KR20160117688A - 생체물질의 검출 방법 - Google Patents

생체물질의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노입자들이 고정된 겔 매트릭스를 이용한 생체물질의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 금 나노입자들이 분산되어 고정된 겔 매트릭스 상에 목표물질 및 산화효소를 함유하는 반응액을 제공하는 것, 상기 산화효소는 상기 목표물질과 반응하여 금속 환원제를 생성하고; 상기 금속 환원제와 금속 성장물질을 반응시켜, 상기 금 나노입자들 상에 금속 물질을 성장시키는 것; 및 상기 금 나노입자들 상에 성장된 상기 금속 물질을 통해 상기 목표물질을 검출하는 것을 포함할 수 있다.

Description

생체물질의 검출 방법{A method for detecting biomaterials}
본 발명은 금 나노입자들이 고정된 겔 매트릭스를 이용한 생체물질의 검출 방법에 관한 것이다.
생체물질을 정량 측정하는 기술은 식품, 환경, 의료 진단에 있어 중요한 기술이다. 측정 가능한 생체물질에는 단백질뿐만 아니라 효소, 항체, DNA, RNA, 올리고 뉴클레오타이드, 및 다당류가 있다. 나아가, 박테리아 같은 미생물도 포함 된다. 이러한 생체물질들과 친화적인 물질을 이용하여 생체 물질을 측정하거나, 효소 반응을 이용하여 생체물질을 측정하게 된다. 각각의 방법 중 대표적으로는 단백질을 농도를 측정하기 위해 항체를 이용한 Sandwich-ELISA 방식이 있다. 또한, 혈당센서와 같이 효소 반응을 이용하여 생체물질을 측정하는 방식이 있다.
최근 나노 기술 분야의 급진적인 발전으로 인하여, 생체물질 측정에 있어 금속 나노입자가 주요 표지로 이용되고 있다. 금 나노입자를 이용한 대표적인 예는 임신진단 키트이다. 임신진단 키트의 경우 눈으로 쉽게 확인이 가능하여 정성적인 검출은 가능하나, 정량적인 검출을 위해서는 정밀한 판독장치가 필요하다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 금 나노입자들이 겔 매트릭스에 고정된 상태로 성장하도록 하여, 신뢰성 높은 생체물질의 검출 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 개념에 따른, 생체물질의 검출 방법은, 금 나노입자들이 분산되어 고정된 겔 매트릭스 상에 목표물질 및 산화효소를 함유하는 반응액을 제공하는 것, 상기 산화효소는 상기 목표물질과 반응하여 금속 환원제를 생성하고; 상기 금속 환원제와 금속 성장물질을 반응시켜, 상기 금 나노입자들 상에 금속 물질을 성장시키는 것; 및 상기 금 나노입자들 상에 성장된 상기 금속 물질을 통해 상기 목표물질을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
상기 겔 매트릭스는 패드 형태를 가지며, 상기 겔 매트릭스는 웰 타입(well type)의 반응 용기 내에 배치될 수 있다.
상기 겔 매트릭스는 폴리-디메틸실록산(poly-dimethylsiloxane), 알지네이트(alginate), 아가로스(agarose), 키토산(chitosan) 또는 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)를 포함할 수 있다.
상기 목표물질은 당류, 단백질, 지방 및 대사물질로 이루어진 군에서 선택된 상기 산화효소의 기질이고, 상기 당류는 글루코스 또는 갈락토오스를 포함하며, 상기 단백질은 항원 또는 항체를 포함하고, 상기 지방은 콜레스테롤 및 지방산을 포함하며, 상기 대사물질은 하이포잔틴, 이노신, 아스코르빈산 또는 콜린을 포함할 수 있다.
상기 산화효소는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 콜린 옥시다아제(choline oxidase), 싸이토크롬 옥시다아제(cytochrome oxidase), 아스코르베이트 옥시다아제(ascorbic oxidase), 잔틴 옥시다아제 (xanthine oxidase), 폴리페놀 옥시다아제 (polyphenol oxidase), 카테콜 옥시다아제(catechol oxidase), 라이실 옥시다아제(lysyl oxidase), NADPH 옥시다아제 (NADPH oxidase), 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase), 라카아제(laccase), 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 및 할로퍼옥시다아제(haloperoxidase)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 금속 환원제와 상기 금속 성장물질을 반응시키는 것은, 상기 반응액에 상기 금속 성장물질을 함유하는 금속 성장용액을 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
상기 금속 성장용액은 계면활성제를 더 함유하고, 상기 계면활성제는 CATC(cetyltrimethylammonium chloride) 또는 CATB(cetyltrimethylammonium bromide)를 포함할 수 있다.
