체(Cinnamoyl polymeric β cyclodextrin, CinPβCD)를 제조하는 단계;
    염화신나모일과 플루로닉 F127을 축합반응시켜 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 제조하는 단계; 및
    신나모일 베타사이클로덱스트린 중합체와 신나모일 플루로닉 F127(Cinnamoyl Pluronic F127, CinPlu)을 수상에서 용해시켜 분자간 소수성 상호작용으로 자가결집시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    자가결집 후, 자가결집체에 자외선을 조사하여 신남산 잔기를 광이량화하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 온도 감응성 분자주사기(thermo-responsive molecular syringe)의 제조방법.
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