상기 반응액은 상기 금속 성장물질을 추가로 함유할 수 있다.
상기 금속 성장물질은 금 이온, 은 이온 또는 구리 이온을 포함할 수 있다.
상기 금 나노입자들 및 이들 상에 성장된 상기 금속 물질은 금속 입자들을 이루고, 상기 목표물질을 검출하는 것은, 상기 금속 입자들의 흡광도를 측정할 수 있다.
상기 생체물질의 검출 방법은, 상기 목표물질을 검출하기 전에, 상기 겔 매트릭스를 세척하여 상기 반응액을 제거하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 금 나노입자들은 상기 겔 매트릭스 내에 균일하게 분산될 수 있다.
본 발명의 다른 개념에 따른, 생체물질의 검출 방법은, 금 나노입자들이 분산되어 고정된 겔 매트릭스 상에 금속 환원제를 제공하는 것; 상기 겔 매트릭스 상에 금속 성장물질을 제공하여, 상기 금나노입자들 상에 금속 물질을 성장시키는 것; 및 상기 금 나노입자들 상에 성장된 상기 금속 물질을 통해 상기 금속 환원제를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
상기 생체물질의 검출 방법은, 상기 금속 환원제를 검출하기 전에, 상기 겔 매트릭스를 세척하여 상기 금속 환원제 및 상기 금속 물질을 제거하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 금속 환원제는 H2O2, NADH, 하이드로퀴논(hydroquinone), 아드레날린(adrenaline), 노르아드레날린(noradrenaline), 도파민(dopamine), L-Dopa, 4-아미노페놀(4-aminophenol), 3-아미노페놀(3-aminophenol), 글리신(glycine), 및 DL-트립토판(DL-tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 생체물질의 검출 방법은, 겔 매트릭스에 금 나노입자들이 고정되어 있기 때문에, 반응액의 부피변화에 따른 희석 및 농축에 의한 농도 변화가 없어 일정한 측정 신호를 제공 할 수 있다. 또한, 금 나노입자들은 세척 작용에도 유실되지 않고 그대로 잔류하므로, 비 특이적 반응에 의한 측정값 오차를 줄일 수 있다. 나아가, 겔 매트릭스를 패드 형태로 제작하여, 기존의 웰 타입(well type)의 반응 용기 내지 미세 유체 채널에 그대로 적용할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체물질의 검출 방법을 개략적으로 나타내는 단면도들이다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 다른 실시예들에 따른 생체물질의 검출 방법을 개략적으로 나타내는 단면도들이다.
도 5는 본 발명의 실시예들에 따라 성장된 금 나노입자의 크기에 따른 흡광도의 변화를 FDTD(finite difference time domain) 시뮬레이션을 통하여 예측하여 본 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예들에 따라 목표물질의 농도를 변화시킴에 따른 금 나노입자의 흡광도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예들에 따라 목표물질의 농도를 변화시킴에 따른 금 나노입자의 SEM 이미지이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예는 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 이하, 본 발명에 따른 생체물질의 검출 방법을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
금 나노입자를 표지로 하는 생체물질 검출 방법에 있어서, 금 이온의 환원을 통해 금 나노입자 자체의 크기를 성장시키는 경우, 이의 흡수 파장의 변화를 관찰할 수 있다. 이러한 방법을 이용한 바이오물질 센싱 기술들이 개발되고 있지만, 미세한 금 나노입자들을 용액 내에서 균일하게 제어하기 어려운 실정이다.
일 예로, 금 나노입자와 산화효소를 알지네이트 비드에 캡슐화하여 바이오센서로 응용하는 기술이 있다. 그러나, 산화효소가 금 나노입자와 함께 알지네이트 비드에 고정되기 때문에, 장기 보관시 효소의 변성으로 인한 활성 감소가 발생할 수 있으며, 나아가 검출하고자 하는 물질에 따라 효소가 달라지기 때문에 범용적인 프로브로 사용되기 어려운 문제가 있다. 또한, 비드 형태이기 때문에 비드 내의 금 나노입자의 농도와 효소의 농도가 매번 달라질 수 있어, 그로 인한 정확한 검출이 어려운 문제가 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체물질의 검출 방법을 개략적으로 나타내는 단면도들이다.
도 1a를 참조하면, 금 나노입자들(120)이 고정된 겔 매트릭스(110)가 준비될 수 있다. 상기 금 나노입자들(120)은 상기 겔 매트릭스(110) 내에 균일하게 분산되어 있을 수 있다. 상기 겔 매트릭스(110)는 폴리-디메틸실록산(poly-dimethylsiloxane), 알지네이트(alginate), 아가로스(agarose), 키토산(chitosan) 또는 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)을 이용하여 형성될 수 있다. 상기 겔 매트릭스(110)가 형성될 때 상기 금 나노입자들(120)을 동시에 첨가함으로써, 상기 금 나노입자들(120)이 상기 겔 매트릭스(110) 내에 고정될 수 있다.
일 예로, 상기 겔 매트릭스(110)는 패드 형태를 갖도록 형성될 수 있다. 패드 형태로 준비된 상기 겔 매트릭스(110)는 웰 타입(well type)의 반응 용기(100)(예를 들어, 96 well plate) 내에 배치될 수 있다. 다른 예로, 상기 겔 매트릭스(110)는 미세 유체 채널의 반응 챔버 내에 배치될 수 있다.
본 발명에 따른 실시예들에 있어서, 상기 금 나노입자들(120)은 상기 겔 매트릭스(110) 내에 균일하게 고정되기 때문에, 상기 금 나노입자들(120)은 유실되지 않고 일정한 농도를 유지할 수 있다.
상기 겔 매트릭스(110) 상에 목표물질(target material) 및 산화효소(140)를 함유하는 반응액(130)이 제공될 수 있다. 상기 목표물질은 당류, 단백질, 지방 및 대사물질로 이루어진 군에서 선택된 상기 산화효소(140)의 기질일 수 있다. 일 예로, 상기 당류는 글루코스 또는 갈락토오스를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 항원 또는 항체를 포함할 수 있고, 상기 지방은 콜레스테롤 및 지방산을 포함할 수 있고, 상기 대사물질은 하이포잔틴, 이노신, 아스코르빈산 또는 콜린을 포함할 수 있다.
상기 산화효소(140)는 상기 목표물질과 반응하여 금속 환원제를 생성할 수 있는 효소일 수 있다. 일 예로, 상기 산화효소(140)는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 콜린 옥시다아제(choline oxidase), 싸이토크롬 옥시다아제(cytochrome oxidase), 아스코르베이트 옥시다아제(ascorbic oxidase), 잔틴 옥시다아제 (xanthine oxidase), 폴리페놀 옥시다아제 (polyphenol oxidase), 카테콜 옥시다아제(catechol oxidase), 라이실 옥시다아제(lysyl oxidase), NADPH 옥시다아제 (NADPH oxidase), 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase), 라카아제(laccase), 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 및 할로퍼옥시다아제(haloperoxidase)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 목표물질과 상기 산화효소(140)가 반응하여 상기 금속 환원제가 생성될 수 있다. 일 예로, 상기 금속 환원제는 H2O2일 수 있으나, 상기 목표물질 및 상기 산화효소(140)에 따라 다양할 수 있다. 다른 예로, 상기 금속 환원제는 상기 산화효소에 의해 생성되는 H2O2외에도, 생체 물질(예를 들어, 목표물질) 내에 존재하는 NADH, 하이드로퀴논(hydroquinone), 아드레날린(adrenaline), 노르아드레날린(noradrenaline), 도파민(dopamine), L-Dopa, 4-아미노페놀(4-aminophenol), 3-아미노페놀(3-aminophenol), 글리신(glycine) 또는 DL-트립토판(DL-tryptophan)을 포함할 수 있다. 상기 생체 물질 내에 존재하는 상기 금속 환원제는, 상기 H2O2에 의한 금속 성장물질의 환원 반응에 부가적으로 참여할 수 있다.
이어서, 상기 반응액(130)에 금속 성장물질을 함유하는 금속 성장용액이 첨가될 수 있다. 상기 금속 성장물질은 상기 금속 환원제에 의해 환원되어 상기 금 나노입자들(120) 상에 성장될 수 있다. 일 예로, 상기 금속 성장물질은 금 이온을 포함하는 AuCl4 -일 수 있다. 상기 금속 성장물질은 상기 금 나노입자들(120)을 핵으로 하며 환원될 수 있다. 상기 금 나노입자들(120)이 성장됨으로써, 금을 함유하는 금속 입자들(125)이 형성될 수 있다.
상기 금속 성장용액은 계면활성제를 더 함유할 수 있다. 상기 계면활성제는 CATC(cetyltrimethylammonium chloride) 또는 CATB(cetyltrimethylammonium bromide)를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 상기 금 이온이 상기 금 나노입자들(120)을 핵으로하여 성장할 수 있도록, 상기 금 나노입자들(120)의 표면을 개질하는 역할을 수행할 수 있다.
다른 실시예로, 상기 금속 성장물질은 상기 반응액(130)과는 별도로 첨가되는 것이 아니라, 상기 금속 성장물질이 상기 반응액(130) 내에 추가로 함유될 수 있다. 즉, 상기 겔 매트릭스(110) 상에 상기 목표물질, 상기 산화효소(140) 및 상기 금속 성장물질을 모두 함유하는 반응액(130)이 한번에 제공될 수 있다. 즉, 상기 목표물질, 상기 산화효소(140) 및 상기 금속 성장물질을 상기 겔 매트릭스(110) 상에 제공하는 순서 및 방법은 특별히 제한되지 않는다.
도 1b를 참조하면, 상기 금 나노입자들(120)이 성장되어 상기 금속 입자들(125)이 형성된 후에, 상기 겔 매트릭스(110)를 세척할 수 있다. 이로써, 상기 반응액(130)이 제거되고, 상기 겔 매트릭스(110) 및 이에 고정된 상기 금속 입자들(125)만이 잔류할 수 있다.
이어서, 상기 금속 입자들(125)에 대한 흡광도를 측정하여, 최대 흡광도를 보이는 파장에서의 세기 변화를 통해 상기 목표물질을 정성 및 정량적으로 검출할 수 있다. 즉, 상기 목표물질의 유무 및 상기 목표물질의 양에 따라 상기 금 나노입자들의 성장 정도가 결정될 수 있기 때문이다. 일 예로, 상기 금 나노입자들은 약 530nm의 파장에서 최대 흡광도를 나타낸다. 이때, AuCl4 -가 환원되어 상기 금 나노입자들(120)이 성장되어감에 따라 상기 최대 흡광도는 점차 증가될 수 있다(도 5 참조). 따라서, 본 실시예에 따른 목표물질의 정성 및 정량 검출은, 상기 금 나노입자들(즉, 금속 입자들(125))의 최대 흡광도 변화를 측정함으로써 달성될 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 금속 입자들(125)은 상기 겔 매트릭스(110) 내에 고정되어 있기 때문에, 상기 반응액(130)이 제거되더라도 상기 금속 입자들(125)은 그대로 잔류할 수 있다. 즉, 상기 반응액(130)이 제거됨으로써 비 특이적 반응에 의한 노이즈가 최소화되어, 상기 금속 입자들(125)에 대한 흡광도 측정이 용이할 수 있다. 이와 함께, 상기 금속 입자들(125)은 그 농도와 크기가 그대로 유지된 상태로 잔류하기 때문에, 정확한 데이터 측정이 가능할 수 있다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체물질의 검출 방법을 개략적으로 나타내는 단면도이다. 앞서 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명한 것과 중복되는 기술적 특징에 대한 상세한 설명은 생략하고, 차이점에 대해 상세히 설명한다. 앞서 본 발명의 일 실시예를 설명하기 위한 생체물질의 검출 방법과 동일한 구성에 대하여는 동일한 참조번호가 제공될 수 있다.
도 2를 참조하면, 목표물질과 산화효소(140)가 반응하여 금속 환원제가 생성될 수 있다. 앞서 도 1a와는 다른 예로, 상기 금속 환원제는 NADH일 수 있다. 예를 들어, 상기 NADH는 NAD+로 산화되면서 구리 이온과 같은 금속 이온을 잘 환원시킬 수 있다.
반응액(130) 내에 첨가된 금속 성장물질은 상기 금속 환원제에 의해 환원되어 상기 금 나노입자들(120) 상에 성장될 수 있다. 앞서 도 1a와는 다른 예로, 상기 금속 성장물질은 구리 이온(Cu2 +)일 수 있다. 상기 구리 이온(Cu2 +)이 상기 금 나노입자들(120)을 핵으로 하여 상기 금 나노입자들(120)의 표면 상에 환원됨으로써, 금속 입자들(125)이 형성될 수 있다. 즉, 각각의 상기 금속 입자들(125)은 코어인 상기 금 나노입자 및 이를 둘러싸는 쉘인 금속 물질(구리)을 포함할 수 있다. 상기 금속 입자들(125)은 상기 금속 물질(구리)의 특성을 나타낼 수 있다.
이어서, 도 1b를 참조하여 설명한 것과 동일하게, 상기 반응액(130)이 제거될 수 있다. 이후, 상기 금속 입자들(125)에 대한 최대 흡광도를 측정하여, 구리의 환원 정도를 측정할 수 있다. 이로써, 목표물질을 정성 및 정량적으로 검출할 수 있다.
본 실시예에서는 금 이온을 제외한 금속 성장물질로 구리 이온(Cu2 +)을 예시하였으나, 그 외에도 상기 금속 성장물질은 은 이온(Ag+)일 수도 있다. 특히 상기 금속 성장물질로 은 이온(Ag+)을 사용할 경우, 상기 효소는 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 및 할로퍼옥시다아제(haloperoxidase)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 생체물질의 검출 방법을 개략적으로 나타내는 단면도이다. 앞서 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명한 것과 중복되는 기술적 특징에 대한 상세한 설명은 생략하고, 차이점에 대해 상세히 설명한다. 앞서 본 발명의 일 실시예를 설명하기 위한 생체물질의 검출 방법과 동일한 구성에 대하여는 동일한 참조번호가 제공될 수 있다.
도 3을 참조하면, 앞서 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명한 것과는 달리, 목표물질이 앞서 설명한 금속 환원제일 수 있다. 즉, 목표물질로서 상기 금속 환원제를 검출하고자 할 경우, 추가적인 산화효소(140) 없이 겔 매트릭스(110)를 프로브로 하여 상기 금속 환원제의 정성 및 정량적 검출이 가능하다.
구체적으로, 금 나노입자들(120)이 고정된 상기 겔 매트릭스(110) 상에 상기 금속 환원제를 함유하는 반응액(130)이 제공될 수 있다. 상기 금속 환원제는 금속 성장물질들을 환원시킬 수 있는 물질들로서, 예를 들어, H2O2, NADH, 하이드로퀴논(hydroquinone), 아드레날린(adrenaline), 노르아드레날린(noradrenaline), 도파민(dopamine), L-Dopa, 4-아미노페놀(4-aminophenol), 3-아미노페놀(3-aminophenol), 글리신(glycine), 및 DL-트립토판(DL-tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이어서, 상기 반응액(130)에 금속 성장물질을 함유하는 금속 성장용액이 첨가될 수 있다. 일 예로, 상기 금속 성장물질은 금 이온을 포함하는 AuCl4 -일 수 있다. 상기 금속 성장물질이 상기 금속 환원제에 의해 상기 금 나노입자들(120) 상에 환원됨으로써, 금을 함유하는 금속 입자들(125)이 형성될 수 있다.
후속으로, 앞서 도 1b를 참조하여 설명한 것과 동일하게, 상기 반응액(130)이 제거될 수 있다. 이후, 상기 금속 입자들(125)에 대한 최대 흡광도를 측정하여, 목표물질인 상기 금속 환원제를 정성 및 정량적으로 검출할 수 있다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 생체물질의 검출 방법을 개략적으로 나타내는 단면도이다. 앞서 도 1a, 도 1b 및 도 3을 참조하여 설명한 것과 중복되는 기술적 특징에 대한 상세한 설명은 생략하고, 차이점에 대해 상세히 설명한다. 앞서 본 발명의 일 실시예를 설명하기 위한 생체물질의 검출 방법과 동일한 구성에 대하여는 동일한 참조번호가 제공될 수 있다.
도 4를 참조하면, 앞서 도 3과는 다른 예로, 금속 성장물질은 은 이온(Ag+)일 수 있다. 즉, 검출하고자 하는 금속 환원제에 따라 상기 금속 성장물질이 적절히 선택될 수 있으며, 일 예로, 상기 금속 환원제는 NADH일 수 있다. 상기 금속 성장물질은 상기 금 나노입자들(120)의 표면 상에 환원됨으로써, 금속 입자들(125)이 형성될 수 있다. 즉, 각각의 상기 금속 입자들(125)은 코어인 상기 금 나노입자 및 이를 둘러싸는 쉘인 금속 물질(은)을 포함할 수 있다. 상기 금속 입자들(125)은 상기 금속 물질(은)의 특성을 나타낼 수 있다.
후속으로, 앞서 도 1b를 참조하여 설명한 것과 동일하게, 상기 반응액(130)이 제거될 수 있다. 이후, 상기 금속 입자들(125)에 대한 최대 흡광도를 측정하여, 목표물질인 상기 금속 환원제를 정성 및 정량적으로 검출할 수 있다.
실시예 1: 겔 매트릭스의 제조
1.2 x 10-8 M의 금 나노입자 수용액 40㎕, 증류수 230㎕ 및 알지네이트 수용액 200㎕을 혼합한 알지네이트 혼합물을 준비하였다. 상기 알지네이트 혼합물과 100mM CaCl2 수용액을 혼합하여, 금 나노입자가 분산된 알지네이트 겔 매트릭스를 패드 형태로 제조하였다. 제조된 상기 알지네이트 겔 매트릭스를 96 well plate에 배치하였다.
실시예 2: 알지네이트 겔 매트릭스 상에 하이포잔틴의 배양
하이포잔틴(hypoxantine)이 농도별로 함유되어 있는 1x phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) 와 2U/mL의 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase, XO) 용액을 각각 준비하고, 하이포잔틴 용액 50㎕와 잔틴 옥시다아제 2.5㎕ 혼합하여 반응액을 준비하였다. 상기 반응액을 앞서 실시예 1에서 제조된 알지네이트 겔 매트릭스 상에 적용하고, 공기 분위기하 상온에서 5min 동안 배양하였다. 이 때, 상기 반응액의 하이포잔틴의 농도를 0mM, 0.05mM, 0.1mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM 및 2.5mM로 변화시켜가며 배양실험을 각각 실시하였다.
실시예 3: 금 나노입자 성장
앞서 실시예 2에서 하이포잔틴이 배양된 반응액에, 금 성장용액으로서, HAuCl4(0.2mM) 및 CTAC(cetyltrimethylammonium chloride)(2mM)의 혼합 수용액(0.01M, pH 7.0)을 첨가하고 상온에서 1hr 동안 두어, 알지네이트 겔 매트릭스 내에서의 금 나노입자 성장을 유도하였다.
실시예 4: 생체물질의 검출
도 5는 본 발명의 실시예들에 따라 성장된 금 나노입자의 크기에 따른 흡광도의 변화를 FDTD(finite difference time domain) 시뮬레이션을 통하여 예측하여 본 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5를 참조하면, 알지네이트 겔 매트릭스 내의 금 나노입자들의 평균 직경을 약 10nm에서 약 16nm로 변화시켜가며 흡광도를 시뮬레이션하였다. 먼저, 금 나노입자의 경우 크기에 상관 없이 약 530nm에서 최대 흡광 파장을 가짐을 확인할 수 있다. 특히, 약 530nm에서의 최대 흡광도는 상기 금 나노입자의 크기에 비례하여 점진적으로 증가함을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 알지네이트 겔 매트릭스 내의 금 나노입자의 평균 크기는, 이의 최대 흡광도를 측정함으로써 확인할 수 있다.
앞서 실시예 3에서 금 나노입자 성장을 유도한 뒤, 96 well plate 내의 알지네이트 겔 매트릭스를 세척하여 잔류하는 반응액을 모두 제거하였다. 이후, 상기 알지네이트 겔 매트릭스의 흡광도를 측정하였다. 이 때, 흡광도는 plate reader(Infinite M200, Tecan, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 본 발명의 실시예들에 따라 목표물질의 농도를 변화시킴에 따른 금 나노입자의 흡광도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6을 참조하면, XO의 기질인 하이포잔틴의 농도가 0mM에서 2.5mM로 증가함에 따라, 약 530nm에서의 최대 흡광도는 점진적으로 증가함을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 실시예들에 따른 생체물질의 검출 방법은, 상기 최대 흡광도의 변화를 통하여 생체물질인 하이포잔틴을 정성 및 정량적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
나아가, 상기 알지네이트 겔 매트릭스의 SEM 이미지를 주사전자현미경(SEM, Hitachi S-4800)을 이용해 확인하였고, 이를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, XO의 기질인 하이포잔틴의 농도가 0mM인 경우, 상기 알지네이트 겔 매트릭스 내의 금 나노입자는 아무런 성장을 하지 않음을 확인할 수 있다. 반면, 하이포잔틴의 농도가 1mM인 경우, 상기 알지네이트 겔 매트릭스 내의 금 나노입자가 성장됨을 확인할 수 있다. 이는 XO에 의한 하이포잔틴의 산화반응으로 인해 생성된 H2O2가, 알지네이트 겔 매트릭스 내 금 나노입자의 성장을 유도하였기 때문이었다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예에는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (15)

  1. 금 나노입자들이 분산되어 고정된 겔 매트릭스 상에 목표물질 및 산화효소를 함유하는 반응액을 제공하는 것, 상기 산화효소는 상기 목표물질과 반응하여 금속 환원제를 생성하고;
    상기 금속 환원제와 금속 성장물질을 반응시켜, 상기 금 나노입자들 상에 금속 물질을 성장시키는 것; 및
    상기 금 나노입자들 상에 성장된 상기 금속 물질을 통해 상기 목표물질을 검출하는 것을 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 겔 매트릭스는 패드 형태를 가지며,
    상기 겔 매트릭스는 웰 타입(well type)의 반응 용기 내에 배치되는 생체물질의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 겔 매트릭스는 폴리-디메틸실록산(poly-dimethylsiloxane), 알지네이트(alginate), 아가로스(agarose), 키토산(chitosan) 또는 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)를 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 목표물질은 당류, 단백질, 지방 및 대사물질로 이루어진 군에서 선택된 상기 산화효소의 기질이고,
    상기 당류는 글루코스 또는 갈락토오스를 포함하며,
    상기 단백질은 항원 또는 항체를 포함하고,
    상기 지방은 콜레스테롤 및 지방산을 포함하며,
    상기 대사물질은 하이포잔틴, 이노신, 아스코르빈산 또는 콜린을 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 산화효소는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 콜린 옥시다아제(choline oxidase), 싸이토크롬 옥시다아제(cytochrome oxidase), 아스코르베이트 옥시다아제(ascorbic oxidase), 잔틴 옥시다아제 (xanthine oxidase), 폴리페놀 옥시다아제 (polyphenol oxidase), 카테콜 옥시다아제(catechol oxidase), 라이실 옥시다아제(lysyl oxidase), NADPH 옥시다아제 (NADPH oxidase), 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase), 라카아제(laccase), 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 및 할로퍼옥시다아제(haloperoxidase)로 구성된 군에서 선택된 생체물질의 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 금속 환원제와 상기 금속 성장물질을 반응시키는 것은, 상기 반응액에 상기 금속 성장물질을 함유하는 금속 성장용액을 첨가하는 것을 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 금속 성장용액은 계면활성제를 더 함유하고,
    상기 계면활성제는 CATC(cetyltrimethylammonium chloride) 또는 CATB(cetyltrimethylammonium bromide)를 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 반응액은 상기 금속 성장물질을 추가로 함유하는 생체물질의 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 금속 성장물질은 금 이온, 은 이온 또는 구리 이온을 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자들 및 이들 상에 성장된 상기 금속 물질은 금속 입자들을 이루고,
    상기 목표물질을 검출하는 것은, 상기 금속 입자들의 흡광도를 측정하는 것을 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 목표물질을 검출하기 전에, 상기 겔 매트릭스를 세척하여 상기 반응액을 제거하는 것을 더 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자들은 상기 겔 매트릭스 내에 균일하게 분산된 생체물질의 검출 방법.
  13. 금 나노입자들이 분산되어 고정된 겔 매트릭스 상에 금속 환원제를 제공하는 것;
    상기 겔 매트릭스 상에 금속 성장물질을 제공하여, 상기 금나노입자들 상에 금속 물질을 성장시키는 것; 및
    상기 금 나노입자들 상에 성장된 상기 금속 물질을 통해 상기 금속 환원제를 검출하는 것을 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 금속 환원제를 검출하기 전에, 상기 겔 매트릭스를 세척하여 상기 금속 환원제 및 상기 금속 물질을 제거하는 것을 더 포함하는 생체물질의 검출 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 금속 환원제는 H2O2, NADH, 하이드로퀴논(hydroquinone), 아드레날린(adrenaline), 노르아드레날린(noradrenaline), 도파민(dopamine), L-Dopa, 4-아미노페놀(4-aminophenol), 3-아미노페놀(3-aminophenol), 글리신(glycine), 및 DL-트립토판(DL-tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택된 생체물질의 검출 방법.
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